Comunicação. Efeito da raça e qualidade do corpo lúteo na taxa de prenhez de receptoras. de embrião bovino. Borges 4

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1 Comunicação Efeito da raça e qualidade do corpo lúteo na taxa de prenhez de receptoras de embrião bovino. Ériklis Nogueira 1, Gabriel Saravi Cardoso 2 ; Heitor Romero Marques Junior 2, Alexandre Menezes Dias 3, Luis Carlos Vinhas Itavo 3 e Juliana Corrêa Borges 4 (1) CPAP- EMBRAPA PANTANAL- Corumbá, MS- eriklis@cpap.embrapa.br (2) Curso Medicina veterinária UCDB- Campo Grande, MS (3) Programa de Pós Graduação em Biotecnologia UCDB- Campo Grande, MS (4) Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal FCAV-UNESP Jaboticabal RESUMO- Objetivou-se com este trabalho, avaliar as taxas de prenhez de receptoras de diferentes grupos raciais (Nelore e cruzadas), bem como os efeitos do tamanho e tipo do corpo lúteo nas concentrações plasmáticas de progesterona e taxas de prenhez de receptoras de embrião bovino. Foram utilizadas 152 receptoras sincronizadas com implantes de progesterona. No dia da transferência dos embriões, previamente obtidos por superovulação e congelados em etilenoglicol, foi avaliado o diâmetro e tipo do corpo lúteo (cavitário e compacto) e retirado sangue para dosagem de progesterona das receptoras. A taxa de prenhez foi de 44,1%, com diâmetro de corpo lúteo superior (P<0,05) em receptoras que ficaram prenhes (2,03 ± 0,41), quando comparado a não-prenhes (1,86 ± 0,34 cm). A concentração plasmática de progesterona não diferiu entre prenhes (1,50 ± 1,05) e não-prenhes (1,31 ± 0,91 ng/ml). O tipo de corpo lúteo não influenciou nas taxas de prenhez (P>0,05). Apenas animais cruzados Angus e Marchigiana apresentaram diferenças (P<0,05) entre si nas taxas de prenhez (33,3 e 59,2%, respectivamente). Conclui-se que a seleção do tamanho do corpo lúteo no momento da inovulação é fator importante para elevar as taxas de prenhez em receptoras, e corpos lúteos cavitários e compactos não influenciam nas taxas de prenhez de receptoras de embrião bovino. Receptoras da raça Nelore apresentam taxas de prenhez satisfatórias e comparáveis às taxas de prenhez de receptoras cruzadas (Bos taurus taurus x Bos taurus indicus). Palavras-chave- Corpo lúteo cavitário, progesterona, ultrasom, Nelore. 1

2 ABSTRACT - The objective of this study was to evaluate pregnancy rates of recipients of different breed groups (Nellore and crossbreed), as well as the effects of size and type of the corpus luteum (CL) on plasmatic concentrations of progesterone and pregnancy rates of embryo recipients. A total of 152 heifers were synchronized with progesterone implants and on the day of embryo transfer, previously obtained by superovulation and frozen in ethylene glycol, the diameter and type of the corpus luteum (cavitary and compact) was measured and blood was collected for progesterone measurement. The pregnancy rate was 44.1%, with a diameter of corpus luteum higher in recipients that became pregnant (2.03±0.41) compared with nonpregnant ones (1.86±0.34 cm). Plasmatic concentrations of progesterone did not differ between pregnant (1.50±1.05) and non-pregnant (1.31±0.91 ng/ml) animals. The type of corpus luteum did not influence the pregnancy rates. Only Angus and crossbred Marchigiana differ among themselves in pregnancy rates (33.3 and 59.2%, respectively). The pregnancy probability was affected only by CL diameter, but not by P4 plasmatic concentration. Selection of the corpus luteum size at the time of embryo transfer is an important factor to increase pregnancy rates in recipients, and compact and cavitary corpora lutea do not influence the pregnancy rates of bovine embryo recipients. Nellore recipients have pregnancy rates that are satisfactory and comparable to crossbred (Bos taurus Bos indicus) recipients. Key Words: cavitary corpus luteum, Nellore, progesterone, ultrasound 2

3 Introdução A transferência de embriões (TE) é uma biotécnica que acelera o melhoramento genético por aumentar o número de descendentes de uma doadora de genética superior em curto período de tempo. Dentre os fatores a considerar nos programas de TE, as receptoras destacam-se por ser fator determinante no sucesso dessa biotecnologia (Spell et al., 2001). O custo de manutenção de fêmeas cruzadas Bos taurus indicus x Bos taurus taurus não gestantes como receptoras de embrião, aliado às baixas taxas de aproveitamento, eleva o custo dessa biotecnologia. Atualmente alguns produtores têm utilizado animais da raça Nelore como receptoras, porém são poucos os dados na literatura e com resultados controversos. Tais dados são fundamentais, devido à obrigatoriedade da utilização de receptoras com genética zebuína nos processos de TE e fertilização in vitro (FIV) para as raças Brahman, Cangaian, Indubrasil, Nelore e Sindi a partir de 2014 (Abcz, 2010). O estabelecimento e a manutenção da gestação envolvem complexa interação entre o embrião, o ambiente uterino e o corpo lúteo (CL) (Mann et al., 1995). As taxas de gestação de embriões oriundos de superovulação (SOV) ou FIV são menores que as obtidas por inseminação artificial ou monta natural (Peterson & Lee, 2003). Tais resultados podem estar associados ao subdesenvolvimento dos embriões, à assincronia útero-embrião e à má qualidade do CL das receptoras (Sreenan & Diskin, 1987), resultando em falhas no reconhecimento materno e manutenção da gestação. CLs cavitários são encontrados entre 40 a 80% dos ciclos estrais de vacas e novilhas tratadas com progesterona (P4) ou prostaglandina, e as concentrações de P4 não são influenciadas pela presença da cavidade (Spell et al., 2001; Marques et al., 2002). Entretanto o aproveitamento de receptoras com CL cavitários tem gerado 3

4 controvérsias (Grygar et al., 1997; Marques et al., 2002; Looney et al., 2006; Siqueira et al., 2009 a). Baruselli et al. (2001) encontraram aumento da concentração de P4 de acordo com o aumento do CL em receptoras cruzadas, e segundo Binelli et al. (2001) CLs maiores em receptoras podem aumentar as taxas de prenhez nos programas de TE. Entretanto Nogueira et al. (2004) encontraram um resultado inverso, no qual receptoras que receberam doses de 400 e 600 UI de Gonadotrofina Coriônica Equina (ECG) apresentaram maiores concentrações de P4 e maiores CLs, porém menores taxas de prenhez que animais que não receberam ou receberam 200 UI de ECG. Objetivou-se com este trabalho comparar as taxas de prenhez de receptoras da raça Nelore e receptoras cruzadas (Bos taurus taurus x Bos taurus indicus), bem como avaliar os efeitos do tamanho e tipo do corpo lúteo nas concentrações plasmáticas de P4 e taxas de prenhez de receptoras de embrião bovino. Material e Métodos O experimento foi realizado na Fazenda Band`alta, localizada no município de Corumbá MS (lat 19 7'26.39"S, long 57 32'42.14"O), no período de janeiro a abril de Inicialmente foram sincronizadas 201 vacas e novilhas Bos taurus indicus e Bos taurus indicus x Bos taurus taurus, em 3 lotes, com intervalos de 40 dias entre eles. Foram utilizadas fêmeas das raças Nelore e cruzadas das raças Angus, Caracu, e Marchigiana. Os dados das receptoras cruzadas das raças Simental e Pardo Suíço foram agrupados e analisados conjuntamente no grupo denominado mestiças. Os animais apresentaram escore de condição corporal regular 3 em escala de 1 a 5 (Ferreira, 1991). Esses animais foram mantidos a pasto formado com capim B. brizantha e B. decumbens, recebendo sal mineral (80g P/kg) e água à vontade. 4

5 Para a sincronização, os animais receberam dispositivo intravaginal novo, contendo 1g de P4 (PRIMER, Tecnopec, Brasil) e 2 mg de benzoato de estradiol (BE) (ESTROGIN, Farmavet, Brasil), por via intramuscular (IM), em dia aleatório do ciclo estral (dia 0) após prévia avaliação ginecológica para avaliação de tonicidade uterina e presenças de estruturas ovarianas indicativas de ciclicidade (CL ou folículo> 10 mm). O dispositivo foi removido no oitavo dia pela manhã e foi administrado 0,150 mg de d- cloprostenol (PGF 2α ) (PROLISE, Tecnopec, Brasil) e 10 UI de FSH (Hormônio Folículo Estimulante-FOLLTROPIN, Tecnopec, Brasil), por via IM. Foi administrado 1 mg de BE (ESTROGIN, Farmavet, Brasil) no nono dia pela manhã, com observação de estro no dia 10. No dia 17 após a colocação dos implantes, foi realizada a avaliação das receptoras com auxilio de um aparelho de ultra-som com sonda linear de 8,0 MHZ (Falcon 100- PIE MEDICAL ), para verificar a resposta ao protocolo e avaliar o diâmetro e tipo de CL (Figura 1- CL cavitário e figura 2- CL compacto). Neste mesmo dia realizou-se a TE, pelo método não cirúrgico, pelo mesmo veterinário, com embriões de grau de qualidade 1 e 2, segundo a IETS (1998), congelados anteriormente em etilenoglicol e descongelados one-step, oriundos de 12 doadoras Nelore submetidas à superovulação com aplicação de FSH. No dia da TE, foi realizada a coleta de sangue das receptoras logo após as inovulações dos embriões, em tubos vacuolizados de 10 ml, com heparina, via punção da veia coccígea, que foram estocados em isopor em temperatura de 5 C. Os plasmas foram acondicionados em microtubos identificados e estocados à temperatura de -20 C, após centrifugação a g por 10 minutos. 5

6 Figura 1- Imagem de avaliação Ultrasonográfica de ovários de receptora no dia da inovulação dos embriões com visualização de corpo lúteo cavitário. Figura 2- Imagem de avaliação Ultrasonográfica de ovários de receptora no dia da inovulação dos embriões com visualização de corpo lúteo compacto. As amostras de plasma foram submetidas à radioimunoensaio (RIA) para dosagem das concentrações plasmáticas de P4, que foi realizada na FMVA-Unesp Câmpus de Araçatuba, Laboratório de Endocrinologia, Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal (DAPSA), utilizando-se de kit comercial (Coat-a-Count, Diagnostic Products Corporation, CA, USA). No ensaio realizado a sensibilidade foi de 0,01 ng/ml e o coeficiente intra-ensaio 2,4%. As receptoras foram examinadas com ultrasom Falcon 100 (Pie Medical ), com transdutor transretal de 8,0 MHZ aos 30 dias após a TE para diagnóstico de gestação. 6

7 Foi realizada análise de variância e procedido o teste de Tukey para comparação de médias (P<0,05). Para análise das taxas de prenhez, as frequências foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado, e as correlações avaliadas pelo teste de Speerman. Procurou-se modelar a probabilidade de prenhez por meio da análise de regressão logística, em função das variáveis independentes: tamanho do CL e concentração de P4. A probabilidade de prenhez foi determinada assumindo-se uma distribuição binomial (1 = prenhe; 0 = não prenhe), e função de ligação logit. As análises foram efetuadas empregando-se o pacote estatístico SAS (Statistical Analysis System, versão 9.2) adotando-α= 0,05. Resultados e Discussão Verificou-se que as receptoras sincronizadas com dispositivo intravaginal contendo P4 associado à aplicação de FSH apresentaram taxas de aproveitamento consideradas satisfatórias de 75,6% (152/201), e taxas de prenhez de 44,1% (67/152), semelhante a outros estudos existentes na literatura, como Barreiros et al. (2006), que obtiveram resultados semelhantes na avaliação ultrasonográfica para estimar a taxa de aproveitamento de receptoras tratadas com PGF 2α e P4, resultando em aproveitamento de 72,8% e 79%, respectivamente. Não houve diferenças entre diâmetro de CL e concentração plasmática de progesterona, entre as raças avaliadas (Tabela 1). Receptoras cruzadas Marchigiana, apresentaram taxa de prenhez superior a receptoras cruzadas Angus. As outras raças apresentaram resultados intermediários, e sem diferenças entre si (Tabela 1). 7

8 Tabela 1- Concentração plasmática de P4 (ng/ml), diâmetro do CL (cm) e porcentagem de prenhez de receptoras de acordo com o grupo racial. Marchigiana Caracu Nelore Mestiça Angus Valor P N P4 1 1,58 ± 1,30 a 1,50 ± 1,11 a 1,48 ± 1,05 a 1,41 ± 0,89 a 1,07 ± 0,40 a 0,666 CL 1 2,10 ± 0,29 a 1,88 ± 0,39 a 1,92 ± 0,44 a 2,10 ± 0,42 a 1,96 ± 0,33 a 0,915 Prenhez(%) 2 59,2 a 40,6 ab 41,1 ab 48,3 ab 33,3 b 0, Médias seguidas pela mesma letra não diferem (P>0,05), pelo teste de Tukey. 2 - a b (P<0,05), pelo teste de Qui-quadrado. Gonzales et al. (1993) registrou diferença no desempenho reprodutivo dos animais com diferentes graus de sangue. Esse mesmo autor afirma que aqueles que apresentaram maior fração genética Bos taurus indicus demonstraram maior eficiência na utilização dos alimentos, maior adaptabilidade às condições adversas e tendência a apresentar melhores índices reprodutivos em condições tropicais. Contudo, essas observações mostram-se conflitantes com as de outros estudos, em que animais com maior fração genética Bos taurus taurus demonstraram maior eficiência reprodutiva, sobretudo quando são utilizadas em programas de transferência de embriões como receptoras. Teodoro e Madalena (2002) afirmou que, dependendo do manejo adotado, animais mestiços Bos taurus taurus x Bos taurus indicus podem apresentar resultados de produção e reprodução iguais ou superiores aos animais taurinos. Vale ressaltar que o município apresentou elevadas temperaturas (máxima e mínima de 32,56 o C e 23,60 o C, respectivamente) e umidade relativa do ar (85,35%), durante os meses da realização do experimento, por localizar-se na região do Pantanal sul-matogrossense (Soriano, 1999). Os índices de prenhez, a partir de Inseminação artificial ou monta natural, caem drasticamente devido ao estresse pelo calor (Badinga et al., 1993). Também Ealy et al. (1993) demonstraram efeito deletério da temperatura sobre o embrião em estudos conduzidos in vivo. Portanto, as altas temperaturas e umidade locais podem ter promovido desconforto térmico nos animais e podem ter 8

9 influenciado na redução das taxas de prenhez, sobretudo em animais com pelagem mais escura como o caso das cruzadas Angus. Entretanto, são necessários estudos sobre a influência da temperatura e umidade locais na taxa de prenhez desses animais para confirmar esta hipótese. As receptoras Nelore apresentaram taxa de prenhez de 41,1% (Tabela 1), valor que não diferiu das demais raças (P>0,05), demonstrando que esta raça pode ser utilizada como receptora de embriões bovinos, pois apresenta resultados satisfatórios de prenhez, desde que atendidos os parâmetros para tal (sincronização do dia do ciclo estral com a idade do embrião, tamanho de corpo lúteo, sanidade e nutrição adequadas). A concentração plasmática de P4, o diâmetro de CL e a taxa de prenhez não diferiram (P>0,05) (Tabela 2), concordando com os resultados obtidos por Spell et al. (2001). Isto demonstra a capacidade de produção de P4 e manutenção de gestações equivalentes entre os dois tipos de CL, diferindo apenas na morfologia. Barreiros et al. (2006), em um trabalho no Paraná com animais mestiços, encontraram 22,7% dos corpos lúteos cavitários quando as receptoras foram sincronizadas com P4. Esses valores foram condizentes aos encontrados neste trabalho (27,6%), não influenciando a concentração plasmática de progesterona pela presença da cavidade, assim como também verificado por Siqueira et al. (2009a). Tabela 2- Concentração plasmática de P4 (ng/ml), diâmetro do CL (cm) e porcentagem de prenhez de receptoras de acordo com a classificação de corpo lúteo. Compacto Cavitário Valor P N P4 1 1,58 ± 1,23 a 1,43 ± 0,96 a 0,602 Diâmetro CL 1 2,00 ± 0,29 a 2,04 ± 0,34 a 0,380 % prenhez 2 45,4 a 42,9 a 0,254 1 Valores não diferem (P>0,05), pelo teste de Tukey. 2 Valores não diferem (P>0,05), pelo teste de Qui-quadrado. 9

10 Outro aspecto observado por Kastelic et al. (1990) foi a perda das cavidades dos corpos lúteos em novilhas gestantes. Tal perda de cavidade demonstra que este achado ultrasonográfico no início da gestação não tem importância para a manutenção da gestação. Adicionalmente, em outros estudos não houve diferença significativa na concentração de progesterona em receptoras com corpos lúteos cavitários ou compactos no momento da inovulação (Spell et al., 2001; Marques et al., 2002). As concentrações plasmáticas de P4 no momento da inovulação não diferiram entre receptoras que ficaram prenhes e não-prenhes (P>0,05), conforme descrito na Tabela 3, discordando de Siqueira et al (2009a), e a probabilidade de prenhez não foi influenciada (P>0,05) pelo aumento da concentração plasmática de P4 (Figura 3). Marques et al. (2009) também não verificaram diferenças nas concentrações de P4 no dia da inovulação dos embriões entre receptoras que ficaram prenhes ou não-prenhes, com valores de 2,51 e 2,42 ng/ml, respectivamente. A concentração plasmática ótima de P4 para o estabelecimento da gestação varia entre 2,0 a 5,0 ng/ml (Niemann et al., 1985). No entanto, Spell et al. (2001) revelaram que a concentração necessária de P4 no dia da TE para o estabelecimento e manutenção da gestação pode ser menor que o descrito previamente. No estudo, não houve diferença nas taxas de gestação quando as concentrações de P4 foram menores que 0,58 ng/ml, ou excederam 16 ng/ml. Também, no trabalho de Hasler et al. (1980) foi encontrado que 8 de 177 receptoras gestantes apresentaram concentrações de P4 <0,5 ng/ml nos dias 10, 11 e 12 do ciclo estral. 10

11 Tabela 3- Concentração plasmática de P4 (ng/ml), diâmetro do CL (cm) de receptoras de acordo com o diagnóstico de gestação. Prenhe Não-prenhe Valor P N P4 1 1,50 ± 1,05 a 1,31 ± 0,91 a 0,385 Diâmetro CL 1 2,03 ± 0,41 a 1,86 ± 0,34 b 0, a b (P<0,05), pelo teste de Tukey. Figura 3- Probabilidade de prenhez em receptoras de embrião em função da concentração de P4 (ng/ml) (P=0,092) Houve diferença (P<0,05) no diâmetro de CL entre receptoras prenhes e nãoprenhes, com diâmetro de CL superior nas primeiras (Tabela 3). Alguns autores têm encontrado correlação positiva entre a área do corpo lúteo e sua capacidade de produzir P4. Neste trabalho verificou-se correlação positiva entre diâmetro de corpo lúteo e concentração plasmática de P4 no valor de 0,32 (P<0,05), 11

12 como também verificado por Siqueira et al. (2009b). A probabilidade de prenhez foi influencia pelo tamanho do CL (P<0,05) (Figura 4). Quanto maior a área do tecido luteal, maior a influência positiva nas taxas de concepção em receptoras de embrião bovino (Tribulo et al., 2000). Conforme Binelli et al. (2001), a obtenção de corpos lúteos maiores em receptoras pode aumentar a taxa de prenhez nos programas de TE; entretanto, Spell et al. (2001) demonstraram que a flutuação da P4 reflete uma combinação entre diferentes taxas de desenvolvimento do corpo lúteo e secreção de P4 durante as fases iniciais do ciclo estral. Looney et al. (2006) indicam que corpos lúteos de ao menos 10 mm são aceitáveis para receptoras de embrião tornarem-se aptas à TE. Os mesmos autores não têm observado diferenças em taxas de gestação quando utilizam receptoras com CL maiores que 10 mm. Neste trabalho, o diâmetro médio dos CL utilizados foi de 20 mm. Figura 4- Probabilidade de prenhez em receptoras de embrião em função do diâmetro do corpo lúteo (cm) (P=0,006) 12

13 Conclusão Receptoras da raça Nelore apresentam taxas de prenhez satisfatórias e comparáveis às taxas de prenhez de receptoras cruzadas (Bos taurus taurus x Bos taurus indicus). A seleção do tamanho do corpo lúteo no momento da inovulação é fator importante para elevar as taxas de prenhez em receptoras de embriões bovinos. Corpos lúteos cavitários e compactos não influenciam nas taxas de prenhez de receptoras de embrião bovino. Agradecimentos Ao professor Guilherme de Paula Nogueira e Devani Mariano Pinheiro, do Laboratório de Endocrinologia Animais da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba- Unesp Araçatuba, por sua assistência na execução das dosagens hormonais. Ao professor Jair Soares Madureira e Denis Alves, por sua assistência na condução do trabalho. Referências bibliográficas ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CRIADORES DE ZEBU - Regulamento do serviço de registro genealógico das raças zebuínas. Uberaba, MG: ABCZ, p. BADINGA, L.; THATCHER, W.W.; THATCHER, T. et al. Effect of environmental heat stress on follicular development and steroidogenesis in lacting Holstein cow. Theriogenology, v.39, p , BARREIROS, T. R. R.; B LASCHI, W.; BORSATO, E. A. et al.comparação das taxas de prenhez entre receptoras com corpos lúteos cavitários ou compactos após protocolo de sincronização com cloprostenol ou transferência de embriões em tempo fixo. Semina: Ciências Agrárias, v. 27, n. 4, p , BARUSELLI, P.S.; MARQUES, M.O.; MADUREIRA E.H. et al. Increased pregnancy rates in embryo recipients treated with CIDR-B devices and ecg. Theriogenology, v.55, p.157, 2001 [abstract]. BINELLI, M.; THATCHER, W. W.; MATTOS, R. et al. Antiluteolytic strategies to improve fertility in cattle. Theriogenology, v. 56, n. 9, p , EALY, A.D.; DROST, M.; HANSEN, P.J. Developmental changes in embryonic resistence to adverse effects on maternal heat stress in cows. Journal of Dairy Science, v. 76, p , FERREIRA, A. de M. Manejo reprodutivo e eficiência da atividade leiteira. Coronel Pacheco : Embrapa-CNPGL, 1991a. 47p. (Embrapa-CNPGL. Documentos, 46). GONZÁLEZ, F. H. D. ; TORRES, C. A. ; VETROMILA, M. A. Efeito da condição corporal em novilhas mestiças sobre a fertilidade e os níveis sanguíneos de glicose, albumina e progesterona pós-serviço. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 22, n. 3, p , GRYGAR, I.; KUDLA C, E.; DOLEZEL, R.; NEDBA LKOVA, J. Volume of luteal tissue and concentration of serum progesterone in cows bearing homogeneous 13

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