25/07/2013. Ms. Rita Figueira Fertility

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1 CLASSIFICAÇÃO OOCITÁRIA e EMBRIONÁRIA Ms. Rita Figueira Fertility CHECAGEM DO LÍQUIDO FOLICULAR E IDENTIFICAÇÃO DOS OÓCITOS 1

2 CLASSIFICAÇÃO DO COMPLEXO CÚMULUS - CORONA Grau I e II: Características: células do cumulus densas e fortemente aderidas. Grau de maturação: Prófase I (PI) e Metáfase I (MI) CLASSIFICAÇÃO DO COMPLEXO CÚMULUS - CORONA Grau III: Características: células expandidas e frouxamente aderidas. Grau de maturação: Metáfase II (MII) 2

3 CLASSIFICAÇÃO DO COMPLEXO CÚMULUS - CORONA Grau IV: Características: células muito expandidas e frouxas. Grau de maturação: Hipermaduro ICSI INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DENUDAÇÃO OOCITÁRIA Concepção natural Fertilização in vitro (FIV) Injeção intracitoplasmática de sptz (ICSI) Etapa enzimática Etapa mecânica 3

4 ICSI INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA GRAU DE MATURAÇÃO NUCLEAR PI (Prófase I, Meiose I) MI (Metáfase I, Meiose I) MII (Metáfase II, Meiose II) MORFOLOGIA OOCITÁRIA 4

5 Oócito maduro humano Ooplasma Mitocôndrias Retículo endoplasmático Complexo de Golgi Oolema Zona pelúcida (glicoproteínas) Espaço Perivitelínico ALTERAÇÕES DA MORFOLOGIA OOCITÁRIA EXTRACITOPLASMÁTICAS INTRACITOPLASMÁTICAS FORMA CORPÚSCULO POLAR ZONA PELÚCIDA ESPAÇO PERIVITELINO PRESENÇA DE VACÚOLOS OOPLASMA GRANULAR AGREGADOS DE RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO CORPOS REFRÁTEIS 5

6 MORFOLOGIA OOCITÁRIA ALTERAÇÕES CITOPLASMÁTICAS CLUSTER RER GRANULOSIDADE CITOPLASMÁTICA VACÚOLOS MORFOLOGIA OOCITÁRIA ALTERAÇÕES EXTRACITOPLASMÁTICAS CORPÚSCULO FRAGMENTADO FORMA 6

7 MORFOLOGIA OOCITÁRIA ALTERAÇÕES EXTRACITOPLASMÁTICAS ZP ESPESSA DEBRIS NO EP EP AUMENTADO CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA A transferência de embriões de melhor prognóstico e de elevado potencial para implantação pode ser considerado um dos mais importantes aspectos da reprodução humana assistida. Apesar dos avanços tecnológicos significativos da área, a seleção dos embriões de melhor qualidade continua sendo predominantemente baseada em parâmetros morfológicos. 7

8 CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA Parâmetros morfológicos Morfologia pronuclear blastocisto Estudos priorizam aspectos avaliados antes da transferência (dia+3 ou dia+5) Avaliação individual ou coletiva dos critérios disponíveis valor preditivo de viabilidade embrionária CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA CRITÉRIOS MORFOLÓGICOS -Morfologia pronuclear -Divisão embrionária precoce -No de células e ritmo de clivagem nos dias +2 e +3 -Tipo e grau de fragmentação -Simetria entre os blastômeros -Presença de multinucleação -Espessura da zona pelúcida -Grau de compactação -Grau de expansão da blastocele / organização MCI e TRF 8

9 CHECAGEM DA FERTILIZAÇÃO FERTILIZAÇÃO PAPEL DO ESPERMATOZÓIDE Genoma paterno haplóide Sinal pra início da ativação metabólica do oócito Centríolo organização dos microtúbulos fusos mitóticos INTERAÇÃO OÓCITO - ESPERMATOZÓIDE Capacitação (Alterações na MP, aumento de mensageiros intracelulares, fosforilação de proteínas) Reconhecimento e ligação a ZP (proteína ZP3 e outras proteínas sob investigação + proteína de ligação na MP do sptz, receptor ainda não definido) Reação acrossômica e incorporação do sptz ao oócito 9

10 FERTILIZAÇÃO FERTILIZAÇÃO ATIVAÇÃO OOCITÁRIA Início e manutenção da resposta oocitária TEORIAS Fusão liberação de componentes liberadores de Ca+2 Receptor cascata de transdução de sinal MP do oócito Bomba de cálcio estoque no sptz ou canais de cálcio na MP do sptz FORMAÇÃO E INTERAÇÃO DOS PRONÚCLEOS Envoltório nuclear Centrossomo Microtúbulos Outras interações protéicas 10

11 FORMAÇÃO DOS PRONÚCLEOS 1- Spindle meiótico com cromátides 2-1º corpúsculo polar 5- Membrana celular do sptz 6- Cauda sptz 7- Núcleo compactado do sptz 8- Centrossomo proximal do sptz 2 horas após fertilização 1-1º corpúsculo polar 2- Núcleo do sptz (Desempacotamento da cromatina) 3- Centrossomo proximal do sptz 4-2º corpúsculo polar em formação 5- Remanescente do spindle meiótico FORMAÇÃO DOS PRONÚCLEOS 1- PN paterno 2- PN materno 3- Centrossomo - espermatozóide 4- Corpúsculos polares 11

12 FORMAÇÃO DOS PRONÚCLEOS 6 horas após fertilização 1- PN paterno 2- PN materno 3- Centrossomo paterno 4- NPB 5- Microtúbulos astrais maternos 18 horas após fertilização 1- PN paterno 2- PN materno 3- Centrossomo paterno duplicado 4- NPB horas FALHA DE FERTILIZAÇÃO PAPEL DO OÓCITO 55% relacionada a falha no processo de penetração do sptz ICSI - 40% relacionado a falha na ativação oocitária Falha da cascata do sistema responsivo oocitário Falha na liberação de Ca+2 12

13 FALHA DE FERTILIZAÇÃO PAPEL DO ESPERMATOZÓIDE FALHA DE FERTILIZAÇÃO PAPEL DO ESPERMATOZÓIDE Efeito paterno precoce deficiência citoplasmática Alteração morfológica em zigotos e embriões em estágio inicial do desenvolvimento Não correlacionado com fragmentação de DNA no sptz Disfunções relacionadas a ativação oocitária e aparato centrossomocitoesqueleto 13

14 FALHA DE FERTILIZAÇÃO PAPEL DO ESPERMATOZÓIDE Efeito paterno tardio deficiência nuclear Comprometimento do potencial de desenvolvimento embrionário resultando em falha de implantação Não correlaciona com presença de alterações morfológicas de zigotos e embriões nos estágios iniciais de desenvolvimento Disfunções relacionadas a estrutura da cromatina espermática FALHA DE FERTILIZAÇÃO OUTROS FATORES: Presença de estruturas do espermatozóide Acrossoma intacto e teca peri-nuclear Atraso no descondensamento da cromatina Conteúdo hidrolítico acrossomal Sensibilidade oocitária - dano 14

15 PAPEL DA CAUDA NA FERTILIZAÇÃO Experimental ainda não elucidado Injeção de segmentos de espermatozóides (cabeça e cauda) -Ativação oocitária OK -Identificação da formação de 2PN -Divisão mitótica anormal -Alto índice de mosaicismo Integridade estrutural do sptz contribui para embriogênese normal PAPEL DA CAUDA NA FERTILIZAÇÃO Zygote May;7(2): The role of structural integrity of the fertilising spermatozoon in early human embryogenesis. Colombero LT, Moomjy M, Sills ES, Rosenwaks Z, Palermo GD. Papel da cauda e da integridade do sptz no desenvolvimento embrionário Injeção de segmentos de espermatozóides Cabeça (N=73), 67% - 2PN e 92% mosaico Cauda (N=11), 18% - 2PN (único CP) e 100% mosaico Cabeça + Cauda (N=26), 46% - 2PN e 91% mosaico Integridade estrutural do sptz contribui para embriogênese normal 15

16 PAPEL DA CAUDA NA FERTILIZAÇÃO Mol Hum Reprod Sep;5(9): Sperm integrity is critical for normal mitotic division and early embryonic development. Moomjy M, Colombero LT, Veeck LL, Rosenwaks Z, Palermo GD. Integridade do sptz e papel do centrossomo -Formação de 2PN OK -Divisão mitótica anormal -Ausência de fuso -Mosaicismo Integridade estrutural do sptz é essencial para o funcionamento correto do aparato mitótico FERTILIZAÇÃO ANORMAL Somente 1 pronúcleo Ativação artificial do oócito (efeitos bioquímicos, mecânico) Falha do desenvolvimento do PN paterno ou materno Desenvolvimento de envelope nuclear ao redor do 2º grupo de cromossomos em metáfase no oócito Pronúcleo haplóide de origem materna: tamanho aumentado 16

17 FERTILIZAÇÃO ANORMAL Poliploidia Falha no bloqueio da polispermia (falha na exositose granular pós inseminação, defeitos na zona pelúcida) (66.4%) Falha de divisão meiótico paterna e/ou materna resultando em: Penetração de espermatozóide binucleado (23.6%) Penetração em um oócito binucleado (10%) Mechanisms giving rise to triploid zygotes during assisted reproduction Bernd E. Rosenbusch, Ph.D. Department of Gynecology and Obstetrics, University of Ulm, Ulm, Germany 17

18 Mechanisms giving rise to triploid zygotes during assisted reproduction Bernd E. Rosenbusch, Ph.D. Department of Gynecology and Obstetrics, University of Ulm, Ulm, Germany DETECÇÃO DE 2PN NÃO GARANTE A PRESENÇÃO DE UM CONJUNTO CROMOSSÔMICO DIPLÓIDE COMPOSTO PELO GENOMA MATERNO E PATERNO MORFOLOGIA PRONUCLEAR Qualidade dos gametas Informações complementares para seleção embrionária nos estágios iniciais da clivagem Correlação com aspectos do desenvolvimento embrionário - Fragmentação - Parada de clivagem - Multinucleação - Constituição cromossômica - Potencial de implantação 18

19 PRONÚCLEO Padrão de normalidade: - Semelhança de tamanho - Posição central em relação ao citoplasma - Pronúcleos feminino e masculino justapostos PRONÚCLEO Diferença de tamanho: - Parada de clivagem - Alterações cromossômicas embriões aneuplóides Afastados: - Alterações cromossômicas embriões aneuplóides Posição periférica: - Falha dos processos de fertilização (formação áster e microtúbulos) 19

20 HALO CITOPLASMÁTICO Padrão diferencial de distribuição do citoplasma no zigoto Dependente dos processos de fertilização Rotação do citoplasma ondas de cálcio Área densa observada próxima aos pronúcleos organelas e mitocôndrias (ATP) HALO CITOPLASMÁTICO Halo citoplasmático não detectado - Distribuição desigual de mitocôndrias nas células-filhas depleção de ATP em alguns blastômeros - Distribuição desigual de produtos gênicos nas células-filhas - Ausência de rotação do pronúcleo paterno alinhamento anormal da cromatina e/ou posicionamento inadequado dos centrossomos - Ritmo de clivagem lento e aumento da taxa de fragmentação em embriões de dia +3 (ativação genoma) - Diminuição das taxas de blastocisto 20

21 CORPOS PRECURSORES DE NUCLÉOLOS Nucléolos: - Sítios nos quais os genes ribossomais são transcritos síntese protéica - Formação: Regiões Organizadoras de Nucléolos (RON) localização dos genes que codificam para os RNAs ribossomais - Constituição: componente fibrilar denso, centro fibrilar e componente granular. Estágio pronuclear apenas porção do centro fibrilar - Corpos precursores de nucléolos (CPN) CORPOS PRECURSORES DE NUCLÉOLOS Nucleogênese: - Crescimento, organização e fusão dos CPN MARCADOR NÃO INVASIVO DE QUALIDADE EMBRIONÁRIA - Dependente da atividade transcricional pronuclear e da presença de fatores do ooplasma relacionados a maturação oocitária - Falta de sincronia efeitos significativos no desenvolvimento embrionário 21

22 CORPOS PRECURSORES DE NUCLÉOLOS MARCADOR NÃO INVASIVO DE QUALIDADE EMBRIONÁRIA Estágio pronuclear inicial -Número elevado de CPN de tamanho relativamente pequeno, distribuídos randomicamente em cada um dos pronucleos. Estágio pronuclear tardio - Pequeno número de CPN de tamanho relativamente maior, distribuição polarizada sendo observado acúmulo próximo ao local de contato entre os pronúcleos. CORPOS PRECURSORES DE NUCLÉOLOS Assincronia - Divisão celular anormal proteínas de controle do ciclo celular - Ritmo lento de clivagem - Aumento de fragmentação - Diminuição das taxas de blastocisto - Menor potencial de implantação 22

23 CHECAGEM DA FERTILIZAÇÃO Parâmetros avaliados N o de PN N o corpúsculo polar Posicionamento e tamanho dos PN No de nucléolos Tamanho de nucléolos (inversamente proporcional ao no de CPN) Alinhamento dos nucléolos Formação do halo citoplasmático Presença de vacúolos 23

24 CLASSIFICAÇÃO DE PN, Tesarik 1999 Parâmetros avaliados Sincronia da nucleogênese Dissociação de diferentes eventos que normalmente são conectados Padrão de normalidade (padrão 0) N o maior que 7 de CPN de menor tamanho distribuídos randomicamente N o menor que 7 de CPN de maior tamanho polarizados Diferença de n o de CPN entre os PN menor que 3 N o de CPN em ambos os PN maior que 3 Padrão Descrição 1 Diferença de número de CPN (>3) entre os pronucleos Pequeno número de CPN (<7) distribuídos randomicamente em pelo menos um dos pronucleos Grande número de CPN (>7) polarizados em pelo menos um dos pronucleos Número muito pequeno de CPN (<3) em pelo menos um dos pronucleos Distribuição polarizada dos CPN em um dos pronucleos e distribuição randômica no outro. Velocidade da nucleogênese sem impacto CLASSIFICAÇÃO DE PN, Scott 2000 Padrão de normalidade (padrão 0) CPN polarizados em número de 3-7 de mesmo tamanho Diferença de n o de CPN entre os PN no máximo 1 Z1 Z2 Velocidade da nucleogênese impacto no desenvolvimento Z3 Z3 Z4 Z4 Padrão Z1 Z2 Z3 Z4 Descrição Igual número (3-7) e tamanho dos CPN polarizados Igual número de CPN distribuídos randomicamente Diferença de número e tamanho dos CPN e/ou distribuição polarizada dos CPN em um dos pronucleos e distribuição randômica no outro Pronucleos de tamanho diferente e/ou periféricos e/ou não justapostos 24

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26 CLIVAGEM PRECOCE - PRIMEIRA CLIVAGEM Divisões celulares embrionárias Denominação: Clivagem Ausência da fase S do ciclo celular Distribuição assimétrica do conteúdo citoplasmático Zigoto 1- Duplicação do DNA nos 2 pronúcleos 2- Desestruturação das membranas dos pronúcleos 3- Microtúbulos do spindle mitótico Zigoto em divisão 20 a 27 horas após fertilização CLIVAGEM PRECOCE - PRIMEIRA CLIVAGEM Intervalo de tempo divergência entre os estudos Relatos iniciais ausência de correlação com viabilidade embrionária Shoukir et al., Primeira indicação de que a primeira clivagem pudesse predizer a competência embrionária - Estabelecimento de intervalo crítico período avaliado horas após ICSI 26

27 CLIVAGEM PRECOCE - PRIMEIRA CLIVAGEM Shoukir et al., Embriões com 2 células observados em 18,9% dos ciclos - Taxa de gestação aumento de 2x - Taxa de implantação aumento de 3x - Aumento significativo das taxas de acordo com o número de embriões com clivagem precoce obtidos por ciclo - Taxa de gestação aumento de 3x, detecção de dois ou mais embriões com clivagem precoce CLIVAGEM PRECOCE - PRIMEIRA CLIVAGEM Wharf et al., 2004 Adição de outras categorias à avaliação da clivagem precoce Parâmetros avaliados Presença de PN Singamia N o de células (2cel) Classificação Embrião não clivado com PN ainda visíveis Embrião não clivado com PN não visíveis Embrião em estágio de 2 células Relevante na determinação do potencial preditivo da clivagem precoce em ciclos nos quais embriões em estágio de 2 células não foram detectados. 27

28 CLIVAGEM PRECOCE Wharf et al., 2004 CLIVAGEM PRECOCE 28

29 CLIVAGEM PRECOCE - PRIMEIRA CLIVAGEM Implicações: Aumento significativo do potencial de desenvolvimento embrionário Alterações no intervalo de clivagem de embriões razões? Exato momento da fertilização e grau de maturidade oocitária parâmetros precisamente controlados em ciclos de ICSI Controle genético através de fatores oocitários desconhecidos Expressão gênica Anomalias cromossômicas Condições do ambiente de cultivo Competência dos gametas feminino e masculino ondas transitórias de cálcio (número, freqüência, amplitude e duração) CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA NOS DIAS DOIS E TRÊS DO DESENVOLVIMENTO MSc. Rita Figueira Fertility 29

30 DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM Número de células: 4 a 5 blastômeros em dia +2 Pelo menos 7 blastômeros em dia +3 Ritmo de clivagem: Ritmo lento ou acelerado de clivagem Comprometimento significativo do desenvolvimento embrionário Maior incidência de anomalias cromossômicas 30

31 NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM 94% 85% 74% 73% 50% 78% NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM 31

32 NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM Categoria No de células d+2 A 4 B 2 ou 5 C 3 ou 6 D 1 ou >6 32

33 NÚMERO DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM Categoria No de células d+2 No de células d+3 A ou 5 >7 B 4 >9 2, 3, 4 6 C 3 >7 >6 * D * <5 * aumento de 1 cel SIMETRIA DE BLASTÔMEROS Parâmetro subestimado na classificação embrionária Indicador clássico da capacidade de desenvolvimento Associado a um aumento da incidência de anomalias cromossômicas Afeta negativamente as taxas de sucesso 33

34 SIMETRIA DE BLASTÔMEROS Distribuição desigual de proteínas, mrna, mitocôndrias e outras organelas Perda da polarização Distribuição desigual de material genético Assimetria x Assincronia SIMETRIA DE BLASTÔMEROS -Simétrico (Si) -Semelhante (Se) -Assimétrico (As) I II Regulares: forma e tamanho semelhantes Irregulares forma ou tamanho (volume dos blastômeros com diferença 31 50%) Presença de blastômeros dominantes (volume de um dos blastômeros > 50% superior ao dos demais) 34

35 CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA No DE CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA ASSINCRONIA X ASSIMETRIA 2 2 CEL = 3 1 CEL GDE 2 CEL MENORES = 4 4 CEL = CEL GDE 2 CEL MENORES = 2 CEL GDE 4 CEL MENORES = 1 CEL GDE 6 CEL MENORES = 8 8 CEL = CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA No DE CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA 7 CEL GDE 2 CEL MENORES = 6 CEL GDE 4 CEL MENORES = 5 CEL GDE 6 CEL MENORES = 4 CEL GDE 8 CEL MENORES = 3 CEL GDE 10 CEL MENORES = 2 CEL GDE 12 CEL MENORES = 1 CEL GDE 14 CEL MENORES = CEL = 35

36 SIMETRIA DE BLASTÔMEROS Implicações: Comprometimento significativo do desenvolvimento embrionário Maior incidência de anomalias cromossômicas Estudo IVI Barcelona embriões avaliados. 980 ciclos de receptoras e 580 ciclos com oócitos próprios. Assimetria x Tx de implantação Tx de implantação Si Se As BD 0.0 Estudo IVI Barcelona Assimetria x Aneuploidia % de embriões aneuplóides <37a >38a Si Se As FRAGMENTAÇÃO Causas exatas ainda não foram estabelecidas Inata ou relacionada a fatores externos Fragmentos anucleados resultantes da clivagem que serão posteriormente reabsorvidos Perda de blastômero por apoptose - controvérsias 41% dos embriões cultivadosinvitro Um dos mais significantes defeitos morfológicos 36

37 FRAGMENTAÇÃO - QUANTITATIVO Classificação: Presente x Ausente A Ausente Volume comprometido no embrião Tamanho e distribuição B 1-10% C 11-20% D 21-35% E > 35% TIPO DE FRAGMENTAÇÃO (Alikani et al., 1999) Tipo I Volume mínimo, fragmentos associados a um blastômero Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo V Fragmentos localizados e predominantemente no espaço perivitelínico Fragmentos pequenos dispersos entre os blastômeros, no espaço perivitelínico ou em ambos Fragmentos grandes semelhantes a blastômeros, distribuídos randomicamente, associados a blastômeros desiguais Fragmentos necróticos, granulosidade e contração citoplasmática característica 37

38 TIPO DE FRAGMENTAÇÃO (Alikani et al., 1999) TIPO DE FRAGMENTAÇÃO TIPO II: Característica: localizada em uma parte da cavidade de clivagem (não dispersa), está associada aos blastômeros, possuindo tamanho e forma regulares. Origem: fragmentação completa de uma ou mais células. Importância: NÃO AFETA O POTENCIAL EMBRIONÁRIO (COMPACTAÇÃO). TIPO III: Característica: pequenas e dispersas por toda a cavidade de clivagem, não variando muito seu tamanho e forma. Origem: inicia-se durante a citocinese, a partir de pequenas vesículas citoplasmáticas e aumentam de acordo com as sucessivas divisões. Importância: NÃO AFETA O POTENCIAL EMBRIONÁRIO, ESPECIALMENTE APÓS REMOÇÃO DE FRAGMENTOS. 38

39 TIPO DE FRAGMENTAÇÃO TIPO IV: Característica: possui tamanho igual ou próximo ao dos blastômeros, sendo assim, é difícil sua diferenciação. Origem: a partir da divisão celular desigual. Importância: COMPROMETE O DESENVOLVIMENTO MESMO COM A RETIRADA DE FRAGMENTOS TIPO DE FRAGMENTAÇÃO Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo V 39

40 FRAGMENTAÇÃO Independente da causa queda significativa do potencial de implantação Fragmentação tipo II e III efeito dependente do volume comprometido no embrião. Controvérsias 10 a 20% Fragmentação tipo IV efeito negativo independente do volume comprometido no embrião FRAGMENTAÇÃO Implicações: Depleção significativa e desigual de organelas e/ou proteínas regulatórias Mosaicismo fragmentos cromossômicos Considerações: Natureza não estática Reabsorção Lise 40

41 DIA +2 41

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43 43

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45 DIA +3 45

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