Thiago Santos de Almeida Lopes 1, André Luíz Alves da Silva 2, Andreia Freitas Silva 3, Gabriely Dias Dantas 4 e Weruska Brasileiro Ferreira 5

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1 Estudo do potencial de geração de biocombustíveis líquidos a partir de microalgas: Utilização de efluentes agroindustriais e domésticos no desenvolvimento da Chlorella sp Thiago Santos de Almeida Lopes 1, André Luíz Alves da Silva 2, Andreia Freitas Silva 3, Gabriely Dias Dantas 4 e Weruska Brasileiro Ferreira 5 1 Graduando em Engenharia Sanitária e Ambiental, CCT/UEPB, thiagosantos_al@outlook.com 2 Graduando em Engenharia Sanitária e Ambiental, CCT/UEPB, nadre.alas@gmail.com 3 Graduanda em Engenharia Sanitária e Ambiental, CCT/UEPB, andreiafreitassilva@gmail.com 4 Graduanda em Engenharia Sanitária e Ambiental, CCT/UEPB, gabrielydias4@gmail.com 5 Professora Doutora do Dept. de Engenharia Sanitária e Ambiental, CCT/UEPB, weruska.brasileiro@pq.cnpq.br Resumo Sabendo-se que os combustíveis fósseis não são renováveis e estão aptos ao esgotamento, os biocombustíveis surgem como alternativa promissora para substituir parcialmente o petróleo e alongar sua vida útil. Nesse sentido as microalgas apresentam-se como uma versátil alternativa para a produção de biocombustíveis, uma vez que assimilam grande taxa de CO 2, possuem um teor de óleo maior que as oleaginosas e não necessitam de grandes extensões de espaço para seu cultivo. O respectivo trabalho teve como objetivo elevar ao máximo o potencial de desenvolvimento da microalga Chlorella sp, visando a produção de biocombustíveis em meios de cultura suplementados com efluentes industriais e efluentes de tratamento anaeróbico de esgoto sanitário, com vistas a reduzir o custo dos cultivos e promover um destino adequado a esses resíduos líquidos. A microalga em estudo foi cultivada utilizando-se o meio de cultura sintético Bold s Basal Medium (BBM), adicionado a diferentes proporções de vinhaça, efluente de reator tipo UASB e efluente de filtro anaeróbio, em meio mixotrófico. Observou-se que os meios de cultivo suplementados com esses efluentes ofereceram características propícias para o desenvolvimento da microalga. Após o alcance da máxima densidade celular, realizou-se centrifugação dos cultivos suplementados com vinhaça e utilizou-se o sobrenadante para composição de novos meios de cultura, que permitiram o crescimento das microalgas, mostrando a possibilidade da reutilização dos meios de cultivo como suplementação nutricional. Desta forma, concluiu-se que há viabilidade no cultivo de microalgas por meio da adição de resíduos líquidos, possibilitando assim a produção de biocombustíveis com menor custo de produção. Palavras-chave: Microalgas, biocombustíveis, reuso, efluentes, Chlorella sp. Abstract Knowing that fossil fuels are not renewable and are fated to exhaustion, biofuels are emerging as a promising alternative to partially replace the petroleum and lengthen its life. In this sense, the microalgae exhibit as a versatile alternative for the production of biofuels, once they absorb large rate of CO 2, have an oil content greater than oilseeds, and do not need large extensions of space for their cultivation. The respective work has had as objective to maximize the development potential of the microalgae Chlorella sp, aiming at the production of biofuels in a culture media supplemented with industrial effluents and of sewage anaerobic treatment of sanitary sewage system, with a view to reduce the cultivation cost and promote a suitable destination to these waste liquids. The microalgae in study was cultivated using the synthetic culture medium Bold's Basal Medium (BBM), added the different proportions of vinasse, effluent of reactor type and UASB effluent from anaerobic filter, in the midst mixotrophic. It was observed that the culture media supplemented with these effluents offered characteristics for the development of the microalgae. After reaching the maximum cell density, it was held centrifugation of cultures supplemented with vinasse and used the supernatant for composition of new media culture, which allowed the growth of microalgae, showing the possibility of reuse of culture media as nutritional supplementation. In this way, it was concluded that there is viability in the cultivation of microalgae through the addition of liquid waste, thus enabling the production of biofuels with a lower production cost. Keywords: Microalgae, biofuels, reuse, effluents, Chlorella sp. I. INTRODUÇÃO O crescente aumento do preço do petróleo, somado aos problemas ambientais causados pela intensificação do efeito estufa, compõem um cenário no qual a utilização de fontes renováveis de energia se torna fundamental para garantir a sustentabilidade das futuras gerações e o equilíbrio do ambiente [1]. A demanda por novas matrizes energéticas no mundo tem impulsionado investimentos nas últimas décadas em diversos países na busca de fontes alternativas de energia. Neste cenário, a produção de biocombustíveis, neutros em emissões nocivas e sem riscos ambientais, configuram uma alternativa de ampla abrangência no contingente de propostas em substituição ao uso dos combustíveis fósseis [2]. Os biocombustíveis, por serem energias renováveis, são apresentados como alternativa aos combustíveis

2 fósseis, contribuindo para a estabilização da concentração de CO 2 na atmosfera e permitindo a ciclagem da matéria na natureza. Derivados geralmente de produtos vegetais, podem ser produzidos utilizando matérias-primas como cana-de-açúcar, mamona, milho, soja, além de outros resíduos agrícolas e excrementos de animais. Devido ao mercado de alimentos, o biodiesel derivado de oleaginosas não supre a demanda existente por combustível para motores a diesel no país. A necessidade de grandes áreas para cultivo torna a produção em larga escala uma realidade distante e contribui para destruição da flora natural, esgotamento da capacidade dos solos e erradicação de espécies. Dentre as propostas em foco, uma série de estudos tem demonstrado as microalgas como a mais promissora fonte de biomassa para a produção de biocombustíveis, devido ao seu rápido crescimento e eficiência fotossintética, permitindo produtividades em óleos muito superiores às outras espécies terrestres utilizadas na produção de biocombustíveis [2]. As algas também apresentam potencial para produção de outras fontes energéticas como metano, etanol e hidrogênio, assim como de biomassa para gaseificação e combustão. A energia proveniente do teor lipídico elevado dessas algas (20% - 50%) é obtida naturalmente convertendo o dióxido de carbono atmosférico por meio da fotossíntese [3]. A produção de biomassa algal em larga escala começou a ser estudada no século XX por meio de tecnologias de cultivo realizadas em tanques abertos e em fotobiorreatores fechados. Nos anos 60, sua produção comercial se voltou principalmente para o uso em suplementos dietéticos e aquicultura, assim como, para pesquisas relacionadas à utilização das microalgas para reciclagem de águas residuais. É geralmente reconhecido que as microalgas desempenham um papel importante na purificação de águas residuais, uma vez que podem ser cultivadas em diferentes meios de cultura e substratos, atuar em processos de tratamento de efluentes e biorremoção de metais pesados [4]. A possibilidade de utilizar nutrientes presentes em efluentes industriais e de tratamento de esgoto doméstico pode reduzir os custos dos cultivos de microalgas, e ainda evitar eutrofização nos corpos receptores [5]. Esgotos sanitários urbanos contêm em média 50 g/m 3 de nitrogênio, sendo que cada m 3 pode contribuir para a formação de 0,5 kg de biomassa para extração de biocombustível. Por outro lado, dentre os sistemas biológicos de tratamento de esgotos, destacam-se os anaeróbios pela possibilidade de produção de metano na forma de biogás dentro da própria ETE. Os reatores UASB incluem amplas vantagens, principalmente no que diz respeito a requisitos de área, simplicidade e baixos custos de projeto, operação e manutenção [6]. Com base nessa perspectiva, muitos países vêm desenvolvendo programas de pesquisa para propiciar produção de microalgas em larga escala buscando elaborar processos eficientes para extração de óleo aproveitando integralmente a biomassa gerada, e identificar as espécies de maior produtividade e fácil cultivo [7]. Este trabalho teve como objetivo maximizar o potencial da microalga Chlorella sp visando a produção de biocombustíveis utilizando como meio de cultura efluentes industriais e de tratamento de esgoto doméstico com vistas a reduzir o custo dos cultivos, bem como promover um destino adequado para esses resíduos líquidos, que, se lançados em corpos hídricos, poderão dar início ao processo de eutrofização devido as altas concentrações de nutrientes. II. MICROALGAS As microalgas pertencem a um grupo muito heterogêneo de organismos. São predominantemente aquáticas, unicelulares com estrutura e organização simples, constituindo a base da cadeia alimentar. Apresentam crescimento rápido podendo formar colônias. Sua coloração varia de acordo com o mecanismo fotoautotrófico e pigmentação presentes. Podem prosperar em águas hiposalinas e hipersalinas, em uma faixa larga de temperatura, suportando diferentes intensidades luminosas e diferentes valores de ph. São consideradas matéria-prima do futuro devido à sua multiplicidade de aplicações em áreas altamente relevantes, tais como: alimentação humana e animal, biocombustíveis, biorremediação ambiental, dermatologia/cosmética, medicina, entre outras. A caracterização e seleção das espécies mais promissoras para cada tipo de aplicação são fatores que contribuem para o sucesso da utilização de biotecnologia algal. As microalgas são responsáveis pela produção primária de pelo menos 60% de oxigênio da Terra [3]. Ao realizar fotossíntese, produzem lipídios de maneira mais eficiente que as plantas terrestres, transformando a energia solar em matéria orgânica [8]. O número exato de espécies microalgais ainda é desconhecido, no entanto, pesquisas indicam que podem existir cerca de até alguns milhões. A. Produção de biocombustíveis a partir de microalgas Para a obtenção dos biocombustíveis, as microalgas podem ser convertidas por métodos termoquímicos e bioquímicos, o que não é uma ideia nova, mas que agora se difunde devido ao aumento do custo do petróleo, bem como a preocupação sobre o aquecimento global decorrente da queima de combustíveis fósseis [9]. Para produção de etanol são utilizadas espécies que produzem altos níveis de carboidratos. Estima-se que a produção a partir das microalgas seja em torno de L/ha [10]. Essa eficiência é maior que a de outras matérias-primas, como está apresentado na Tabela 1.

3 Tabela 1 Rendimento de etanol a partir de diferentes fontes. Fonte Rendimento de Etanol (L/ha) Trigo Mandioca Sorgo doce Milho Beterraba açucareira Microalgas Fonte: [10] A produção de bioetanol a partir de algas marinhas tem um grande potencial para o desenvolvimento sustentável. No entanto a produção de energia a partir de microalgas só será viável economicamente se os custos de produção forem baixos. Microalgas podem oferecer vários tipos de biocombustíveis renováveis. Estes incluem o metano ou biogás, produzidos pela digestão anaeróbica da biomassa, o biodiesel derivado de óleo de microalgas, diohidrogênio produzido pela lignina celulósica por meio da fermentação, e o bioetanol e biobutanol obtido do açúcar da biomassa por meio da fermentação [11]. A Tabela 2 lista as principais fontes de óleo para produção de biodiesel, mostrando que as microalgas tem potencial para substituir completamente as oleaginosas na produção desse biocombustível. Tabela 2 Comparação das microalgas com diferentes culturas na produção de biodiesel. Fonte Rendimento de Óleo (gal/ha.ano) Girassol 102 Amendoim 113 Canola 127 Coco 287 Palma 635 Microalgas Fonte: [12]. As microalgas apresentam rendimentos, tanto em termos de biomassa quanto em produção de óleo, muito superiores aos das principais culturas para a produção de biocombustíveis. No entanto necessita-se de grande investimento para a implementação dessa tecnologia. B. Crescimento das microalgas Conforme a fonte de carbono empregada, os cultivos de microalgas podem ser classificados em três tipos: heterotrófico, onde o fornecimento de carbono é realizado pela introdução de compostos orgânicos apropriados ao meio de cultura (glicose, glicerol, entre outros); mixotrófico, onde o carbono é disponibilizado tanto por meio de compostos orgânicos quanto pelo CO 2 atmosférico (CO 2 inorgânico); autotrófico, onde a única fonte de carbono disponibilizada é o CO 2 inorgânico. Neste caso, o carbono inorgânico pode estar na forma de CO 2, ácido carbônico (H 2CO 3), bicarbonato (HCO 3) ou carbonato (CO 3). A maioria das espécies das microalgas são fotoautotróficas, ou seja, podem obter energia da luz do sol utilizando a atmosfera como fonte de carbono. O cultivo mixotrófico garante maior rendimento de biomassa, no qual atuam o metabolismo heterotrófico e autotrófico. A microalga ao mesmo tempo assimila o CO 2 autotroficamente e o carbono orgânico disponível. Algumas espécies de microalgas estabelecem rendimento muito maior quando cultivadas em regime mixotrófico. A fonte de carbono é um dos principais componentes na produção de biomassa microalgal [13]. O dióxido de carbono (CO 2) é a fonte de carbono preferencial das microalgas, difundindo passivamente do meio de cultivo ao meio intracelular e sendo utilizado diretamente nos processos de fixação de carbono [14]. Portanto, com a adição de CO 2 no meio de cultivo podese aumentar em até sete vezes a multiplicação celular, enquanto que a redução da disponibilidade de carbono pode ser fator limitante para o crescimento microalgal [15]. Em condições favoráveis as microalgas podem crescer rapidamente, duplicando seu número de células por um período de 24h ou menos durante a fase de crescimento exponencial. Um dos métodos para avaliar o crescimento é o aumento da densidade celular, que pode ser percebida através da curva de crescimento apresentada na Figura 1. Figura 1 Curva de crescimento de uma cultura microalgal em relação à disponibilidade de nutrientes. Fonte: [16]. Na construção da curva de crescimento, podem ser identificadas seis fases principais: Fase de adaptação ou lag (1) - caracterizada por intensa atividade celular, a taxa específica de crescimento é nula; Fase de aceleração (2) - taxa de crescimento específico entre nula e máxima; Fase de crescimento exponencial (3) - taxa específica de crescimento máxima; Fase de desaceleração (4) - caracterizada pela diminuição da taxa de crescimento; Fase estacionária (5) - concentração celular máxima e redução contínua da taxa de crescimento específico (até se anular); Fase de declínio (6) - caracterizada pela diminuição de células viáveis possibilitando a lise celular. A curva demostra o potencial de crescimento das microalgas, sendo consideradas possíveis fontes de matéria-prima para produção de biodiesel devido a sua alta produtividade por litro e fácil adaptação às diferentes formas de cultivo.

4 C. Resíduo líquido da indústria sucroalcooleira A vinhaça é um efluente originado do processo de destilação do álcool. Dentre todos os resíduos gerados pela indústria sucroalcooleira é o que apresenta o maior impacto ambiental, uma vez que é gerado na proporção de cerca de 10 litros para cada litro de etanol produzido a partir de processos convencionais de fermentação utilizados no Brasil [17]. A aplicação da vinhaça nos canaviais como fertirrigação é uma prática antiga e muito difundida, sendo relatados diversos benefícios de ordem química, física e biológica ao solo, bem como o aumento da produtividade da cultura da cana-de-açúcar. O valor fertilizante da vinhaça advém fundamentalmente do elevado teor de potássio, e em segundo plano, da matéria orgânica contida no efluente. Entretanto, os mesmos elevados teores de potássio e matéria orgânico solúvel, aliados a elevada DQO (demanda química de oxigênio) e baixo ph desta água residuária, sugerem que sua aplicação no solo deve ser feita de maneira criteriosa [18]. Sua carga poluidora sempre elevada varia em função das características da usina e da eficiência do processo de produção. Possui composição complexa, com características variáveis de parâmetros não controlados como: tipo de solo onde é plantada a canade-açúcar, tipo de cultivo e manejo da lavoura, formas de colheita, dentre outros fatores. Em média, esse efluente tem elevado teor orgânico (aproximadamente 45 g/l, expressa em DQO, baixo ph (em torno de 4,5) e elevada temperatura (90 ºC). Apesar do potencial da vinhaça como meio nutritivo, existem poucos estudos na literatura sobre sua utilização como meio de cultivo para micro-organismos. No tocante as microalgas, os pioneiros relatam a utilização da vinhaça de cana-de-açúcar como complemento do meio de cultivo para espécies de água doce, em pesquisa realizada na Universidade Federal de São Carlos [19; 20]. Dessa forma, o aproveitamento de resíduos líquidos ricos em nutrientes no cultivo de microalgas alicerça uma possibilidade promissora na obtenção de compostos com potencialidade para a geração de energia, ao mesmo tempo em que mitiga os impactos negativos desses resíduos no ambiente. D. Tratamento anaeróbio de esgoto doméstico Antes de ser lançado em corpos de água é necessário que o esgoto seja tratado de forma adequada. A busca por melhores condições ambientais tem exigido das unidades produtoras de águas residuárias a adoção de políticas ambientais que prevejam, entre outros fatores, a instalação de sistemas de tratamento, sejam eles físicos, químicos ou biológicos. O tratamento biológico de águas residuárias vem sendo bastante utilizado e consiste na remoção de nutrientes, sólidos em suspensão, material carbonáceo e organismos patogênicos, promovendo a estabilização do esgoto para que não haja o consumo de oxigênio presente nos corpos d água receptores, podendo ser dividido em duas modalidades: os tratamentos aeróbios e os tratamentos anaeróbios [21]. Os reatores anaeróbios podem ser considerados a opção mais utilizada como alternativa de tratamento de esgotos sanitários, principalmente por não exigir grande área para seu funcionamento [22]. Os sistemas anaeróbios geralmente são constituídos por um reator anaeróbio em um tanque fechado que promove a remoção da matéria orgânica, desprendendo o metano para a atmosfera em função da presença de microrganismos. Esse processo é realizado em quatro etapas (hidrólise, acidogênese, acetogênese e metanogênese), sendo mais indicado para efluentes com uma alta concentração de substâncias orgânicas. Entre os sistemas de tratamento anaeróbio encontram-se os reatores tipo UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket), também chamado de Reator Anaeróbio de Fluxo Ascendente (RAFA), e os filtros anaeróbios. No reator UASB o esgoto passa em fluxo ascendente por uma manta de lodo de elevada atividade microbiana. A ação dos microrganismos sobre os componentes dos esgotos torna-se mais fácil devido a presença do lodo em suspensão [23]. O esgoto é biologicamente degradado na manta de lodo do reator. O compartimento de decantação forma uma zona tranquila que facilita o processo de retorno das partículas suspensas mais pesadas para o interior do reator eliminando as partículas mais leves junto com o efluente final. O gás proveniente da mistura é desprendido pelo separador de fases. Apesar das vantagens do processo, principalmente no que diz respeito ao baixo custo de operação e manutenção, requisitos de área e simplicidade operacional, o sistema ainda apresenta algumas desvantagens como sensibilidade a mudanças nas condições ambientais, baixa capacidade em tolerar cargas tóxicas, elevado intervalo de tempo para a partida do sistema e necessidade de uma etapa de póstratamento [23; 24]. Os filtros anaeróbios são utilizados para tratamento de esgotos desde 1950, sendo os primeiros trabalhos datados da década de 60. Desde então, tem tido uma aplicação crescente, promovendo hoje uma tecnologia avançada para o tratamento dos esgotos domésticos e efluentes industriais [6]. O filtro consiste de um tanque que funciona como reator que estabiliza a matéria orgânica por meio de microrganismos que formam o biofilme aderidos ao leito filtrante, constituído basicamente de pedra ou outro material inerte operando em fluxo vertical, tanto ascendente como descendente [25]. O efluente do filtro anaeróbio é geralmente bastante clarificado apresentando baixa concentração de matéria orgânica, inclusive dissolvida, porém é rico em sais minerais. Sendo indicado para uso (reuso) em hidroponia ou para irrigação com fins produtivos [6]. A importância de introduzir o cultivo de microalgas no tratamento de águas residuárias é que elas necessitam de compostos orgânicos em sua nutrição, favorecendo a redução dos compostos de nitrogênio e fósforo. Com

5 isso, as microalgas reduzem as concentrações desses nutrientes nas águas residuárias, prevenindo a eutrofização de corpos aquáticos [15]. Neste sentido, uma boa alternativa é aliar a produção de microalgas com meios de cultura alternativos, entre os quais é possível destacar: águas residuárias, efluentes de biodigestores, lodo digerido, vinhaça de cana-de-açúcar, dentre outros. III. A. Microalga Chlorella sp METODOLOGIA O presente estudo foi realizado no Laboratório de Saneamento do Centro de Ciências e Tecnologia (CCT) da Universidade Estadual da Paraíba (UEPB) utilizando cepas da microalga de espécie Chlorella sp fornecidas pelo Laboratório de Biologia Marinha da Universidade Federal Fluminense e pelo Laboratório de Biotecnologia Alimentar da Universidade Federal de Santa Catarina. A Figura 2 representa a fotomicrografia das cepas da microalga Chlorella sp. Figura 2 Fotomicrografia da microalga Chlorella sp. para o efluente de UASB e 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100% para o efluente de filtro anaeróbio. Objetivando uma maior redução com os custos de cultivos foi também estudada a reutilização do meio de cultura após separação das microalgas nas proporções de 25, 50, 75 e 100%. Essa reutilização foi realizada apenas nos cultivos suplementados com a vinhaça, que, dos três efluentes, é a mais tóxica. Assim, caso a Chlorella sp obtivesse um bom desenvolvimento com a suplementação de vinhaça, provavelmente também obteria bom desenvolvimento nos demais efluentes estudados. D. Aclimatação dos cultivos A aclimatação dos cultivos foi realizada de modo a estabelecer um ambiente propício para a otimização do crescimento da Chlorella sp. Cada unidade experimental (fotobioreator) consistiu de uma cultura microalgal desenvolvida em frasco de vidro do tipo Erlenmeyer. Os fotobioreatores foram mantidos a temperatura de 26 C±2 sob agitação, devido à injeção de ar comprimido (aeração), e expostos por um período de 12 horas à iluminação de lâmpadas fluorescentes de 40W. A Figura 3 ilustra as condições de aclimatação adotadas para o desenvolvimento das microalgas. Figura 3 Aclimatação dos cultivos. B. Meio de cultivo Para o cultivo da Chlorella sp utilizou-se o meio sintético Bold s Basal Medium (BBM), recomendado pelo Centro de Cultura de Algas e Protozoários de Cambridge, suplementado com extrato de levedura. Para avaliação do crescimento da Chlorella sp foram desenvolvidas culturas em meio líquido por meio de repiques de culturas algais mantidas em meio sólido. C. Resíduos líquidos suplementados ao meio de cultivo O estudo foi realizado utilizando resíduos líquidos de grande impacto ambiental: vinhaça e efluentes de tratamento anaeróbio de esgoto sanitário provenientes de reator tipo UASB e de filtro anaeróbio. Para melhor avaliação, devido as grandes quantidades utilizadas, o ph da vinhaça foi corrigido para a neutralidade e os efluentes de tratamento anaeróbio foram filtrados, retendo sólidos suspensos. Todos foram armazenados sob refrigeração. Com o intuito de verificar a concentração de melhor adaptação da Chlorella sp, os efluentes foram adicionados em diferentes proporções ao meio de cultura. As proporções, em volume, adicionadas, foram de 5, 10 e 15% para a vinhaça, 10, 30, 50, 70 e 100% E. Avaliação do crescimento da Chlorella sp Com o auxílio da microscopia óptica foi possível determinar o crescimento das microalgas avaliando-se a densidade celular em função do tempo de cultivo em cada uma das unidades experimentais. As amostras foram retiradas a cada 24 horas após o início dos cultivos para contagem de células em câmara de Neubauer, determinando, desse modo, a densidade celular expressa em número de células por mililitro de cultivo (células.ml -1 ). A contagem de células foi realizada em triplicata. O número de células corresponde à média geométrica das três contagens. O tempo de cultivo foi expresso pela quantidade de dias decorridos desde o início da inoculação (período de adaptação fase lag) até o alcance máximo da densidade celular (fase estacionária). Os gráficos de dispersão foram plotados para representar as curvas de crescimento da Chlorella

6 sp, onde o eixo das abscissas corresponde ao o tempo de cultivo em dias e o eixo das ordenadas ao número de células.ml -1. F. Separação do resíduo de cultivo A separação do resíduo de cultivo foi realizada pelo método da centrifugação utilizando, para tal, uma centrífuga de alta rotação da marca TARFEC - Mod - CP0603 mantendo, por um período de 8 minutos, uma rotação de 3000 RPM. O resíduo de cultivo, então separado da biomassa, foi armazenado sob refrigeração para posterior reutilização. G. Cálculo da velocidade específica de crescimento A velocidade de crescimento é diretamente proporcional à concentração de microrganismos em um dado instante. A fração pela qual a população cresce na unidade de tempo é dada por μ máx, que representa a velocidade específica de crescimento e tem unidade de tempo h -1. Na fase exponencial (ou logarítmica) a velocidade específica de crescimento é constante e máxima, sendo μ x igual a μ máx. A velocidade de crescimento pode ser calculada através da Equação 1, onde t e x correspondem, respectivamente, ao tempo e à concentração de microrganismos no final da fase exponencial de crescimento. Já t i e x i são os parâmetros relacionados ao início dessa fase. ln(x) = μ máx (t ti) + ln(xi) (1) A representação gráfica de ln (x) versus o tempo de cultivo, na fase exponencial, resulta em uma reta com coeficiente angular igual à velocidade específica máxima de crescimento μ máx. A fase exponencial também é caracterizada pelo tempo de geração (t g ), que é o tempo necessário para dobrar o valor da concentração celular (x = 2x i). O tempo de geração, t g, pode ser calculado através da Equação 2. t g = ln(2) μ máx = 0,693 μ máx (2) H. Análise de remoção da Demanda Química de Oxigênio (DQO) As análises de DQO foram realizadas nos cultivos suplementados com vinhaça, que dos três efluentes estudados é a mais tóxica. Uma vez que a Chlorella sp promoveu boa remoção de DQO nos meios de cultivo suplementados com vinhaça, provavelmente também promoveria boa remoção de DQO nos demais efluentes estudados. O equipamento utilizado foi o Fotocolorímetro Digital AquaColor DQO, onde os reagentes utilizados foram fornecidos pelo fabricante. As análises foram realizadas nos meios de cultivo (BBM suplementado com vinhaça nas proporções de 5, 10 e 15%) antes do inóculo das microalgas, para evitar interferências nas leituras causadas pelas células. Após o tempo de estudo que serviu para acompanhar o crescimento das microalgas, separou-se a biomassa dos cultivos por meio da centrifugação e analisou-se a DQO dos sobrenadantes. Desse modo, foi possível comparar os valores de DQO inicial e DQO final para verificar se a microalga Chlorella sp promoveu redução. As análises foram realizadas em triplicata e as porcentagens de remoção de DQO foram calculadas segundo a Equação 3, onde DQO inicial é a Demanda Química de Oxigênio do meio de cultivo com adição de vinhaça e DQO final é a Demanda Química de Oxigênio do sobrenadante do cultivo, após o desenvolvimento e separação das microalgas. %remoção DQO = DQO inicial DQO final DQO inicial 100. (3) IV. RESULTADOS E DISCUSSÕES Este estudo teve como base o aproveitamento de resíduos líquidos, de alto impacto ambiental, para o desenvolvimento da microalga Chlorella sp em fotobioreatores visando à obtenção de biocombustível. Com o intuito de estudar o crescimento celular em função das diferentes concentrações e formulações do meio de cultura utilizado, foram plotadas curvas de crescimento para cada experimento, analisando a densidade celular obtida pela contagem diária de células. A. Crescimento da Chlorella sp em meio de cultivo BBM suplementado com vinhaça Com o intuito de verificar a concentração de melhor adaptação da Chlorella sp, a vinhaça foi adicionada nas proporções de 5, 10 e 15%. Devido à sua alta toxicidade, concentrações maiores que 15% de vinhaça adicionadas ao meio de cultivo resultaram na inibição do desenvolvimento da espécie estudada. No estudo ilustrado, na Figura 4, observa-se o crescimento da Chlorella sp, em meio de cultivo BBM contendo 5% de vinhaça, sendo essa a concentração que desenvolveu o maior número de células. Verifica-se que o cultivo teve uma ótima taxa de crescimento, atingindo, como média das três contagens, uma densidade celular de 1, cél.ml -1 em um tempo de cultivo de 7 dias, e no oitavo dia apresentou declínio que pode ter ocorrido pela escassez de nutrientes devido o consumo acelerado por sua alta população.

7 Figura 4 Curva de crescimento da Chlorella sp em cultivo BBM com 5% de vinhaça. Estudos do crescimento da Chlorella vulgaris em meio de cultura Conway modificado com fotoperíodo de 12 horas em fotobioreatores de vidro de 250 ml com intensidade luminosa de 4000 lux, obtiveram a densidade máxima celular no oitavo dia cultivo de 2, cel.ml -1. Porém, estes estudos alcançaram melhores resultados quando realizados com fotoperíodo integral, atingindo o número máximo de células no nono dia de cultivo com um valor de 9, cél.ml -1 [26]. Comparando-se esses estudos com a suplementação de vinhaça verifica-se que ela proporciona um maior rendimento celular. A Figura 5 representa o comparativo entre os cultivos obtidos com suplementação de 5, 10 e 15% de vinhaça. Os melhores resultados foram obtidos a partir das menores concentrações de vinhaça, que apresentaram semelhante produção de biomassa e excelente crescimento celular, na grandeza de 10 8 cel.ml -1. Figura 5 Comparativo entre os cultivos suplementados com vinhaça nas proporções de 5, 10 e 15%. A Tabela 3 mostra as velocidades específicas de crescimento máximas e os tempos de geração dos cultivos com suplementação orgânica de vinhaça. Os cultivos realizados com vinhaça nas proporções de 5 e 10% apresentaram taxas de crescimento semelhantes, assim como de produção de biomassa. Utilizando-se a concentração de 10% de vinhaça para a produção de biocombustíveis ocorrerá uma maior redução de custos dos cultivos, ao mesmo tempo em que promove uma destinação adequada para esse efluente industrial. Então, a concentração de vinhaça mais recomendada para o cultivo da Chlorella sp é a de 10%. A Tabela 3 também apresenta o coeficiente de determinação (R²), cujos valores elevados indicam que houve um excelente ajuste amostral ao modelo de estudo utilizado. Tabela 3 Velocidades específicas de crescimento máximas e tempos de geração da Chlorella sp em cultivo mixotrófico sob diferentes concentrações de vinhaça. Vinhaça (%) Velocidade específica μmáx (h -1 ) R² Tempo de geração (h) 5 0,020 0,972 34, ,018 0,987 38, ,008 0,979 86,643 A microalga Chlorella sp proporcionou uma alta remoção da carga poluidora dos meios de cultura suplementados com vinhaça. Na Tabela 4 pode-se observar que as porcentagens de remoção de DQO foram satisfatórias e praticamente constantes, não sofrendo variação com o aumento da concentração de vinhaça. Essa observação provavelmente não ocorreria se as concentrações fossem superiores a 15%, visto que o crescimento da microalga seria afetado negativamente. Como prova disso, estudos com a Chlorella vulgaris em 100% de vinhaça obtiveram apenas 25% de remoção de DQO e baixo crescimento celular [17]. Tabela 4 Remoção de DQO dos cultivos suplementados com vinhaça. Vinhaça (%) DQOinicial DQOfinal Remoção de DQO (%) (mg.l -1 ) (mg.l -1 ) ,33 190,00 87,57 ± 1, ,00 528,33 83,09 ± 2, ,33 705,00 84,62 ± 3,36 Após definir a melhor concentração de vinhaça a ser utilizada para produção de biocombustíveis, foi também estudada a reutilização do meio de cultura após a extração das microalgas, que ocorreu por meio da centrifugação. Reutilizou-se nas proporções de 25, 50, 75 e 100% o sobrenadante do cultivo suplementado com 10% de vinhaça, para realização de novos cultivos. A Figura 6 ilustra a curva de crescimento da microalga em meio BBM com adição de 25% de sobrenadante. A microalga apresentou rápida adaptação e o cultivo chegou a uma média de densidade celular máxima de 3, cel.ml -1, partindo de uma população de 1, cel.ml -1. Dentre as proporções de sobrenadante utilizadas, a de 25% foi a que resultou no melhor crescimento da Chlorella sp.

8 Figura 6 Curva de crescimento da Chlorella sp em cultivo BBM com 25% de sobrenadante do cultivo de 10% de vinhaça. A Figura 7 representa o comparativo entre os cultivos obtidos com suplementação de 25, 50, 75 e 100% de sobrenadante do cultivo de 10% de vinhaça. Todos os cultivos obtiveram ótimo crescimento celular, na ordem de 10 7 cel.ml -1, confirmando assim a alta concentração de nutrientes e a eficiência de se reutilizar o meio de cultura após extração das microalgas. Figura 7 Comparativo entre os cultivos suplementados com sobrenadante nas proporções de 25, 50, 75 e 100%. maior taxa de crescimento e o melhor tempo de geração, mostrando que a microalga desenvolveu um bom crescimento nessa concentração. Analisando-se as variáveis de crescimento e verificando-se que não houve diferença significativa entre o número final de células dos cultivos com 25 e 50% de sobrenadante, recomenda-se a utilização da proporção de 50% para a produção de biocombustíveis, pois promoverá maior redução de custos. B. Crescimento da Chlorella sp em meio de cultivo BBM suplementado com efluente de UASB Com o intuito de verificar a concentração de melhor adaptação da Chlorella sp, o efluente de UASB foi adicionado como suplemento ao Bold s Basal Medium (BBM) nas proporções de 10, 30, 50, 70 e 100%. A Figura 8 representa a curva de crescimento do cultivo realizado com efluente do reator tipo UASB na proporção de 30%, que foi a que gerou o maior número de células da microalga Chlorella sp. Pode-se observar que ao término do experimento o número máximo de células alcançado foi de 1, cel.ml -1. Figura 8 Curva de crescimento da Chlorella sp em cultivo BBM com 30% de efluente de UASB. A Tabela 5 ilustra as velocidades específicas de crescimento máximas e os tempos de geração dos cultivos suplementados com o sobrenadante do cultivo de 10% de vinhaça. Tabela 5 Velocidades específicas de crescimento máximas e tempos de geração da Chlorella sp em cultivo mixotrófico sob diferentes concentrações de sobrenadante. Sobrenadante (%) Velocidade específica μmáx (h -1 ) R² Tempo de geração (h) 25 0,035 0,996 19, ,057 0,930 12, ,031 0,969 22, ,039 0,967 17,77 O cultivo realizado com 25% de sobrenadante apresentou o maior número de células, indicando que nessa concentração houve uma melhor adaptação da microalga em estudo. Por outro lado, o cultivo realizado com sobrenadante na proporção de 50% apresentou a A Figura 9 representa o cultivo suplementado com 50% de efluente do reator UASB, sendo essa a concentração de efluente que proporcionou a maior velocidade de crescimento da Chlorella sp. O cultivo foi iniciado com uma concentração celular de 1, cel.ml -1 e finalizou com 5, cel.ml -1. A Figura 10 representa o comparativo entre os cultivos obtidos com suplementação de 10 a 100% de efluente de UASB. O cultivo realizado com efluente do reator tipo UASB na porcentagem de 30% apresentou maior desempenho para produção de biomassa, porém as outras concentrações não devem ser desprezadas e podem ser utilizadas.

9 Figura 9 Curva de crescimento da Chlorella sp em cultivo BBM com 50% de efluente de UASB. Figura 10 Comparativo entre os cultivos suplementados com efluente de UASB nas proporções de 10 a 100%. A Tabela 6 mostra as velocidades específicas de crescimento máximas e os tempos de geração dos cultivos com suplementação orgânica de efluente de UASB. Os dados indicam um melhor crescimento das microalgas nas concentrações de 30 e 50%, cujas amostras foram as que melhor se ajustaram ao modelo de estudo utilizado, como indicam os elevados valores de R². Tabela 6 Velocidades específicas de crescimento máximas e tempos de geração da Chlorella sp em cultivo mixotrófico sob diferentes concentrações de efluente de UASB. Efluente de UASB (%) Velocidade específica μmáx (h -1 ) R² Tempo de geração (h) 10 0,0262 0, , ,0407 0, , ,0439 0, , ,0285 0, , ,0222 0, ,2228 O cultivo suplementado com 30% de efluente de UASB, apesar de uma menor taxa de crescimento quando comparado ao de 50%, desenvolveu um número bem maior de células. Isso ocorreu porque a célula se adaptou melhor ao meio com concentração de 30%, pois houve uma fase lag menor quando comparado com o cultivo de 50%. Então, a concentração mais recomendada para o cultivo da Chlorella sp é a de 30% de efluente de UASB. Na Tabela 6 também é possível observar os tempos de geração dos cultivos estudados e verifica-se que ao se adicionar o efluente de UASB, em concentrações de até 50% do meio de cultura, o tempo de geração diminui. Após o percentual de 50% as células apresentam maior dificuldade para o seu desenvolvimento, que pode ser comprovado pelo tempo de geração da célula que aumenta à medida que a suplementação de efluente de UASB no cultivo é aumentada. Isto fica mais evidente quando se compara o melhor tempo de geração obtido, cerca de 16 horas, com o do máximo de efluente UASB utilizado, cerca de 31 horas. O mesmo pode ser observado com as velocidades específicas de crescimento. C. Crescimento da Chlorella sp em meio de cultivo BBM suplementado com efluente de filtro anaeróbio Com o intuito de verificar a concentração de melhor adaptação da Chlorella sp, o efluente de filtro anaeróbio foi adicionado como suplemento ao Bold s Basal Medium (BBM) nas proporções de 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100%. A Figura 11 ilustra os dados experimentais do cultivo realizado com efluente de filtro anaeróbio que obteve melhor desenvolvimento da Chlorella sp, que foi aquele na proporção de 10%. O cultivo teve seu início com uma densidade populacional de 1, cel.ml -1 e apresentou no quinto dia uma população de 3, cel.ml -1. Verificou-se no cultivo um crescimento crescente e contínuo. É importante ressaltar que as demais concentrações de efluente de filtro anaeróbio utilizadas nos cultivos também proporcionaram resultados satisfatórios, possibilitando o desenvolvimento das microalgas em estudo. Figura 11 Curva de crescimento da Chlorella sp em cultivo BBM com 10% de efluente de filtro anaeróbio. Estudos sobre a utilização de efluente de suíno, rico em fósforo e nitrogênio inorgânicos, para a produção de biomassa de microalga Spirulina platensis resultaram em remoção de DQO e fósforo, além da produção de biomassa [27]. Igual semelhança com a utilização do

10 efluente do filtro anaeróbio destaca a solução para o impacto ambiental gerado pelo lançamento de efluentes em fontes naturais. Outros estudos revelaram que algas isoladas de estações de tratamento de águas residuárias ou de corpos d água adaptam-se melhor às condições práticas de cultivo e demonstram maior eficiência na remoção de nutrientes inorgânicos [28]. A Figura 12 apresenta o comparativo entre os cultivos suplementados com efluente de filtro anaeróbio nas proporções de 5 a 100%, destacando-se maior eficiência para produção de biocombustível as concentrações de 10 e 80%. O efluente pode ser utilizado em sua totalidade sem adição do meio sintético, com objetivo de tratamento do mesmo, favorecendo a redução dos nutrientes presentes em tais efluentes, assim como o desenvolvimento das microalgas. Figura 12 Comparativo entre os cultivos suplementados com efluente de filtro anaeróbio nas proporções de 5 a 100%. A Tabela 7 mostra as velocidades específicas de crescimento máximas e os tempos de geração dos cultivos com suplementação orgânica de efluente de filtro anaeróbio. Os dados indicam um ótimo crescimento das microalgas nas concentrações superiores a 10%. O cultivo suplementado com 10% de efluente de filtro anaeróbio, apesar de possuir a terceira menor taxa de crescimento quando comparado com as demais concentrações, desenvolveu um maior número de células. Isso ocorreu porque a célula se adaptou melhor ao meio com concentração de 10%, pois houve uma fase lag menor quando comparado os demais cultivos. Observou-se que os cultivos de concentração igual ou superiores a 40% de efluente de filtro anaeróbio apresentaram excelentes velocidades específicas de crescimento, além do desenvolvimento de um número considerável de células. Isso indica que o efluente de filtro anaeróbio pode compor parte ou até a totalidade do meio de cultura da espécie estudada, reduzindo o custo do cultivo com a redução da utilização do meio sintético e ainda destinando de forma adequada os resíduos líquidos provenientes do filtro anaeróbio. Observando-se os tempos de geração na Tabela 7 percebeu-se que todos os cultivos resultaram em tempos de geração parecidos, mostrando que as microalgas da espécie Chlorella sp desenvolveram-se de forma semelhante nas diversas concentrações do efluente de filtro anaeróbio e tendo um crescimento mais acelerado na concentração de 40%. Tabela 7 Velocidades específicas de crescimento máximas e tempos de geração da Chlorella sp em cultivo mixotrófico sob diferentes concentrações de efluente de filtro anaeróbio. Efluente de f. anaeróbio (%) Velocidade específica μmáx (h -1 ) R² Tempo de geração (h) 5 0,0140 0, , ,0291 0, , ,0277 0, , ,0728 0, , ,0373 0, , ,0380 0, , ,0548 0, ,472 A adição do efluente de filtro anaeróbio forneceu matéria orgânica e suplementação nutritiva ao meio, fazendo com que as microalgas pudessem se desenvolver acima do esperado tendo em vista o aumento na densidade populacional das mesmas. É importante ressaltar que a velocidade específica de crescimento e o tempo de geração estão diretamente ligados ao bom crescimento da microalga. Analisando essas variáveis em conjunto com o número final de células, recomenda-se o uso de concentrações de 40% de efluente de filtro anaeróbio nos cultivos. D. Análise comparativa do desenvolvimento da microalga Chlorella sp nos efluentes estudados A Figura 13 apresenta o comparativo das melhores proporções dos efluentes estudados na suplementação do meio de cultura da microalga Chlorella sp. As melhores concentrações foram definidas levando-se em consideração o número final de células, a taxa de crescimento das microalgas e a possibilidade de maior redução de custos nos diversos cultivos estudados. Figura 13 Comparativo entre os cultivos suplementados com vinhaça, efluente de UASB e efluente de filtro anaeróbio. Dentre todos os experimentos realizados, os que apresentaram melhor rendimento foram os cultivos suplementados com efluente de UASB na concentração de 30% e com vinhaça na concentração de 10%, sendo

11 essas as substituições mais viáveis para produção de biomassa, e assim de biocombustíveis. Porém, o uso do efluente de filtro anaeróbio não deve ser desprezado, pois o mesmo promove uma maior redução nos custos do cultivo de microalgas, uma vez que pode substituir totalmente o meio sintético, e ainda promove ótimo crescimento celular, na ordem de 10 7 células.ml -1. A reutilização do meio de cultura dos cultivos com vinhaça, ou seja, a utilização do seu sobrenadante após separação das microalgas, proporcionou ótimo crescimento celular, na ordem de 10 7 células.ml -1, mostrando assim a alta concentração de nutrientes e a eficiência de utilizar esse resíduo pela segunda vez, onerando custos energéticos, contudo diminuindo com a utilização do meio sintético. Os reatores UASB e os filtros anaeróbios, além de serem sistemas simples e de baixo custo para o tratamento de esgotos domésticos, quando aliados à produção de microalgas promoverão a produção de biocombustíveis, que gerarão energia e reduzirão ainda mais os custos de tratamento. Então, além da destinação ambientalmente adequada para os efluentes desses sistemas através de sua utilização no cultivo de microalgas, o uso dos efluentes de UASB e filtro anaeróbio poderão ser uma alternativa para incentivar o tratamento de esgoto doméstico nos municípios que ainda não possuem esse sistema, principalmente na região Nordeste, que apresenta o maior déficit no que diz respeito à coleta e tratamento de esgotos sanitários. V. CONCLUSÕES Perante a avaliação do desenvolvimento da microalga Chlorella sp por meio do uso de vinhaça, efluente de reator UASB e efluente de filtro anaeróbio como suplementação nutricional, visando a produção de biocombustíveis, pôde-se concluir que: O uso do cultivo de microalgas para o tratamento de efluentes acoplado à geração de biocombustíveis é uma opção atrativa na medida em que possibilita redução de custos energéticos e de emissão de gases de efeito estufa, assim como a minimização de nutrientes lançados aos corpos hídricos que favorecem a eutrofização; Os cultivos suplementados com 10% de vinhaça e 30% de efluente do reator UASB apresentaram excelente desenvolvimento celular, alcançando densidades máximas na ordem de 10 8 células.ml -1. O desenvolvimento da biomassa com elevada produtividade permite a extração de grandes concentrações de lipídios viabilizando a produção de biocombustíveis; A reutilização do meio de cultura oriundo dos cultivos com vinhaça proporcionou ótimo crescimento celular, na ordem de 10 7 células.ml -1, mostrando a eficiência de utilizar esse resíduo pela segunda vez, reduzindo custos energéticos; O uso do efluente de filtro anaeróbio apresentou a possibilidade de uma maior redução nos custos dos cultivos de microalgas, uma vez que, ao substituir totalmente o meio sintético, promoveu ótimo crescimento celular da Chlorella sp, na ordem de 10 7 células.ml -1 ; A produtividade elevada da biomassa de microalgas a partir de águas residuárias sugere que este método de cultivo favorece a viabilidade de geração de biocombustíveis, sendo assim avaliado como uma abordagem sustentável e renovável para produção de energia. REFERÊNCIAS [1] GARCILASSO, V. P. 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