OTIMIZAÇÃO DE REATOR BATELADA ALIMENTADA PARA HIDROLISE DE PALHA DE CANA DE AÇÚCAR APLICANDO A TEORIA DE CONTROLE ÓTIMO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA OTIMIZAÇÃO DE REATOR BATELADA ALIMENTADA PARA HIDROLISE DE PALHA DE CANA DE AÇÚCAR APLICANDO A TEORIA DE CONTROLE ÓTIMO DISSENTE: Vitor Debiazzi Pereira Pinto ORIENTADORA: Profª. Dra. Inti Doraci Cavalcanti-Montano COORIENTADOR: Prof. Dr. Carlos Alberto Galeano Suarez DISSERTAÇÃO DE MESTRADO GOIÂNIA

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3 VITOR DEBIAZZI PEREIRA PINTO OTIMIZAÇÃO DE REATOR BATELADA ALIMENTADA PARA HIDROLISE DE PALHA DE CANA DE AÇÚCAR APLICANDO A TEORIA DE CONTROLE ÓTIMO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Goiás, como requisito para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química, área de concentração em Pesquisa e Desenvolvimento de Processos Químicos Orientadora: Profª. Dra. Inti Doraci Cavalcanti-Montano Coorientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Galeano Suarez Goiânia 2016

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9 Sumário Capítulo 1 INTRODUÇÃO Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica Etanol de primeira geração (1G) Etanol de segunda geração (2G) Palha de Cana-de-Açúcar Materiais lignocelulósicos Celulose Hemicelulose Lignina Hidrólise Enzimática da Celulose Modelo cinético de Michaelis-Menten Pré-Tratamento Pré-tratamento hidrotérmico Pré-tratamento alcalino Controle Ótimo Princípio do Máximo de Pontryagin Capítulo 3 OBJETIVO GERAL Objetivo Específicos Capítulo 4- MATERIAIS E MÉTODOS Modelagem do biorreator e Otimização Hidrólise enzimática Material lignocelulósico Enzima Procedimento experimental Pré-tratamento hidrotérmico Pré-tratamento alcalino da palha de cana-de-açúcar pré-tratada hidrotermicamente Caracterização da palha de cana-de-açúcar Determinação de umidade das amostras de palha Hidrólise ácida da palha da cana-de-açúcar Determinação de lignina solúvel Determinação de lignina insolúvel Determinação das cinzas da lignina Determinação de cinzas totais Determinação da atividade enzimática total das celulases... 34

10 Quantificação dos açúcares redutores totais Hidrólise enzimática da palha de cana-de-açúcar Capítulo 5- RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Apêndice... 57

11 DEDICO Às pessoas que mais me apoiaram nesta caminhada: Meus pais Carlos Afonso e Ana Maria, que me ajudaram a me tornar a pessoa que sou hoje e os quais devo tudo o que conquistei. Meu irmão Lucas, por sempre me incentivar a crescer e ser melhor, e minha futura esposa Thaisa por ser meu ponto de apoio nos momentos difíceis.

12 Agradecimentos Aos meus pais Carlos Afonso e Ana Maria e meu irmão Lucas, pelo apoio em cada etapa deste trabalho e por sempre acreditarem em mim. À minha noiva Thaisa, por sempre me incentivar e estar comigo, mesmo nos momentos difíceis. Aos meus padrinhos José Vinícius e Kátia, pelo carinho. À minha cunhada Tamara e seu esposo João, pela amizade, pela ajuda e pelo apoio para a realização deste trabalho. À minha cunhada Fernanda, por aguentar meu irmão e pelo carinho. À minha segunda família Baldo (Denivaldo, Francisca e Jane), por me acolherem. À Profª. Drª. Inti Doraci Cavalcanti-Montano, pela orientação e amizade ao decorrer destes 2 anos. Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Galeano Soares, pela coorientação e ajuda nestes 2 anos. Ao Prof. Dr. Ruy de Sousa Junior, pela colaboração direta na realização deste trabalho, ajudando-me em discussões científicas e na parte experimental. À colega Bruna, pela parceria que possibilitou a realização deste trabalho. Aos meus amigos Dorcinio, Arinan, Pedro Lucas e Camila não só pela amizade, mas por toda a ajuda. Ao meu grande amigo Rodrigo, sua esposa Charlise e sua família, pela amizade de mais de 9 anos de amizade, e que sem ajuda este trabalho nunca seria possível. Às minhas colegas de mestrado, a Daniele, Lorena, Camila, e em especial a Késia, pela amizade e companheirismo. Aos amigos do clã Oblivion, em especial ao Denis, Hélio e Breno, pelas boas horas passadas online. Ao Departamento de Engenharia Química da UFScar, pelo suporte acadêmico que permitiu a realização deste trabalho. À CAPES,pela bolsa concedida. À todos que de alguma forma cederam uma parcela de carinho, esforço, incentivo para a realização deste trabalho.

13 O que prevemos raramente ocorre; o que menos esperamos geralmenteacontece. (Benjamin Disraeli)

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15 RESUMO Doo ponto de vista econômico é importante processar elevadas cargas de sólidos na hidrólise enzimática dos resíduos lignocelulósicos para a produção de etanol 2G, mas operação em batelada com altas cargas iniciais de substrato pode causar uma mistura ineficiente, prejudicando o processo reacional. Uma alternativa atraente é operar os reatores em batelada alimentada. O objetivo deste trabalho foi determinar, aplicando a teoria do controle ótimo, o perfil ótimo de alimentação de substrato em reator de bancada. Para isso, foram testadas duas cinéticas de Michaelis-Menten, a cinética de Michaelis Menten psêudo-homôgenea e a cinética de Michaelis Menten com inibição competitiva pelo produto, onde nesta última cinética foi obtido o melhor ajuste aos dados obtidos experimentalmente. O algoritmo desenvolvido foi executado no software Matlab e os resultados das simulações foram experimentalmente validados. Os ensaios de hidrólise enzimática foram realizados com palha de cana-de-açúcar prétratada hidrotérmicamente, seguido pela deslignificação alcalina com NaOH. Foram obtidos bons ajustes dosdados simulados com respeito aos dados experimentais, com valores de concentração final de glicose de 164,647 g / L (média da triplicata) e na simulação a concentração foi 174,93 g / L. Provando que a palha de cana-de-açúcar, além de ser uma matéria-prima barata e abundante, tem um grande potencial energético. Além disso, a estratégia de controle ótimo foi eficiente na otimização do problema proposto. Palavras chaves: hidrólise enzimática, pré-tratamento hidrotérmico, deslignificação alcalina.

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17 ABSTRACT From the economic point of view it is important to process high charges of solid in enzimatic hydrolysis of the lignocellulosic residues for the production of 2G ethanol, but batch operation with high initial charges of substrate can cause inefficient mixture, damaging the reactional process. An attractive alternative is operating the reactors in fed batch. The aim of this work was to determine, applying the theory of optimal control, the optimal feeding profile of substrate in bench reactor. For this, it was tested two kinetic of Michaelis-Menten: pseudo-homogeneous Michaelis-Menten kinetic and Michaelis Menten kinetic with inhibition by the product, in the last kinetic was obtained the best fit to experimental data. The developed algorithm was run in Matlab software and the simulation results were experimentally validated. Enzymatic hydrolysis assays were performed with hydrothermally pre-treated sugar cane straw followed by the alkaline delignification. It was obtained good fiting of the simulation data with respect to the experimental data, with values of glucose final concentration close to g/l (triplicate average) and in simulation the concentration was g/l. Proving that the sugar cane straw, besides being a good feedstock cheap and abundant, it has a great energetic potential. Furthermore, the optimal control strategy was very efficient in optimization of the proposed problem. Keywords: enzymatic hydrolysis, hydrothermal pre-treatment, alkaline delignification.

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19 Lista de Figuras Figura 1- Representação da estrutura da parece celular, com foco na celulose e as cadeias de glicose presentes na mesma...20 Figura 2-Representação gráfica do algoritmo utilizado na simulação...30 Figura 3- Curva padrão de glicose. Faixa linear de absorbância 0,172 a 0,838, corresponde a faixa de concentração de concentração de glicose de 0,5 a 2,5 g/l...36 Figura 4- Curva referente à concentração de glicose em função do logaritmo da concentração de enzima adicionada...37 Figura 5- Comparação entre o modelo cinético de Michaelis- Mentem pseudohomogênico simulado e os dados experimentais...43 Figura 6-Comparação entre o modelo cinético Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose simulado e os dados experimentais...44 Figura 7-Comparação entre o modelo cinético Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose simulado e os dados experimentais, após o ajuste dos parâmetros. 45 Figura 8- Perfil simulado de alimentação de substrato no reator, obtido aplicando a - teoria clássica do controle ótimo. Concentração inicial de enzima e(0)=900 FPU.L solução 1 e concentração inicial de glicose potencial de 44 g glicose_potencial.l -1 solução...46 Figura 9- Montagem dos reatores no início da operação de validação., Figura 10- Comparação entre os resultados simulados e experimentais da concentração de produto para a validação 1. Condições de operação: 50ºC, ph 4,8, concentração inicial de enzima e(0)=900 FPU.L -1 solução e concentração inicial de glicose potencial de 44 g glicose_potencial.l -1 solução...48 Figura 11-Perfil de alimentação de palha pré-tratada calculado na simulação. Concentração inicial de enzima e(0)=1400 FPU.L -1 solução e concentração inicial de glicose potencial de 44 g glicose_potencial.l -1 solução. 50 Figura 12- Comparação entre os resultados simulados e experimentais da concentração de produto para a validação 2. Condições de operação: 50ºC, ph 4,8, concentração inicial de enzima e(0)=1400 FPU.L -1 solução e concentração inicial de glicose potencial de 44 g glicose_potencial.l -1 solução... 51

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21 Lista de Tabelas Tabela1- Composição geral da parede secundária...19 Tabela 2- Composição da palha de cana segundo Pratto et Al., Tabela 3- Cinéticas de Michaelis-Menten selecionadas para avaliação Tabela 4 Caracterização da palha pré-tratada hidrotermicamente e deslignificada...40 Tabela 5- Condições operacionais dos experimentos em batelada...40 Tabela 6- Dados obtidos nos experimentos em batelada Tabela 7- Parâmetros das cinéticas obtidas por Pratto et al., (2016) Tabela 8- Parâmetros cinéticos ajustados utilizados na simulação Tabela 9- Caracterização da palha para novo experimento... 49

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23 14 Capítulo 1 INTRODUÇÃO Os sistemas energéticos mais usados mundialmente dependem fortemente dos combustíveis fósseis, com cerca de 80% do consumo mundial de energia provinda desse tipo de combustível. Atualmente, os combustíveis fósseis têm sido vinculados com problemas de sustentabilidade, sendo questionáveis dos pontos de vista social, econômico e ambiental.a grande quantidade de emissão de gases poluentes gerados pela queima desses combustíveisestá diretamente relacionado com o aquecimento global [8]. Além disso, vinculados aos produtos derivados de petróleo tem se também a geração de subprodutos, tais como farmacêuticos, pesticidas, plástico, solventes, fertilizantes, asfalto, lubrificantes, entre outros [8]. Logo, a substituição dessa fonte energética para uma fonte energética renovável se faz necessária. A busca por alternativas menos agressivas para o meio ambiente levou à pesquisa e produção de biocombustíveis como o etanol, sendo que para sua produção em escala industrial é necessária uma matéria-prima abundante e barata [1-6-11]. O início do século XXI ficou marcado pela grande iniciativa de substituir os combustíveis fósseis, como a gasolina, por biocombustíveis, como o etanol. Esse fato também foi motivado por tratados internacionais, como o Protocolo de Kyoto e o Bali Action Plan, vinculados emissões de carbono [9]. Os biocombustíveis estão vinculados a grandes vantagens, tanto na dependência do petróleo como na emissão de gases poluentes. Além disso, os biocombustíveis têm potencial de diminuir a quantidade de emissão de gás carbônico (CO 2 ), visto que o mesmo é primordial para as plantas, sob o ponto de vista do seu metabolismo, contribuindo para o equilíbrio climático global [8]. O Brasil tem avançado na busca de alternativas a fim de substituir os combustíveis fósseis por biocombustíveis. O país produziu cerca de 18 bilhões de litros de etanol na safra 2008/2009, o que representou 36% da produção mundial, que foi estimada em 140 milhões de toneladas por ano [2-11]. Já no ano de 2011a produção de cana-de-açúcar foi em torno de 625 milhões de toneladas, estimando que a produção de rejeitos, como palha e bagaço, após o processamento da cana foi de aproximadamente 82,4 milhões de toneladas (em base seca) [32,33].Neste contexto, no presente trabalho são aplicadas técnicas de modelagem e simulação para a otimização do processo de conversão da fração C6 presente na palha de cana

24 15 de açúcar em monossacarídeos a serem utilizados na produção de bioetanol de segunda geração. No capítulo 2, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, é realizada uma breve síntese dos conceitos mais importantes relacionados à produção de biocombustíveis a partir de resíduos lignocelulósicos. Apresenta-se também a formulação do problema do controle ótimo. No capítulo 3, OBJETIVO, sãoapresentados o objetivo geral e os objetivos específicos do presente trabalho. Nos capítulos 4 e 5, é descrita uma política de alimentação de substrato ao reator em batelada alimentada a qual foi definida utilizando a teoria clássica do controle ótimo, junto com os materiais e métodos utilizados para a sua respectiva validação experimental.

25 16 Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica A grande vantagem do etanol em relação aos combustíveis fósseis é o fato de que este pode ser produzido a partir de vários materiais brutos que contenham açúcar em sua composição que micro-organismos como bactérias e leveduras possam metabolizar, ou que contenham polissacarídeos, como a celulose, que possam ser quebrados em monossacarídeos e então metabolizados [4]. Os biocombustíveis podem ser classificados principalmente de duas formas: biocombustíveis de primeira geração (1G) e segunda geração (2G). 2.1.Etanol de primeira geração (1G) A produção mundial do etanol 1G, como combustível, gira em torno de 50 bilhões de litros por ano[8].no Brasil o etanol já é amplamente utilizado como combustível, sendo puro ou misturado na gasolina (em torno de 25% de etanol na gasolina). Segundo as projeções do MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) a produção de etanol no Brasil para 2019 pode chegar a 50,8 bilhões de litros, mais do que o dobro produzido em 2008 [22]. O etanol 1G representa uma ótima alternativa aos combustíveis fosseis, recebendo uma grande atenção internacional tanto por razões econômicas bem como ambientais, oferecendo vantagens em relação à emissão de CO 2, por ser oriundo de plantas, sendo a principal fonte de etanol a fermentação dos açúcares presentes na cana-de-açúcar. Além disso, o CO 2 resultante da queima dos biocombustíveis equivale ao CO 2 utilizado pelas plantas durante a fotossíntese, logo não contribui para alteração da quantidade de CO 2 na atmosfera [8-4]. Porém, o etanol produzido a partir de matérias-primas que servem de alimentos como milho, beterraba, mandioca e outros, gerou o aumento de preço dos alimentos em várias partes do mundo, gerando uma competição encontrada nas vertentes comida versus combustível, acarretando mudanças no pensamento sobre essa tecnologia [ ]. 2.2.Etanol de segunda geração (2G)

26 17 O etanol 2G é produzido a partir de biomassas (resíduos florestais, resíduos agrícolasou outras matérias-primas lignocelulósicas). O termo bioetanol é outra denominação encontrada na literatura para conversão do material celulósico, seja ele bagaço de cana, bagaço de malte, resíduos agrícolas, palha de cana-de-açúcar, etc, em etanol através de um bioprocesso [8]. Segundo Naik et. al, (2010), esta tecnologia ainda é economicamente inviável devido aos seus custos operacionais e limitações tecnológicas. Porém, em setembro de 2014, na cidade de São Miguel dos Campos, Alagoas, foi inaugurada a primeira usina de etanol feita a partir de matéria-prima celulósica, chamada de Bioflex 1, bagaço e palha de cana-de-açúcar. A estimativa foi que o uso da matéria-prima celulósica aumentasse a produção de etanol em 30%, uma vez que a biomassa de plantas é abundante e pouco utilizada, tendo grande potencial para pesquisas visando à melhoria do aproveitamento desse tipo de matéria-prima e se apresentando com umaótima alternativa nas questões energéticas. O grande desafio éa redução do custo das enzimas [20]. Em abril de 2016 a usina Bioflex 1 interrompeu suas atividades para ajustes de equipamento e de processos de produção. Porém a previsão de retorno está marcada para outubro de 2016[38]. O foco deste trabalho é a utilização do material lignocelulósico presente na palha de cana-de-açúcar para produzir etanol de segunda geração (2G), a partir da hidrólise enzimática da celulose presente nesse tipo de material. O grande interesse nessa matéria prima lignocelulósica se dá ao fato de ela ser abundante, rica em polissacarídeos como a celulose e a hemicelulose, e principalmente porque ela não afeta o estoque de alimentos por não entrar na competição combustível versus alimento. Além disso, essa matéria prima também é barata, já que esses materiais são derivados de materiais considerados resíduos [1-8-9], mostrando que nos dias atuais a hidrólise de material lignocelulósico para a produção de etanol de segunda geração pode serviável no Brasil [20]. Desta forma, biocombustíveis de segunda geração são vistos como alternativa mais sustentável aos problemas encontrados nos combustíveis de primeira geração [3]. 2.3.Palha de Cana-de-Açúcar A cana-de-açúcar é uma biomassa excelente para a geração de etanol, podendo ser quase totalmente aproveitada. Segundo Soares e Rossel, 2015, estima-se que para cada 1000 kg de cana limpa, pode-se gerar kcal de energia a partir dos açúcares da cana (etanol

27 18 de primeira geração), kcal a partir do bagaço da cana e kcal a partir da palha da cana-de-açúcar [21]. A palha é composta por folhas verdes, secas e ponteiras. A partir de 1996, com a proibição da queima da cana,a colheita da cana-de-açúcar passou gradativamente a ser mecanizada, podendo ser melhor aproveitada. O avanço da mecanização da colheita elimina a queima e preserva a palha [14-28]. Com a diminuição da queima da palha, devido a acordos ambientais firmados entre governo e usinas sucroalcooleiras (embora essa prática ainda seja muito comum), houve um aumento da quantidade de palha disponível nos campos, tornando-a assim uma ótima fonte para a produção de etanol de segunda geração. [ ] A palha da cana-de-açúcar também pode gerar energia através da queima, porém, segundo dados da literatura, o poder calorífico da palha da cana-de-açúcar é de kcal/kg (poder calorífico inferior)[29] A palha também tem uma função muito importante do ponto de vista agrário, uma vez que a manutenção da mesma no campo evita a infiltração da água no solo, prevenindo assim a erosão, além da reciclagem de nutrientes e estocagem de carbono no solo. Entretanto, o excesso da palha no solo pode gerar problemas, tais como, aumento de parasitas, prejuízoao crescimento das plantas e aumento do risco de incêndio. Pesquisas publicadas pelo PROTEC, mostram que mesmo com a retirada de cerca de 50% da palha do campo o restante ainda pode continuar a suprir as necessidades do solo [28-36]. 2.4.Materiais lignocelulósicos. Os materiais lignocelulósicos são fibrosos, formando matrizes complexas constituídas de celulose, um polímero de glicose, hemiceluloses, e outroscompostos. Adicionalmente, essa matriz é impregnada com lignina, a qual pode ser considerada como uma cobertura de resina plástica [10-26]. Esses materiais (glicose, hemilcelulose e lignina) formam a chamada parede celular secundária que é responsável pela resistência mecânica da planta [24]. As paredes secundárias têm composição variável em cada planta, porém consistem dos mesmos materiais, celulose, hemicelulose e lignina. A tabela 1 mostra a quantidade geral, comumente encontrada, na parede celular de plantas, de cada uma dessas moléculas.

28 19 Tabela1-Composição geral da parede secundária [24] Componente Quantidade (%) Celulose 41~45 Hemicelulose 30 Lignina 22~28 Na tabela 2 abaixo, encontra-se os dados da composição da parede celular para a palha de cana-de-açúcar de acordo com a literatura. Tabela 2- Composição da palha de cana segundo Pratto et Al., 2016 Componente Palha in natura (%) Celulose 34,75 ± 0,5 Hemicelulose 24,32 ± 0,7 Lignina 20,17 ± 0,4 Cinzas 8,75 ± 0,3 Proteína 2,68 ± 0,03 Extrativos 10,33 ± 0,3 A figura 1 mostra a composição da parede celular das plantas. Em especial, a relação entre a celulose e a glicose na biomassa.

29 20 Figura 1- Representação da estrutura da parece celular, com foco na celulose e as cadeias de glicose presentes na mesma Celulose A celulose é o composto orgânico mais abundante no planeta, sendo considerado um polímero natural de glicose de alta massa molecular formado de ligações β1,4 glicosídicas, sendo insolúvel em água e o principal componente da parede celular da biomassa vegetal. É encontrada na parede celular das plantas, e de alguns tipos de bactérias [2,26]. Sua estrutura é fibrosa e linear, na qual se estabelecem múltiplas ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila das distintas cadeias de glicose, tornando-as, assim, impenetráveis à água e, consequentemente, insolúveis, dando origem a fibras compactas que constituem a parede celular de vegetais e alguns tipos de bactérias, sendo resistentes a ataques enzimáticos etambém à degradação [10]. O firme alinhamento e as ligações entre essas moléculas de glicose determinam a linearidade e cristalinidade das moléculas de celulose.toda matriz celulósica pode apresentar camadas cristalinas e camadas amorfas, isso depende da organização das fibrilas formadas pelas cadeias de celulose [26-28]. A lignina, outra molécula da classe dos polímeros orgânicos, é muito mais rígida que a celulose. A combinação de microfibrilas de celulose incorporadas na lignina favorece o aumento da força à biomassa. [26] Além disso, a celulose, quando separada dos outros

30 21 constituintes do material lignocelulósico, apresenta uma grande reatividade devido à sua estrutura química e física [10] Hemicelulose A hemicelulose são grupos de polissacarídeos constituídos de vários tipos de açúcares, estando localizadas também, na parede celular da biomassa vegetal [30]. Estes polissacarídeos incluem, substâncias pécticas, β- glucana não celulósica e diversos açúcares, tais como: D- xilose, D-manose, D-glicose, D-galactose e D-galactourônico [2]. Durante a formação da parede celular, a hemicelulose é depositada como um constituinte amorfo que ocupa espaço entre as fibrilas das paredes primária e secundária e então, cada microfibrila pode ser considerada como uma rede de fibrilas elementares de celulose embebidas em uma matriz de hemicelulose e lignina [30]. Esse polímero, depois de removidas as substâncias pécticas, é uma substância solúvel em álcali, tendo um grau muito menor de polimerização quando comparada com a celulose. Aditivos alimentares e outros polímeros são produzidos com hemiceluloses solubilizadas. Após a hidrólise da hemicelulose, a xilose (maior componente da hemicelulose) pode ser convertida em produtos de alto valor agregado, como por exemplo, o xilitol[30-12]. A hemicelulose também pode ser hidrolisada para ser convertida em etanol, porém, por se tratar de um polímero formado por vários tipos de monossacarídeos, pode facilmente sofrer hidrólise ácida se degradando em xilose, arabinose, ácido urônico e furfural. [13-28] Lignina A lignina é um polifenol construído de unidades de fenil-propano(c6-c3). A lignina não tem estrutura cristalina e é considerada um polímero amorfo [30]. Na biomassa vegetal, a lignina está associada juntamente com a celulose e hemicelulose, o que impede a degradação desses materiais, isto é, a lignina confere firmeza e rigidez ao conjunto de fibras de celulose. A lignina é geralmente encontrada entre as microfibilas de celulose, dando a resistência mecânica às plantas, sendo considerada o segundo composto orgânico mais abundante na terra, atrás apenas da celulose. Além da resistência mecânica, a lignina também é a barreira das plantas contra patógenos [30].

31 22 Outro fato importante é que a lignina não é facilmente solúvel na maioria dos solventes existentes, isso ocorre devido ao alto peso molecular da mesma [26]. Devido a isso, a lignina restringe a hidrólise enzimática devido à adsorção de celulases à lignina insolúvel, sendo assim uma limitação da taxa de hidrólise da celulose [7]. 2.5.Hidrólise Enzimática da Celulose A celulose pode ser hidrolisada à glicose após a remoção da lignina. Essa reação de hidrólise pode ser realizada utilizando ácido diluído, ácido concentrado ou enzimas. As hidrólises são afetadas principalmente pela composição da matéria-prima e o pré-tratamento utilizado anteriormente [17]. Embora a hidrólise ácida seja uma alternativa para a hidrólise da celulose, a utilização de ácidos fortes gera problemas devido ao fato desses ácidos serem tóxicos e corrosivos. Logo, é necessário um reator que seja resistente à corrosão. Além do que, é necessário fazer a recuperação desse ácido ao final da hidrólise para que esse processo se torne viável economicamente [17-28]. Ao se utilizar a hidrólise ácida, a fração da hemicelulose se degrada primeiro que a fração da celulose, ficando assim exposta ao meio reacional.caso isso ocorra por um longo período de tempo, pode acarretar a degradação e perda desses açúcares [17]. Na hidrólise enzimática a biomassa é pré-tratada, para facilitar o ataque enzimático, e catalisada por enzimas chamadas de celulases, que são utilizadas como catalisadores para hidrolisar as cadeias de hemicelulose e celulose, formando assim seus açúcares redutores, inclusive a glicose, que é o produto de interesse neste trabalho. Como são utilizadas enzimas, não há formação de subprodutos, devido à especificidade das mesmas. Esse processo tem um alto rendimento, porém é necessária uma quantidade de enzimas considerável para obter uma alta conversão da celulose, elevando assim o custo de produção [17-28]. As celulasessão complexos enzimáticos que atuam de forma sinérgica, compostos por três grupos, as endoglucanases, as celobiohidrolases e as β-glicosidases [11-13]. Essas enzimas são produzidas por microrganismos presentes em matérias celulósicas, como bactérias e fungos [14]. As endoglucanases ou endo-1-4- β-d-glucanases, atuam preferencialmente na região amorfa, quebrando as ligações glicosídeas das moléculas de celulose liberando novos terminais [13-19].

32 23 As celobiohidrolases ou exo-1,4-β-d-glucanases atuam nos terminais gerados pelas endoglucanases agindo tanto na região amorfa quanto na região cristalina, tendo mais eficiência na região cristalina. Além disso, suas ações nos terminais geram as celobioses [13-19]. As β-glicosidases hidrolisam as celobioses em glicose, sendo geralmente as enzimas responsáveis por regulamentar o processo celulolítico, uma vez que as endoglucanases e as celobiohidrolases são inibidas pela celobiose [13-19]. 2.6 Modelo cinético de Michaelis-Menten O modelo de Michaelis-Menten é o mais utilizado para descrever processos enzimáticos com consumo de substratos [35]. A equação de Michaelis-Menten descreve reações enzimáticas ocorrendo em sistemas homogêneos, porém na hidrólise da celulose a reação enzimática ocorre em meio heterogêneo, onde a celulose encontra-se em estado sólido e as enzimas estão dissolvidas em uma fase aquosa.portanto, a utilização desse modelo pode não ser adequada para sistemas heterogêneos, principalmente quando a transferência de massa limita esse sistema. Neste caso, para o estudo de reações enzimáticas,alternativas de modelos cinéticos têm sido propostos [34]. 2.7.Pré-Tratamento Como citado anteriormente, a lignina interfere no rendimento da hidrólise enzimática. A hidrólise sem pré-tratamento chega a ter um rendimento de 20%, enquanto quando utilizado um pré-tratamento esse rendimento sobe consideravelmente, podendo chegar em até 90% [11]. Existem vários tipos de pré-tratamento, e esses podem ser classificados de trêsformas diferentes: pré-tratamentos físicos, como por exemplo, a moagem, os pré-tratamentos físicoquímicos, como por exemplo, a explosão a vapor e os pré-tratamentos químicos, como os prétratamentos alcalino e ácido [15]. Um pré-tratamento deve ser eficaz e viável economicamente, para isso o prétratamento deve ter algumas características, como evitar a degradação de carboidratos, evitar a formação de inibidores dos processos que seguem o pré-tratamento, solubilizar a lignina e a hemicelulose, diminuir a cristalinidade da celulose, apresentar baixo custo operacional e baixo

33 24 consumo energético e tornar a celulose altamente digerível com a finalidade de aumentar seu rendimento e com pouca carga enzimática [28] Pré-tratamento hidrotérmico Essa técnica de pré-tratamento é muito interessante econômica e ambientalmente, devido ao fato de não utilizar materiais químicos e não necessitar de equipamentos altamente resistentes à corrosão, além de remover boa parte da fração hemicelulósica, aumentar a susceptibilidade da celulose à ação enzimática e gerar pouca quantidade de produtos de degradação. Porém esse procedimento não é eficaz na remoção da lignina [14-28]. O pré-tratamento hidrotérmico é feito utilizando água sob pressão de aproximadamente 1,2 MPa e temperatura entre 180 e 230 o C por aproximadamente 15 minutos [14]. O vapor d água penetra na biomassa, causando o fracionamento dos grupos acetil da cadeia de hemicelulose a ácido acético, que vai tornar o processo autocatalítico, atuando como catalisador da reação, promovendo assim a solubilização das hemicelulose e o rompimento das ligações glicosídicas dos polissacarídeos [28] Pré-tratamento alcalino Pré-tratamentos alcalinos são feitos com reagentes químicos com ph básico, como por exemplo o hidróxido de sódio (NaOH) e a amônia (NH 3 ). São excelentes para a remoção da lignina e baixa solubilização em relação à hemicelulose e à celulose quando comparados a outros pré-tratamentos [28]. Este procedimento causa a deslignificação rompendo a estrutura da lignina,além de separar as ligações entre a lignina e os carboidratos presentes na biomassa [15]. O tratamento alcalino não requer reatores resistentes à corrosão e pode ser feito em baixas pressões e temperaturas. Porém alguns reagentes alcalinos são convertidos em sais que podem ser incorporados na biomassa [15-28]. Esse pré-tratamento é muito eficaz na remoção de lignina obtendo uma porcentagem deremoção de até 78% de lignina no pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar com NaOH 1% (1:20 m biomassa /v NaOH ) à 80 o C por 3h [28].

34 Controle Ótimo Na última década, o controle ótimo anda sendo muito utilizado em problemas de otimização na bioengenharia [5].O objetivo do controle ótimo é a obtençãode soluções in silicode problemas de controle e para serem transformadas em ações físicas [5]. Atualmente, a teoria de controle ótimo está muito bem desenvolvida, tornando possível usar critérios de performance. Esta teoria prove soluções ótimas para diversos problemas e uma abordagem sistemática e direta para uma vasta gama de problemas de controle, sendo possível o uso para otimização, porém havendo restrição em relação às variáveis do sistema ( ) [5]. Para se ter um problema de controle ótimo são necessários 2 conjuntos de equações: as equações das variáveis de estado, que são as equações dinâmicas do modelo matemático e as equações diferenciais das variáveis adjuntas. As condições necessárias para otimização são matematicamente expressas pelo Hamiltoniano. As restrições de desigualdade nas variáveis de controle geram o chamado princípio do máximo de Pontryagin. As condições geradas para otimização desses sistemas de otimização dinâmica também provém desse princípio [23-25]. Em um processo com uma variável de controle u(t) no sistema, na qual se deseja determinar o controle ótimo dessa variável. (01) (02) De forma que seja gerada a função de critério de desempenho, que deve ser maximizada ou minimizada, de acordo com as condições do problema (Equação 3) [25]. (03) O problema de controle ótimo pode gerar dois tipos de soluções, sendo elas, as soluções do tipo bang-bang, ou problema de controle tipo bang-bang, e as soluções do tipo arco singular, ou problema de controle singular [23-25].

35 Princípio do Máximo de Pontryagin Em 1962, Pontryagin desenvolveu esse método que permite transformar esse problema em um problema bidimensional de dois pontos de valores de contorno, introduzindo n variáveis adjuntas adicionais. Esse problema então consiste em dois conjuntos de variáveis, as variáveis de processo e as equações diferenciais nas variáveis adjuntas, que são unidas por uma condição final de otimização. Nas variáveis de processo são utilizadas as condições iniciais do processo e nas equações das variáveis adjuntas somente as condições finais. [23-25] Segundo o princípio de Pontryagin para que o controle ótimo de u(t) em,, gere um máximo absoluto do critério de desempenho J (Eq.03) e uma resposta ótima, é necessário o uso de um conjunto de variáveis adjuntas λ(t) que satisfaça as condições [23-25]. (04) (05) (06) Para o caso da Eq.04 e Eq.05 esse tipo de solução representa um problema de arco bang-bang. Para a Eq.06 essa solução será dada derivando parcialmente o hamiltoniano em relação a variável de controle até que a derivada seja nula. Esse tipo de solução representa um problema de arco singular. Neste trabalho, o problema de controle recai numa solução do tipo bang-bang [23-25]. Para a utilização da teoria do controle ótimo, também é necessário gerar as equações das variáveis adjuntas λ(t). (07) O hamiltoniano é definido em função das variáveis do processo e das variáveis adjuntas ( ) (Eq.10). (08)

36 27 Para obtenção das variáveis adjuntas que serão usadas na resolução do problema de controle ótimo, e consequentemente no cálculo do Hamiltoniano, é necessário calcular as condições de transversalidade, definidas pela equação 09. (09) Neste trabalho, a segunda parcela será considerada igual a zero, pois neste trabalho o tempo final ( ) é fixo. Logo, a equação 09será simplificada, como descritona equação 10. (10) A partir da equação 10é possível calcular as restrições de Euler-Lagrange (Eq.11) e assim calcular as equações diferenciais das variáveis adjuntas que serão utilizadas na resolução do problema de controle ótimo. (11)

37 28 Capítulo 3 OBJETIVO GERAL Com base nos conceitos apresentados, o objetivo deste trabalho é otimizar o perfil de alimentação de substrato, palha de cana-de-açúcar, em um reator batelada alimentada, utilizando a teoria do controle ótimo. 3.1 Objetivo Específicos Para poder concluir o objetivo geral alguns objetivos específicos devem ser concluídos, sendo eles, definiri e ajustar a cinética que melhor descreve o processo e caracterizar a palha de cana de açúcar pré-tratada hidrotermicamente e deslignificada.

38 29 Capítulo 4- MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Modelagem do biorreator e Otimização As cinéticas de Michaelis-Menten foram aplicadas às equações de balanço de um reator batelada alimentada para obter as restrições do sistema, representadas pelas equações de 12a 14: (12) (13) (14) Onde: (15) O próximo passo foi a aplicação da teoria do controle ótimo utilizando a equação01, apresentada na revisão. As funções f e g são definidas pelas equações 16e 17e, a variável x pela equação 18: (16) (17) (18)

39 30 A teoria de controle ótimo necessita respeitar algumas condições, como a definição de uma variável de controle (D) e o critério de desempenho J, que foi definido em um tempo final fixo (Equação 19): (19) u = D = Fa lim / V (20) A resolução do algoritmo da simulação das equações do problema de controle ótimo é representada no esquema abaixo. Figura 2- Representação gráfica do algoritmo utilizado na simulação. 4.2 Hidrólise enzimática Material lignocelulósico O Material utilizado para o desenvolvimento do projeto foi a palha de cana-de-açúcar in natura cedida pela Usina Itapirta, situada na cidade de Catanduva, SP. O material foi seco

40 31 em temperaturaambiente, moído e peneirado, obtendo no final uma tamanho de 5mesh(abertura de 4 mm). O material foi estocado em sacos plásticosem freezer à -20ºC para evitar qualquer tipo de contaminação Enzima O complexo enzimático utilizado nos experimentos de hidrólise enzimática foi doado pela Novozymes, cujo nome comercial é dado por Cellic CTec2. Para o rendimento operacional ótimo deste complexo utilizou-se uma faixa térmica de 45 a 50 o C e ph 5,0 a 5,5 (dados retirados do catálogo da Novozymes ) 4.3Procedimento experimental As primeiras etapas realizadas para o tratamento da palha de cana-de açúcar foram: pré-tratamento hidrotérmico da palha de cana-de-açúcar e pré-tratamento alcalino. As amostras pré-tratadas foram submetidas à hidrólise enzimática Pré-tratamento hidrotérmico Antes de se iniciar o pré-tratamento, a moagem da palha de cana-de-açúcarfoi realizada a 18 mesh e aferiu-se a sua umidade. O pré-tratamento hidrotérmico foi realizado em um reator modelo 4532 (Parr Instrument Company, Moline, Illinois, EUA), onde se adicionou uma mistura na proporção de 1:10 de massa de palha seca e massa de água (m palhaseca / m água ), respectivamente, durante 10 minutos a 195ºC e 200 rpm. Estas condições de pré- tratamento foram estabelecidas previamente por SOUZA; CRUZ, 2013 [37]. Após a reação, filtrou-se a fração sólidaerealizou-se a lavagem com água para a remoção dos componentes solubilizados. Após esta etapa de pré-tratamento, as amostras foram separadas para caracterização química Pré-tratamento alcalino da palha de cana-de-açúcar pré-tratada hidrotermicamente Após o pré-tratamento hidrotérmico, as amostras de palha de cana-de-açúcar foram submetidas ao pré-tratamento alcalino em solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4,0% (m/m). Esta etapa foi fundamental para se obter uma deslignificação mais significativa, ou seja, uma maior remoção de lignina da biomassa.

41 32 Este pré-tratamento consistiu em produzir uma suspensão de massa de palha seca em função do volume de NaOH, mantendo-se a proporção de 1:20, respectivamente. A condição de reação utilizada foi: 75 g de palha (base seca) misturadas com 1,5 L de NaOH 4%.A suspensão foi transferida para frascos de Erlenmeyers de 2L e autoclavada por 30 minutos a 121 o C e 1 atm. Finalizada a reação, fez-se sucessivas lavagens com água quente até se obter ph próximo ao ph utilizado na etapa de hidrólise Caracterização da palha de cana-de-açúcar A caracterização química da palha in natura após o pré-tratamento foi realizada em função do teor de umidade, de cinzas e de lignina solúvel e insolúvel. O procedimento adotado para esta caracterização foi descrito anteriormente por Rocha et al. (1997) e Gouveia et al. (2009) Determinação de umidade das amostras de palha A aferição da umidade das amostras de palha foi realizada pelo medidor de umidade modelo ID50 (Marte Balanças e Aparelhos de Precisão Ltda), a 100 C, em modo automático Hidrólise ácida da palha da cana-de-açúcar Em um béquer de 100mL, colocou-se 1,0 g (massa seca) de palha in natura pré-tratada e 10,0 ml de ácido sulfúrico H 2 SO 4 72% (v/v). Esta mistura foi macerada vigorosamente e colocada em um banho termostatizado a 45ºC durante 7 minutos. Adicionou-se à mistura 50,0 ml de água destilada com o intuito de diminuir a velocidade de reação. Este conteúdo foi transferido para um Erlenmeyer de 500 ml e se adicionou 225 ml de H 2 O destilada, obtendo assim uma concentração de 3,0 % de H 2 SO 4. Os Erlenmeyers foram fechados com papel alumínio e autoclavados por 30 min a 121 C. Após o finaldo processo de autoclave, esperou-se até que os Erlenmeyers retornassem à temperatura ambiente. O conteúdo foi filtrado diretamente em um balão volumétrico de 500 ml, usando papel de filtro qualitativo (previamente pesado e seco em estufa a 100 C),sendo que o mesmo teve o seu volume completado com água de lavagem do material retido no filtro.

42 33 A solução contida no balão volumétrico foi armazenada para análise de lignina solúvel. A fração sólida retida no papel filtro foi lavada com 2,0 L de água destilada, tomando-se o cuidado de lavar bem as bordas do papel para posterior determinação de lignina insolúvel e cinzas da lignina. Este método foi utilizado para quantificar os produtos da hidrólise, sendo que o mesmo não foi usado nos experimentos de controle ótimo Determinação de lignina solúvel Uma alíquota de 5 ml da fração líquida do material hidrolisado foi transferida para um balão volumétrico de 100 ml e completado com NaOH 0,098 mol/l. A quantificação da lignina solúvel foi realizada por espectroscopia na região do UV em espectrofotômetro UV-visível Ultrospec A medida de absorbância utilizada foi de 280 nm utilizando cubeta de quartzo. O cálculo da lignina solúvel foi determinado conforme a equação21: (21) Onde: C lig : concentração de lignina solúvel (g/l); A T : absorbância da solução de lignina junto com os produtos de degradação; A pd = c 1.ε 1 +c 2.ε 2 absorbância dos produtos de decomposição dos açúcares (furfural e HMF), cujas concentrações c 1 e c 2 foram determinadas previamente por CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) e ε 1 e ε 2 são as absortividades e valem, respectivamente, 146,85 e 114,00 L g -1.cm Determinação de lignina insolúvel O método de Klason (modificado por Rocha, 1997) foi utilizado para a determinação da quantidade de lignina insolúvel. A fração sólida contida no papel filtro foi transferida para um pesa filtro e colocado em estufa a 105º C até massa constante. A porcentagem de lignina insolúvel foi calculada em relação à massa de amostra seca conforme a equação 22: (22)

43 34 Onde: M lig insol : massa de lignina insolúvel seca; M cinzas : massa de cinzas; M amostra seca : massa da amostra seca Determinação das cinzas da lignina Os materiais resultantes da etapa de determinação da lignina insolúvel foram calcinados em cadinhos de porcelana (previamente calcinados e tarados) a 300 C por 30 minutos e, em seguida, a 800 C por 2 horas. O teor de cinzas da lignina insolúvel foi determinado conforme a equação 23: (23) Onde: % cinzas: percentual em massa de cinzas na lignina; M cinzas : massa de cinzas (diferença entre a massa do cadinho com cinzas e a massa do cadinho vazio); M a : massa da amostra seca Determinação de cinzas totais A determinação das cinzas totais foi realizada calcinando-se 2,0 g de palha em cadinho de porcelana calcinada a 300 C por 30 minutos e, em seguida, a 800 C por 2 horas.o teor de cinzas totais foi determinado conforme a equação 24: (24) Onde: M cinzas totais : diferença entre a massa do cadinho com cinzas e a massa do cadinho vazio; M a : massa da amostra seca Determinação da atividade enzimática total das celulases A determinação da atividade enzimática do complexo enzimático (Cellic CTec2) é uma etapa fundamental antes de emprega-lo nos demais estudos.

44 35 A atividade enzimática das celulases foi determinada seguindo as diretrizes União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC), descrita por Ghose (1987), que se embasa em encontrar a concentração de uma solução de enzima de interesse que libere aproximadamente 2,0 mg de açúcares redutores a partir da hidrólise de 50 mg de papel filtro Whatman n o 1, durante 60 minutos de reação. A medida da atividade enzimática das celulases é dada por atividade em papel filtro de celulose e expressa em unidades de papel filtro- FPU (Filter Paper Units) por volume de enzima. Primeiramente, uma solução estoque de enzima foi preparada em tampão citrato 50 mmol L -1 ph=4,8; a diluição utilizada foi de 1:50- v/v. Quatro diluições sucessivas de enzima foram realizadas partindo da solução estoque 1:50. O controle da análise espectrofotométrica (branco do espectro) foi efetuado adicionando-se em um tubo 1,5 ml de tampão citrato. Para o branco da enzima, cuja função é identificar interferências advindas da enzima, adicionou-se em outro tubo 1,0 ml de tampão de citrato e 0,5 ml da enzima diluída.para cada diluição de enzima foi preparado um branco de enzima com sua respectiva diluição. A adição de 1,0 ml de citrato 50 mmol L-1, ph=4,6, foi realizada em diferentes tubos Folin Wu, juntamente com 0,5 ml de solução de enzima previamente diluída. Os tubos foram colocados em um shaker (Marconi MA-832) sob temperatura de 50 o C. Depois de atingida a temperatura, uma tira de papel filtro Whatman n o 1, de dimensão equivalente a 50 mg (aproximadamente 1,0 x 6,0 cm) foi adicionada a cada tubo (exceto branco do espectro e branco da enzima), de forma que a tira de papel ficasse totalmente submersa pela solução tampão + enzima. Resumindo, os conjuntos de tubos foram preparados como descrito abaixo: Branco do espectro: 1,5 ml de tampão citrato Branco da enzima: 1,0 ml de tampão citrato + 0,5 ml de enzima diluída Amostra: 1,0 ml de tampão citrato + 0,5 ml de enzima diluída + papel filtro Posterior ao tempo de incubação removeram-se os tubos do shaker e adicionou-se 3,0 ml de ácido dinitrosalicílico (DNS), fez-se a agitação destes tubos e colocou-se os mesmos em banho fervente por 5 minutos. Esta etapa é responsável pela desativação da enzima. Em seguida, colocaram-se os tubos em um banho de gelo até que os mesmos retornassem à temperatura ambiente. Por fim, adicionou-se água destilada até o menisco de 25 ml dos tubos e agitou-se até que a solução ficasse bem homogênea. A medida de absorbância foi realizada em um espectrofotômetro (modelo 2000, Pharmacia Biotech) a 540 nm. Para

45 36 evitar a interferência de papéis filtros em suspensão, é recomendada a centrifugação das amostras até total decantação do papel filme. A quantificação dos açúcares redutores liberados durante a reação foi realizada através da construção de uma curva de calibração padrão de glicose (figura 3) em função da absorbância. Diferentes concentrações de glicose foram preparadas partindo de uma solução estoque de 10 g/l -1. As concentrações de 6,7; 5,0; 2,0 e 1,5 g/l -1 foram estudadas. Figura 3- Curva padrão de glicose. Faixa linear de absorbância 0,172 a 0,838, correspondente a faixa de concentração de concentração de glicose de 0,5 a 2,5 g/l. A curva padrão de glicose apresentou sensibilidade de 2,985 g/l e um coeficiente de determinação superior 0,99, sendo efetiva a sua utilização na determinação de açúcares redutores durante a reação. Em diferentes tubos adicionaram-se 1,0 ml de tampão citrato e 0,5 ml do padrão de glicose. A partir desse ponto, seguiu-se o mesmo procedimento utilizado para as amostras. Com a equação da reta ajustada, determinaram-se os valores de glicose liberada em cada amostra. Após o cálculo da concentração de glicose em cada amostra, foi possível realizar a estimativa da concentração de enzima necessária para liberar exatamente 2,0 mg de glicose, a

46 37 figura4 mostra a relação da quantidade de glicose liberada em 0,5 ml vs. logaritmo da concentração de enzima. Figura 4- Curva referente à concentração de glicose em função do logaritmo da concentração de enzima adicionada. A concentração de enzima obtida considerando-se a quantidade de 2,0 mg de glicose liberada é de 0,0016 mg/ml. Com o valor de concentração de enzima obtido, calculou-se a atividade enzimática de acordo com a equação 25: (25) A unidade de FPU é baseada na Unidade Internacional (IU): 1 IU = 1µmol.min -1 de substrato convertido = 0,18 mg.min -1 quando o produto for glicose. A quantidade de glicose liberada (2 mg) por 0,5 ml de enzima em 60 minutos é correspondente a uma atividade enzimática em FPU de:

47 38 A atividade enzimática encontrada foi de 231,05FPU Quantificação dos açúcares redutores totais Açúcares que possuem grupos carbonílicose cetônicos livres, que formam aldeído em soluções básicas, são denominados açúcares redutores. Como exemplos podem ser citados: glicose, maltose, frutose e lactose. A determinação dos açúcares redutores totais foi viável fazendo-se o uso do reagente DNS. Esta metodologia foi previamente descrita por Miller (1959), e se baseia na oxidação do grupo aldeído do açúcar a grupo carboxílico ao mesmo tempo em que o ácido do ácido dinitro 3,5 salicílico se reduz a ácido amino 3,5 nitrosalicílico, em meio alcalino. Na presença de açúcares redutores, o DNS muda sua coloração de alaranjada, para diferentes tonalidades de vermelho-alaranjado, tornando-se possível acompanhar a reação através da medida de absorbância em comprimento de onda de 540 nm. O preparo do reagente DNS foi feito através da dissolução de 5 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico em 100 ml de NaOH (2M). Uma mistura de 150 g de tartarato duplo de sódio e potássio com 250 ml foi realizada separadamente, sendo a mesma aquecida até completa dissolução. Em seguida, as duas soluções foram misturadas e diluídas com água destilada para um volume final de 500 ml. Por fim, aqueceu-se a solução de DNS em banho Maria a 40 o C até que houvesse completa dissolução dos reagentes. A quantificação dos açúcares redutores totais foi realizada de acordo com o procedimento descrito no item Hidrólise enzimática da palha de cana-de-açúcar Para a reação em batelada, as amostras de palha foram previamente pré-tratadas hidrotermicamente, seguida de pré-tratamento alcalino, e depois submetidas à hidrólise enzimática para a conversão de celulose em monômeros de glicose. Todos os experimentos foram realizados em reatores de bancada com controle de temperatura e agitação, com volume de reação de 50 ml. Durante cada ensaio experimental foram retiradas alíquotas e adicionado

48 39 NaOH 0,2 M, na proporção 300 µl NaOH:400 µl amostra, para inativação da enzima. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Para a reação em batelada alimentada, os procedimentos são semelhantes à reação em batelada, com volume inicial de 50 ml,sendo que a alimentação do substrato foi feita de forma manual a cada 30 minutos. Assim como na reação batelada foram retiradas alíquotas e adicionado NaOH 0,2 M, na proporção 300 µl NaOH:400 µl amostra, para inativação da enzima. Capítulo 5- RESULTADOS E DISCUSSÃO O estudo do controle ótimo tem início com a escolha da cinética e seus parâmetros, onde serão usadas as cinéticas propostas, por Pratto et al., (2016)[28]. Das cinéticas propostas duas foram selecionadas para simulações e ajustes de parâmetros. Ambas as cinéticas foram escolhidas pelo fato de serem propícias na utilização da abordagem escolhida da teoria clássica do controle ótimo, devido a suas formulações matemáticas, onde a variável S (substrato) está explícita em ambas as equações.a tabela 3 apresenta as cinéticas de Michaellis-Menten utilizadas. Tabela 3- Cinéticas de Michaelis-Menten selecionadas para avaliação Michaelis-Menten pseudo- homogênico Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose Onde: R- Modelo cinético de Michaelis-Menten; S- Concentração de glicose potencial em função do tempo; P- Concentração de Produto em função do tempo; k-constante de velocidade aparente; e- Concentração de enzimas; Km- Constante de Michaelis-Menten, e Ki- Constante de inibição pelo produto. Para uma boa comparação entre as cinéticas, ambas foram simuladas e os resultados das simulações comparados com resultados obtidos experimentalmente.

49 40 A parte experimental para ajuste de parâmetros cinéticos e validação experimental da estratégia de alimentação descrita neste trabalho foi realizada pela aluna de Doutorado em Engenharia Química do PPG-EQ/UFSCar, Bruna Pratto, com a colaboração deste Mestrando. Para os experimentos em batelada simples, a palha de cana-de-açúcar, foi primeiramente, prétratada, deslignificada e caracterizada em relação a sua composição. A tabela 4 mostra os dados obtidos da caracterização. Tabela 4 Caracterização da palha pré-tratada hidrotermicamente e deslignificada. Componentes Teor (%) Celulose 71,37 Hemicelulose 7,09 Lignina 21,54 Os experimentos foram realizados em triplicata e a média dos valores do teor de de celulose, hemicelulose e lignina foram usados nas simulações e nos experimentos em batelada. As condições operacionais utilizadas nos experimentos em batelada são apresentadas na tabela 5. Tabela 5- Condições operacionais dos experimentos em batelada simples. Parâmetros Valores Temperatura (ºC) 50 ph 5 Agitação (rpm) 200 Atividade enzimática (FPU/L) 230 Conc. de enzima (FPU/g celulose ) 20 Conc. de sólidos (%) 5 Umidade (%) 75,97 Volume total (ml) 50

50 41 A tabela 5 ilustra as condições operacionais dos experimentos em batelada, algumas dessas condições também foram usadas como condições iniciais para os experimentos em batelada alimentada que será abordado mais a diante. As condições de temperatura, ph e agitação são as condições ótimas na hidrólise pela enzima utilizada. Os experimentos em batelada simples foram realizados em duplicata, e após o fim dos mesmos os dados foram comparados com os dados gerados pela simulação para a determinação da cinética que melhor descreve o processo de hidrólise enzimática. Os dados obtidos pelos experimentos em batelada são apresentados na tabela 6. Tabela 6- Dados obtidos nos experimentos em batelada. Tempo de hidrólise (h) Média Desvio 0 0,000 0, ,693 1, ,397 0, ,808 0, ,836 1, ,818 2, ,977 1, ,742 0, ,440 4,252 Os dados apresentados na tabela 6 representam o processo de hidrólise enzimática em um processo batelada onde a coluna média é o valor da concentração de glicose obtida nos reatores, descontando o valor do branco para minimizar os erros, denso que e o branco é o valor para um reator com as mesmas condições dos reatores A e B, porém sem a adição de substrato. O tempo apresentado representa o momento onde cada amostra foi coletada no reator e foi interrompido em 72h, pois não houve uma grande alteração da concentração de glicose em relação à amostra coletada em 48 horas. Para a simulação foram utilizados como parâmetros os dados das cinéticas escolhidas e apresentados por Pratto et al., (2016). Esses parâmetros são apresentados na tabela 7[28].

51 42 Tabela 7- Parâmetros das cinéticas obtidas por Pratto et al., (2016)[28] Michaelis-Menten pseudohomogênico Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose V m = 0,214± 0,003(g. L-1.min -1 ) K m =9,65± 1,51(g.L -1 ) K i =0,8± 0,08(g.L -1 ) As simulações usaram os parâmetros apresentados na tabela 7, onde Vm representa a multiplicação das constantes k e e dos modelos, e ambos os modelos têm os mesmos valores para Vm e Km. A curva da concentração do produto em relação ao tempo usando a cinética de Michaelis-Menten pseudo-homogênea, comparado com a curva obtida experimentalmente, é apresentada na figura 5. No eixo y tem-se a concentração de glicose em g/l e no eixo x tem-se o tempo em minutos.

52 43 Figura 5- Comparação entre o modelo cinético de Michaelis- Mentem pseudo- homogêneo simulado e os dados experimentais em batelada, nas condições, Temperatura=50ºC, ph=5,0, concentração de enzima =230 FPU/L e Volume=50 ml Analisando a figura 5, pode-se observar que os perfil simulado têm diferenças em relação ao perfil obtido obtido experimentalmente. Porém a concentração final de glicose é similar em ambos os casos. Essa cinética se mostra inadequada principalmente entre os tempos de 500 minutos (8 horas e 15 minutos) e 3000 minutos (50 horas). Esse fato pode ser explicado devido a cinética não usar a constante de inibição, essa cinética de Michaelis- Mentem pseudohomogêneaatinge a conversão máxima (45,95 g/l) rapidamente, em aproximadamente 1500 minutos (25 horas). Logo, pode-se concluir que a inibição pelo produto é uma característica presente e muito importante no processo de hidrólise enzimática, não podendo ser descartada nas simulações em batelada simples. Essa importância da constante de inibição fica ainda mais clara ao analisar a figura 6, que apresenta a comparação entre os dados experimentais e os dados simulados para a cinética de Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose.o eixo y expressa a

53 44 concentração de glicose em g/l e o eixo x expressa o tempo em minutos. Figura 6-Comparação entre o modelo cinético Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose simulado e os dados experimentais. Nas condições, Temperatura=50ºC, ph=5,0, concentração de enzima =230 FPU/L e Volume=50 ml Na figura 6, nota-se que ambos os perfis são similares, chegando até a se sobrepor em alguns momentos. Ao analisar a figura 6, pode-se também concluir que a cinética de Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose descreve a hidrólise enzimática de forma mais precisa que o modelo de Michaelis- Menten pseudo- homogênea. Além de obter uma conversão final também muito similar, a conversão final simulada foi de 45,36 g/l de glicose e a conversão experimental foi de 45,44 g//l de glicose. A principal diferença entre os perfis simulados apresentados nas figuras 5 e 6, é devido à inibição pelo produto, pois o modelo de Michaelis- Menten pseudo- homogêneo não usa uma constante para a inibição, fazendo a mesma inadequada para os estudos usando a teoria clássica do controle ótimo. Vale ressaltar que devido a que os valores dos parâmetros de Pratto et al., (2016) terem sidoobtidos a partir de experimentos em frascos agitados, foi realizado um ajuste manual fino ( fine-tuning ) nos parâmetros da cinética escolhida,para que a mesma fosse mais

54 45 compatível com os dados obtidosexperimentalmenteem biorreator de bancada. A figura 7 mostra à comparação entre a simulação e os dados experimentais após o ajuste (fine-tuning). Figura 7-Comparação entre o modelo cinético Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose simulado e os dados experimentais, após o ajuste dos parâmetros. Nas condições, Temperatura=50ºC, ph=5,0, concentração de enzima =230 FPU/L e Volume=50 ml. Com o ajuste feito, os parâmetros estão definidos para a utilização na simulação para o reator batelada alimentado.esses parâmetros são apresentados na tabela 8. Tabela 8- Parâmetros cinéticos ajustados utilizados na simulação Parâmetros cinéticos Valores V m (g.l -1.min -1 ) 0,208 k m (g/l) 9,65 k i (g/l) 1,85 Na tabela 8 são apresentados os parâmetros ajustados utilizando a cinética de Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose para a simulação de um reator

55 46 batelada alimentada. Onde: k= Constante de velocidade aparente; k m = Constante de Michaelis-Menten; k i = Constante de inibição pelo produto; e 0 = carga enzimática. Com a cinética a ser utilizada definida e os parâmetros ajustados, o estudo do controle ótimo pode ser iniciado. A figura 8mostra o perfil de alimentação do substrato gerado usando a cinética de Michaelis-Menten com inibição competitiva por glicose e a teoria clássica do controle ótimo. A resolução computacional das equações geradas pela teoria de controle ótimo foi realizada usando o software MatLab. O eixo y representa a quantidade de massa de palha alimentada em g (base seca), o eixo x representa o tempo em minutos. Figura 8- Perfil simulado de alimentação de substrato no reator, obtido aplicando a teoria clássica do controle ótimo. Concentração inicial de enzima e(0) = 900 FPU e concentração inicial de glicose potencial de 44 g glicose_potencial.l solução -1. Através da Figura 8, pode-se observar que o perfil de alimentação de substrato calculado na simulação apresenta um comportamento exponencial, com uma alimentação de substrato em um curto espaço de tempo (t= 45,5h ou 2730 min) em comparação com o tempo total da batelada. A alimentação é interrompida pois o volume máximo de operação do reator (V=0,6 L) é atingido, tendo assim início a operação em batelada. O perfil de alimentação para a validação experimental foi baseado nos dados apresentados na Figura 8. É importante ressaltar que os valores numéricos apresentados nessa

56 47 Figura correspondem à quantidade de palha pré-tratada seca e, portanto, para a utilização desses dados foi feita a correção pela umidade do substrato no momento da adição ao reator, como sitado no tópico 4.3.4, onde a umidade foi medida e somada ao resultado gerado pela simulação (figura 8) para a correção da massa a ser alimentada no reator. Nos ensaios experimentais a alimentação ocorreu de acordo com a figura 8 usando a correção de umidade citada nos procedimentos experimentais, sendo o substrato alimentado num intervalo de 0,5 hora. Os experimentos de validação foram feitos em triplicata e seguindo as condições apresentadas na tabela 8 e o perfil de alimentação apresentado na figura8. Ovalor máximopara a variável de controle D, foi de 0,91x10-3 min -1, e o valor mínimo foi de D=0 min -1. Os reatores foram montados como representados na figura 8. Figura 9- Montagem dos reatores no início da operação de validação. Como observado na figura 9, houve a montagem de três reatores no início da operação em batelada alimentada, cuja finalidade foi a validação experimental da estratégia de controle ótimo. As medidas foram geradas em triplicatas. A figura 10 apresenta a comparação entre a concentração de produto simulada usando a teoria do controle ótimo e aobtida através dos experimentos para a validação da estratégia,