GISELE APARECIDA FIDELIS

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1 GISELE APARECIDA FIDELIS Estudos citogenéticos em peixes da família Sternopygidae (Pisces, Gymnotiformes) da planície de inundação do alto rio Paraná Maringá Paraná - Brasil MAIO

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3 GISELE APARECIDA FIDELIS Estudos citogenéticos em peixes da família Sternopygidae (Pisces, Gymnotiformes) da planície de inundação do alto rio Paraná Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de Mestre. Maringá Paraná - Brasil MAIO

4 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) F451e Fidelis, Gisele Aparecida Estudos citogenéticos em peixes da família Sternopygidae(Pisces, Gymnotiformes) da planície de inundação do alto rio Paraná / Gisele Aparecida Fidelis. Maringá, PR : [s.n.], f. : il. color. Orientador : Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, Sternopygus macrurus - Citogenética - Rio Paraná. 2. Eigenmannia aff.trilineata (Sternopygidae, Gymnotiformes) - Citogenética - Rio Paraná.I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento.II. Título CDD 21.ed Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte (A autora)

5 Segue o teu destino, Rega as tuas plantas Ama as tuas rosas, O resto é a sombra De árvores alheias. Fernando Pessoa. ii

6 Dedico aos meus pais, Valente Antônio Fidelis e Marlene Roncaglia Fidelis, pelo apoio incondicional durante toda esta caminhada. iii

7 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, que me guia em todos os momentos. Aos meus irmãos, Carlos e Valmir (in memorian) e a todos os meus familiares que sempre torceram por mim. apoio. Ao meu orientador, Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior, pela orientação e À Prof.ª Dr.ª Ana Luiza de Brito Portela Castro pela excelente co-orientação, e à Prof.ª Dr.ª Isabel Cristina Martins dos Santos, pela atenção e ensinamentos prestados. Aos membros da banca examinadora: Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior (orientador, UEM), Prof.ª Dr.ª Lucia Giuliano Caetano (UEL) e Prof.ª Dr.ª Ana Luiza de Brito Portela Castro (UEM) pelas sugestões e críticas, que contribuíram para o enriquecimento deste trabalho. Ao Prof. Dr. Hélio Conte, por ter despertado em mim o interesse pela pesquisa. Aos colegas que fizeram ou fazem parte do Laboratório de Citogenética de Peixes da UEM: Alain, Ricardo, Édner, Tiago, Diego, Paulo, Rafael, Lana, Kátia, Letícia, Suzana (a macrófita) e principalmente à Ana Paula, Alexandre e Fernanda, pela paciência e atenção sempre que precisei de ajuda. Aos técnicos, Soninha e Leonardo e à auxiliar de laboratório mais atenciosa que já conheci, Maria José. À Valéria, pela amizade adquirida neste período e pelos momentos de estudo e trabalho que dividimos. iv

8 A todos os amigos e amigas que conquistei durante minha vida, especialmente Érica, Camila, Cris e Thaís. Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento pela oportunidade deste trabalho se tornar realidade. bolsa concedida. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela E a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho. v

9 BIOGRAFIA Gisele Aparecida Fidelis, natural de Doutor Camargo, Paraná, concluiu o curso de Técnico em Contabilidade no ano de Ingressou no curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá em 1998, graduando-se em Licenciatura no ano de Em 2003, iniciou o curso de Mestrado no Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento. vi

10 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... ix RESUMO... x ABSTRACT... xii 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA CARACTERÍSTICAS GERAIS DA ORDEM GYMNOTIFORMES CARACTERÍSTICAS GERAIS DA FAMÍLIA STERNOPYGIDAE ESTUDOS CITOGENÉTICOS Variabilidade cromossômica As regiões organizadoras de nucléolos (NORs) MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL MÉTODOS Indução de mitoses Preparação dos cromossomos mitóticos Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda C) Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (NORs) Detecção das regiões ricas em bases GC Hibridação fluorescente in situ (FISH) vii

11 Estudos cariotípicos Medidas cromossômicas RESULTADOS E DISCUSSÃO ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM Sternopygus macrurus ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM Eigenmannia aff. trilineata CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS viii

12 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Exemplar das espécies: (a) Sternopygus macrurus; (b) Eigenmannia aff. trilineata Figura 2. Mapa da planície de inundação do rio Paraná Figura 3. (a) Cariótipo de Sternopygus macrurus; (b) Caracterização da NOR utilizando Giemsa, banda C e Ag-NOR Figura 4. Cromossomos metafásicos de Sternopygus macrurus (a) bandeamento C; (b) Ag-NOR; (c) hibridação fluorescente in situ; (d) mitramicina Figura 5. Cariótipo de Eigenmannia aff. trilineata (a) fêmea; (b) macho Figura 6. Cromossomos metafásicos de Eigenmannia aff. trilineata (a) Ag-NOR; (b) hibridação fluorescente in situ ix

13 RESUMO FIDELIS, Gisele Aparecida. M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, Maio de Estudos citogenéticos em peixes da família Sternopygidae (Pisces, Gymnotiformes) da planície de inundação do alto rio Paraná. Professor Orientador: Horácio Ferreira Júlio Júnior. Professores Conselheiros: Ana Luiza de Brito Portela Castro e Isabel Cristina Martins dos Santos. Estudos citogenéticos foram realizados em Sternopygus macrurus e Eigenmannia aff. trilineata (Sternopygidae, Gymnotiformes) coletados na planície de inundação do alto rio Paraná. A análise cariotípica em S. macrurus mostrou número diplóide 2n=46 cromossomos para machos e fêmeas. A fórmula cariotípica é composta por 30M+16SM com NF=92. Esta espécie apresentou sistema de NOR simples, com marcação na posição terminal do braço curto do maior par de cromossomos metacêntricos, detectado através da técnica de impregnação pela prata (Ag-NOR) e hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda de DNAr 18S. O padrão de banda C mostrou marcações evidentes na região adjacente à constrição secundária e fracas marcações nas regiões centroméricas de alguns cromossomos do complemento. A análise da coloração com mitramicina (MM) mostrou que as regiões organizadoras do nucléolo são MM positivas, indicando que esta região é rica em pares de bases GC. Em Eigenmannia aff. trilineata, a análise citogenética mostrou cariótipo com 2n=36 cromossomos para machos e fêmeas e presença de mecanismo sexual simples do tipo XX/XY. A fórmula cariotípica é composta por 8M+4SM+2ST+22A com NF=50 para fêmeas e 9M+4SM+2ST+21A com NF=51 para machos. As técnicas Ag-NOR e FISH mostraram um par de cromossomos acrocêntricos marcados na região terminal do braço curto, mostrando heteromorfismo de tamanho para este segmento. Os dados citogenéticos obtidos e comparados com os descritos para outras populações leva a concluir que S. macrurus apresenta padrão cariotípico conservado, indicando uma x

14 condição ancestral para o grupo. Em Eigenmannia aff. trilineata o número diplóide e fórmula cromossômica encontrados na população analisada são distintos para este gênero, indicando fortemente a existência de uma nova espécie na planície de inundação do alto rio Paraná. PALAVRAS-CHAVE: Sternopygidae, Gymnotiformes, cariótipo. xi

15 ABSTRACT FIDELIS, Gisele Aparecida. M. Sc. State University of Maringá, May, Cytogenetic studies in fishes from family Sternopygidae (Pisces, Gymnotiformes) from upper Paraná River floodplain. Adviser: Horácio Ferreira Júlio Júnior. Co-Advisers: Ana Luiza de Brito Portela Castro and Isabel Cristina Martins dos Santos. Cytogenetic studies were carried out in Sternopygus macrurus and Eigenmannia aff. trilineata (Sternopygidae, Gymnotiformes) from upper Paraná River floodplain. Karyotipical analysis in S. macrurus showed diploid number 2n=46 chromosomes for males and females. The karyotipic formulae is composed by 30M+16SM with FN=92. This species presented simple NOR system with a marker in the terminal region of the short arm of the largest metacentric pair of chromosomes, detected by silver staining (Ag- NOR) and fluorescent in situ hybridization (FISH) with 18S rdna gene probes. The C- banding pattern showed evident marks in the area adjacent to the secondary constriction and weak marks in the centromerics areas of some chromosomes of the complement. Mitramycin staining (MM) analysis showed that nucleolus organizer region is MM positive, indicating that this region is GC-rich. In Eigenmannia aff. trilineata the cytogenetic analysis showed karyotype with 2n=36 chromosomes for males and females and presence of XX/XY sex chromosome system. The karyotipic formulae is composed by 8M+4SM+2ST+22A with FN=50 for females and 9M+4SM+2ST+21A with FN=51 for males. Ag-NOR and FISH techniques showed a pair of acrocentric chromosomes marked in the terminal area of the short arm showing size heteromorphism for this segment. The cytogenetic data obtained and compared with previous reports for other populations leads to conclude that S. macrurus presents karyotipical conserved pattern indicating an ancestral condition for the group. In Eigenmannia aff. trilineata the diploid number and xii

16 chromosome formulae found in the analyzed population are distinct for this genus indicating strongly the existence of a new specie from upper Paraná River floodplain. Key-Words: Sternopygidae, Gymnotiformes, karyotype. xiii

17 1. INTRODUÇÃO A ictiofauna de água doce da América do Sul e Central é uma das mais diversificadas e ricas do mundo, estimando-se cerca de espécies, o que representa aproximadamente 25% de toda a diversidade de peixes do planeta (VARI e MALABARBA, 1998). Na bacia do alto rio Paraná, são estimadas mais de 250 espécies para a ictiofauna somente no trecho brasileiro, mas não existe consenso acerca do status taxonômico de muitas espécies listadas (AGOSTINHO e JÚLIO JÚNIOR, 1999). De acordo com a revisão de OLIVEIRA et al. (2000), são conhecidos os números diplóides e/ou haplóides para 921 espécies, 252 gêneros e 44 famílias em peixes Neotropicais das águas continentais, com registros de grande diversidade cariotípica. A citogenética de peixes tem contribuído bastante, principalmente nos últimos anos, como uma ferramenta citotaxonômica utilizando cariótipos para identificação de espécies. O estudo citogenético pode fornecer dados cromossômicos que permitem separar espécies morfologicamente muito semelhantes, propor a existência de espécies não descritas ou detectar variações cromossômicas populacionais e, além disso, é possível ter evidências de grupos citogenéticamente conservativos e não conservativos. A realização de estudos citogenéticos na planície de inundação do alto rio Paraná é útil quanto à caracterização das espécies fornecendo subsídios para identificação das mesmas, uma vez que nessa região existe um grande número de espécies que ainda não foram descritas, e outras com descrição não confiável que dificultam muitos trabalhos sobre biologia e ecologia de peixes. Diante disso, este trabalho tem por objetivo caracterizar cromossômicamente algumas espécies da família Sternopygidae, ordem Gymnotiformes, que ocorrem na planície de inundação do alto rio Paraná, com ênfase em Sternopygus macrurus e Eigenmannia aff. trilineata. 1

18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DA ORDEM GYMNOTIFORMES Os Gymnotiformes são peixes de água doce, originários da América do Sul, com espécies que invadiram posteriormente a América Central, e constituem um grupo interessante do ponto de vista científico pela sua capacidade eletrogênica e de eletrolocalização, apresentando órgãos geradores de eletricidade localizados na pele que lhes permite formar um campo elétrico ao redor do corpo (MAGO-LECCIA, 1978). As descargas elétricas da maioria das espécies de Gymnotiformes atingem apenas algumas frações de volts e são utilizadas na detecção de objetos e na comunicação intraespecífica. Dessa forma, qualquer objeto ou animal que penetre nesse campo provocando distorção é detectado imediatamente. A amplitude e freqüências dos pulsos elétricos são típicas de cada espécie e estão relacionadas com o reconhecimento sexual entre os indivíduos desta ordem (HOPKINS, 1974). As espécies da ordem Gymnotiformes apresentam severas modificações na forma do corpo em relação aos outros grupos de peixes, sendo desprovidos de nadadeiras dorsal e ventral e a nadadeira caudal está ausente em quase todas as espécies, exceto nos membros da família Apteronotidae. A nadadeira peitoral tem a forma semelhante a de outros peixes, mas a nadadeira anal é muito longa, com mais de 100 raios, podendo ou não alcançar o final da cauda e a abertura anal está localizada na porção anterior do corpo, abaixo da inserção das nadadeiras peitorais. A presença da nadadeira anal muito extensa facilita seu movimento na água através de ondas de contração que os permitem nadar para frente e para trás com igual facilidade. O corpo é coberto por escamas ciclóides delgadas, que podem estar ausentes na região antero - dorsal ou estarem restritas à cauda (LOWE- McCONNEL, 1975). 2

19 De acordo com MAGO-LECCIA (1994), os Gymnotiformes se alimentam basicamente de pequenos animais aquáticos como microcrustáceos e insetos (particularmente larvas de Diptera), porém, as espécies que alcançam um porte maior como Electrophorus e Sternopygus são piscívoras. MAGO-LECCIA (1978) propôs pela primeira vez, um sistema classificatório com seis famílias para a ordem Gymnotiformes designadas como Sternopygidae, Gymnotidae, Apteronotidae, Rhamphichthyidae, Hypopomidae e Electrophoridae. Segundo AGOSTINHO et al. (1997), na planície de inundação do alto rio Paraná ocorrem peixes de todas as famílias desta ordem, exceto Electrophoridae CARACTERÍSTICAS GERAIS DA FAMÍLIA STERNOPYGIDAE As espécies da família Sternopygidae possuem múltiplas fileiras de dentes viliformes e pequenos em ambas as mandíbulas e os olhos apresentam diâmetro igual ou maior que a distância entre as narinas. Uma importante distinção morfológica entre os gêneros Sternopygus e Eigenmannia se refere à presença de margem orbital livre em Sternopygus e olho sem a margem orbital livre, ou seja, o olho fica coberto pela pele da cabeça em Eigenmannia (MAGO-LECCIA, 1978). Segundo AGOSTINHO et al. (1997), nesta família, apenas os gêneros Sternopygus e Eigenmannia ocorrem na planície de inundação do alto rio Paraná, sendo coletadas as espécies S. macrurus, E. virescens, E. trilineata e outra muito semelhante a E. virescens denominada Eigenmannia sp., sugerindo que nesta região podem ocorrer várias espécies desta família (AGOSTINHO e JÚLIO JÚNIOR, 1999). Estas espécies habitam lagoas da planície de inundação com cobertura de macrófitas flutuantes, principalmente Eichhornia azurea e E. crassipes. Apresentam 3

20 hábito noturno e durante o dia permanecem escondidas entre as raízes dessas plantas ou em cavidades da margem. Os peixes do gênero Sternopygus são popularmente conhecidos como espadinha e os do gênero Eigenmannia como tuvira ou sarapó, os quais são utilizados como isca pelos pescadores, além de serem explorados como peixes ornamentais no comércio de aquários ESTUDOS CITOGENÉTICOS Variabilidade Cromossômica Os peixes da ordem Gymnotiformes apresentam uma grande variação de números cromossômicos. Em estudos iniciais na família Gymnotidae realizados por HINEGARDNER e ROSEN (1972), foi relatado apenas o número cromossômico haplóide de Gymnotus carapo como n=19. Contudo, FORESTI et al. (1981) encontraram o número diplóide de 2n=52 e análises cariotípicas posteriores realizadas nesta espécie por FORESTI et al. (1984) indicaram ampla variabilidade no número de cromossomos, com variação entre 2n=42 até 2n=54 cromossomos, além de apresentar diferenças na morfologia cromossômica. Estas informações já sugeriam a possível existência de espécies não descritas, as quais ainda estavam sendo consideradas como Gymnotus carapo. Posteriormente, ALBERT et al. (1999) realizaram comparações ao nível morfológico, molecular, citogenético e dos padrões de descargas dos órgãos elétricos entre as espécies do gênero Gymnotus. Os dados obtidos por estes autores mostraram que G. silvius apresenta número diplóide de 2n=40 sendo descrita como uma nova espécie para este gênero, pois difere de G. carapo (2n=54), G. inaequilabiatus (2n=52) e G. pantherinus (2n=52). 4

21 A variabilidade cariotípica entre os Gymnotiformes também é encontrada na família Sternopygidae. Análises cromossômicas em Eigenmannia virescens realizadas por ALMEIDA-TOLEDO (1978) revelaram variação no número diplóide de 2n=38 até 2n=40 e Eigenmannia sp. com 2n=28 até 2n=32, em exemplares da Bacia Amazônica e do Paraná. Além disso, em uma população de Eigenmannia sp. proveniente da Bacia Amazônica foi encontrado um indivíduo com 46 cromossomos caracterizado como um triplóide natural (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1985). De acordo com FORESTI (1987) as populações de Eigenmannia sp. do rio Jarí (PA) apresentaram 2n=31 e 2n=32 cromossomos e tal diferença no número diplóide não caracterizava um mecanismo sexual, mas sim um caso de rearranjo cromossômico do tipo fusão Robertsoniana, uma vez que este fenômeno ocorreu tanto em machos quanto em fêmeas desta população; na Ilha de Marajó (PA) foram encontrados números diplóides com 28, 29, 30, 31 e 32 cromossomos; em Pirassununga (SP) os indivíduos analisados apresentaram 2n=28 e em Torres (RS) 2n=30, sendo que tal polimorfismo cromossômico não se mostrou ligado ao sexo. Nos Gymnotiformes a variabilidade cariotípica está associada também à presença de cromossomos sexuais. Na família Sternopygidae, especialmente no gênero Eigenmannia ocorrem sistemas de cromossomos sexuais do tipo simples e múltiplo. Em Eigenmannia sp., os exemplares procedentes do rio Capivara (SP) apresentaram cariótipo com 2n=36 cromossomos, NF=49 e 50 e fêmea heterogamética, evidenciando o sistema sexual simples do tipo ZZ/ZW. Populações de E. virescens da ilha de Marajó (PA) e de rios da Bacia do Paraná possuem 2n=38, entretanto os exemplares de Marajó apresentam cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW enquanto que nos exemplares da Bacia do Paraná não foram detectadas diferenças cromossômicas ligadas ao sexo (FORESTI, 1987). De acordo com ALMEIDA-TOLEDO et al. (2002), populações de E. virescens com procedência da Bacia Amazônica e da Bacia do rio São Francisco (MG) mostraram um par 5

22 cromossômico heterogamético no cariótipo da fêmea, caracterizando o mecanismo sexual ZZ/ZW. Além disso, estudos citogenéticos realizados por ALMEIDA-TOLEDO et al. (2001) em duas populações de E. virescens mostraram que a população dos rios Tiête e Mogi-Guaçu (SP) pertencentes à Bacia do alto rio Paraná apresentam o mesmo número cromossômico (2n=38), porém a do rio Tietê apresenta um sistema de determinação do sexo do tipo XX/XY, enquanto que a população do rio Mogi-Guaçu não possuem cromossomos sexuais diferenciados. Estes dados reforçam a idéia de que E. virescens representa um complexo de espécies tal como acontece com outros grupos de peixes como o complexo Hoplias malabaricus (BERTOLLO et al., 2000) e o complexo Astyanax scabripinnis (MOREIRA-FILHO e BERTOLLO, 1991). O sistema sexual múltiplo (X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y) foi relatado em Eigenmannia sp.2 proveniente de um pequeno tributário do rio Tietê, apresentando número diplóide 2n=32 para fêmeas e 2n=31 para machos (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2000a). O mesmo tipo de mecanismo foi descrito em Brachyhypopomus pinnicaudatus (Hypopomidae, Gymnotiformes), sendo este o segundo relato deste mecanismo sexual em Gymnotiformes e o quinto entre os peixes Neotropicais de água doce (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2000b). Recentemente, SOARES e JÚLIO JÚNIOR (2004) analisaram uma espécie identificada como E. trilineata coletada na planície de inundação do alto rio Paraná que apresentou 2n=32 para fêmeas e 2n=31 para machos e mecanismo múltiplo de determinação do sexo do tipo X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y. Em S. macrurus, HINEGARDNER e ROSEN (1972) descreveram inicialmente o número haplóide de n=24 cromossomos. Estudos posteriores realizados por FORESTI et al. (1981) e FORESTI (1987) em populações de Manaus (AM), Rio Claro (SP) e Botucatu (SP), mostraram um cariótipo característico com 2n=46 cromossomos, todos do tipo meta e submetacêntrico e não foi detectada a presença de cromossomos heteromórficos ligados ao 6

23 sexo. BAROLIN et al. (2002) realizaram estudos em S. macrurus no trecho argentino do rio Paraná e observaram o mesmo número diplóide (2n=46), com fórmula cariotípica composta principalmente por cromossomos metacêntricos e submetacêntricos. Dessa maneira, o cariótipo de S. macrurus apresenta-se conservativo, uma vez que exemplares capturados em bacias hidrográficas distantes mostram grande identidade cariotípica As regiões organizadoras de nucléolos (NORs) A técnica de impregnação pela prata (Ag-NOR) foi desenvolvida para a diferenciação da região organizadora do nucléolo (NOR) em cromossomos humanos por HOWELL et al. (1975) e modificada por HOWELL e BLACK (1980). Entretanto, essa técnica detecta apenas loci de DNAr nucleolares que estiveram ativos na intérfase precedente (MILLER et al., 1976). Posteriormente, outras técnicas foram empregadas para a caracterização das NORs, como as que utilizam fluorocromos base específicos. Segundo AMEMIYA e GOLD (1986) existe uma estreita correlação entre os fluorocromos GC específicos cromomicina A 3 (CMA) e mitramicina (MM) com os loci de Ag-NORs em peixes. No entanto, esta característica nem sempre ocorre nos peixes, como foi observado em E. virescens, onde há alguns blocos Cromomicina A 3 positivos que não possuem correlação com as NORs da espécie (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1989). Recentemente, a hibridação fluorescente in situ (FISH) com sonda de DNAr é usada para marcar a região organizadora do nucléolo em muitas espécies de vertebrados, incluindo peixes (PENDÁS et al., 1993). Segundo ALMEIDA-TOLEDO et al. (1996) para desenvolver um estudo comparativo entre a atividade e a posição da NOR, é necessário associar os resultados da técnica Ag-NOR com a hibridação fluorescente in situ. 7

24 Nos peixes podem ser observados dois padrões de distribuição da NOR. Alguns grupos possuem sistema simples com os cístrons ribossômicos localizados em um único par de cromossomos, enquanto outros apresentam sistema múltiplo com os sítios da NOR distribuídos em vários cromossomos do complemento (GALETTI JÚNIOR, 1998). FORESTI et al. (1981) analisaram a região organizadora do nucléolo em cinco espécies de Gymnotiformes (G. carapo, Apteronotus albifrons, S. macrurus, Eigenmannia sp. e E. virescens) e todas elas apresentaram somente um par de cromossomos portadores de NOR. Posteriormente, ALMEIDA-TOLEDO et al. (1996) encontraram apenas um par de cromossomos portadores de NOR em quatro espécies do gênero Eigenmannia coletadas nos rios Tietê, Paranapanema e Mogi-Guaçu. Contudo, um espécime de Eigenmannia sp.1 apresentou fenótipo diferente, contendo dois pares de cromossomos portadores de NOR. Em S. macrurus, a NOR ocorre apenas em um par de cromossomos. Na população de Manaus (AM), o segmento da NOR se localiza em posição intersticial do braço longo de um dos maiores cromossomos do complemento, enquanto que nas populações de Rio Claro e Botucatu (SP) este segmento se localiza em posição terminal do braço curto de um cromossomo metacêntrico de tamanho intermediário (FORESTI, 1987). Em estudos realizados no rio Paraná (Corrientes, Argentina) observou-se em S. macrurus, regiões organizadoras do nucléolo localizadas no braço curto de um par grande de metacêntrico/submetacêntrico (BAROLIN et al., 2002). Em peixes, são freqüentes as formas heteromórficas das NORs com relação ao seu tamanho. Em Eigenmannia sp., FORESTI et al. (1981) descreveram extensa variação no tamanho deste segmento, tanto inter quanto intraespecífica. Na população da Ilha de Marajó (PA) foi encontrado um indivíduo com NOR próxima ao centrômero de um par de acrocêntricos pequenos e um indivíduo com este segmento cerca de seis vezes maior em um dos homólogos. Um terceiro indivíduo apresentou par portador de NOR heteromórfico, 8

25 formado por um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico. O autor (op. cit.) atribui a este heteromorfismo como resultante provável de uma inversão pericêntrica na região da constrição secundária. Na população de S. macrurus proveniente de Manaus (AM), a localização da NOR é terminal em um cromossomo e subterminal no seu homólogo, causada segundo os autores, por uma deleção na porção terminal do braço longo de um dos cromossomos portadores de NOR. 9

26 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. MATERIAL Foram obtidos resultados satisfatórios em 13 exemplares de Sternopygus macrurus (7 machos, 3 fêmeas e 3 indeterminados) e em 7 exemplares de Eigenmannia aff. trilineata (4 machos e 3 fêmeas) que estão representados na Figura 1. Os peixes foram coletados em sintopia nos bancos de macrófitas em lagoas da planície de inundação do alto rio Paraná, na Área de Proteção Ambiental das Ilhas e Várzeas do rio Paraná, próximo ao município de Porto Rico (PR), cujos locais estão representados na Figura 2. Os animais foram transportados com aeração para o Laboratório de Citogenética de Peixes, Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Estadual de Maringá (UEM), onde foram analisados citogenéticamente. Os exemplares foram identificados pela Dr.ª Carla Pavanelli e depositados na coleção de peixes do Laboratório de Citogenética de Peixes da UEM. Figura 1. Exemplar das espécies: (a) Sternopygus macrurus (28 cm); (b) Eigenmannia aff. trilineata (18 cm). 10

27 Figura 2. Mapa da planície de inundação do rio Paraná - as setas indicam os locais de coleta MÉTODOS Indução de mitoses Para aumentar o índice de células em divisão foi utilizada a técnica descrita por MOLINA (2001), a qual consiste em aplicar intra-abdominalmente o composto farmacêutico Munolan (Allergan Frumtost) na proporção de 1 ml de solução para cada 50 g do peso do animal, por um período de 24 a 54 horas anterior à preparação cromossômica. Este composto contém uma associação de antígenos de fungos e bactérias, a qual provoca um aumento na produção da taxa de divisão mitótica nas células de defesa sem provocar a morte do animal. 11

28 Preparação dos cromossomos mitóticos As preparações cromossômicas seguiram a metodologia de BERTOLLO et al. (1978) com algumas adaptações que consiste em: 1) Injetar intra-abdominalmente, solução de colchicina a 0,025%, na proporção de 1 ml/100 g do peso do animal; 2) Deixar o peixe em um aquário bem aerado por um período de minutos e sacrificá-lo em seguida retirando o rim anterior; 3) Colocar os tecidos retirados em uma placa de Petri contendo solução hipotônica de KCl (0,075 M) à temperatura ambiente; 4) Fragmentar o material com auxílio de pinças de dissecção e em seguida fazer movimentos de aspiração e expiração do material com o auxílio de uma seringa hipodérmica de vidro desprovida de agulha para facilitar a separação dos blocos celulares; 5) Colocar a suspensão obtida em estufa a 37 C, durante 30 minutos; 6) Ressuspender o material, com auxílio de uma pipeta Pasteur e transferir a solução para um tubo de centrífuga. Nesta transferência, os pedaços de tecido ainda não desfeitos devem ser descartados; 7) Adicionar algumas gotas de fixador (álcool metílico - ácido acético 3:1) recém preparado e ressuspender o material novamente; 8) Centrifugar durante 10 minutos, a 900 rpm; 9) Retirar o sobrenadante e colocar 6-8 ml de fixador; 10) Ressuspender o material com uma pipeta Pasteur; 11) Repetir os itens 8 a 10 por três vezes; 12) Após a última centrifugação, descartar o sobrenadante e colocar 1 ou 2 ml de fixador, ressuspender o material, acondicionar a solução em tubos de plástico do tipo Eppendorff e mantê-los em ambiente refrigerado; 12

29 13) Pingar duas ou três gotas da suspensão em uma lâmina limpa (mantida em água destilada, na geladeira), deixar secar ao ar, corar com Giemsa 10% durante 15 minutos e lavar em água corrente Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda C) A técnica utilizada foi descrita por SUMNER (1972) com algumas adaptações, seguindo os procedimentos abaixo: 1) A lâmina contendo as gotas do material para a análise devem ser tratadas com HCl 0,2N em temperatura ambiente, por 7 minutos; lavar em água deionizada e secar ao ar; 2) Incubar em solução filtrada de hidróxido de bário 5% (recém preparada) por 5 minutos, a 42 C; 3) Lavar rapidamente em solução de HCl 0,2N em água destilada e secar ao ar; 4) Incubar em solução salina (2 x SSC) a 60 C, por 30 minutos; 5) Lavar em água deionizada e secar ao ar; 6) Corar com Giemsa, diluído a 5% em tampão fosfato ph 6,8, por 5-10 minutos; 7) Lavar em água corrente e secar ao ar Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (NORs) Foi adotada a metodologia de impregnação com nitrato de prata descrita por HOWELL e BLACK (1980), que consiste em: 1) Sobre uma lâmina previamente preparada para obtenção de cromossomos mitóticos, pingar duas gotas de solução de gelatina (1g de gelatina/50 ml de água deionizada/0,5 ml de ácido fórmico); 2) Adicionar 1 gota de água destilada e 2 gotas de solução aquosa de nitrato de prata 50% (1g de AgNO 3 /1 ml de água deionizada); 13

30 3) Cobrir com lamínula e colocar em estufa a 60 C; 4) Deixar por 3-8 minutos, até a lâmina assumir uma cor amarelada, retirar da estufa e monitorar a cor dos cromossomos sob o microscópio; 5) Remover a lamínula com água corrente e deixar secar Detecção das regiões ricas em bases GC Esta metodologia foi descrita por SCHWEIZER (1980), modificada por SCHMID (1980) e GALETTI JÚNIOR e RASCH (1993): 1) Sobre uma lâmina preparada segundo a técnica descrita para cromossomos mitóticos, colocar 150 µl de solução de distamicina A; 2) Cobrir com lamínula e deixar agindo por 15 minutos em temperatura ambiente; 3) Lavar a lâmina em tampão McIlvaine, de modo que a lamínula saia da lâmina e deixar secar por poucos minutos; 4) Colocar sobre a lâmina 150 µl de solução de mitramicina, cobrindo novamente com lamínula. Deixar agir por 60 minutos, no escuro, a temperatura ambiente; 5) Repetir o item 3; 6) Montá-la com uma nova lamínula, utilizando DABCO 5%; 7) Estocar a lâmina à temperatura ambiente ou na geladeira, no escuro, por no mínimo 15 dias antes de analisar, para aumentar a estabilidade do fluorocromo Hibridação fluorescente in situ (FISH) Obtenção das sondas: A extração do DNA foi realizada a partir de tecidos (músculo e nadadeira) de Astyanax scabripinnis seguindo o protocolo apresentado por SAMBROOK et al. (1989). 14

31 Para detecção dos sítios de DNAr foram utilizadas técnicas descritas por HESLOP-HARRISON et al. (1991) e CUADRADO e JOUVE (1994). As sondas de DNAr foram produzidas a partir de PCR (reação de polimerase em cadeia), utilizando-se os primers NS1 (5 -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ) e NS8 (5 - TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3 ) para amplificar os genes 18S conforme protocolo descrito em VAHEY et al. (1995), usando oligonucleotídeos empregados por WHITE et al. (1990). Procedimento para amplificação da sonda 18S: 3,5 µl de tampão; 1,5 µl de MgCl 2 ; 8 µl de dntps (concentração inicial: 1,2 mm de cada dntp); 3 µl de primer NS1; 3 µl de primer NS8; 1 µl de Taq polimerase (concentração inicial: 5000 u/ml); 1 µl de DNA (concentração inicial: 100 ng/µl); 29 µl de Água-milliQ. Ciclos de reação: (94ºC por 5 minutos; 94ºC por 1 minuto; 50ºC por 1 minuto; 72ºC por 2,5 minutos) repetir 30 ciclos, 72ºC por 10 minutos até infinito. Tratamento da lâmina: 1) Colocar 50 µl de RNAse em cada lâmina, cobrir com lamínula plástica e levar para a estufa a 37 C por 1 hora, em câmara úmida; 2) Lavar a lâmina em 2 x SSC por 10 minutos a temperatura ambiente no agitador; 3) Transferir para a solução de paraformaldeído 4% a temperatura ambiente, por 10 minutos no agitador; 15

32 4) Lavar novamente em 2 x SSC, por 10 minutos, no agitador; 5) Transferir para álcool etílico 70% por 5 minutos, no agitador; 6) Lavar em álcool 100% por 5 minutos, sem agitar; 7) Deixar a lâmina secando por 1 a 3 horas; 8) Neste intervalo, deve-se preparar a mistura de hibridação (HIS): 15 µl de formamida 100%, 6 µl de Dextran, 3 µl de 20 x SSC, 1 µl de DNA de bloqueio (timo de bezerro), 1 µl de SDS 10%, 5 µl de sonda; 9) Denaturar a mistura de hibridação (HIS) a 70 C por 10 minutos; 10) Incubar no gelo ao menos 5 minutos e no máximo por 2 horas; 11) Colocar 30 µl da mistura de HIS por lâmina, cobrir com lamínula plástica e levar para o termociclador (90 C por 10 minutos, 48 C por 10 minutos, 38 C por 5 minutos e 37 C até infinito); 12) Deixar a lâmina em câmara úmida a 37 C durante a noite. Banhos pós-hibridação (Sonda 18S): 1) Lavar a lâmina em 2 x SSC a 42 C, por 5 minutos; 2) Lavar em formamida 20% (20 ml de formamida deionizada/80 ml de 0,1 x SSC) a 42 C, por 10 minutos; 3) Colocar a lâmina em 0,1 x SSC a 42 C por 5 minutos; 4) Lavar com 2 x SSC a 42 C por 5 minutos; 5) Descartar o 2 x SSC e colocar o 4 x SSC/tween 0,2%, a 42 C por 5 minutos; 6) Repetir a última lavagem à temperatura ambiente. Obs.: Todas as lavagens desta etapa foram efetuadas no agitador. 16

33 Detecção da hibridação: 1) Retirar a lâmina e com ela ainda molhada, colocar 50 µl de BSA 5% por 5 minutos e cobrir com lamínula plástica; 2) Retirar a lamínula e colocar 50 µl de solução de detecção (1 µl de Avidina- FITC (Fluoresceina Isotil Cianato-avidina conjugada) + 49 µl de BSA 5%), cobrir com lamínula plástica e incubar a 37 C por 1 hora em câmara úmida; 3) Lavar a lâmina em 4 x SSC/tween 0,2% por 5 minutos à temperatura ambiente no agitador, no escuro. Coloração: 1) Após retirar a lâmina do 4 x SSC/tween 0,2%, colocar 25 µl de solução de iodeto de propídio (1 µl de iodeto de propídio e 25 µl de antifading como o DABCO 5%), cobrir com lamínula de vidro e guardar em caixa fechada para evitar entrada de luz Estudos cariotípicos As análises das metáfases foram realizadas em microscópio óptico comum. Após a contagem dos cromossomos foi estabelecido o número modal para machos e fêmeas das espécies estudadas. As metáfases coradas com Giemsa ou submetidas à impregnação com nitrato de prata que apresentaram melhor dispersão e nítida morfologia dos cromossomos foram fotografadas com objetivas de imersão em microscópio Axioskop Zeiss, utilizando-se filme Kodak Imagelink, preto e branco, regulado para ISO 25 e revelado em D-76, da Kodak. As cópias dos negativos foram feitas em papel fotográfico profissional KODABROMIDE-F3. 17

34 As metáfases submetidas às técnicas de banda C, FISH e mitramicina foram analisadas com objetivas de imersão em microscópio Axioskop 2 plus Zeiss com AxioCam acoplada, e digitalizadas utilizando o Software AxioVision Medidas cromossômicas As fotografias foram recortadas para a montagem dos cariótipos e ordenação visual dos cromossômicos homólogos. Em seguida foram realizadas as medidas dos cromossomos nos cariótipos de machos e de fêmeas, com o auxílio de paquímetro, determinando-se o comprimento do braço menor, do braço maior e o comprimento total de cada cromossomo, calculando-se os valores médios para cada par. A classificação dos cromossomos em metacêntrico, submetacêntrico, subtelocêntrico e acrocêntrico foi estabelecida conforme os valores da relação de braços (RB) proposto por LEVAN et al. (1964), sendo que a constrição secundária não foi considerada para a classificação. Para a determinação do número fundamental (NF), os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos foram considerados com dois braços cromossômicos. 18

35 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM Sternopygus macrurus Os exemplares de S. macrurus apresentaram um número diplóide constante de 46 cromossomos para machos e fêmeas, não sendo detectada a presença de cromossomos sexuais diferenciados. A fórmula cariotípica é formada por quinze pares de cromossomos metacêntricos (M) e oito pares de submetacêntricos (SM), apresentando número fundamental (NF) igual a 92 (Figura 3a), com predomínio de cromossomos de dois braços, sugerindo que esta seja a condição ancestral no grupo. A constituição cariotípica de S. macrurus é similar à da população analisada por FORESTI et al. (1981) e FORESTI (1987), embora os autores classifiquem os cromossomos em um único grupo (M-SM). Além disso, BAROLIN et al. (2002) observaram o mesmo número diplóide (2n=46) em S. macrurus e fórmula cariotípica composta principalmente por cromossomos metacêntricos e submetacêntricos. Dessa forma, os resultados obtidos evidenciam um cariótipo conservado nesta espécie. Pela técnica de banda C, foram detectados blocos de heterocromatina constitutiva discretos nas regiões centroméricas de alguns cromossomos do complemento e um bloco heterocromático mais conspícuo foi observado no maior par metacêntrico (par 1 do cariótipo) em posição pericentromérica do braço curto, próximo ao centrômero e não coincidente com a região da constrição secundária (Figuras 3b e 4a). Casos como este de banda C negativa para a região da constrição secundária foi relatado em Apteronotus albifrons por ALMEIDA-TOLEDO et al. (1981) e em Liposarcus anisitsi por ARTONI et al. (1999) entre outros. Entretanto, a região da constrição secundária pode ser banda C positiva para outros peixes como, por exemplo, em Rineloricaria latirostris e R. pentamaculata (GIULIANO-CAETANO, 1998) e em peixes do gênero Eigenmannia (FORESTI, 1987). 19

36 Duas regiões organizadoras do nucléolo (Ag-NORs) foram observadas nesta espécie, localizadas em um par de cromossomos metacêntricos, o de número 1 no cariótipo, coincidente com a localização da constrição secundária no braço curto, a qual se mostrou evidente em algumas preparações com Giemsa (Figuras 3b e 4b). O sistema de NOR simples observado em S. macrurus também foi relatado por FORESTI et al. (1981) em espécimes de Manaus (AM); por FORESTI (1987) em Manaus (AM), Rio Claro (SP) e Botucatu (SP) e por BAROLIN et al. (2002) no trecho argentino do rio Paraná. Entretanto, houve diferença na localização da NOR entre as populações estudadas por FORESTI (1987), sendo que nos indivíduos de Manaus, a NOR se localiza em posição intersticial do braço longo do primeiro par de cromossomos do complemento, enquanto que na população de São Paulo este segmento se localiza em posição terminal do braço curto de um par cromossômico metacêntrico/submetacêntrico (par 7) de tamanho intermediário. Em S. macrurus do alto rio Paraná, o par cromossômico portador da NOR é muito similar ao par Ag-NOR da população de Manaus, embora o autor considere estes sítios como intersticial, eles se encontram próximos da região telomérica. Contudo, variações fenotípicas das regiões organizadoras do nucléolo foram registradas em outras populações de S. macrurus, sugerindo a possibilidade dos espécimes representarem um complexo de espécies relacionadas (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1993). Na espécie analisada, a hibridação fluorescente in situ com sonda de DNAr 18S mostrou marcações coincidentes com os sítios Ag-NOR (Figura 4c). Os resultados obtidos com esta metodologia confirmam o sistema de NOR simples para S. macrurus do rio Paraná. Em tratamentos com mitramicina (MM) observou-se que a região organizadora do nucléolo é positiva para este fluorocromo (Figura 4d), indicando que esta região é rica em pares de bases GC. Embora AMEMIYA e GOLD (1986) tenha observado correlação entre 20

37 segmentos Ag-NORs e regiões positivas para fluorocromos GC específicos, em E. virescens há alguns blocos Cromomicina A 3 positivos que não possuem correlação com as NORs da espécie (ALMEIDA-TOLEDO et al., 1989) ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM Eigenmannia aff. trilineata As metáfases mitóticas mostraram 2n=36 cromossomos para machos e fêmeas, porém foram encontradas diferenças na macroestrutura cariotípica entre os sexos. O cariótipo das fêmeas apresentou 4 pares de cromossomos metacêntricos, 2 submetacêntricos, 1 subtelocêntrico e 11 acrocêntricos com NF=50, enquanto que os machos apresentaram cariótipo com 4 pares de cromossomos metacêntricos, 2 submetacêntricos, 1 subtelocêntrico, 10 acrocêntricos e 1 par heteromórfico formado por um cromossomo acrocêntrico e um metacêntrico pequeno e com NF=51, caracterizando o sistema sexual simples do tipo XX/XY (Figuras 5a e 5b), o qual provavelmente teve origem por uma inversão pericêntrica em um dos homólogos do menor par de cromossomos acrocêntricos. O número diplóide encontrado (2n=36) foi descrito anteriormente em um citótipo de Eigenmannia, coletado na bacia hidrográfica do rio São Francisco (ALMEIDA-TOLEDO et al., 2004), contudo a estrutura cariotípica apresentou nove pares de cromossomos meta/submetacêntricos, nove pares de acrocêntricos e ausência de mecanismo de determinação do sexo. Existe considerável homologia na estrutura cariotípica e mecanismo sexual entre os cariótipos de Eigenmannia aff. trilineata da planície de inundação do rio Paraná com uma população de E. virescens proveniente do rio Tietê, entretanto, esta última apresenta 2n=38 com dois pares de cromossomos meta/submetacêntrico excedentes. A fórmula cromossômica e número diplóide observados em Eigenmannia aff. trilineata também diferem de E. trilineata estudada por SOARES e JÚLIO JÚNIOR (2004), a qual apresentou 2n=32 cromossomos (8M-24A) para fêmeas e 21

38 2n=31 (9M-22A) para machos com mecanismo múltiplo de determinação do sexo (X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y). Essa diferença no número diplóide e na fórmula cariotípica sugere que na planície de inundação do alto rio Paraná, provavelmente ocorre duas espécies do gênero Eigenmannia que são morfologicamente muito parecidas, visto que ambas foram inicialmente identificadas como E. trilineata. A grande divergência cariotípica encontrada neste gênero provavelmente é causada por alterações cromossômicas estruturais e a variedade de citótipos faz supor que o gênero Eigenmannia seja um complexo formado por um número maior de espécies do que se tem referência. Foram observadas duas regiões organizadoras do nucléolo localizadas em um par de cromossomos acrocêntricos, provavelmente o par 16, em posição terminal no braço curto (Figura 6a). O sistema de NOR simples encontrado na espécie analisada é freqüente no gênero Eigenmannia e foi registrado por FORESTI et al. (1981); FORESTI (1987); ALMEIDA-TOLEDO et al. (2000a,b; 2001 e 2002) em várias populações. A hibridação fluorescente in situ mostrou pequenas marcações em um par de cromossomos acrocêntricos (par16), com localização na região terminal do braço curto, coincidindo com a localização da NOR pela impregnação com nitrato de prata (Figura 6b). A região organizadora do nucléolo se mostra discretamente heteromórfica, apresentando diferença entre os homólogos devido ao tamanho desigual da constrição secundária. Em estudos prévios, FORESTI et al. (1981) descreveram extensa variação no tamanho deste segmento, tanto inter quanto intraespecífica em uma população de Eigenmannia sp. da Ilha de Marajó no Estado do Pará. Os dados citogenéticos obtidos com a espécie Eigenmannia aff. trilineata demonstra a importância destas análises na identificação de novas espécies e confirma a complexidade cariotípica e taxonômica deste gênero. 22

39 Figura 3. (a) Cariótipo de Sternopygus macrurus; (b) Caracterização da NOR utilizando Giemsa, banda C e Ag-NOR. 23

40 Figura 4. Cromossomos metafásicos de Sternopygus macrurus (a) bandeamento C- as setas indicam os blocos mais conspícuos de heterocromatina constitutiva; (b) Ag-NOR- as setas mostram a região organizadora do nucléolo; (c) hibridação fluorescente in situ- as setas apontam os sinais de hibridação; (d) mitramicina - as setas indicam regiões ricas em pares de bases GC. 24

41 Figura 5. Cariótipo de Eigenmannia aff. trilineata (a) fêmea; (b) macho. 25

42 Figura 6. Cromossomos metafásicos de Eigenmannia aff. trilineata (a) Ag-NOR - as setas mostram a região organizadora do nucléolo; (b) hibridação fluorescente in situ- as setas apontam os sinais de hibridação. 26

43 5. CONCLUSÕES A ocorrência de cariótipos similares em exemplares de S. macrurus provenientes de bacias hidrográficas distantes parece mostrar certa estabilidade do padrão cariotípico, indicando uma característica conservativa para esta espécie. Não foi observado nenhum mecanismo de determinação sexual, ao nível das análises efetuadas. A presença de um cariótipo característico para Eigenmannia aff. trilineata confirma a variabilidade cromossômica observada em estudos prévios no gênero Eigenmannia, uma vez que o número diplóide e fórmula cromossômica encontrados em Eigenmannia aff. trilineata são distintos para este gênero, indicando fortemente a existência de uma nova espécie na planície de inundação do alto rio Paraná. Os dados citogenéticos mostram que a biodiversidade regional é maior que aquela estimada pela sistemática convencional. Desse modo, a variedade de citótipos faz supor que o gênero Eigenmannia seja um complexo formado por um número maior de espécies do que se tem referência. 27

44 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGOSTINHO, A.A.; JÚLIO JÚNIOR, H.F.; GOMES, L.C.; BINI, L.M.; AGOSTINHO, C.S. Composição, abundância e distribuição espaço-temporal da ictiofauna. In: VAZZOLER, A.E.M.A.; AGOSTINHO, A.A.; HAHN, N.S. (Eds). A planície de inundação do rio Paraná: aspectos físicos, biológicos e sócio-econômicos. Eduem, p AGOSTINHO, A.A.; JÚLIO JÚNIOR, H.F. Peixes da Bacia do Alto Paraná. In: LOWE- McCONNELL, R.H. Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais. Tradução: VAZOLLER, A.E.M.A.; AGOSTINHO, A.A.; CUNNINGHAM, P.T.M. São Paulo: EDUSP, p ALBERT, J.S.; FERNANDES-MATIOLI, F.M.; ALMEIDA-TOLEDO, L.F. New Species of Gymnotus (Gymnotiformes, Teleostei) from Southeastern Brazil: Toward the deconstruction of Gymnotus carapo. Copeia, v. 2, p , ALMEIDA-TOLEDO, L.F. Contribuição à citogenética dos Gymnotoidae (Pisces, Ostariophysi) Ph.D. Thesis, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, São Paulo, ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F.; TOLEDO-FILHO, S.A. Constitutive heterochromatin and nucleolus organizer in the knifefish, Apteronotus albifrons (Pisces, Apteronotidae). Experientia, v. 37, p , ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F.; TOLEDO-FILHO, S.A. Spontaneous triploidy and NOR activity in Eigenmannia sp. (Pisces, Sternopygidae) from the Amazon basin. Genetica, v. 66, p , ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F.; TOLEDO-FILHO, S.A.; GRANT, G. Coloração por cromomicina A 3 dos cromossomos de Eigenmannia virescens (Pisces, Sternopygidade). Brazilian Journal of Genetics, v. 12, p. 128, ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F.; DANIEL-SILVA, M.F.Z.; TOLEDO-FILHO, S.A. Nucleolar chromosome variants in Sternopygus macrurus (Pisces, Sternopygidade) from three Brazilian river basins. Caryologia, v. 46 (1), p , ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; STOCKER, A.J.; FORESTI, F.; TOLEDO-FILHO, S.A. Fluorescence in situ hybridization with rdna probes on chromosomes of two nucleolus organizer phenotypes of a species of Eigenmannia (Pisces, Gymnotoidei, Sternopygidae). Chromosome Research, v. 4, p ,

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