Introdução. Bombas de efluxo: características gerais, importância e inibidores. Introdução. Caracterização. Caracterização

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1 Curso de Pós-Graduação em Microbiologia BMM 5753 Bacteriologia de Anaeróbios O que são bombas de efluxo e qual sua função na célula bacteriana? Bombas de efluxo: características gerais, importância e inibidores Quais são as famílias de bombas de efluxo relacionadas com a resistência aos antimicrobianos? Dra. Viviane Nakano Família MFS (Piddock, 2006) MSF: Major Facilitator Superfamily ABC: ATP Binding Cassette SMR*: Small Multidrug Resistance RND*: Resistance Nodulation Division MATE*: Multidrug and Toxic Compound Extrusion * Exclusiva em procariotos Procariotos e Eucariotos gram positivas gram negativas (MFS+Canal ME) Efluxo realizado por força próton motiva (antiporte) * Membrana Citoplasmática Família MFS * Transportadores transmembrânicos e tipos de transporte Procariotos e Eucariotos gram positivas gram negativas (MFS+Canal ME) Efluxo realizado por força próton motiva (antiporte) Transporta açúcares, metabólitos e drogas S. aureus (NorB) e B. subtilis (LmrB) E. coli (EmrAB-TolC/EmrKY-TolC) 1

2 Superfamília ABC Procariotos e Eucariotos Duas membranas hidrofóbicas e duas hidrofílicas Efluxo realizado pela hidrólise de ATP Transporta toxinas, metabólitos e drogas L. lactis (LmrCD) e S. aureus (AbcA) E. coli (MacAB-TolC) Família SMR Menor sistema de efluxo Transporta drogas catiônicas Efluxo realizado por força próton motiva S. marcescens (SsmE) e S. aureus (SepA) Humanos agentes tumorais Família MATE Topologia da membrana similar MFS Efluxo realizado por força próton motiva e gradiente de íons sódio Transporta detergentes e drogas S. aureus (MepA) e H. influenza (HmrM) Resistance Nodulation Division (RND) K. pneumoniae (AcrABR) P. aeruginosa (MexAB-OprM) Família RND Usam o gradiente de prótons para forçar o efluxo E. coli (AcrAB-TolC) A. baumannii (AdeIJK) Transporta moléculas lipofílicas e anfifílicas Responsável pela tolerância de bactérias a solventes N. gonorrhoeae (FarAB-MtrE) (Poole, 2008) P. aeruginosa (MexCD-OprJ) A bomba está divida em três partes P. aeruginosa (MexXY-OprM) S. enterica sorovar Typhimurium (AcrAB-TolC) P. aeruginosa (MexEF-OprN) 2

3 TolC = OMF (outer membrane factor) AcrA = MFP (Membrane fusion protein) Mex = Efluxo múltiplo Opr = Proteína de membrana externa Acr = Acriflavina Membrana Externa TolC = Tolerância a colicina TolC Sentido do efluxo AcrA AcrB Membrana Interna Modelo de bomba de efluxo RND de Escherichia coli (Piddock, 2006) Modelo de bomba de efluxo RND de Pseudomonas aeruginosa Comunicação com o periplasma Cada um dos três componentes é essencial para o efluxo da droga e a ausência de um deles pode comprometer todo o funcionamento do complexo. AcrB (Nikaido, 2009) TolC Escherichia coli TolC (Eswaran et al.,, 2004) (Koronakis et al.,, 2004) 3

4 Bomba AcrAB-TolC TolC AcrA 4º. Componente???? YajC (associação com AcrB) AcrB (Recio-Fernandez et al.,, 2004) (Tornroth-Horsefield et al.,, 2007) Regulação (Piddock, 2006) Regulação Regulador MFP Transportador OMP Anaeróbios E. coli sistema AcrAB-TolC: Repressor: AcrR Regulador Global: MarA, SoxS, Rob (Bacteroides MarA-like) 4

5 Bombas MATE foram encontradas em Bacteroides thetaiotaomicron (Miyamae et al., 2001) bexa (Bacteroides exporter A): similaridade NorM Vibrio parahaemolyticus orf1: proteína de inserção de membrana externa orfx: não tem função aparente no sistema de efluxo (Miyamae et al., 2001) Primeira bomba RND foi em Porphyromonas gingivalis XepCAB (Ikeda e Yoshimura, 2002) pbrbt20: orfx, orf1, orf2(bexa) pbrbt201: orf1, orf2 pbrb201me: orf2 pbrbt2012: orf1 (Miyamae et al., 2001) Bombas MATE foram encontradas em Clostridium difficile (Dridi et al., 2004) (Ikeda e Yoshimura, 2002) 5

6 (Dridi et al., 2004) (Dridi et al., 2004) Primeiro relato de bombas RND em B. fragilis foi em 2005 (Ueda et al.) bombas RND (BmeABC) bme (Bacteroides fragilis multidrug efflux) (Ueda et al., 2005) Membrana Externa 16 genes bmeabc são expressos constitutivamente Bombas podem estar associadas com resistência intrínseca TolC = BmeC Sentido do efluxo Modelo de bomba de efluxo RND de Escherichia coli AcrA = BmeA AcrB = BmeB Membrana Interna (Piddock, 2006) CARACTERIZAÇÃO Aumento da expressão das bombas podem aumentar a resistência a múltiplos antibióticos 6

7 Clonagem + Expressão E como são realizados os estudos de análise das bombas de efluxo? Srikumar et al. (1998) - P. aeruginosa MexAB-OprM e MexCD-OprJ 1º experimento Clonagem + Expressão MexAB-OprM e MexCD-OprJ = resistência ou Construção de cepas mutantes = Perfil de substrato e de resistência 2º experimento Hospedeiro susceptível comportamentos MexAB = Não houve alteração da susceptibilidade MexCD = resistência Clonagem + Expressão Família RND pstv28 plasmídio/vetor psec38: sedxy psec32: sedy Clonaram: E. coli KAM 32 (Δ acrb, Δ ydhe) (Chen et al., 2003) Clonagem + Expressão KAM3: (ΔacrB) pbet5: ebra, ebrb Família SMR (Masaoka et al., 2000) 7

8 Clonagem + Expressão paef82: efra, efrb Família ABC (Lee et al., 2003) Construção de cepas mutantes (Lee et al., 2003) Construção de cepas mutantes bme 5, 7 e 15 - sobre pressão antibióticos são reguladas - MDR outras bombas situações particulares podem ser reguladas (Pumbwe et al., 2006) 8

9 Família RND (Martinez et al., 2009) Virulência Bacteriana Homeostase/Detoxificação Virulência Bacteriana Homeostase/Detoxificação Homeostase/Detoxificação Virulência Bacteriana Fitobactérias: Erwinia amylovora Erwinia chrysanthemi Agrobacterium tumefaciens 9

10 Virulência Bacteriana Homeostase/Detoxificação Virulência Bacteriana Homeostase/Detoxificação Iniciou com a resistência a antibióticos Controle da expressão de genes em resposta a densidade celular e aos fatores ambientais. Envolve a produção e a detecção de moléculas sinalizadoras chamadas de autoindutoras (ex.: N-acil homoserina lactonas) E. coli B. fragilis Consequência da atividade antropogênica Mas esse mecanismo não seria recente, talvez uma adaptação? Inibidores Pagés e Amaral.,

11 Inibidores Inibidores Clorpromazine Redução da expressão de componentes da bomba. Competem com o antibiótico pelo sítio de ligação na bomba de efluxo. Inibidores Perspectivas Novas Tetraciclinas By-passing a atividade do efluxo Novas Fluoroquinolonas Novos macrolídeos Causam colapso no sistema de energia da bomba. Maiores estudos sobre inibidores Bloqueadores dos canais de Membrana (TolC) 11