António Manuel Ferreira de Gouveia

Transcrição

1 António Manuel Ferreira de Gouveia Tumores Mesenquimatosos do Tubo Digestivo Estudo de parâmetros clínico-patológicos e de prognóstico, com especial ênfase nos Tumores Estromais Gastrointestinais Dissertação de candidatura ao grau de Doutor apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Fevereiro de

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3 Orientador: Prof. Doutor José Manuel Pedrosa Baptista Lopes Co-orientador: Prof. Doutor Silvestre Porfírio Ramos Carneiro Artº 48, 3º - A Faculdade não responde pelas doutrinas expandidas na dissertação (Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto, 29 de Janeiro de 1931, Decreto nº 19337) 3

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5 JÚRI Presidente: Reitor da Universidade do Porto Vogais: Doutor Henrique Manuel Bicha Castelo, Professor Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa; Doutor José Manuel Pedrosa Baptista Lopes, Professor Associado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, e orientador da tese; Doutor António Taveira Gomes, Professor Associado Convidado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto; Doutor João António Pinto de Sousa, Professor Associado Convidado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto; Doutor Rui Manuel Vieira Reis, Professor Auxiliar da Escola de Ciências da Saúde da Universidade do Minho; Doutora Ana Paula Soares Dias Ferreira, Professora Auxiliar da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto. 5

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7 CORPO CATEDRÁTICO DA FACULDADE DE MEDICINA DO PORTO Professores Catedráticos Jubilados ou Aposentados Doutor Abel José Sampaio da Costa Tavares Doutor Abel Vitorino Trigo Cabral Doutor Alexandre Alberto Guerra de Sousa Pinto Doutor Amândio Gomes Sampaio Tavares Doutor António Augusto Lopes Vaz Doutor António Carvalho Almeida Coimbra Doutor António Fernandes da Fonseca Doutor António Fernandes de Oliveira Barbosa Ribeiro Braga Doutor António Germano Pina da Silva Leal Doutor António José Pacheco Palha Doutor António Luís Tomé da Rocha Ribeiro Doutor António Manuel Sampaio de Araújo Teixeira Doutor Belmiro dos Santos Patrício Doutor Cândido Alves Hipólito Reis Doutor Carlos Rodrigo de Magalhães Ramalhão Doutor Cassiano Pena de Abreu e Lima Doutor Daniel dos Santos Pinto Serrão Doutor Eduardo Jorge da Cunha Rodrigues Pereira Doutor Fernando de Carvalho Cerqueira Magro Gomes Ferreira Doutor Fernando Tavarela Veloso Doutor Francisco Sousa Lé Doutor Henrique José Ferreira Gonçalves Lecour de Menezes Doutor José Augusto Fleming Torrinha Doutor José Carvalho de Oliveira Doutor José Fernando de Barros Castro Correia Doutor José Luís Medina Vieira Doutor José Manuel da Costa Mesquita Guimarães Doutor Levi Eugénio Ribeiro Guerra Doutor Luís Alberto Martins Gomes de Almeida Doutor Manuel Augusto Cardoso de Oliveira Doutor Manuel Machado Rodrigues Gomes Doutor Manuel Maria Paula Barbosa Doutora Maria da Conceição Fernandes Marques e Magalhães Doutora Maria Isabel Amorim de Azevedo Doutor Mário José Cerqueira Gomes Braga Doutor Serafim Correia Pinto Guimarães Doutor Valdemar Miguel Botelho Santos Cardoso Doutor Walter Friedrich Alfred Osswald 7

8 Professores Catedráticos Efectivos Doutor Alberto Coimbra Sobrinho Simões Doutor Manuel Mergulhão Castro Tavares Doutora Maria Amélia Duarte Ferreira Doutor José Agostinho Marques Lopes Doutor Patrício Manuel Vieira Araújo Soares Silva Doutor Daniel Filipe Lima Moura Doutor Alberto Manuel Barros da Silva Doutor José Manuel Lopes Teixeira Amarante Doutor José Henrique Dias Pinto Barros Doutora Maria Fátima Machado Henriques Carneiro Doutora Isabel Maria Amorim Pereira Ramos Doutora Deolinda Maria Valente Alves Lima Teixeira Doutora Maria Dulce Cordeiro Madeira Doutor Altamiro Manuel Rodrigues Costa Pereira Doutor Rui Manuel Almeida Mota Cardoso Doutor António Carlos Freitas Ribeiro Saraiva Doutor Álvaro Jerónimo Leal Machado de Aguiar Doutor José Carlos Neves da Cunha Areias Doutor Manuel Jesus Falcão Pestana Vasconcelos Doutor João Francisco Montenegro Andrade Lima Bernardes Doutora Maria Leonor Martins Soares David Doutor Rui Manuel Lopes Nunes Doutor José Eduardo Torres Eckenroth Guimarães Doutor Francisco Fernando Rocha Gonçalves Doutor José Manuel Pereira Dias de Castro Lopes Doutor Manuel António Caldeira Pais Clemente 8

9 À Graça, ao João, à Luísa e à Carolina 9

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11 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Doutor José Manuel Lopes, meu orientador e principal impulsionador deste projecto, pela amizade e pelo incentivo constantemente demonstrados. Pela transmissão do conhecimento científico, compreensão e, acima de tudo, pelo elevado grau de exigência, o meu sincero reconhecimento. Ao Prof. Doutor Amadeu Pimenta, meu primeiro orientador e anterior Director de Serviço na Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pela capacidade de transmitir, com generosidade e tolerância, as aptidões técnicas e humanas ímpares que sempre soube ostentar. Pelo crescimento pessoal e profissional, o meu profundo e eterno agradecimento. À Dra. Olga Martinho, à Dra. Ana Gomes e ao Prof. Doutor Rui M. Reis, pela colaboração empenhada e pela valiosa participação na elaboração dos trabalhos. Ao Prof. Doutor Valdemar Cardoso e ao Prof. Doutor M. Cardoso de Oliveira, meus anteriores Directores de Serviço na Cirurgia 4, Cirurgia B e Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pelo apoio convicto do projecto e por sempre me terem incentivado na procura do conhecimento. Ao Prof. Doutor Silvestre Carneiro, por ter aceitado incondicionalmente a co-orientação na fase final dos trabalhos, agradeço a disponibilidade e o encorajamento. Ao Dr. Costa Maia, meu actual Director de Serviço na Cirurgia Geral do Hospital de S. João, pelo estímulo e por me ter facultado as condições necessárias à conclusão deste projecto. À Prof. Doutora Fátima Carneiro, Directora do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de S. João, e ao Prof. Doutor Sobrinho Simões, Director do Serviço de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina do Porto e do IPATIMUP, pelo acolhimento e pela forma como sempre facilitaram o acesso aos meios necessários ao desenrolar dos trabalhos. À Dra. Paula Silva, pela amizade e pela inestimável e sempre abnegada colaboração. À Dra. Ana F. Capelinha, ao Dr. Dionísio de la Cruz e a todos os co-autores, pela valiosa contribuição e partilha de ideias. À Prof. Doutora Cristina Santos e ao Prof. Doutor Armando Teixeira-Pinto, pela ajuda preciosa na análise dos dados. Ao Dr. Sousa Rodrigues, ao Dr. Aníbal Liberal, ao Dr. Aníbal Justiniano, ao Dr. Bernardo Bonifácio e ao Prof. Doutor Moutinho Ribeiro, pelo exemplo de competência e pela minha iniciação em Cirurgia. 11

12 Aos elementos da Unidade Esófago-Gastro-Duodenal do Serviço de Cirurgia Geral, presentes e passados, pelo apoio, colaboração e amizade dispensados. A todos os meus colegas, especialistas e internos, do Serviço de Cirurgia Geral no Hospital de S. João, pelo interesse e cooperação nas diferentes actividades desenvolvidas. Às secretárias dos Serviços de Cirurgia B, de Cirurgia Geral e de Anatomia Patológica do Hospital de S. João, pela dedicação e pelo auxílio sempre solícito. À Novartis Oncology (Portugal), pelo financiamento de parte dos custos envolvidos na execução do projecto, e ao Sr. José Seara, por toda a atenção dispensada. O trabalho só foi possível devido à necessária disponibilização de meios por parte de várias Instituições, das quais destaco: a Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, o Hospital de S. João, E.P.E., o IPATIMUP e a Escola de Ciências da Saúde da Universidade do Minho. O meu voto de gratidão pela hospitalidade e pelas condições de trabalho que sempre souberam proporcionar. Aos meus Pais, pelo modelo de trabalho e integridade que me souberam transmitir, e pelo apoio emocional e dedicação de toda uma vida. Aos meus irmãos e aos meus familiares pelo incentivo e pelo apoio incondicional recebido ao longo dos anos. Aos meus filhos, pela alegria que despertam e pela paciência revelada nos muitos momentos de ausência do pai. À minha mulher, que em todos os momentos sinto ao meu lado, pelo estímulo, a compreensão e o carinho. 12

13 Ao abrigo do Art. 8º do Decreto-Lei nº 388/70 fazem parte integrante desta dissertação os seguintes trabalhos publicados: Gouveia AM, Pimenta AP, Capelinha AF, de la Cruz D, Silva P, Lopes JM. Surgical margin status and prognosis of gastrointestinal stromal tumor. World J. Surg Nov, Vol 32 (11): Gouveia AM, Pimenta AP, Lopes JM, Capelinha AF, Ferreira SS, Valbuena C, Oliveira MC. Esophageal GIST: Therapeutic implications of an uncommon presentation of a rare tumor. Dis. Esophagus 2005 Mar, Vol 18 (1): Gomes AL, Gouveia A, Capelinha AF, de la Cruz D, Silva P, Reis RM, Pimenta A, Lopes JM: Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs: evaluation of a Portuguese series. J. Clin. Pathol Feb, Vol 61 (2): Martinho O, Gouveia A, Viana-Pereira M, Silva P, Pimenta A, Reis RM, Lopes JM. Low frequency of MAP kinase pathway alterations in KIT and PDGFRA wild-type GISTs. Histopathology 2009 Jul, Vol 55 (1): Martinho O, Gouveia A, Silva P, Pimenta A, Reis RM, Lopes JM. Loss of RKIP expression is associated with poor survival in GISTs. Virchows Arch Sep, Vol 455 (3): Em cumprimento do disposto no referido Decreto-Lei declara que participou activamente na recolha e estudo do material incluindo em todos os trabalhos, tendo redigido os textos com a activa colaboração dos outros autores. 13

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15 ÍNDICE Resumo 17 Abstract 21 Abreviaturas 25 INTRODUÇÃO Epidemiologia Características patológicas 33 Macroscopia 33 Microscopia Alterações genéticas KIT e PDGFRA e vias de sinalização intracelular 4 - Alterações cromossómicas e do ciclo celular Marcadores imuno-histoquímicos no diagnóstico Diagnóstico diferencial Características clínicas 40 Apresentação clínica 40 GIST e neurofibromatose tipo I 41 GISTs pediátricos 41 GISTs associados com a tríade de Carney e com a díade de Carney (síndrome de Carney-Stratakis) GISTs familiares 42 Procedimentos de diagnóstico e estadiamento Avaliação do risco biológico e estadiamento dos GISTs 44 Factores de prognóstico e avaliação do risco biológico 44 Estadiamento clínico dos GISTs O papel da análise molecular no prognóstico e no tratamento não-cirúrgico dos GISTs 10 - Tratamento 50 a) Doença primária localizada 50 Tumor residual microscópico (R1) 52 Cirurgia Laparoscópica 52 GIST primário localmente avançado 54 Tratamento adjuvante 55 Follow-up dos doentes

16 b) Doença recidivada e metastática 56 Eficácia e tolerabilidade do imatinib como terapêutica de 1ª linha 57 Resistência e progressão da doença nos doentes submetidos a tratamento de 1ª linha com imatinib Avaliação da resposta ao tratamento 62 Tratamento cirúrgico pós-imatinib em doentes com GIST avançado metastático 63 c) Eficácia da terapêutica de segunda linha dirigida a alvos moleculares nos GISTs Eficácia e tolerabilidade do sunitinib 65 A resposta ao sunitinib e o genótipo dos GISTs 67 Progressão da doença após tratamento com sunitinib 67 d) Opções terapêuticas após falência do tratamento dirigido a alvos moleculares OBJECTIVOS 71 Objectivo geral 73 Objectivos específicos 73 MATERIAL E MÉTODOS Parâmetros clínicos e cirúrgicos Parâmetros anátomo-patológicos e imuno-histoquímicos Extracção de ADN Análise de mutações nos genes KIT e PDGFRA Análise de mutações na região 3 do exão 11 do KIT e nos genes H-RAS, K-RAS, N-RAS e BRAF 6 - Análise da metilação no promotor do gene RKIP Follow-up e análise estatística 80 RESULTADOS 81 Trabalho I 83 Trabalho II 93 Trabalho III 99 Trabalho IV 109 Trabalho V 121 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 131 Perspectivas futuras 151 Referências

17 RESUMO Introdução: Os tumores estromais gastrointestinais (GISTs) são os tumores mesenquimatosos mais frequentes no tracto gastrointestinal (GI), constituindo ~1-3% das neoplasias malignas nesta localização. A maioria dos GISTs é esporádica, mas há formas hereditárias, incluindo algumas famílias com mutações germinativas nos genes KIT e PDGFRA. O diagnóstico deve ser confirmado pelo estudo imuno-histoquímico dos tumores, integrado no contexto clínico e morfológico. Os GISTs expressam geralmente CD117 (95%) e CD34 (70%). O comportamento biológico é incerto e a classificação (incluindo > dimensão, índice mitótico e localização GI) em categorias de risco é útil para prever o comportamento clínico dos GISTs. Caracterizam-se por mutações activantes nos genes dos receptores tirosina-cinásicos KIT (até cerca de 85% dos casos) ou PDGFRA (5-8%) nas células tumorais, sendo que 10-15% não apresentam mutações destes proto-oncogenes (GISTs wild-type). A ressecção cirúrgica completa, sem linfadenectomia, é considerada o tratamento padrão dos GISTs primários localizados (sem evidência de disseminação peritoneal ou metastização à distância). A inibição KIT/PDGFRA com terapêuticas inibidoras tirosina-cinásicas (imatinib e sunitinib) permite o controlo de GISTs inoperáveis e/ou metastáticos. A resposta clínica objectiva ao imatinib e sunitinib parece depender da presença e do tipo de mutações nos genes KIT e PDGFRA. Objectivos: Estudar parâmetros clínico-patológicos, imuno-histoquímicos e moleculares numa série de doentes consecutivos ( ) com GIST, diagnosticados no Hospital de São João: (I) analisar o valor prognóstico da qualidade das margens cirúrgicas no tratamento dos doentes com GIST primário; (II) avaliar os procedimentos de diagnóstico de GIST no esófago (localização rara) e rever as opções terapêuticas mais adequadas nesta localização; (III) avaliar o estado mutacional dos genes KIT e PDGFRA e a sua correlação com as características clinico-patológicas, e com o prognóstico dos doentes; (IV) identificar alterações moleculares alternativas em GISTs wild-type, potencialmente úteis para o diagnóstico e preditivas de resposta a terapêuticas dirigidas a novos alvos moleculares; e (V) avaliar a expressão de RKIP, a sua associação com parâmetros clínicopatológicos, e esclarecer o papel deste marcador em doentes com GISTs primários. Material e métodos: Foram reavaliados os registos clínicos e anátomo-patológicos de todos os casos de GIST identificados (n=114). Foi avaliado todo o material anátomo-patológico disponível em cortes corados por HE e o diagnóstico de GIST estabelecido de acordo com a classificação OMS. Realizaram-se estudos imuno-histoquímicos em cortes representativos de cada tumor com o método do complexo estreptavidina-biotina-peroxídase. Foram utilizados nos diversos trabalhos os seguintes anticorpos: CD117, actina, desmina, proteína S100, CD34, fosfo-kit, SCF, fosfo-erk e RKIP. As amostras para extracção de ADN foram obtidas por dissecção de áreas seleccionadas. O estudo molecular incluiu as seguintes técnicas, consoante os trabalhos: amplificação por PCR ou PCR-SSCP, seguida de sequenciação directa, e análise mutacional dos genes KIT, PDGFRA, H- RAS, K-RAS, N-RAS, BRAF e RKIP. A análise da sobrevida global (SG), da sobrevida específica (SE) e da sobrevida livre de recidiva (SLR) dos casos submetidos a cirurgia de ressecção (n=104) foi realizada pelo método de Kaplan-Meier e com o teste Log rank. A associação entre variáveis clínicopatológicas, moleculares e a recidiva do tumor foi analisada com o teste Qui-quadrado ou com o teste exacto de Fisher. Na análise univariada foi utilizado o modelo de regressão de Cox 17

18 separadamente para cada variável. A análise multivariada foi efectuada com o modelo de riscos proporcionais de Cox. Resultados: (I) Obteve-se ressecção completa macroscópica (R0 ou R1) em 92,3% dos GISTs e margens microscópicas negativas (R0) em 75% dos casos. A ressecção cirúrgica dos GISTs primários associou-se a SE e SLR aos 5 anos de 87,7% e 89,8%, respectivamente. A taxa de recidiva foi significativamente (p=0,045) menor nos casos R0. Na análise multivariada, apenas a presença de tumor residual macroscópico (R2) se associou significativamente (p=0,013) a SE mais curta dos doentes. (II) Diagnosticou-se um GIST esofágico de alto risco de agressividade, com expressão CD117 e mutação no exão 11 do KIT (557del558). O caso (achado radiológico incidental, sem biópsia prévia) foi submetido a esofagectomia transtorácica de tipo Ivor Lewis, que permitiu obter margens R0. (III) 92% dos GISTs expressaram CD117, sem associação significativa entre essa expressão e a presença de mutações do KIT. Nos 78 doentes com estudo molecular, observou-se 56,4% com mutações do KIT, 91% das quais no exão 11 e 9% no exão 9. A presença de mutações do KIT associou-se a pior prognóstico e a sobrevida mais curta dos doentes (p=0,0460). Na análise do PDGFRA identificou-se mutações em 6% dos casos (15% dos GISTs KIT wild-type), 80% (4/5) das quais em tumores gástricos. Todos os GISTs com mutações do PDGFRA tinham expressão de CD117. De todas as mutações resistentes ao imatinib, identificou-se a mutação D842V em 2 GISTs desta série. (IV) Na reavaliação dos casos wild-type (n=29) identificaram-se 3 casos com duplicação no exão 11, permitindo ajustar para 33% a percentagem efectiva de GISTs wild-type na nossa série. Nos GISTs wild-type (n=26), identificou-se co-expressão do ligando (SCF) e do receptor KIT (CD117) em ~65% dos casos e expressão de fosfo-kit em ~30% dos casos com expressão de KIT e SCF. Não se identificaram mutações do H-RAS, K-RAS ou N-RAS (via de sinalização MAPK) nestes GISTs wild-type; identificou-se mutação activante V600E do gene BRAF num caso (4%) de GIST wild-type. Não se identificou qualquer mutação do BRAF nos GISTs com mutações do KIT ou do PDGFRA. A expressão de fosfo-erk foi identificada em 30% dos casos wild-type e em 50% dos tumores sem expressão de fosfo-kit. (V) A ausência de expressão citoplasmática de RKIP [8,5% (6/70) dos casos] associou-se significativamente com a presença de necrose (p=0,038) e com SE mais curta (p=0,023) dos doentes. Observou-se uma tendência (não significativa) entre a presença de expressão RKIP e a ausência de metastização. Não se identificou metilação do promotor do RKIP nos 6 GISTs sem expressão de RKIP. Conclusões: (I) Na nossa série de 104 GISTs submetidos a cirurgia de ressecção, obteve-se ressecção macroscópica completa (R0 ou R1) do tumor em 92,3% dos casos. A SE e a SLR observadas enquadram-se com os resultados de outros estudos publicados. A taxa de recidiva foi significativamente menor nos casos R0, mas na análise multivariada apenas a ressecção R2 se associou significativamente a sobrevida mais curta dos doentes. De acordo com as recomendações de consenso actuais, os nossos resultados sublinham o valor prognóstico da ressecção macroscópica completa dos tumores, com o objectivo de se obterem margens microscópicas negativas e evitar a ruptura do tumor. (II) A opção terapêutica mais adequada para os GISTs do esófago depende da confirmação diagnóstica prévia, da localização no esófago, da dimensão/extensão loco-regional do tumor e do risco cirúrgico do doente. A esofagectomia, seguindo os princípios oncológicos, e sem prejuízo da opção neoadjuvante, é o procedimento cirúrgico indicado na maioria dos casos, para uma ressecção R0. (III) Descrevemos pela primeira vez a frequência de mutações do KIT e do PDGFRA numa série de doentes portugueses com 18

19 GIST. A frequência global de mutações do KIT e do PDGFRA (63%) é concordante com os resultados de outros estudos, especialmente em populações ibéricas. Foram identificadas mutações do KIT em 56% dos casos e mutações do PDGFRA em 6% dos tumores. A presença de mutações do KIT parece associar-se com sobrevida mais curta dos doentes. A grande maioria (91%) das mutações activantes do KIT localiza-se no exão 11, indicando a possibilidade de resposta favorável à terapêutica destes doentes com imatinib. (IV) Este estudo constitui uma análise compreensiva da desregulação da via MAPK em GISTs wild-type (KIT e PDGFRA). Na ausência de mutações RAS sugere-se que a via da MAPK pode ser activada através de mecanismos autócrinos/parácrinos de SCF/KIT e/ou por mutação do BRAF num subgrupo de GISTs wild-type. As mutações activantes V600E nos GISTs wild-type levantam a possibilidade de terapêutica com inibidores da cínase RAF neste subgrupo de tumores. (V) Descreve-se pela primeira vez a associação significativa entre os níveis de expressão tumoral de RKIP e parâmetros clínico-patológicos em doentes com GIST. Verificou-se que a perda de expressão de RKIP num subgrupo de GISTs parece ser independente da metilação do promotor, e associa-se significativamente a necrose tumoral e a sobrevida mais curta dos doentes. A participação de RKIP na progressão tumoral e no desenvolvimento de metástases sugere que este marcador pode ter potencial prognóstico, e pode permitir novas abordagens terapêuticas específicas, baseadas na modulação da expressão de RKIP em doentes com GIST. Palavras-chave: GIST, tumor estromal gastrointestinal, GIST do esófago, margens cirúrgicas, sobrevida, imuno-histoquímica, análise mutacional, KIT, PDGFRA, wild-type, MAPK, BRAF, RKIP. 19

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21 ABSTRACT Introduction: Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most common gastrointestinal tract (GI) mesenchymal tumors, accounting for ~1-3% of all malignant neoplasms in this location. Most GISTs are sporadic, but there are hereditary forms, including some families with germline KIT and PDGFRA gene mutations. GIST diagnosis must be confirmed by immunohistochemistry of tumors, and integrated with other clinical and morphological features. GISTs usually express CD117 (95%) and CD34 (70%). Biological behavior is uncertain and classification (including largest size, mitotic rate and GI site) in risk categories is useful for predicting clinical behavior of GISTs. These tumors are characterized by oncogene mutations in KIT (up to ~85%) or PDGFRA (5-8%) receptor tyrosine kinases (RTKs) genes; 10-15% does not harbor any of the aforementioned gene mutations: so called wild-type GISTs. Complete surgical resection, without lymph node dissection, is considered standard treatment for primary localized GISTs (without peritoneal dissemination or metastatic disease). KIT/PDGFRA inhibition with tyrosine kinase inhibitors (imatinib and sunitinib) may control inoperable and/or metastatic disease. The objective clinical response to imatinib and sunitinib seems to be dependent on the presence and type of KIT and PDGFRA mutation. Objectives: Study of clinicopathological, molecular and immunohistochemistry parameters in a series of consecutive ( ) GIST patients, diagnosed at Hospital de S. João: (I) to analyze the prognostic value of surgical margins status in the treatment of primary GISTs; (II) to evaluate diagnostic procedures in esophageal GIST and review major therapeutic options for GISTs occurring in this rare GI site; (III) to assess the mutational status of KIT and PDGFRA genes and its correlation with clinicopathological parameters, and patient s prognosis; (IV) to identify alternative molecular alterations in wild-type GISTs, which may be useful for diagnosis and as predictive markers of response with novel molecular targeted therapy; and (V) to evaluate RKIP expression, its association with clinicopathological parameters, and clarify the role of this marker in patients with primary GIST. Material and methods: The clinical and pathological files of all identified GIST cases (n=114) were reevaluated. All available pathological material was evaluated with H&E stained sections and the diagnosis of GIST was established according to the WHO classification. Immunohistochemistry analysis was performed in representative sections of each tumor using the streptavidin-biotin-peroxidase complex method. The following antibodies were used in the study: CD117, actin, desmin, S100 protein, CD34, phospho-kit, SCF, phospho-erk and RKIP. Samples for DNA extraction were obtained by dissection of selected areas. The study included also the following molecular techniques: PCR amplification or PCR-SSCP, followed by direct sequencing, and mutational analysis of KIT, PDGFRA, H-RAS, K-RAS, N-RAS, BRAF and RKIP genes. Overall survival (OS), disease-specific survival (DSS) and recurrence-free survival (RFS) analysis in resection cases (n=104) were analyzed with the Kaplan-Meier method and Log rank test. Association between clinicopathological, molecular parameters and tumor recurrence was analyzed with Qui-square test or the Fisher exact test. The Cox regression model was used in the univariate analysis of each variable. Multivariate analysis was performed with the Cox proportional hazards model. 21

22 Results: (I) We obtained complete macroscopic resection (R0 or R1) in 92.3% of GISTs and microscopic negative margins (R0) in 75% of cases. 5-year DSS and RFS was 87.7% and 89.8%, respectively, after surgical resection of patient s primary GIST. The recurrence rate was significantly (p=0.045) lower in R0 cases. In the multivariate analysis, only the presence of macroscopic residual tumor (R2) was significantly associated (p=0.013) with shorter DSS. (II) An esophageal high-risk GIST was diagnosed, expressing CD117 and harboring a KIT mutation in exon 11 (557del558). This case (a radiological incidental finding, without previous biopsy) underwent an Ivor Lewis transthoracic esophagectomy, and R0 margins were obtained. (III) 92% of GISTs expressed CD117, without significant association with KIT mutation status. Molecular analysis of 78 cases disclosed 56.4% KIT mutations, 91% of which in exon 11 and 9% in exon 9. KIT mutated cases associated with worst prognosis and shorter survival (p = ) of patients. PDGFRA analysis disclosed mutations in 6% of the cases (15% of KIT wild-type GISTs), 80% (4/5) of which were gastric. All GISTs with PDGFRA mutation displayed CD117 expression. Of all imatinib resistant mutations, only D842V mutation was identified in 2 GISTs of the series. (IV) The reevaluation of wild-type cases (n = 29) disclosed 3 cases with duplication in exon 11, allowing the adjustment to 33% of wild-type GISTs in our series. In wild-type GISTs (n = 26), co-expression of ligand (SCF) and KIT receptor (CD117) was observed in ~65% of the cases, and the expression of phospho- KIT in ~30% of the cases expressing KIT and SCF. No mutations of H-RAS, K-RAS or N-RAS (MAPK signaling pathway) were identified in our wild-type GISTs; BRAF V600E mutation was identified in a wild-type GIST case (4%). No BRAF mutation was observed in any KIT or PDGFRA mutated GIST. Phospho-ERK expression was observed in 30% wild-type cases and in 50% of GISTs without phospho-kit expression. (V) The absence of RKIP cytoplasmic expression [8.5% (6/70) of the cases] was significantly associated with the presence of necrosis (p = 0.038) and shorter DSS (p=0.023) of patients. A trend (not significant) was observed between RKIP expression and lack of metastases. RKIP promoter methylation was not identified in any of the 6 GISTs lacking RKIP expression. Conclusions: (I) In our series of 104 GISTs submitted to resection, complete macroscopic tumor resection (R0 or R1) was obtained in 92.3% of cases. The DSS and RFS values in our patients fit with results published in other studies. The recurrence rate was significantly lower in R0 cases, but in multivariate analysis only R2 resection was significantly associated with shorter survival of patients. According to the actual consensus recommendations, our results underline the prognostic importance of complete macroscopic surgical tumor resection, with the aim of achieving negative microscopic margins, and avoiding tumor rupture. (II) Most appropriate therapeutic option for esophageal GISTs depends on prior diagnostic confirmation, location in the esophagus, tumor size/loco-regional extension, and patient's performance status. An esophagectomy following oncologic principles, considering neoadjuvant option, is the recommended surgical procedure to achieve R0 resection in most cases. (III) We described for the first time KIT and PDGFRA mutation frequency in a series of Portuguese GIST patients. The overall frequency of KIT and PDGFRA mutations (63%) is consistent with results from other studies, namely in Iberian patients. KIT mutations were identified in 56% and PDGFRA mutations in 6% of our GISTs. The presence of KIT mutation seems to associate with shorter survival of patients. The large majority (91%) of KIT mutations were in exon 11, indicating a favorable response to imatinib therapy. (IV) Our study represents a comprehensive analysis of MAPK pathway deregulation in (KIT and PDGFRA) wild- 22

23 type GISTs. The observed absence of RAS mutations suggests that MAPK pathway may be activated by SCF/KIT autocrine/paracrine mechanisms and/or by BRAF mutation in a subset of wild-type GISTs. V600E mutation in wild-type GISTs raises the possibility of RAF kinase inhibitor therapy in this sub-group of patients. (V) We described for the first time a significant association between RKIP tumor expression level and clinicopathological parameters in GIST patients. Loss of RKIP expression in a subgroup of GISTs seems to be independent of promoter methylation, and associates significantly with tumor necrosis and shorter survival of patients. RKIP role in tumor progression and metastases development suggests that this marker may hold a potential prognostic value, and may allow new targeted therapy based on the modulation of RKIP expression in GIST patients. Key-words: GIST, gastrointestinal stromal tumor, esophageal GIST, surgical margins, survival, immunohistochemistry, mutational analysis, KIT, PDGFRA, wild-type, MAPK, BRAF, RKIP. 23

24 24

25 LISTA DE ABREVIATURAS ABL Proto-oncogene Abelson ACOSOG American College of Surgeons Oncology Group ADN Ácido desoxirribonucleico AFIP Armed Forces Institute of Pathology AGITG Australasian Gastro-Intestinal Trials Group AIO German Working Group on Medical Oncology ALK Anaplastic lymphoma kinase ARG Arginase ATP Adenosina trifosfato BCR-ABL Fusion protein, product of Breakpoint cluster region - Abelson oncogene B-Raf; BRAF Serine/threonine-protein kinase B-raf; proto-oncogene que codifica B-Raf c-fms Proto-oncogene que codifica CSF-1R CGA Campo de grande ampliação CIC Célula intersticial de Cajal CpG Cytosine-phosphate-guanine CSF-1R Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor (product of FMS proto-oncogene) DAB Diaminobenzidina DE Doença estável dntp Desoxirribonucleotídeo-trifosfato DOG 1 Discovered on GIST-1; TMEM16A EC Extracelular EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EMA European Medicines Agency EORTC European Organization for Research and Treatment of Cancer ERK Extracellular signal-regulated kinase ESMO European Society for Medical Oncology EUA Estados Unidos da América FDA Federal Drug Administration FGFR3 Fibroblast growth factor receptor 3 FLT3 FMS-like tyrosine kinase 3 receptor GFAP Glial fibrillary acid protein GI Gastrointestinal GIST Gastrointestinal stromal tumor HE; H&E Hematoxilina-eosina; hematoxylin-eosin HR Hazard ratio HSP-90 Heat shock protein 90 ISG Italian Sarcoma Group ITC Inibidor tirosina-cinásico JM Justamembranar 25

26 KIT; KIT Receptor tirosina-cinásico KIT; proto-oncogene KIT LMC Leucemia mielóide crónica MAPK MAP kinase; mitogen-activated protein kinase MDE Mutation detection enhancement MEK MAPK/ERK kinase MSKCC Memorial Sloan-Kettering Cancer Center MSP Methylation-specific PCR mtor Mammalian target of rapamycin NCCN National Comprehensive Cancer Network NF1 Neurofibromatose tipo 1 NFkB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NIH National Institutes of Health NS Não significativo OMS Organização Mundial de Saúde p16 INK4A p27 KIP1 pb PCR PDGFA Cyclin-dependent kinase (cdk) 4A inhibitor Cyclin / cdk complexes inhibitor pares de bases Polymerase chain reaction (reacção de polimerização em cadeia) Platelet-derived growth factor A PDGFRA e -B Platelet-derived growth factor receptor-α and -β PDGFRA e -B Proto-oncogenes PDGFRA e B PERSIST Post-resection Evaluation of Recurrence-free Survival for GastroIntestinal Stromal Tumors PET Tomografia por emissão de positrões PET-FDG Tomografia por emissão de positrões com 18-fluordesoxiglicose PFI Pólipo fibróide inflamatório PI3K-Akt Phosphatidylinositol 3 kinase - protein kinase B R0 /R1 /R2 Ressecção R0 /R1 /R2 RAF; RAF Serine/threonine-protein kinase; proto-oncogene RAF RAS Proto-oncogene RAt Sarcoma RC Resposta completa RECIST Response Evaluation Criteria in Solid Tumors RET Glial cell-line derived neurotrophic factor receptor (rearranged during transfection) RKIP; RKIP Raf kinase inhibitory protein; proto-oncogene RKIP RMN Ressonância magnética nuclear RP Resposta parcial RTK Receptor tirosina-cinásico SCF Stem cell factor (factor de crescimento de células estaminais) SDH; SDH Succinato-desidrogenase; proto-oncogene que codifica SDH SE Sobrevida específica SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results SG Sobrevida global 26

27 SLP Sobrevida livre de progressão SLR Sobrevida livre de recidiva SMA α-smooth muscle actin SRC Non-receptor tyrosine kinase SRC family SSCP Single strand conformational polymorphism SSG Scandinavian Sarcoma Group STAT Signal transducer and activation of transcription STBSG Soft Tissue and Bone Sarcoma Group SWOG Southwest Oncology Group TC Tomografia computadorizada TK 1 e 2 Domínios tirosina-cinásicos 1 e 2 TGM Tumor-grade-metastasis (staging system) TMBNP Tumor maligno da bainha dos nervos periféricos TNM Classificação TNM de Tumores Malignos TPT Tempo para progressão do tumor TSH Hormona tireo-estimulante UICC Union for International Cancer Control VEGF Vascular endothelial growth factor VEGFR Vascular endothelial growth factor receptor 27

28 28

29 INTRODUÇÃO 29

30 30

31 INTRODUÇÃO Os tumores estromais gastrointestinais (GISTs) são os tumores mesenquimatosos mais comuns do tracto gastrointestinal (GI), correspondendo a cerca de 1-3% das neoplasias malignas nesta localização. Ocorrem preferencialmente no tubo digestivo, embora também possam ser diagnosticados noutras localizações, como o epíploon ou mesentério. Durante décadas, antes do final dos anos 90, os tumores mesenquimatosos do tracto GI eram frequentemente classificados como tumores do músculo liso ou tumores das bainhas nervosas 1. Quando apresentavam características de células de músculo liso na microscopia, eram classificados como leiomiomas ou leiomiossarcomas 2, 3. Mais recentemente, tornou-se evidente que os GISTs são uma entidade independente, sendo os sarcomas mais comuns do tracto GI 4, 5. A designação tumor estromal foi utilizada pela primeira vez em 1983 por Mazur e Clark 4. No entanto, esta designação não foi amplamente aceite até ao início dos anos 90, quando o CD34 foi identificado como marcador relativamente específico dos tumores estromais GI 6. Em 1998, Hirota et al. descreveram a existência de mutações activantes no gene do receptor tirosina-cinásico KIT nas células tumorais, bem como a expressão imuno-histoquímica da proteína KIT em GISTs 7. O gene KIT codifica um receptor trans-membranar para o factor de crescimento de células estaminais SCF (stem cell factor); o componente intracitoplasmático do receptor tem funções tirosina-cinásicas 8. Em 2003, Heinrich et al. 9 descreveram mutações no gene do receptor α do factor de crescimento derivado de plaquetas PDGFRA (platelet-derived growth factor receptor-α), que constituem eventos patogénicos alternativos e mutuamente exclusivos em GISTs sem mutações KIT. Actualmente, até cerca de 85% dos GISTs têm mutações activantes no gene KIT e 5-8% mutações no PDGFRA, sendo que 10-15% dos casos não apresentam mutações destes protooncogenes (GISTs wild-type), podendo no entanto ter expressão de KIT A expressão de KIT (com o anticorpo CD117) nas células tumorais é um método fiável e sensível no diagnóstico dos GISTs Há semelhanças morfológicas entre as células dos GISTs e as células intersticiais de Cajal (CIC), que são células localizadas designadamente em torno dos plexos mioentéricos do tracto GI, pacemakers das contracções peristálticas 7, 16. As CIC expressam KIT e dependem do SCF para o seu desenvolvimento 17, 18. Aceita-se que os GISTs têm origem em células intersticiais de Cajal ou em células estaminais precursoras das CIC 7, 13, 19, 20. No passado, os GISTs com comportamento maligno eram reconhecidamente os sarcomas mais resistentes ao tratamento convencional, com <10% de respostas clínicas após quimioterapia e/ou radioterapia 21, 22. Em 2001, Joensuu et al. 23 descreveram que o mesilato de imatinib (Glivec /Gleevec ; Novartis Pharmaceuticals, Basileia Suíça) era eficaz no tratamento do GIST. O imatinib, um inibidor dos receptores tirosina-cínase KIT e PDGFRΑ, é o tratamento padrão de 1ª linha em GISTs irressecáveis e/ou metastáticos KIT-positivos 24, 25. Mais de 80% dos doentes 31

32 beneficiam da terapêutica com este inibidor tirosina-cinásico e a mediana do tempo de sobrevida do GIST metastático atinge actualmente ~5 anos 26, 27. Os GISTs inoperáveis e/ou metastáticos são doenças controláveis, estando em fase de ensaio clínico nos últimos anos um número considerável de estudos com novos fármacos alternativos 28. O avanço no conhecimento da biologia do GIST e a excelente resposta alcançada nos GISTs com o imatinib revelou-se um paradigma na terapêutica molecular dos tumores sólidos, proporcionando novos desafios para o esclarecimento das vantagens e limitações das designadas terapêuticas dirigidas contra alvos moleculares. 1 - Epidemiologia A incidência do GIST nos EUA e na Europa é difícil de determinar, considerando que só recentemente foram generalizadamente reconhecidos e diagnosticados uniformemente como grupo individualizado. Os resultados do programa de vigilância epidemiológica SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results) do National Cancer Institute de 1995 dos Estados Unidos da América (EUA) indicam casos novos de GIST diagnosticados anualmente nos EUA 29. Mais recentemente, estudos de base populacional realizados na Suécia 30, Holanda 31 e Islândia 32, descrevem incidências de aproximadamente 14,5, 12,7 e 11 casos/milhão/ano, respectivamente. Estes resultados permitem estimar a incidência anual na Europa em ~ casos e nos EUA em ~ casos /ano. No entanto, como muitos dos doentes sobrevivem períodos longos, a prevalência do GIST pode ser superior. Por outro lado, estes dados correspondem apenas a tumores detectados clinicamente, excluindo um número muito provavelmente substancial de micro-gists (< 1 cm), que apenas são detectados na autópsia ou, por exemplo, em gastrectomias realizadas por outras causas. Um estudo alemão em autópsias consecutivas identificou micro-gists (1-10 mm) em 22,5% de indivíduos com idade > 50 anos 33. Os micro-gists expressam KIT e têm geralmente mutação oncogénica no gene KIT ou PDGFRA. Resultados semelhantes têm sido publicados por outros grupos Estes estudos sugerem que os micro-gists não progridem habitualmente (ou progridem muito lentamente) para tumores de grandes dimensões, com sintomas /sinais clínicos 12. Embora os GISTs ocorram em doentes de todas as idades, aquando do diagnóstico a maioria tem idade compreendida entre os anos, com uma mediana de 60 anos 27. Têm incidência idêntica em ambos os géneros 38, embora algumas séries descrevam um ligeiro predomínio no género masculino 27. Ocorrem raramente em crianças e adultos jovens. Os GISTs pediátricos são considerados um grupo clínico-patológico independente, com características distintas, e são diagnosticados predominantemente na segunda década de vida 16, 39, 40. A maioria dos GISTs é esporádica, mas foram descritas algumas famílias com mutações germinativas nos genes KIT e PDGFRA 45, 50 e GISTs hereditários. Os doentes com síndromes hereditários como a neurofibromatose tipo I 51-53, a tríade de Carney (GIST gástrico, paraganglioma e condroma pulmonar) 54 e a díade de Carney (paraganglioma, GIST gástrico) 48 podem cursar com GISTs. 32

33 2 - Características patológicas Macroscopia Os GISTs têm grande variedade morfológica na maioria das localizações, podendo ser diagnosticados como pequenos tumores incidentais ou tumores com grandes dimensões. Apresentam-se muitas vezes como nódulos bem circunscritos e muito vascularizados, particularmente na localização gástrica ou intestinal. Os GISTs de menor dimensão são habitualmente nódulos subserosos, intramurais ou, com menor frequência, polipóides intraluminais; os de maior dimensão desenvolvem-se geralmente com crescimento extraparietal e por vezes pediculado 55. Ao corte, têm um aspecto carnudo, róseo ou branco-acastanhado e, nos casos de maior dimensão, podem ter áreas hemorrágicas, císticas ou necróticas. Microscopia As características microscópicas dos GISTs variam com o órgão envolvido 55 e classificam-se geralmente em três subtipos de morfologia celular: fusiforme (70%), epitelióide (20%) ou misto (fusiforme e epitelióide) 1. Nos GISTs de células fusiformes, as células têm citoplasma fibrilar eosinofílico claro, núcleo ovóide, e limite celular mal definido, muitas vezes com aspecto sincicial. As células tumorais dispõem-se em feixes, que se entrecruzam, ou em novelos. As células fusiformes podem ter núcleos em paliçada ou vacuolização paranuclear proeminente que, apesar de sugestiva de fenótipo muscular liso, é muito comum nos GISTs. Os GISTs epitelióides são compostos por células arredondadas com citoplasma eosinofílico ou claro, organizadas em toalhas e ninhos. Cerca de 10% dos GISTs são mistos. Os GISTs têm geralmente estroma escasso e morfologia celular uniforme, com núcleos de cromatina fina e nucléolos aparentes 56. A celularidade é variável e a matriz extracelular pode ser esclerótica, colagenosa ou mixóide. Ocasionalmente podem ser pleomórficos 55 ou desdiferenciados 57. Após tratamento com inibidores tirosina-cinásicos, podem ter diminuição substancial da celularidade tumoral e esclerose acentuada ou transformação mixóide do estroma. Na maioria dos casos, a morfologia celular mantém-se idêntica à do tumor original. No entanto, após tratamento com estes agentes, têm sido descritos casos de modificação da morfologia celular fusiforme para epitelióide, padrão epitelióide pseudopapilar 58 e, muito raramente, diferenciação rabdomiossarcomatosa 59. Estas alterações podem dificultar o diagnóstico, especialmente quando o tumor também perde expressão de KIT. Nestes casos, a análise mutacional pode esclarecer o diagnóstico porque os tumores podem manter a mutação do KIT ou do PDGFRA 58, Alterações genéticas KIT e PDGFRA e vias de sinalização intracelular Os genes KIT e PDGFRA localizam-se no braço longo do cromossoma 4 (4q11-q12) 60. Codificam receptores tirosina-cinásicos (RTK) de tipo III que partilham características estruturais idênticas. 33

34 São compostos por uma região extracelular (EC) para interacção com o ligando, uma região transmembranar, um domínio justamembranar (JM) e dois domínios cinásicos citoplasmáticos (TK1: bolsa de ligação ao ATP; e TK2: ansa de activação cinásica) (Fig. 1) 61, 62. Fig. 1: Representação esquemática dos receptores tirosina-cinásicos KIT e PDGFRA e distribuição das mutações mais frequentes nos GISTs Os receptores KIT e PDGFRA são normalmente activados pela ligação dos respectivos ligandos o ligando KIT (SCF/stem cell factor; mast cell growth factor; Steel factor) e o ligando PDGFA. A ligação de SCF na região EC resulta na homodimerização do receptor e na sua activação cinásica. A consequente auto-fosforilação do receptor (KIT/PDGFRA) ocorre nos vários resíduos de tirosina JM e citoplasmáticos. Estes resíduos fosforilados servem de pontos de ligação a diversas moléculas de sinalização secundária, activando cascatas de fosforilação e activação de substratos com funções de regulação da proliferação, diferenciação, adesão e sobrevivência ou apoptose celular (Fig. 2). A actividade tirosina-cinásica do receptor é regulada pelo domínio JM, que, na ausência de activação pelo ligando, tem função inibidora 68. A activação do KIT pode regular funções celulares fundamentais para o desenvolvimento e manutenção de vários tipos celulares, designadamente células germinativas e hematopoiéticas, mastócitos, melanócitos e células intersticiais de Cajal 65, 69. Uma mutação com ganho-de-função no gene KIT ou PDGFRA desencadeia sinalização oncogénica constitucional, ou seja, sem necessidade da acção dos respectivos ligandos. A desregulação da actividade tirosina-cinásica do receptor resulta na activação de vias de sinalização PI3K-Akt (phosphatidylinositol 3 kinase - protein kinase B), MAPK (mitogen-activated protein kinase; RAS/RAF/MEK) e, num nível relativamente mais baixo de activação, da via STAT (signal transducer and activation of transcription; STAT1, STAT3) 63, 67, A activação destas vias de sinalização intracelular condiciona alterações no ciclo celular, na translação de proteínas, no metabolismo e na apoptose celular (Fig. 34

35 2). Estudos efectuados em extractos tecidulares de GISTs descreveram grande variação no grau de activação das diferentes vias de sinalização KIT. O melhor esclarecimento das vias de sinalização Fig. 2: Vias de sinalização intracelular dependentes da activação dos receptores KIT e PDGFRA 10, 63, 64. envolvidas na patogénese dos GISTs poderá ser útil no estabelecimento de novas estratégias para o tratamento dos doentes com GIST avançado 10, 71, As mutações activantes do KIT ocorrem noutras neoplasias: mastocitose 77, tumores de células germinativas 78, leucemia mielóide aguda 79 e neuroblastoma 80. Foram descritas mutações activantes do KIT, semelhantes às descritas em GISTs, num subgrupo de melanomas malignos das extremidades (pele) e das mucosas 81. A maioria dos GISTs tem mutações activantes dos receptores tirosina-cinásicos KIT (~75-85%) ou PDGFRA (~5-8%). Contudo, uma proporção de GISTs (10-15%) não tem quaisquer mutações do KIT ou do PDGFR (GISTs wild-type) 9-12, 82. As mutações nos genes KIT e PDGFRA são mutuamente exclusivas 83. As mutações alteram duas regiões principais: os domínios reguladores EC (domínio de dimerização) e JM, e os domínios enzimáticos tirosina-cinásicos intracitoplasmáticos (TK1 e TK2). As mutações no domínio JM alteram a função auto-inibitória e causam activação cinásica 84, 85 e as mutações na região EC causam dimerização do receptor independente do ligando 9. 35

36 A maioria das mutações do gene KIT ocorre no exão 11 (domínio JM) 57-70%, e no exão 9 (domínio EC) 5-18% 9, 11, As mutações KIT primárias também podem ocorrer no exão 13 (TK1: bolsa de ligação do ATP) e no exão 17 (TK2: ansa de activação cinásica), mas são raras (<2%) e os dados disponíveis limitados 9, 11, 70, 87, 88, 90, 92. As mutações descritas no gene PDGFR envolvem os exões 12, 14 e 18, e correspondem às mutações homólogas nos exões 11, 13 e 17 do gene KIT, respectivamente. Em > 90% dos casos, as mutações do PDGFRA ocorrem nos codões do exão 18, sendo a substituição D842V a mutação mais frequente (62,6%) 11, 83. Mais de uma década de estudos sobre as mutações do KIT e do PDGFRA nos GISTs indica que algumas das mutações podem associar-se a características histopatológicas bem definidas, e que há grande variação de mutações em GISTs de localizações gastrointestinais diferentes, benignos e malignos 75, 90, 93. Os GISTs com mutação no exão 11 do gene KIT podem ocorrer em todo o tracto GI. Vários tipos de mutações podem ser observadas neste exão, mas as delecções são as alterações mais frequentemente descritas. As delecções, delecções-inserções e substituições de nucleotídeo no exão 11 foram descritas em GISTs do esófago ao ânus 38, O impacto prognóstico das mutações de genes de RTKs foi avaliado em diversos estudos retrospectivos, mas persiste controvérsia relativamente ao significado prognóstico das mutações do KIT no exão 11 dos GISTs. Alguns estudos descreveram que as mutações neste exão eram mais comuns nos tumores de maior dimensão, com índice mitótico mais elevado, sem nenhuma relação entre os diferentes tipos de mutações KIT neste exão e a morfologia celular, e que se associavam a evolução clínica maligna 99, 100. Outros autores sugeriram que as mutações podiam ser detectadas tanto em tumores malignos como benignos e clinicamente indolentes 36, 70. Estudos mais recentes sugeriram que os diferentes tipos de mutações no exão 11 podem correlacionar-se com a evolução clínica dos tumores 75. Os GISTs gástricos com delecções neste exão parecem ter tendência para cursar, na ausência de tratamento com imatinib, com um comportamento clínico mais agressivo do que os tumores com substituições de um nucleotídeo 38. No entanto, a associação a comportamento biológico mais agressivo das delecções nos codões do exão 11 descrita por diversos autores não foi confirmada em estudos recentes 10, Os GISTs com mutação no exão 9 ocorrem mais frequentemente no intestino delgado. Na maioria dos casos, as mutações caracterizam-se pela inserção de seis pares de bases, a duplicação de alanina e tirosina, e ocorrem quer em tumores primários quer em GISTs recidivados e/ou avançados 89, 103. Os tumores com duplicações no exão 9 têm sido associados a evolução maligna 86, 96, 104, 105. No entanto, um estudo de GISTs do intestino delgado com mutações no exão 9 não descreveu diferenças significativas na evolução clínica quando comparada com a de tumores com mutações no exão Os GISTs com mutações nos exões 13 e 17 do KIT são ligeiramente mais prevalentes em localização intestinal. Estas mutações não parecem ter impacto nas características clínicopatológicas dos tumores, quando comparadas com os restantes tipos de GIST nesta localização. GISTs com mutação no exão 13 localizados no estômago tendem a ser algo maiores e mais agressivos do que os GISTs gástricos sem esta mutação

37 As mutações no gene PDGFRA ocorrem principalmente ( 6-7%) no exão 18 (TK2: ansa de activação cinásica) e no exão 14 (TK1: bolsa de ligação ATP), sendo raramente identificadas no exão 12 justamembranar (~1%) 11, 12, 72, 83, As mutações nos exões 14 e 18 do PDGFRA são sobretudo mutações missense. Os GISTs com mutações do PDGFRA predominam no estômago, têm morfologia epitelióide, estroma mixóide e pleomorfismo nuclear 11, Este subgrupo associa-se a comportamento clínico geralmente benigno e ausência de expressão KIT 106, 107, Os GISTs com a mutação D842V no exão 18 do PDGFRA são resistentes ao tratamento com imatinib e sunitinib 9, 83, 87, 113. Mais recentemente, foram também descritas mutações no exão 15 de BRAF (gene que codifica serine/threonine-protein kinase B-raf) em 5-13% dos GISTs wild-type de adultos Os GISTs têm diferentes tipos de mutações nos genes KIT e PDGFRA e diferenças nas assinaturas moleculares da expressão génica que podem explicar a complexidade biológica e a variabilidade da resposta ao tratamento com inibidores tirosina-cinásicos dos doentes com estes tumores Alterações cromossómicas e do ciclo celular As mutações do KIT ou do PDGFRA são eventos precoces no desenvolvimento dos GISTs. A ocorrência de mutação é independente da dimensão do tumor. Observam-se em tumores incidentais microscópicos, múltiplos e "silenciosos", detectados em gastrectomias realizadas por outras causas, e em 10-20% dos indivíduos com idade > 60 anos, sem diagnóstico clínico de GIST 34, 35. Estas evidências sugerem que as mutações estão envolvidas na oncogénese e na proliferação dos tumores, mas que não parecem ser decisivas para a transformação maligna dos GISTs 36. A progressão clínica dos GISTs depende de eventos genéticos adicionais. Nos estudos citogenéticos foram descritos desarranjos dos cromossomas 14 e 22. Cerca de dois terços dos GISTs mutantes KIT e PDGFRA têm monossomia no cromossoma 14 ou perda parcial de 14q 72, 118, 119. Duas regiões de 14q, 14q11.2 q12 e 14q23 q24, parecem incluir genes de supressão tumoral importantes para o desenvolvimento precoce dos GISTs A perda do braço longo do cromossoma 22 (22q) foi descrita em ~50% dos casos. Esta alteração associa-se a progressão para comportamento biológico intermédio / borderline ou maligno dos GISTs 118, Os doentes pediátricos ou adultos com GISTs sem mutações KIT ou PDGFRA têm progressão citogenética insignificante quando comparados com a dos doentes com GISTs com mutações 16, 124, sublinhando o facto de que os mecanismos que levam à progressão tumoral são diferentes em GISTs com mutação e em GISTs wild-type. O gene supressor tumoral CDKN2A (p16 INK4A ) localizado no cromossoma 9p é inactivado através de vários mecanismos numa percentagem significativa de GISTs malignos A delecção, a 37

38 mutação e a metilação do promotor contribuem para a diminuição da expressão de p16, que é um inibidor do ciclo celular. Os resultados de estudos imuno-histoquímicos descrevem uma correlação significativa com o comportamento agressivo, mesmo em tumores de baixo risco Outro inibidor do ciclo celular, o p27 KIP1, é frequentemente activado nos GISTs malignos, mas a associação com a progressão tumoral não foi confirmada consistentemente 128, 130, 131. Embora a expressão destes marcadores indique uma tendência para a associação com comportamento biológico de alto risco ou maligno, nenhum deles parece ser factor de risco independente em análise multivariada. 5 - Marcadores imuno-histoquímicos no diagnóstico O diagnóstico anátomo-patológico de GIST resulta da integração de dados morfológicos com os do estudo imuno-histoquímico, num contexto clínico adequado. Os GISTs expressam CD117/KIT (95%) e frequentemente CD34 (70%). A expressão do KIT tem elevada especificidade e sensibilidade no diagnóstico diferencial dos GISTs com os tumores mesenquimatosos do tracto GI 7, 13, 15, 20. Podem ser observados padrões diferentes de expressão KIT 15. A maioria dos GISTs tem expressão citoplasmática forte e difusa do KIT (Fig. 3A), que muitas vezes se associa a padrão paranuclear (tipo dot). A extensão e o padrão da expressão KIT não se correlacionam com o tipo de mutação do KIT nem são preditivos da resposta aos inibidores tirosina-cinásicos. Fig. 3: Expressão imuno-histoquímica de CD117/KIT (A) e de DOG1 (B) em GISTs de células fusiformes. Estudos recentes descrevem a existência de um subgrupo de aproximadamente 4-5% de GISTs que não expressam CD117 designados como GISTs KIT-negativos 106, 107. Os GISTs com expressão KIT fraca ou focal, bem como os GISTs sem expressão do KIT, podem corresponder a tumores KIT wild-type (sem mutações KIT/PDGFRA) ou com mutações do PDGFRA 106, 107. Ocorrem preferencialmente no estômago e epíploon e com morfologia epitelióide ou mista. 38

39 Nos últimos anos surgiram novos anticorpos usados no diagnóstico do GIST. Estes marcadores foram identificados sobretudo através de estudos moleculares e têm despertado interesse no estudo do subgrupo de GISTs KIT-negativos. O marcador mais relevante deste grupo é o DOG 1 (discovered on GIST-1) (Fig. 3B), também conhecido como TMEM16A, uma proteína trans-membranar de função desconhecida, descoberta através de análise de expressão génica 132. Vários estudos publicados descreveram que os anticorpos anti-dog 1 têm maior sensibilidade e especificidade do que o CD117 e o CD34, e que este anticorpo pode ser um marcador imuno-histoquímico específico de GIST, independentemente da existência de mutações KIT/PDGFRA ou da expressão KIT Os diferentes anticorpos monoclonais recentemente desenvolvidos para DOG 1 (ex: DOG 1.1; K9) 133, 135 podem ser marcadores válidos na prática, particularmente no diagnóstico diferencial entre GISTs KITnegativos e outros sarcomas 24, Cerca de 1/3 dos GISTs KIT-negativos expressa DOG 1, sendo que os restantes 2/3, apesar de morfologia típica, continuam a ser difíceis de classificar no estudo imuno-histoquímico 134. Dependendo da morfologia histológica, o diagnóstico de GIST KIT-negativo pode ser problemático. A análise das mutações nos genes KIT e PDGFRA pode confirmar em definitivo o diagnóstico de GIST, não só em casos que apresentem morfologia equívoca, mas também nos GISTs sem expressão de CD117 e DOG1, 24, 138 porque alguns destes tumores podem ter mutações num dos proto-oncogenes 107, 110. Neste contexto, importa salientar que a ausência de expressão KIT não justifica excluir doentes do tratamento com inibidor tirosina-cinásico (ITK). Algumas das mutações detectadas nos GISTs KIT-negativos (incluindo mutações do PDGFRA) são sensíveis ao tratamento com ITKs. Alguns GISTs wild-type respondem ao tratamento com ITKs. A análise mutacional deve ser considerada indispensável para a confirmação do diagnóstico e é boa prática na decisão terapêutica, designadamente com ITKs 11. Outros marcadores frequentemente expressos no GIST, embora menos sensíveis e específicos, são o CD34, o h-caldesmon e a SMA (α-smooth muscle actin). O CD34 é uma glicoproteína transmembranar presente nos precursores das células hematopoiéticas humanas e no endotélio vascular. É expresso em ~80% dos GISTs gástricos, 50% do intestino delgado e 95% do esófago e recto 96, 139, enquanto o h-caldesmon é expresso em > 2/3 dos GISTs 140, 141 e a SMA em ~30% 142. Os GISTs raramente expressam desmina, que é geralmente focal. No entanto, tem sido descrita positividade em ~30% de GISTs KIT-negativos, especialmente no estômago e com morfologia epitelióide 134. A proteína S-100 (5%) e as citoqueratinas são raramente expressas nos GISTs. 6 - Diagnóstico diferencial Os principais diagnósticos diferenciais do GIST de células fusiformes são os tumores do músculo liso (leiomiomas e leiomiossarcomas), a fibromatose (desmóide), o schwanoma, o tumor miofibroblástico inflamatório, o pólipo fibróide inflamatório e o tumor fibroso solitário. 39

40 Os leiomiomas ocorrem mais frequentemente no esófago, mas também no cólon e recto. São menos celulares e têm citoplasma mais eosinofílico, com limites celulares bem definidos. Embora a SMA e o h-caldesmon sejam expressos em ambos os tipos de tumor, a expressão de desmina é mais extensa nos tumores do músculo liso 1. Os leiomiossarcomas do tracto GI são raros e têm marcado pleomorfismo nuclear e elevada actividade mitótica. Os schwanomas ocorrem raramente no tracto GI, sobretudo no estômago, habitualmente com um bordalete linfóide periférico e expressam proteína S-100 e GFAP (glial fibrillary acid protein) 143. A fibromatose (desmóide) intra-abdominal é um tumor raro com potencial de crescimento e agressividade local, mas que não metastiza. As células expressam beta-catenina nuclear em ~75% dos casos 144, 145 e a expressão de KIT é pouco frequente 146. Os tumores miofibroblásticos inflamatórios, também designados como pseudo-tumores inflamatórios, ocorrem sobretudo em crianças e adultos jovens. As células expressam desmina e SMA na ausência de expressão de CD34 e CD117. A expressão de ALK (anaplastic lymphoma kinase) em até 50% dos casos facilita o diagnóstico destas lesões 147. O pólipo fibróide inflamatório (PFI) é uma lesão pseudo-tumoral que ocorre no adulto e sobretudo no estômago e intestino delgado. As células (fibroblastos) expressam habitualmente CD34. Foi descrita expressão PDGFRA e mutações de PDGFRA nos PFIs 148, 149. No entanto, contrastando com os GISTs, os PFIs não expressam KIT nem DOG1 135, 150. O diagnóstico diferencial dos GISTs epitelióides inclui o tumor neuroendócrino, o tumor glómico, o melanoma maligno/metastático, o leiomiossarcoma epitelióide, o tumor maligno da bainha dos nervos periféricos (TMBNPs) epitelióide, o sarcoma de células claras e o angiossarcoma. Os tumores neuroendócrinos caracterizam-se pela expressão de citoqueratina, sinaptofisina e cromogranina. Os tumores glómicos ocorrem raramente no tracto GI e são morfológica e imunohistoquimicamente idênticos aos tumores glómicos noutras localizações. O melanoma, o sarcoma de células claras e o TMBNP epitelióide expressam proteína S-100; os dois primeiros também podem ter expressão de outros marcadores de melanoma, que não são expressos no TMBNP. O sarcoma de células claras caracteriza-se por genes de fusão EWSR1 CREB1 ou EWSR1 ATF1 151, 152. O angiossarcoma epitelióide expressa KIT/CD117 e marcadores vasculares (CD31 e CD34). 7 - Características clínicas Apresentação clínica Os GISTs ocorrem ao longo de todo o tracto GI e são mais frequentemente identificados no estômago (60%), jejuno e íleo (30%), duodeno (5%), recto (4%) e menos no esófago e apêndice27, 38, 40, 96, 153. Podem também desenvolver-se raramente fora do tracto gastrointestinal (EGISTs), em locais como o mesentério, epíploon e estruturas retroperitoneais 141, 154,

41 Apesar de ~70% dos doentes apresentar alguma forma de sintomatologia, o diagnóstico de GIST é muitas vezes realizado na sequência de uma laparotomia efectuada por outro motivo. Devido à baixa incidência, o diagnóstico pré-operatório requer um alto grau de suspeição, podendo alguns achados radiológicos fornecer informações úteis 156. Os GISTs são tumores de crescimento expansivo e muitas vezes rápido, que ultrapassam facilmente o seu suporte sanguíneo, desenvolvendo áreas centrais de necrose detectáveis na imagiologia; podem fistulizar para o lúmen visceral e causar hemorragia GI. Os GISTs têm tendência para comprimir, mais do que invadir, os órgãos adjacentes e podem atingir grandes dimensões antes de causar sintomas, geralmente inespecíficos: náuseas, vómitos, saciedade precoce, distensão abdominal ou tumefacção palpável. No entanto, os sintomas clínicos mais comuns são a dor abdominal e a hemorragia digestiva 157. Os doentes podem ter hemorragia GI crónica, associada a anemia, ou perdas agudas causadas pela erosão/ulceração da mucosa gástrica ou intestinal. Raramente, pode ocorrer ruptura tumoral para a cavidade abdominal com hemoperitoneu potencialmente fatal. Tal como outros tumores, os GISTs podem causar disfagia quando localizados no esófago ou na junção esófago-gástrica, icterícia obstrutiva quando periampolares, ou invaginação/oclusão intestinal quando localizados no intestino delgado 156, 158. Um estudo de base populacional descreveu que ~70% dos GISTs apresentava sintomatologia clínica, 20% eram assintomáticos e 10% eram detectados apenas na autópsia. A dimensão média do tumor em cada uma destas categorias foi, respectivamente, de 8,9 cm, 2,7 cm e 3,4 cm 30. Os GISTs de menores dimensões são habitualmente assintomáticos e muitas vezes são detectados durante uma endoscopia, intervenção cirúrgica ou estudo radiológico, efectuados por outras razões. Os GIST malignos são frequentemente diagnosticados como doença disseminada. As metástases desenvolvem-se principalmente na cavidade celómica e/ou fígado e, raramente, nos tecidos moles e pele, em gânglios linfáticos ou no pulmão 27. Clinicamente, é essencial diferenciar GIST metastático de GIST multifocal, em doentes com mutações KIT ou PDGFRA germinativas (GISTs familiares) e em doentes com neurofibromatose 1, e de GISTs múltiplos esporádicos, que ocorrem sobretudo no estômago proximal 159. A patogénese dos GISTs múltiplos esporádicos está pouco esclarecida; no entanto, estes GISTs têm mutações de KIT distintas nas diferentes lesões tumorais do doente 159. GIST e neurofibromatose tipo I Existe uma associação entre GIST e neurofibromatose tipo I (NF1) 43, 51-53, 160, 161. A ocorrência de GISTs múltiplos e pequenos no intestino delgado, fora do contexto de GIST esporádico disseminado, associa-se significativamente à síndrome NF1. Estes GISTs têm habitualmente morfologia fusiforme, baixo índice mitótico e expressam KIT, geralmente na ausência de mutações de KIT ou PDGFRA Habitualmente, têm comportamento clínico benigno, embora tenham sido descritos alguns casos clinicamente malignos co-existindo com tumores síncronos benignos 96. GISTs pediátricos Aproximadamente 1-3% dos GISTs ocorre na população pediátrica, especialmente na segunda década de vida. Predominam no género feminino (F:M = 9:1), localizam-se preferencialmente no 41

42 estômago e apresentam sobretudo morfologia epitelióide 16, 39, 40, 162. Embora expressem consistentemente KIT, a maioria não tem mutações de KIT ou PDGFRA (GISTs wild-type) 16, 39, 40, 162. Nas crianças é mais frequente a ocorrência de tumores gástricos multifocais e, divergindo dos GISTs no adulto, frequentemente com metástases nos gânglios linfáticos. Em adultos jovens, os GISTs podem apresentar-se como tumores de tipo pediátrico ou de tipo adulto. O perfil de expressão génica dos GISTs na população pediátrica e nos adultos jovens é uma área de grande interesse e investigação. Os GISTs pediátricos sem mutações (wild-type) não apresentam as alterações genéticas observadas tipicamente em GISTs do adulto com mutações de KIT, sendo provável que estes tumores correspondam a uma entidade clínico-patológica independente 16, 39. GISTs associados com a tríade de Carney e com a díade de Carney (síndrome de Carney-Stratakis) Os GISTs gástricos pediátricos associam-se por vezes a paragangliomas e condromas pulmonares, integrando a tríade de Carney 54, 163, ou apenas a paragangliomas, na denominada díade de Carney 48, 163. Tal como na maioria dos tumores estromais esporádicos do grupo etário pediátrico, são GISTs sem mutações de KIT/PDGFRA (wild-type). A patogénese da tríade de Carney ainda não é conhecida e admite-se que é uma situação esporádica. A díade de Carney é transmitida de forma autossómica dominante. Pasini et al. descreveram recentemente no subgrupo de GISTs da díade de Carney mutações germinativas dos genes que codificam as subunidades B, C ou D da succinatodesidrogenase (SDH), evidenciando assim mecanismos patogénicos moleculares distintos (das mutações do KIT/PDGFRA) neste subgrupo de GISTs 48. A existência de vários GISTs gástricos é comum na tríade e na díade de Carney. Zhang et al. publicaram uma série de 104 GISTs da tríade de Carney, descrevendo as diferenças relativamente aos GISTs esporádicos comuns 164. As características clínicas da tríade incluem: a ocorrência predominante no género feminino e em idades jovens, o crescimento indolente e a multifocalidade dos tumores, a metastização frequente (muitas vezes para os gânglios linfáticos), a ausência de resposta ao imatinib e, por vezes, evolução fatal. Este subgrupo de GISTs ocorre principalmente no antro gástrico, tem morfologia geralmente epitelióide e não tem mutações de KIT, PDGFRA ou SDH. Não há correlação clara entre as classificações convencionais de risco biológico e o comportamento clínico destes tumores, que é imprevisível, mesmo na doença metastática 164. GISTs familiares Já foram identificadas cerca de duas dúzias de famílias com mutações hereditárias de KIT e PDGFRA A penetrância nestas famílias é elevada e os membros mais afectados desenvolverão durante a sua vida um ou mais GISTs. A idade média (44 anos) aquando do diagnóstico é inferior à dos GISTs esporádicos comuns, e não foram descritas diferenças significativas na distribuição por género. A maioria destes GISTs tem curso clínico benigno e não difere morfologicamente dos tumores esporádicos. 42

43 Procedimentos de diagnóstico e estadiamento Os GISTs são diagnosticados com frequência durante a avaliação efectuada para outras patologias. Dependendo da sua localização, os tumores podem ser identificados na endoscopia gastroduodenal, colonoscopia, tomografia computorizada ou na ressonância magnética. A endoscopia pode indicar o diagnóstico de GIST gástrico ou colo-rectal. Na avaliação endoscópica, o GIST identifica-se tipicamente como uma tumefacção submucosa. A ultrassonografia endoscópica pode ser útil para solucionar a dificuldade diagnóstica e confirmar que o tumor tem origem (na parede) sub-epitelial e não na mucosa gastrointestinal Uma massa circunscrita hipoecóica contígua com a muscular própria do estômago é característica de GIST 165, 169. Uma lesão heterogénea com diâmetro > 4 cm e com limites irregulares indica um elevado grau de suspeição de malignidade 170, 171. Embora as biópsias endoscópicas continuem a ser realizadas na prática clínica, fornecem raramente resultados conclusivos 165, 169. A biópsia com agulha fina realizada com ultrassonografia endoscópica permite identificar células fusiformes/epitelióides que expressam marcadores imuno-histoquímicos característicos de GIST. A biópsia percutânea (com agulha fina ou microbiópsia/com agulha grossa) guiada por ecografia ou TC para confirmar o diagnóstico de GIST ressecável deve ser usada com alguma ponderação, atendendo à possibilidade de ruptura tumoral, disseminação de células tumorais ou hemorragia 138. O diagnóstico de GIST numa biópsia percutânea, mesmo na microbiópsia, pode ser extremamente difícil ou impossível, quando apenas se obtém material necrótico ou hemorrágico. As biópsias, preferencialmente microbiópsias e, se possível, obtidas com ultrassonografia endoscópica, estão indicadas nos doentes em que o diagnóstico diferencial pode alterar a decisão terapêutica 24, 172, incluindo linfoma, fibromatose mesentérica ou tumor de células germinativas. A biópsia pode também ser útil nos casos em que a massa é volumosa e ressecável marginalmente ou implica uma ressecção multi-visceral, indicando a necessidade de tratamento neoadjuvante. O risco de disseminação peritoneal tem sido considerado desprezível quando são seguidas todas as precauções na realização do procedimento. A excisão laparoscópica/laparotómica imediata é uma alternativa válida a considerar, especialmente nos casos indicados para ressecção local limitada 24. Na doença metastática a biópsia de uma das lesões pode ser útil para planear o tratamento, evitando a necessidade de laparoscopia ou laparotomia. A tomografia computorizada (TC) é considerada o estudo radiológico mais útil para o diagnóstico dos GISTs. A TC com contraste endovenoso (e.v.) pode permitir avaliar o tumor primário, o fígado e o peritoneu, que são os locais mais comuns da doença metastática 138, 173. O tumor primário consiste habitualmente numa massa bem circunscrita e muitas vezes muito vascularizada, em relação íntima com o estômago ou com o intestino delgado. Na TC, são geralmente tumores hiperdensos, que contrastam bem, podendo apresentar áreas heterogéneas ou císticas, necrose central ou hemorragia intratumoral. As metástases ganglionares são muito raras e a metastização extra-abdominal ocorre especialmente em fases muito avançadas dos GISTs. O exame radiológico indicado para estadiamento dos GISTs é a TC do abdómen e da pelve, com contraste e.v., podendo a Ressonância Magnética Nuclear 43

44 (RMN) e a ultrassonografia com contraste e.v. constituir alternativas válidas 24, 138. A RMN permite maior acuidade na avaliação pré-operatória dos GISTs rectais. A radiografia simples do tórax pode ser considerada suficiente para avaliar o tórax num doente assintomático, porque o GIST raramente metastiza inicialmente para o tórax. O cintilograma ósseo deve ser realizado apenas no esclarecimento de sintomas específicos 24, 174. A tomografia por emissão de positrões com 18-fluordesoxiglicose (PET-FDG) tem elevada sensibilidade na identificação de actividade metabólica destes tumores, ajudando a distinguir tumor activo de tecido necrótico ou fibrosado 175, mas não permite o diagnóstico de GIST. A PET-FDG pode ser considerada nos doentes em que os resultados da TC são inconclusivos ou discordantes dos achados clínicos 138, 173. É um meio auxiliar de diagnóstico importante nos casos em que é necessária a avaliação precoce da resposta do tratamento molecular dirigido a alvos moleculares 24, 156, 176. A integração da PET-FDG e da TC (ou RMN) nos sistemas combinados PET/TC disponíveis permite optimizar a avaliação dos doentes submetidos a terapêutica dirigida a alvos moleculares Avaliação do risco biológico e estadiamento dos GISTs Factores de prognóstico e avaliação do risco biológico O comportamento dos GISTs baseado na avaliação de parâmetros anátomo-patológicos é classificado de forma distinta da maioria tumores malignos (carcinomas) do tracto GI. O melhor indicador de malignidade é a confirmação de doença metastática. Nalgumas séries, 10-45% dos doentes apresentam doença metastática aquando do diagnóstico 30, 178, 179. Os GISTs podem-se manifestar com um espectro vasto de comportamento biológico, sendo muitas vezes difícil prever a recidiva tumoral após ressecção cirúrgica macroscopicamente completa. Vários parâmetros podem ser úteis na previsão do comportamento clínico dos GISTs. Os três mais importantes são: dimensão maior, índice mitótico e localização do tumor 153, 180, 181. Numa análise multivariada recente do MSKCC (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) 180, cada um destes parâmetros permitiu prever de forma independente a sobrevida livre de recidiva após exérese numa série retrospectiva de GISTs primários e localizados. O impacto do índice mitótico foi o mais significativo em doentes com 5 mitoses/50 campos de grande ampliação (CGA). Os doentes com tumores localizados no intestino delgado e tumores com diâmetro 10 cm apresentaram maior probabilidade de recidiva. Os doentes com tumores <5 cm de dimensão ou tumores localizados no estômago apresentaram comportamentos mais favoráveis. Embora a grande maioria dos GISTs <2 cm seja considerada como tendo comportamento clinicamente benigno, há doentes ocasionais que desenvolvem metástases 5 ou mais anos após a excisão do tumor primário. Por isso, as classificações dicotómicas "benigno" ou "maligno" foram substituídas por classificações de estratificação do risco biológico para a prever o comportamento clínico dos GISTs. 44

45 A primeira classificação de risco de comportamento clínico no GIST foi publicada em 2002 por Fletcher e et al., na sequência de uma reunião de consenso do National Institute of Health (NIH) 1, 182. A avaliação de risco proposta baseou-se na maior dimensão e na actividade mitótica (mitoses/50 CGA) do tumor, sendo a dimensão de 5 cm e o índice de 5 mitoses/50 CGA os valores limite usados na estratificação do comportamento clínico. De acordo com esta classificação, todos os GISTs podem ter potencial maligno. É muito usada por médicos e patologistas, dado o pequeno número de grupos de risco e a simplicidade de aplicação. No entanto, parece ter limitações nos GISTs de risco intermédio exclusivamente baseado na dimensão do tumor. Na maior parte das séries de base populacional, o grupo de "risco intermédio" não discrimina satisfatoriamente os doentes com prognóstico desfavorável 24. A principal limitação desta classificação resulta da não valorização da localização anatómica do tumor nem da ruptura tumoral. Não obstante ter sido validada em diversos estudos a utilidade e a sensibilidade da classificação de risco NIH, alguns autores descreveram um valor superior ao de classificações alternativas para estratificação do risco 180, 183. Em 2005 e 2006, Miettinen e et al. do Armed Forces Institute of Pathology (AFIP), publicaram dois estudos de grandes séries de GISTs gástricos e jejunais/ileais com follow-up prolongado 38, 96. Estes estudos descreveram que, para dimensões e índices mitóticos idênticos, os GISTs localizados no estômago têm comportamento menos agressivo do que os jejunais e ileais. A localização anatómica do tumor passou a ser incluída como parâmetro adicional na avaliação de risco dos GISTs, de acordo com as orientações do consenso National Comprehensive Network (NCCN) de 2007, recentemente actualizadas 21 (Tabela 1, adaptada de Miettinen et al. 184 ). Miettinen et al. definiram 8 subgrupos, com base na maior dimensão e no índice mitótico, usando também a localização anatómica, para distinguir quatro grupos de risco: "muito baixo", "baixo", "moderado" e "alto", idênticos aos 4 grupos de risco do sistema NIH, e incluíram um grupo de tumores benignos ( 2 cm e 5 mitoses/50 CGA) 184. O sistema de classificação AFIP pretende estimar o risco de recidiva e/ou progressão do tumor, expresso numericamente 185. Para alguns autores, o inconveniente principal resulta da complexidade do sistema AFIP, com 8 subgrupos, sendo que a excessiva subdivisão pode reduzir a sensibilidade e especificidade prognóstica 183. Comparando as classificações NIH e AFIP, constata-se que o sistema NIH sobrevaloriza o risco dos tumores gástricos em relação aos GISTs não-gástricos. A European Society of Medical Oncology (ESMO) considera que a classificação de risco AFIP pode estratificar melhor os grupos de risco dos GISTs 24. A previsão do comportamento do GIST num doente concreto permanece um desafio clínico. Actualmente, aceita-se que todos os GISTs podem ter potencial maligno e nenhum caso, com a possível excepção de tumores <1 cm, deve ser classificado como benigno 156. A história natural dos GISTs microscópicos permanece desconhecida. Dois estudos descreveram a presença de GISTs microscópicos, respectivamente, em 22,5% e 35% dos estômagos em autópsias consecutivas e removidos por carcinoma gástrico 33, 35. Estes resultados indicam que os GISTs são comuns na população em geral. Alguns autores admitem que os GISTs mais pequenos não progridem para tumores de dimensões clinicamente relevantes 138, 184, 186. No entanto, alguns podem ser precursores de GISTs com significado clínico 33, 187. São necessários estudos adicionais para esclarecer quais os 45

46 mecanismos biológicos responsáveis pela evolução de tumores microscópicos para GISTs com significado clínico. Tabela 1: Estratificação de risco dos GISTs primários segundo o índice mitótico, dimensões e localização anatómica Parâmetro tumoral Risco de progressão da doença a Índice mitótico Dimensões Estômago Duodeno Jejuno/íleo Recto 5/50 CGA 2 cm Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum 5/50 CGA > 2 5 cm Muito baixo (1,9%) 5/50 CGA > 5 10 cm Baixo (3,6%) - c 5/50 CGA > 10 cm Moderado (10%) Baixo (8,3%) Baixo (4,3%) Baixo (8,5%) Moderado (24%) Alto (34%) Alto (52%) Alto (57%) b > 5/50 CGA 2 cm Nenhum b - c Alto (50%) b Alto (54%) - c > 5/50 CGA > 2 5 cm Moderado (16%) Alto (50%) Alto (73%) Alto (52%) > 5/50 CGA > 5 10 cm Alto (55%) - c Alto (85%) - c > 5/50 CGA > 10 cm Alto (86%) Alto (86%) Alto (90%) Alto (71%) a Definido como metastização ou morte relacionada com o GIST b Número de casos limitado c Dados insuficientes Tabela adaptada de Miettinen et al. 184 Dados baseados no follow-up prolongado de 1,055 GISTs gástricos, 629 do intestino delgado, 144 duodenais e 111 rectais 38, 96. Um nomograma prognóstico para estimativa da sobrevida livre de doença após ressecção cirúrgica macroscópica completa de GISTs primários localizados foi proposto por Gold et al É um método que utiliza a dimensão, o índice mitótico e a localização dos tumores, para prever a probabilidade de sobrevida livre de recidiva (SLR). São atribuídos pontos em cada caso, numa escala baseada na localização (gástrico vs. intestino delgado vs. cólon/recto vs. extragastrointestinal), na dimensão (variável contínua não-linear) e no índice mitótico (< 5 vs. 5/50 CGA) dos tumores. O total de pontos indica a SLR aos 2 e 5 anos. O nomograma permitiu estimar uma probabilidade de concordância de 0,78, equivalente à obtida com o sistema AFIP, e superior à do sistema NIH no mesmo estudo 138. Desconhece-se a precisão do nomograma para estimar a SLR a longo prazo em GISTs indolentes e progressão tardia 188. As estimativas da SLR obtidas com o nomograma podem ser mais úteis para a selecção dos doentes candidatos a tratamento adjuvante com inibidores tirosina-cinásicos

47 Foram propostos outros sistemas de estratificação de risco dos GISTs. Vários autores apresentaram versões do sistema de estratificação de risco NIH, incluindo outros factores de prognóstico. O risco de recidiva pode ser estimado com base não só no índice mitótico, dimensão e localização do tumor, mas também na qualidade das margens cirúrgicas e na ocorrência de ruptura do tumor 24. Apesar da controvérsia existente, a ressecção cirúrgica com margens microscópicas positivas (R1) pode expor os doentes a risco de recidiva tumoral loco-regional. Rutkowski et al. 189 descreveram que a ressecção não radical (R1) e a ruptura do tumor associam-se a resultados desfavoráveis 31. Joensuu et al. utilizaram o sistema NIH como base e incluiram a presença de ruptura tumoral como factor de risco para estimar comportamento agressivo, independente do tamanho e do índice mitótico dos tumores 186. Outra modificação da proposta de Joensuu foi a inclusão dos tumores não-gástricos, do grupo de risco intermédio (classificação NIH), no grupo de risco elevado, corroborando a importância da classificação de Miettinen/AFIP. A ocorrência de ruptura tumoral intra-abdominal, antes ou durante a ressecção cirúrgica, tem sido associada a evolução clínica desfavorável, com metastização peritoneal 190, 191. A ruptura do tumor deve ser sempre valorizada porque traduz risco de evolução desfavorável, independente de qualquer outro factor prognóstico 24. Para além da dimensão do tumor, do índice mitótico e da localização do tumor, do estado das margens cirúrgicas e da ruptura tumoral, têm sido investigados outros parâmetros preditivos de recidiva 181. A proliferação tumoral estimada com Ki-67 foi descrita como factor prognóstico independente A invasão difusa da mucosa é uma ocorrência rara, associada a evolução mais agressiva da doença 181, 195, 196. A presença de necrose tem sido descrita com valor prognóstico em algumas séries 38, 197, 198. A aneuploidia é um factor de agressividade 193, 199, 200, e alguns estudos têm sugerido que a expressão da telomerase é um factor de mau prognóstico 190, 201. A expressão ou o padrão de expressão KIT e a expressão de CD34 não parecem ser factores independentes de prognóstico dos doentes com GIST 202. Estadiamento clínico dos GISTs Woodall et al. propuseram um método de estadiamento dos GISTs baseado num sistema tumorgrade-metastasis (TGM) 203. Os autores, usando resultados do SEER (2537 casos), determinaram a dimensão 7cm como a mais útil para a previsão do comportamento clínico dos GISTs do que os valores previamente usados (2 cm, 5cm e 10cm). No entanto, uma percentagem destes casos foi diagnosticada antes de 2000, sem avaliação da expressão KIT, motivo pelo qual a série estudada poderá não corresponder totalmente a casos de GIST. Além disso, o método utilizado para a classificação do grau de diferenciação dos GISTs, em quatro categorias e de forma semelhante à dos sarcomas dos tecidos moles, não parece ser a mais adequada. A sétima edição da classificação TNM da International Union Against Cancer (UICC) publicada em 2010 incluiu pela primeira vez a classificação e o estadiamento dos GISTs 204. O objectivo principal da classificação TNM é facilitar uma abordagem homogénea e padronizada dos tumores e o estabelecimento de follow-up uniforme dos doentes com base no estádio do tumor

48 A classificação TNM utiliza critérios da avaliação de risco para caracterizar os tumores em quatro categorias T, combinando o índice mitótico e a localização do tumor para definir os estádios clínicos. Em geral, dada a raridade das metástases ganglionares linfáticas nos GISTs, é recomendada a classificação de todos os casos em que os gânglios linfáticos regionais não foram estudados, como pn0. A presença de metástases ganglionares linfáticas, tal como a metastização à distância, corresponde a um estadio IV. A classificação TNM reproduz, genericamente, os 8 subgrupos de prognóstico definidos pela classificação de Miettinen/AFIP 4. Deste modo, pode-se argumentar que a utilização dos mesmos critérios de risco para determinar os estádios TNM representa uma agregação diferente dos grupos de risco estabelecidos por vários grupos de trabalho nos últimos anos 185. Um dos aspectos mais sensíveis é a subdivisão da categoria alto risco em dois ou três estádios (II, III ou III-B), sabendo-se que o valor desta subclassificação dos tumores de alto risco continua a aguardar validação. Na proposta de classificação de Miettinen/AFIP os tumores pequenos (< 2 cm) e mitoticamente inactivos não apresentam risco de progressão e poderão ser considerados como de comportamento clínico benigno, independente da localização anatómica 4. Sendo assim, a inclusão deste grupo de tumores numa classificação TNM de tumores malignos pode ser controversa. Outra controvérsia relaciona-se com o tipo de crescimento dos GISTs. A classificação TNM não estabelece a relevância da infiltração da subserosa, do epíploon/mesentério, da invasão do peritoneu visceral pelas células tumorais, da ruptura tumoral, nem da multiplicidade de tumores primários no epíploon/mesentério. É, por isso, evidente a necessidade de um sistema consensual e validado de classificação/estadiamento que inclua a heterogeneidade do comportamento biológico dos GISTs. 9 - O papel da análise molecular no prognóstico e no tratamento não-cirúrgico dos GISTs Apesar das semelhanças é importante considerar as diferenças entre GISTs com mutação do KIT e mutação do PDGFRA e os casos com sequências normais de KIT e de PDGFRA (wild-type). A resposta clínica objectiva ao imatinib depende da presença e do tipo de mutação do RTK implicado. Foi proposta uma classificação molecular dos GISTs 10, 90, que destaca as diferenças moleculares destes tumores e fornece uma referência rápida para outras síndromes com que podem associar-se (Tabela 2). Com base em quatro ensaios clínicos (fase I-III) que investigaram mais de 700 GISTs com genótipos diferentes, as taxas de resposta objectiva ao imatinib nos GISTs com mutações no exão 11 e no exão 9 do gene KIT, e nos GISTs wild-type foram, respectivamente, 72-86%, 38-48% e 28% 9, 21, 87, 152, 205, 206. Os GISTs com mutação no gene PDGFRA respondem ao imatinib, com a excepção da mutação D842V no exão 18 9, 83, 87, 113. As taxas de resposta ao imatinib mais favoráveis [mediana do tempo livre de progressão da doença mais elevada (~ 24 meses) e mediana da sobrevida mais longa (~ 63 meses)] 9, 87, 206 são descritas nos GISTs com mutações no exão 11 do KIT. 48

49 Tabela 2: Classificação molecular dos GISTs Frequência Comentários KIT Exão 11 67% A maioria é sensível ao imatinib Exão 9 10% Requer dose mais elevada de imatinib Exão 13 & 17 3% PDGFRA Exão 12 & 14 2% Sensível ao imatinib Exão 18 5% D842V é resistente ao imatinib Wild type 15% Mutações BRAF ou KRAS raras GIST Familiar Raros Mutações KIT ou PDGFRA germinativas Carney-Stratakis Raros Mutações SDHB, SDHC, SDHD GIST Pediátrico Raros Mutações KIT e PDGFRA são raras Tríade de Carney Raros Sem mutações KIT ou PDGFRA GIST associado a NF-1 Raros Mutações KIT ou PDGFRA pouco comuns Adaptado de Corless, C. 10 Os doentes com mutações no exão 11 do gene KIT são habitualmente tratados com imatinib, numa dose diária de 400 mg, e a escalada da dose para 800 mg/dia tem sido recomendada nos casos de progressão da doença durante o tratamento. Os doentes que têm mutação no exão 9 do KIT apresentam sobrevida livre de progressão da doença mais longa quando tratados com a dose inicial de 800 mg/dia 87, 89, 206. De acordo com o consenso actual, o estado mutacional KIT deve ser avaliado por rotina em GISTs inoperáveis, com administração de 800 mg/dia de imatinib nos casos em se identifica mutação no exão 9 do KIT 24, 138. A realização da análise molecular de rotina em todos os GISTs continua a ser um tema muito controverso. Os resultados dos principais centros de referência Europeus e dos Estados Unidos fornecem evidência a favor da realização destes testes nos GISTs irressecáveis e/ou metastáticos, beneficiando os doentes que têm mutação no exão 9 do KIT. A análise mutacional pode também ser considerada na decisão de realizar tratamento adjuvante com imatinib em GISTs primários de risco intermédio e alto" 24, 138. Deste modo, podem ser excluídos GISTs com mutações resistentes ao imatinib (ex: mutações D842V do PDGFRA). Estes testes, na opção neoadjuvante, permitem ajustar a decisão terapêutica de forma mais adequada. Embora o tratamento de primeira linha dos doentes com GIST metastático/irressecável seja, de acordo com o estado actual da arte, a utilização do imatinib, é possível que no futuro este regime terapêutico possa ser alterado para outros inibidores tirosina-cinásicos ou terapêuticas alternativas, com base no estudo molecular dos tumores 89,

50 10 - Tratamento 10. a) Doença primária localizada É consensual o tratamento de GISTs primários de dimensão 2 cm e sem evidência de disseminação peritoneal ou metastização à distância com ressecção cirúrgica macroscópica completa 24, 138. No entanto, quando são detectados nódulos subepiteliais esófago-gástricos ou duodenais com diâmetro <2 cm, a abordagem padrão dos doentes consiste na avaliação com ecografia endoscópica e na vigilância activa, porque muitos destes nódulos, quando correspondem a GISTs, são tumores de baixo risco biológico 1, 184, ou com significado clínico desconhecido. A exérese cirúrgica é reservada para os doentes cujo tumor aumenta de dimensão ou é sintomático. Os resultados de uma análise retrospectiva recente 208 indicam que apenas alguns (3/23; 13,0%) dos tumores pequenos sem características eco-endoscópicas de risco (maior dimensão, limites extraluminais irregulares, padrão ecográfico heterogéneo, presença de áreas císticas e focos hiperecogénicos) progridem durante o seguimento de longo prazo com eco-endoscopia. Como alternativa, a decisão pode ser partilhada com o doente, no sentido de se poder optar por uma avaliação histológica inicial (biópsia com agulha) ou pela excisão, quando a morbilidade não é substancial. Nos nódulos intra-abdominais não passíveis de avaliação endoscópica, a exérese/ressecção laparoscópica/laparotómica é a abordagem padrão. Nos nódulos rectais (ou do espaço recto-vaginal), a abordagem deve ser a realização de biópsia/exérese, após avaliação por ecografia endoscópica, independente da dimensão do tumor, porque os GISTs nesta localização têm risco biológico mais elevado e as implicações de uma intervenção cirúrgica nesta região são mais críticas, sobretudo nos tumores de grandes dimensões 24. As orientações da ESMO e da NCCN indicam que os tumores com dimensões > 2 cm devem ser ressecados 24, 138, porque, sendo GISTs, implicam maior risco de comportamento agressivo. Para doentes com GIST primário localizado, a ressecção cirúrgica continua a ser a única possibilidade de cura 209. Normalmente causa pouca morbilidade em tumores <10 cm limitados ao estômago ou intestino delgado. Ao contrário dos carcinomas GIs, os GIST não se originam nas camadas epiteliais e apresentam biologia e comportamento diferente, com implicações distintas relativamente às margens cirúrgicas e à linfadenectomia dos gânglios linfáticos loco-regionais. Dependendo do órgão onde se origina, da localização exacta, e das dimensões do tumor, podem ser necessárias abordagens cirúrgicas diferentes. O objectivo do tratamento é a ressecção completa do GIST, com margens microscópicas negativas (R0) e preservando a pseudo-cápsula intacta (i.e. evitando a ruptura tumoral) 24, 138. Como o GIST não tem geralmente padrão infiltrativo intraparietal, raramente é necessário efectuar ressecções alargadas 27. As recomendações actuais para as margens cirúrgicas têm por base a experiência, o consenso, e a aplicação de conceitos patobiológicos sobre GIST 24, 138. Não há dados prospectivos conclusivos sobre a extensão das margens de ressecção e o risco de recidiva local ou à distância do GIST. A ressecção em cunha é a opção mais utilizada nos GISTs do estômago e a ressecção segmentar nos GISTs do intestino delgado. Nos GISTs de grandes dimensões, na pequena curvatura e/ou 50

51 com envolvimento pilórico, pode não ser possível a ressecção em cunha, sendo mais adequada a gastrectomia distal. A gastrectomia total não é habitualmente necessária, devendo ser considerada em função da localização (junção esófago-gástrica) e/ou a extensão do tumor. Os GISTs do recto são incomuns e o diagnóstico definitivo é, frequentemente, obtido aquando do estudo anátomo-patológico da peça operatória. O GIST rectal de pequenas dimensões, localizado no terço inferior, pode ser removido com ressecção parietal completa, com abordagem trans-anal ou trans-esfinctérica 210. Esse tipo de abordagem deve ser efectuada com os cuidados necessários, porque foram descritas taxas menores de ressecção R0 (32% vs. 82%) e taxas maiores de recidiva local (77% vs. 31%), quando comparadas com a ressecção anterior baixa do recto, que é o procedimento recomendado para GISTs dos terços superior e médio 211, 212. A técnica cirúrgica utilizada para ressecar os GISTs tem implicações determinantes na ocorrência de recidiva tumoral. A ruptura do tumor deve ser estritamente evitada, especialmente quando tem Fig. 4: Aspecto macroscópico de ressecção de GIST gástrico com invasão do cólon transverso. grandes áreas císticas ou necróticas. A enucleação simples dos GISTs é considerada uma opção inadequada, porque pode não remover parte da pseudo-cápsula que contém células tumorais viáveis e associa-se a maior frequência de ruptura tumoral. Por estes motivos, a enucleação não é aconselhável, mesmo quando o objectivo é preservar uma estrutura vital 213. Quando o GIST apresenta grandes dimensões pode ser submetido a tratamento pré-operatório com imatinib (neoadjuvante), com o objectivo de se obter condições de ressecabilidade do tumor que é, muitas vezes, necrótico e friável 214. Esta opção pode facilitar a ressecção cirúrgica com 51

52 preservação da função ou do órgão, particularmente em GISTs da junção esófago-gástrica, da segunda porção do duodeno e do 1/3 inferior do recto 24, 138. Quando há invasão de órgãos adjacentes, a ressecção em bloco pode ser uma alternativa. A ressecção incompleta do tumor deve ser efectuada apenas como opção terapêutica paliativa, em casos de hemorragia, dor ou sintomas relevantes, secundários ao efeito de massa. Muitos autores descreveram que os GISTs metastizam raramente para os gânglios linfáticos, mesmo nos casos de alto risco. Bucher et al. 215 descreveram 5/80 doentes (6%) com GIST localizado com metástases hematogéneas, com ou sem envolvimento ganglionar linfático. Na série de Rutkowski et al. 189 (n=335) descreve-se quatro casos (1,2%) com metastização ganglionar. Os estudos publicados indicam que não se justifica a realização de linfadenectomia de rotina no tratamento cirúrgico dos GISTs, excepto quando é detectado envolvimento ganglionar macroscópico 24, 27, 138, Tumor residual microscópico (R1) De acordo com as orientações da ESMO e da NCCN, nos casos em que foi efectuada ressecção microscopicamente incompleta (R1) pode ser considerado o alargamento de margens quando a localização exacta da lesão é identificavel e o risco de morbilidade cirúrgica é baixo. Quando a ressecção R0 resulta previsivelmente em complicações funcionais ou co-morbilidades importantes, e o tratamento médico neoadjuvante não é eficaz ou não pode ser administrado, a decisão de realizar uma ressecção R1 deve ser discutida com o doente. A ressecção R1 pode ser aceitável em GISTs de baixo risco. Não há estudos que demonstrem a associação de ressecção R1 com sobrevida mais curta dos doentes 218. Cirurgia Laparoscópica A cirurgia laparoscópica no GIST está a ser progressivamente mais utilizada nos últimos anos. O diagnóstico endoscópico melhorou a capacidade de identificar GISTs gástricos de pequenas dimensões com baixo risco de agressividade 1, 184. A abordagem minimamente invasiva tem vindo a ser adoptada na generalidade destes tumores, devido aos benefícios potenciais decorrentes de se evitar a laparotomia dos doentes. Recomenda-se que a técnica deve seguir rigorosamente os princípios oncológicos da cirurgia aberta: ressecção completa do tumor com margens livres (R0), evitando a disseminação de células tumorais na cavidade peritoneal 24, 138, 219. Nos GISTs de grandes dimensões, a ressecção R1 pode complicar-se com ruptura intra-operatória do tumor e disseminação peritoneal. Por este motivo, a ressecção laparoscópica tem sido desaconselhada em doentes com GISTs de grandes dimensões 173, 218. Novitsky et al. 220 sugeriram que esta recomendação devia ser revista, porque não foi baseada em evidências, mas traduz apenas uma medida preventiva para cirurgiões inexperientes neste procedimento. Diversos autores propuseram a adopção de orientações mais alargadas para a cirurgia laparoscópica nos GISTs 221, 222. Várias séries descrevem a realização de ressecção por via laparoscópica de tumores com dimensões entre 0,3-12,5 cm 218, 223, sugerindo a laparoscopia na ressecção de GISTs, sobretudo em localização gástrica. 52

53 Não há estudos de ensaios clínicos controlados randomizados e prospectivos que permitam validar estas opções. A NCCN (2007) considera aceitável a ressecção laparoscópica de tumores até 5 cm de dimensão, e que os tumores > 5 cm, dependendo da localização e da morfologia, podem ser ressecados por via laparoscópica ou por técnicas de laparoscopia hand-assisted 21, 138, 220, 223. Antes de iniciar a ressecção do tumor, deve ser realizada uma exploração formal da cavidade abdominal para excluir a presença de metastização no peritoneu ou no fígado. A ecografia intraoperatória pode ser útil na avaliação de metástases hepáticas e, nas lesões suspeitas, para orientar a realização de biópsias. A endoscopia intra-operatória tem sido frequentemente utilizada para a localização dos GISTs de pequenas dimensões e na selecção da técnica de ressecção mais adequada. Para evitar o risco de ruptura, os GISTs não devem ser manipulados directamente com os instrumentos laparoscópicos 220. Embora não existam dados disponíveis, a utilização de saco de extracção da peça operatória parece essencial para evitar a disseminação de células tumorais na cavidade abdominal ou no orifício da porta respectiva, e eventualmente metastização 24, 220, 224. Nas diversas séries publicadas, têm sido utilizadas diferentes abordagens, dependendo de vários factores (ex: dimensão, localização e forma macroscópica do tumor), para o tratamento dos GISTs gástricos: ressecções em cunha ou segmentares por via laparoscópica, laparoscópica-endoscópica (intragástrica) ou laparoscópica hand-assisted 220. Os GISTs da parede anterior e da pequena e grande curvatura do estômago são geralmente submetidos a ressecção em cunha, com máquina de anastomose linear endoscópica. As lesões de maiores dimensões podem ser ressecadas com margens livres, utilizando o bisturi ultrassónico 220. Os tumores da parede posterior são muitas vezes abordados pela retrocavidade dos epíploons, mas a abordagem trans-gástrica, com gastrotomia anterior, constitui alternativa válida, especialmente nos GISTs localizados próximo da junção esófago-gástrica Esta opção é, no entanto, tecnicamente mais exigente 226, e há relatos de ressecções incompletas 213 e de complicações pós-operatórias, como estenoses e fugas na linha de sutura 224. A abordagem combinada endoscópica-laparoscópica intragástrica tem sido descrita como método alternativo no tratamento dos GISTs da junção esófago-gástrica 220, 224. A localização do tumor não deve ser considerada contra-indicação absoluta para cirurgia minimamente invasiva, desde que assegurada a experiência técnica necessária e todas as precauções indispensáveis 224. No entanto, nos GISTs com maiores dimensões e/ou com localizações desfavoráveis, como a pequena curvatura ou a junção esófago-gástrica, pode não ser possível efectuar ressecção em cunha com margens livres de tumor, podendo ser necessário optar por gastrectomia subtotal ou total. Nestes casos, o tratamento neoadjuvante com imatinib, como sugerido nas recomendações ESMO e NCCN, pode ser uma opção válida, para redução da dimensão do tumor que permita a cirurgia conservadora do órgão 224. Contudo, a exequibilidade e os resultados deste tipo de abordagens são ainda objecto de avaliação em curso 229. A cirurgia laparoscópica pode aplicar-se a GISTs com localizações diversas, como é o exemplo dos GISTs rectais de pequenas dimensões. No entanto, os dados disponíveis relativamente a ressecções laparoscópicas de GISTs noutras localizações (extragástricas) são escassos

54 Os resultados globais publicados da cirurgia laparoscópica descrevem que as complicações intraoperatórias e pós-operatórias são relativamente raras, ocorrendo, respectivamente, em 6,8% e 7,7% dos doentes 218. As ressecções decorrem com perdas mínimas de sangue, satisfazendo os tempos de cirurgia e períodos curtos de estadia hospitalar 223, 224. Evita-se também a morbilidade relacionada com a ferida operatória da laparotomia 220. A "curva de aprendizagem" nos procedimentos laparoscópicos faz presumir que, com a maior experiência técnica, os tempos operatórios serão progressivamente melhorados 230, 231. Apesar dos dados de follow-up dos doentes serem escassos, não excedendo ~5 anos 218, algumas séries descreveram segurança oncológica na abordagem laparoscópica 220, 232, 233, com eficácia e taxas de recidiva semelhantes às obtidas com cirurgia convencional. A aplicabilidade da abordagem laparoscópica deve assentar numa variedade de factores, incluindo as características do doente, a dimensão e a forma macroscópica do tumor, o padrão de invasão e a localização do tumor, bem como a experiência e qualificação em cirurgia laparoscópica do cirurgião 220. Os dados da literatura indicam que as ressecções laparoscópicas ou assistidas por laparoscopia são exequíveis e associam-se a taxas de recidiva reduzidas, períodos curtos de internamento e morbilidade baixa 213, 217, 220, 232, 234, 235. Esta abordagem deve ser recomendada como opção de escolha para a maioria dos doentes com GISTs gástricos de pequenas e médias dimensões 220, 224. GIST primário localmente avançado Nos GISTs localmente avançados, não metastáticos, pode ser impossível a realização de ressecção R0. Nestes casos, deve considerar-se a citorredução tumoral com terapêutica neoadjuvante com imatinib. Esta abordagem pode facilitar a obtenção de margens cirúrgicas R0 e permitir uma cirurgia menos mutilante, com melhores resultados funcionais, de acordo com orientações da ESMO e da NCCN. Esta recomendação baseia-se em publicações de dados retrospectivos, não randomizados 236, 237. O tratamento primário com imatinib, para citorredução do tumor, pode ser considerado nos GISTs em que se prevê um risco elevado de hemorragia ou ruptura tumoral durante a cirurgia. A resposta terapêutica máxima é atingida geralmente após 6-12 meses de tratamento. A intervenção cirúrgica subsequente pode, na maioria dos casos, ser realizada com segurança 24, 214, 238. No entanto, nem sempre é necessário esperar pela resposta máxima antes de realizar a cirurgia. A análise mutacional pode auxiliar a ponderar a terapêutica neoadjuvante dos GISTs com menos sensibilidade ao imatinib (por exemplo, com mutações D842V do PDGFRA), e permitir adoptar o esquema terapêutico mais adequado. A PET ou PET-TC, ou a avaliação da densidade do tumor com TC pode ser particularmente útil na avaliação rápida da resposta à terapêutica, não condicionando atraso na intervenção cirúrgica dos GISTs que não respondem ao tratamento É imprescindível estabelecer um plano terapêutico multidisciplinar, envolvendo patologistas, radiologistas, cirurgiões e médicos oncologistas. A partilha de experiências, disponível em centros 54

55 de referência para sarcomas e GISTs e/ou em redes de referenciação de doentes oncológicos, deve ser entendida como fundamental no tratamento dos GISTs 24. Tratamento adjuvante Após ressecção, o risco de recidiva de GISTs pode ser substancial 180, 243, conforme definido pela classificação de risco (classificação de Miettinen/AFIP). Tendo em conta a eficácia do imatinib na doença metastática, o seu uso em tratamento adjuvante tem sido avaliado em vários estudos Um ensaio clínico intergrupo de fase II (Z9000) do American College of Surgeons Oncology Group (ACOSOG) avaliou o tratamento adjuvante com imatinib, administrado numa dose de 400 mg/dia durante 12 meses, após ressecção completa do tumor primário em GISTs de risco elevado (n=107). Os GISTs de alto risco foram definidos como tumores com dimensões> 10 cm, com ruptura ou hemorragia intraperitoneal, ou tumores multifocais (> 5). Os resultados descrevem que o imatinib é bem tolerado no contexto adjuvante, prolonga a sobrevida livre de recidiva e está associado a sobrevida global melhor, em comparação com controlos históricos 244. Foi concluído um ensaio clínico intergrupo do ACOSOG (Z9001), de fase III, randomizado, duplamente cego, em que os doentes receberam imatinib (400 mg/dia) ou placebo durante 1 ano, após efectuarem uma ressecção macroscópica completa de GISTs primários KIT-positivos e com diâmetro 3 cm. Os doentes foram apenas estratificados segundo o tamanho do tumor (3 6 cm, 6 10 cm, and 10 cm). Com um tempo mediano de follow-up (713 doentes) de 19,7 meses, o estudo descreve que o tratamento adjuvante com imatinib aumentou significativamente a sobrevida livre de recidiva dos doentes, relativamente ao grupo placebo (98% vs. 83%). Resultados idênticos foram descritos nos diferentes subgrupos de estratificação, segundo a dimensão do tumor, mas a maior diferença entre o braço terapêutico e o braço placebo foi observada nos GISTs de risco mais elevado, com diâmetro 10 cm. Não foram observadas diferenças na sobrevida global entre os dois braços do estudo 246. Estes resultados apoiaram decisivamente o papel do imatinib no tratamento adjuvante do GIST. No entanto, é necessário um período de follow-up mais longo para conclusões definitivas sobre algumas questões fundamentais: taxa de recidiva absoluta após um intervalo de tempo de follow-up maior; tempo de atraso no aparecimento da recidiva; e, no caso de recidiva, tempo decorrido até ocorrer resistência secundária ao imatinib. Com base neste estudo, o imatinib foi aprovado, como terapêutica adjuvante no GIST, pela FDA (Federal Drug Administration) e pela EMA (European Medicine Agency). Embora ainda não exista consenso geral relativamente a que subgrupo de doentes deve ser administrado o tratamento adjuvante, é amplamente aceite que deve ser proposto aos doentes com GISTs de risco elevado. Segundo as recomendações actuais, o imatinib adjuvante pode ser proposto como opção para doentes com um risco substancial de recidiva (ESMO) 24, mais concretamente, para doentes com GISTs de risco intermédio ou elevado (NCCN) 138. A análise mutacional dos GISTs pode ser relevante para complementar a avaliação de risco na selecção dos doentes que são previsivelmente mais susceptíveis de beneficiar com o tratamento adjuvante. Os resultados dos estudos disponíveis sustentam o tratamento adjuvante durante um período de 12 meses. Estão em curso dois ensaios clínicos fase III (EORTC 62024; SSG 55

56 XVIII/AIO), para avaliar períodos de tratamento mais longos (0 vs. 2 e 1 vs. 3 anos, respectivamente) 247, 248. Foi recentemente iniciado um estudo fase II de tratamento adjuvante, denominado Post-resection Evaluation of Recurrence-free Survival for GastroIntestinal Stromal Tumors with Adjuvant Imatinib (PERSIST)-5 (ClinicalTrials.gov identifier: NCT ) para avaliar a sobrevida livre de recidiva em doentes com GIST de alto risco tratados com imatinib (400 mg/dia) durante 5 anos após ressecção cirúrgica. No caso de ruptura pré ou per-operatória do tumor, com disseminação de células tumorais na cavidade peritoneal, pode assumir-se um estado de doença peritoneal oculta. Este estado coloca os doentes perante um risco elevado de recidiva peritoneal e, por esse motivo, podem considerar-se candidatos a tratamento com imatinib. A duração ideal do tratamento nestes casos é ainda desconhecida 24. Follow-up dos doentes Não existem dados publicados conclusivos sobre qual o seguimento de rotina ideal para os doentes com GIST localizado submetidos a tratamento cirúrgico. Os esquemas de follow-up variam de instituição para instituição. A avaliação de risco baseada no índice mitótico, na dimensão e na localização do tumor, pode ajudar na selecção da melhor estratégia de seguimento. Nos doentes com GISTs de risco alto, a recidiva ocorre geralmente nos primeiros 2-3 anos após ressecção. Nos GISTs de risco baixo, a recidiva é menos provável e surge, na maior parte dos casos, após 2-3 anos. Como as metástases podem ocorrer anos após a cirurgia, o seguimento dos doentes deve ser prolongado 12. Existindo actualmente um tratamento eficaz para os GISTs recidivados e/ou metastáticos, algumas instituições de referência propõem a realização de TC todos os 3-4 meses durante 3 anos, nos doentes com GISTs de risco intermédio ou alto; depois, de 6/6 meses até aos 5 anos; e posteriormente com periodicidade anual. Nos doentes com tumores de risco baixo, é proposta a realização de TC de 6/6 meses durante os primeiros 5 anos. Os doentes com GISTs de risco muito baixo não necessitam provavelmente de seguimento de rotina, embora o risco de comportamento agressivo não deva ser considerado nulo 24, b) Doença recidivada e metastática Reconhece-se que o tratamento cirúrgico isolado não é curativo nos casos de GIST avançado, com doença recidivada e/ou metastática, mesmo quando se removem todas as lesões metastáticas abdominais. Na recidiva, cerca de 2/3 dos doentes têm envolvimento hepático e 1/2 doença peritoneal 27. As metástases extra-abdominais no pulmão ou no esqueleto são mais raras, podendo desenvolver-se em estadios mais avançados. 56

57 As metástases hepáticas são geralmente multifocais, difusas e difíceis de ressecar. Cerca de 26% dos doentes, submetidos a metastasectomia 249, desenvolvem recidiva após ressecção hepática 174. A exérese das lesões peritoneais associa-se geralmente a recidiva subsequente. A quimioterapia convencional para o tratamento do GIST tem uma taxa diminuta (cerca de 5%) de resposta A radioterapia tem também valor reduzido, devido à localização dos tumores e à limitação nas doses que podem ser utilizadas 202. A embolização da artéria hepática e a cirurgia de citorredução, seguida de quimioterapia intraperitoneal, foram também objecto de investigação, mas os resultados obtidos são desencorajadores 253, 254. O tratamento de escolha do GIST recidivado/metastático consiste, com poucas excepções, na administração do mesilato de imatinib (ESMO, NCNN). Os doentes com GIST primário e doença metastática síncrona de baixo volume podem ser seleccionados num primeiro tempo para ressecção cirúrgica, especialmente se forem sintomáticos. No entanto, as orientações de consenso recomendam a associação ao tratamento com imatinib, mesmo nos casos em que toda a doença macroscópica é ressecada 24. O uso do mesilato de imatinib revolucionou o tratamento dos GISTs. O imatinib é um inibidor selectivo de tirosina-cínases específicas, incluindo o KIT, PDGFRα, ARG, c-fms, ABL e BCR- ABL 253. O imatinib causa uma inibição competitiva no local de ligação do ATP do receptor KIT, levando à inibição da auto-fosforilação e subsequente interrupção das vias de sinalização envolvidas na proliferação e na sobrevida celular 255. O imatinib foi inicialmente desenvolvido como um inibidor do PDGFRα. A sua primeira utilização terapêutica foi no tratamento da leucemia mielóide crónica (LMC), em que uma proteína de fusão BCR-ABL (Breakpoint cluster region-abelson gene protein) causa desregulação da actividade tirosina-cinásica 256. Descreveu-se que o imatinib induz uma resposta completa em quase todos os doentes com LMC em fase crónica, tendo sido aprovado pela FDA para o tratamento dos doentes com LMC em Em 2001, Joensuu et al. publicaram a experiência com imatinib num único doente com GIST metastático 23. Os resultados confirmados nas imagens seriadas da RMN e da PET foram muito promissores. Esta publicação de um caso clínico desencadeou a realização de vários ensaios clínicos, sendo actualmente descrito que até 80% dos doentes com GIST metastático têm resposta parcial ou estabilidade da doença após terapêutica com imatinib 56. O imatinib é geralmente bem tolerado e os efeitos laterais incluem edemas, erupção cutânea, diarreia, náuseas, dores abdominais e fadiga. Eficácia e tolerabilidade do imatinib como terapêutica de 1ª linha A eficácia e a tolerabilidade com 400 e 800 mg/dia de imatinib na terapêutica de 1ª linha dos GISTs têm sido descritas em ensaios clínicos fase II/III. Num estudo fase II, multicêntrico e randomizado (B2222), com imatinib na dose de 400 ou 600 mg/dia em doentes com GIST avançado 258, a taxa de resposta, baseada nos critérios Southwest Oncology Group (SWOG) 259, foi de 53,7% (n=79) com resposta parcial e 27,9% (n=41) com doença estável, não se obtendo resposta completa em nenhum doente. Nos resultados a longo prazo deste 57

58 estudo 206 (tabela 3) descreve-se que, com uma mediana de seguimento de 71 meses, as taxas de resposta, a mediana da sobrevida livre de progressão (SLP) e a mediana da sobrevida global (SG) foram idênticas em ambos os braços terapêuticos. Neste estudo, a mediana da resposta terapêutica foi de 29 meses e a mediana da SG 57 meses. Tabela 3: Resultados de ensaios clínicos fase II e III com os inibidores tirosina-cinásicos (ITC) imatinib e sunitinib, em doentes com GIST localmente avançado ou metastático Ensaio clínico Desenho do estudo (N) ITC, dose (mg/dia) Resposta terapêutica Follow-up B2222 (Blanke, Demetri et al. 2008) Fase II-R (147) Imatinib, 400 vs. 600 RC: 1,4%, RP: 66,7% TPT (mediana): 20 e 26 meses, respectivamente (p=0,37). SG (mediana): 57 meses. EORTC (STBSG) (Verweij, van Oosterom et al. 2003) Fase II (27) Imatinib, 400x2 RC: 4%, RP: 67%, DE: 18% SLP a 1 ano: 73% STI571B1202 (Nishida, Shirao et al. 2008) Fase II-R (47) Imatinib, 400 vs. 600 RP: 69%, DE: 26% SLP (mediana): 96 semanas. SG aos 3 anos estimada: 73,6% European- Australasian (Verweij, Casali et al. 2004) Fase III-R (946) Imatinib, 400 vs. 800 RC: 5%, RP: 45%, DE: 32% vs. RC: 6%, RP: 48%, DE: 32% SG a 1 e 2 anos: 85% vs. 86% e 69% vs. 74%. SLP aos 2 anos: 50% vs. 56% (p=0,026). Intergroup S0033 (Blanke, Rankin et al. 2008) Fase III-R (746) Imatinib, 400 vs. 800 RC: 5%, RP: 40%, DE: 25% vs. RC: 3%, RP: 42%, DE: 22% SLP e SG (medianas): 18 vs. 20 meses e 55 vs. 51 meses (p=ns) Sunitinib phase III (Demetri, van Oosterom et al. 2006) Fase III-R Sunitinib, (312) a 50mg/kg (esq. 4/2) vs. placebo RP: 7%, DE: 58% vs. RP: 0%, DE: 48% SLP (mediana): 24,1 vs. 6 semanas (p<0,0001) EORTC- European Organisation for Research and Treatment of Cancer, STBSG- Soft Tissue and Bone Sarcoma Group, RC- resposta completa, RP- resposta parcial, DE- doença estável, SG- sobrevida global, SLPsobrevida livre de progressão, TPT- tempo para progressão do tumor, R- randomizado, N- número de doentes, NS- não significativo. a - terapêutica de 2ª linha. Outro estudo fase II, iniciado pelo EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group 260, corroborou os resultados obtidos com o imatinib (tabela 3). Este ensaio avaliou a eficácia de 400 mg de imatinib administrado duas vezes/dia. Aos 12 meses, 73% dos casos estavam livres de progressão da doença. Neste estudo, os efeitos laterais associados à dose de 800 mg/dia mais comuns foram: anemia (92%), edema palpebral (84%), rash cutâneo (69%), fadiga (76%), náuseas (57%), 58

59 neutropenia (47%) e diarreia (47%). Os eventos adversos descritos foram geralmente classificados como sendo de grau leve a moderado, não obrigando à exclusão de nenhum doente nesse estudo. Dois ensaios clínicos fase III, multicêntricos e randomizados 205, 261, 262, procuraram validar os resultados obtidos nos estudos fase I/II e determinar a dose terapêutica ideal de imatinib. Ambos os estudos avaliaram a eficácia do imatinib comparando a dose padrão (400 mg/dia) com uma dose mais elevada (800 mg/dia) em doentes com GIST avançado ou metastático, com ou sem quimioterapia prévia. Aos doentes incluídos no regime de uma dose diária (400 mg) que apresentaram progressão da doença, foi oferecida a opção de passar para o braço terapêutico de duas tomas por dia (800 mg). As melhores taxas de resposta objectiva nos dois estudos são apresentadas na tabela 3. No estudo mais alargado do EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group (European-Australasian trial /EORTC-ISG-AGITG) (n = 946) 261, não se observaram diferenças significativas nas taxas de resposta entre braços terapêuticos. No entanto, após uma mediana de 760 dias de seguimento dos doentes, verificou-se diferença significativa na percentagem de doentes livres de progressão da doença entre os grupos de 800 e 400 mg/dia de imatinib (50 vs. 44%, respectivamente), correspondendo, respectivamente, a taxas de SLP aos 2 anos de 56% e 50%. O estudo efectuado nos Estados Unidos e Canadá (S0033) 205 corroborou que os benefícios obtidos com o imatinib eram consistentes com os resultados previamente publicados (tabela 3). Após uma mediana de follow-up de 4,5 anos não se observaram diferenças significativas nas taxas de resposta entre os doentes que receberam 800 mg/dia e os que foram tratados com 400 mg/dia de imatinib, nem na mediana da SLP entre os dois grupos (20 vs. 18 meses, respectivamente). As taxas de SLP aos 2 anos também não foram significativamente diferentes (46% vs. 41%, respectivamente). Nos dois estudos, a estimativa da taxa de sobrevida global aos 2 anos foi de 74-72% para os doentes tratados com imatinib 800 mg/dia, e 69-76% para os doentes que receberam 400 mg/dia. Não se observou qualquer vantagem em termos de sobrevida global comparando a dose de 800 mg/dia com a de 400 mg/dia de imatinib. O imatinib foi descrito como razoavelmente bem tolerado pelos doentes, embora fosse relativamente comum a ocorrência de efeitos laterais de grau ligeiro a moderado. O braço terapêutico com dose mais elevada associou-se a maior incidência de efeitos adversos grau 3-4 em ambos os estudos 205, 261. No ensaio Europeu-Australiano 261, os eventos hematológicos adversos mais frequentes foram a anemia e a neutropenia. Os efeitos colaterais não-hematológicos mais frequentes foram: edema, astenia, náuseas, dor pleurítica, diarreia e rash cutâneo. No estudo Norte-americano (S0033) 205, a percentagem de doentes com eventos adversos de grau 3 a 5 foi maior no grupo submetido a tratamento com imatinib 800 mg/dia do que no grupo de 400 mg/dia (63 vs. 43%, respectivamente). A toxicidade hematológica mais importante foi a anemia (grau 3) e a neutropenia grave. Os efeitos colaterais não-hematológicos mais frequentes foram: toxicidade gastrointestinal, náuseas ou diarreia (grau 3 ou 4), toxicidade cardíaca (grau 3 a 5) e hemorragia (grau 3 a 5). O imatinib não pode ser completamente excluído como causa de morte em 13 casos (1%), no primeiro estudo, e em 11 doentes, no segundo. Embora o imatinib fosse 59

60 geralmente bem tolerado, foi possível identificar, em ambos os ensaios clínicos, necessidade de mais reduções de dose e/ou interrupções do tratamento no grupo de doentes tratados com a dose mais elevada. Com o objectivo de aumentar o poder e a acuidade dos dados e avaliar o benefício clínico da dose de 800 mg de imatinib, os estudos Europeu-Australiano e Norte-Americano foram agrupados num estudo designado como meta-análise MetaGIST 263. Foi avaliado um total de 1640 doentes com GIST avançado, tendo sido investigados diferentes subgrupos de doentes e possíveis factores de prognóstico. A análise dos dados combinados mostrou, para uma mediana de follow-up de 45 meses, um pequeno (mas significativo) aumento da SLP no grupo com 800 mg de imatinib, que não foi possível extrapolar para a SG. A eficácia associada à transferência de doentes para o grupo com 800 mg de imatinib, após a progressão com 400 mg/dia, e a disponibilidade de novos fármacos para a terapêutica de 2ª linha dificultam a interpretação destes resultados de SG. A presença de mutações KIT no exão 9 foi o único factor preditivo para a SLP mais longa e para uma maior taxa de resposta objectiva, atribuíveis à dose elevada de imatinib 263. Como a toxicidade associada ao tratamento com 800 mg diários de imatinib poder ser relativamente grave, as orientações internacionais recomendam iniciar o tratamento dos doentes com GISTs irressecáveis ou metastáticos com a dose de 800 mg/dia apenas nos casos com mutação no exão 9 do KIT 24, 138. Embora a dosagem do imatinib tenha sido extensivamente analisada, continua ainda por estabelecer em definitivo se o tratamento dos GISTs avançados deve ser mantido continuamente. O ensaio clínico fase III BFR14 (ClinicalTrials.gov identifier: NCT ) pretende responder a esta questão, estudando os efeitos do tratamento contínuo versus interrupção da terapêutica com imatinib em GISTs avançados. A análise preliminar deste estudo, que avaliou os resultados nos doentes submetidos a tratamento durante 1 ano, descreve uma SLP significativamente maior nos casos submetidos a tratamento contínuo, em comparação com os casos cuja terapêutica foi interrompida. A mediana da SLP, após randomização, foi de 6 meses no grupo com interrupção e 18 meses no braço de tratamento contínuo (p 0,0001) 264. Relatos mais recentes deste ensaio clínico compararam também a interrupção vs. continuidade da terapêutica aos 3 e aos 5 anos 265, 266. Foram descritas vantagens significativas na SLP dos doentes no braço de tratamento ininterrupto, em ambos os pontos temporais analisados. A mediana da SLP dos doentes randomizados no braço da interrupção terapêutica foi significativamente maior nos casos submetidos a tratamento durante 5 anos (12,2 meses), relativamente aos que foram tratados durante 1 (5,7 meses) ou 3 anos (6. 3 meses). Deste modo, os autores concluíram que o imatinib deve ser administrado sem interrupções até ocorrer intolerância ao tratamento ou progressão da doença 266. As orientações de consenso suportam estes achados, recomendando que a administração de imatinib, nos doentes com GISTs irressecáveis e/ou metastáticos, deve ser mantida de forma contínua e indefinida 24, 138. Resistência e progressão da doença nos doentes submetidos a tratamento de 1ª linha com imatinib Num grupo de casos, tem sido documentado crescimento tumoral durante os primeiros 6 meses de tratamento. A progressão do tumor nos primeiros 6 meses de tratamento com imatinib é designada 60

61 resistência primária. Resultados de ensaios clínicos descrevem que 12-14% dos doentes evidenciam progressão da doença nos primeiros 3 meses após o início do tratamento com imatinib 258, 267. Está amplamente documentado que o estado mutacional inicial dos genes KIT e PDGFR influencia a resposta ao imatinib 9, 87, 268. Em alguns ensaios clínicos fase II e III, que utilizaram o imatinib em doentes com GISTs avançados 9, 87, 205, descreveram-se taxas de resposta parcial mais elevadas nos casos com mutações no exão 11 do KIT, em comparação com os doentes com mutação no exão 9 ou sem qualquer mutação detectável. Além disso, os doentes com mutações no exão 11 tiveram uma mediana da sobrevida global mais longa do que os doentes com mutação no exão 9 ou outra mutação /nenhuma mutação detectável no gene KIT (63 meses vs. 44 e 26 meses, respectivamente; p=0,005) 205. Mais de 1/3 dos casos com mutação do PDGFR 83 exibiram resposta ao imatinib 9, particularmente os casos com mutação nos exões 12 e 14, assim como alguns com mutações no exão Quase todos os doentes com progressão precoce da doença durante o tratamento com imatinib (400 mg/dia) apresentam mutações no exão 9 do KIT ou no PDGFRA, ou têm GISTs wild-type9, 87, 268. Em particular, os GISTs que expressam a mutação D842V no exão 18 do PDGFR (a maioria das mutações PDGFR) podem não ter qualquer resposta clínica ao imatinib 9. Esta falta de resposta ao imatinib foi demonstrada em GISTs com algumas mutações no exão 17 do KIT, tais como as mutações D816H e D816V 82. No entanto, os GISTs com mutações no exão 9 do KIT podem responder a doses mais elevadas (800 mg/dia) de imatinib 87, 263, 267, mas com maior incidência de eventos adversos 261. A ocorrência de progressão precoce durante o tratamento com imatinib é atribuída sobretudo ao estado mutacional dos tumores. No entanto, as mutações do KIT secundárias (~ 10% dos casos 207 ) e alguns parâmetros clínicos podem também estar envolvidos. No estudo fase III Europeu- Australiano, utilizando imatinib nas doses de 400 mg e 800 mg/dia, a presença de metastização pulmonar e a ausência de metástases hepáticas, bem como valores baixos de hemoglobina e contagem elevada de neutrófilos, foram factores preditivos independentes de resistência precoce ao imatinib 267. A maioria dos doentes que inicialmente apresentam resposta ou estabilidade da doença acaba por desenvolver, geralmente após meses de tratamento, progressão numa ou mais lesões tumorais. Este evento é habitualmente designado como resistência secundária ao tratamento 12, 269. A resistência secundária é mais frequentemente causada por mutações secundárias (adquiridas) no domínio cínase do KIT, tendo sido mais raramente descritos outros mecanismos, como a amplificação génica KIT/PDGFRA e a activação de oncogenes alternativos 270, 271. As mutações secundárias do KIT desenvolvem-se mais frequentemente nos GISTs com mutações primárias no exão 11 do que nos casos com mutações no exão 9 207, e são habitualmente substituições simples de nucleotídeos que afectam codões na bolsa de ligação-atp (exões 13 e 14) e na ansa de activação cinásica (exão 17 e 18). Vários estudos têm descrito a existência deste tipo de mutações em 44-67% dos GISTs que progridem durante a terapêutica com imatinib 152, 269, 272, 273. A mutação secundária mais frequente nos GISTs com mutação primária no exão 11 do KIT é a mutação pontual V654A na bolsa de ligação-atp 152, 268. As mutações secundárias são raras nos GISTs com mutações no exão 9 do KIT ou wild-type que têm resistência primária ao imatinib. 61

62 Liegl et al. descreveram heterogeneidade inter- e intralesional das mutações associadas a resistência nos doentes tratados apenas com imatinib ou com imatinib e sunitinib: 83% dos doentes neste estudo apresentaram mutações secundárias do KIT, incluindo casos (67%) com duas a cinco mutações secundárias diferentes em metástases independentes e casos (34%) com duas mutações secundárias do KIT na mesma metástase 271. A progressão tardia é definida como a progressão que ocorre em doentes que inicialmente obtiveram resposta ou que apresentaram um intervalo de SLP superior a 3-6 meses, depois do início do tratamento com imatinib 274. Nestes casos, a progressão ocorre como resultado da resistência adquirida ou secundária ao imatinib, em grande parte associada ao desenvolvimento de mutações secundárias no gene KIT. No entanto, outros mecanismos relacionados com factores farmacocinéticos podem estar envolvidos na progressão tardia, como por exemplo as alterações na disponibilidade sistémica dos medicamentos ao longo do tempo, devido a maior depuração 275 e/ou ao aumento da ligação do imatinib a α 1-ácido glicoproteína 276. Foi também estudado o efeito da insuficiência renal na farmacocinética e na toxicidade do imatinib, num ensaio clínico fase I, em que se administrou imatinib a doentes com tumores sólidos avançados e função renal variável (de normal a insuficiência grave) 277. O estudo concluiu que é necessária precaução nos casos de disfunção renal grave, porque estes doentes poderão não tolerar doses de 800 ou 600 mg/dia de imatinib. Estas observações sugerem que pode ser necessária uma monitorização dos níveis plasmáticos do fármaco para assegurar uma exposição adequada ao tratamento instituído e, desse modo, preservar a resposta terapêutica e evitar a progressão da doença. Outros factores clínicos podem desempenhar um papel relevante no desenvolvimento de resistência tardia durante o tratamento com imatinib: valores base elevados na contagem de neutrófilos; tumores primários em localização extragástrica; tumores de grandes dimensões; dose inicial de imatinib de 400 mg/dia 267. Além disso, como os doentes podem omitir tomas do fármaco por várias razões (ex: efeitos adversos, preocupações com os custos), este facto deve ser considerado quando se avalia a resposta ao tratamento. Avaliação da resposta ao tratamento A resposta ao tratamento com inibidores tirosina-cinásicos nos doentes com GIST foi definida como a ausência de progressão da doença no momento da primeira avaliação formal 267, habitualmente realizada 2-3 meses após o início do tratamento. No entanto, alguns autores defendem um período mais alargado (até 6 meses) para avaliação inicial da resposta ou progressão tumoral, porque o tempo que decorre até ao início da resposta terapêutica pode ser variável. É essencial avaliar com precisão a resposta ao tratamento, para que se possa determinar quais os tratamentos que devem ser mantidos ou alterados, e melhorar os resultados. O sistema padrão de avaliação da resposta tumoral objectiva, amplamente aceite e utilizado, é o RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors), que tem como critérios base as dimensões do tumor 278. Na maioria dos doentes, a actividade anti-tumoral do imatinib traduz-se numa redução das dimensões do tumor. Contudo, os GISTs submetidos a tratamento com imatinib podem não exibir redução 62

63 imediata das dimensões, mas manifestar uma inibição do crescimento 267 ou evidenciar necrose e/ou degenerescência cística/mixóide. Deste modo, nas imagens da TC, alguns doentes podem apresentar apenas alterações da densidade das lesões tumorais. Mesmo um aumento da dimensão pode ser indicativo de resposta se, na TC, a densidade das lesões diminuir. Os GISTs podem aumentar de dimensões na presença de uma resposta terapêutica efectiva, de acordo com a avaliação clínica ou com a PET 279. O aparecimento de novos nódulos pode corresponder apenas ao facto de estes se tornarem mais evidentes quando, pelo efeito terapêutico, ficam menos densos. Os critérios de Choi (redução de 10% da dimensão do tumor ou diminuição de 15% da densidade tumoral nas imagens da TC com contraste e.v.) foram propostos como método alternativo mais preciso de avaliação da resposta dos GISTs ao tratamento 279. Para além da dimensão das lesões (usado no RECIST), os critérios de Choi avaliam a densidade do tumor e apresentam melhor relação com o intervalo de tempo livre de progressão da doença e com a sobrevida dos doentes, quando comparados com os critérios RECIST 279, 280. A progressão pode não ser acompanhada por alterações na dimensão do tumor. O aumento da densidade das lesões tumorais pode indicar progressão do tumor, como por exemplo no padrão típico de progressão caracterizado por imagem de nódulo dentro de um nódulo. As recomendações de consenso 24 indicam que a dimensão e a densidade do tumor na TC, ou as alterações equivalentes na RMN ou na ecografia com contraste e.v., podem ser considerados os critérios de avaliação da resposta ao tratamento. A PET-FDG tem revelado sensibilidade na detecção precoce de resposta ao imatinib em doentes com GIST, e pode ser muito útil na previsão de resposta a longo prazo 281. A PET-FDG pode ser também útil em casos de dúvida ou nos doentes em que é altamente desejável uma previsão precoce da resposta ao tratamento pré-operatório. No entanto, antes do início do tratamento, algumas lesões não são detectáveis pela PET. Recentemente, a PET foi também avaliada prospectivamente em doentes tratados com sunitinib, após falência da terapêutica de 1ª linha (imatinib) 282. Um único exame realizado às 4 semanas de tratamento pode prever a longo prazo a resposta ao sunitinib. Actualmente, como a PET não é um meio auxiliar de diagnóstico facilmente acessível e/ou disponível como a TC, não é considerada como exame de 1ª escolha. Tratamento cirúrgico pós-imatinib em doentes com GIST avançado /metastático A resistência secundária ao imatinib é a principal complicação que limita a sua eficácia a longo prazo. Esta resistência está relacionada com vários factores, incluindo as alterações farmacocinéticas e as mutações adquiridas, que se tornam comuns e clinicamente relevantes após exposição prolongada ao tratamento 12, 267, 269. Estes factos dão suporte para a utilização da cirurgia como parte integrante de uma abordagem multimodal no tratamento do GIST metastático 174, 283. Muitos centros começaram a incluir a cirurgia na terapêutica dos doentes com GIST metastático. Realizar a ressecção cirúrgica aquando da melhor resposta ao tratamento com imatinib pode ser uma possibilidade de reduzir o volume /quantidade de tumor viável e o risco de resistência secundária. A cirurgia pode ser considerada apenas nos casos em que ocorre progressão focal, com o objectivo 63

64 de ressecar as lesões que já desenvolveram resistência secundária. Ambas as estratégias podem ser exequíveis 174, 283. Alguns estudos retrospectivos descrevem resultados favoráveis em doentes que respondem ao tratamento com imatinib e são submetidos a ressecção cirúrgica A ressecção cirúrgica não está geralmente indicada para os doentes com GIST metastático e resistência multifocal e/ou difusa ao imatinib Mussi et al. publicaram um estudo de 80 doentes submetidos a cirurgia após terapêutica com imatinib, efectuada em três centros (Milan, Mannheim and Robert-Rössle Clinic Berlin) 283. Os doentes foram divididos em 2 grupos: casos com cirurgia realizada na melhor resposta clínica ao imatinib e casos com cirurgia na progressão focal da doença. Os resultados obtidos descreveram diferença na sobrevida dos doentes que foram submetidos a cirurgia na melhor resposta clínica, comparada com a dos que foram operados com doença focalmente progressiva, com SLP e SE significativamente inferiores no último grupo. Os autores concluíram que a cirurgia em lesões focalmente progressivas pode ser considerada como parte integrante das opções terapêuticas de segunda/terceira linha em casos seleccionados. Porque estes resultados são comparáveis aos obtidos pelos inibidores tirosina cinásicos de segunda linha, não tão bem tolerados como o imatinib, a cirurgia pode ser considerada como opção nos doentes com bom estado geral e com GISTs em localização favorável para ressecção cirúrgica, bem como nos casos que toleram mal o tratamento médico de segunda linha 24, 283. A cirurgia da doença residual na melhor resposta clínica parece estar associada a um benefício da sobrevida, também quando comparada com os controlos históricos de séries idênticas, referentes a doentes tratados apenas com imatinib 206. Como os doentes seleccionados para cirurgia são provavelmente aqueles que apresentam melhor estado geral, menor volume tumoral e resposta duradoura ao tratamento, é provável que estes resultados estejam enviesados pela selecção dos doentes 24, 283. A utilidade efectiva da cirurgia neste contexto necessita de validação em estudos randomizados. O tratamento cirúrgico dos doentes com GIST metastático que respondem ao tratamento está ainda em fase de investigação. Fora dos ensaios clínicos, esta opção deve ser individualizada e a decisão partilhada com o doente 24. A excisão cirúrgica da progressão tumoral focal, como o nódulo dentro de nódulo, pode ser considerada uma opção terapêutica paliativa em casos seleccionados com progressão limitada da doença. Nestes casos, podem ser também seleccionados outros procedimentos não-cirúrgicos de tratamento local, como as técnicas de ablação c) Eficácia da terapêutica de segunda linha dirigida a alvos moleculares nos GISTs Nos doentes com GIST que apresentam progressão da doença com 400 mg/dia de imatinib como terapêutica de 1ª linha, os dados clínicos disponíveis sugerem que pode ser considerado o tratamento de 2ª linha com imatinib 800 mg/dia ou com sunitinib, e que nos casos que progridem com 800 mg/dia de imatinib a terapêutica pode ser alterada para sunitinib 24,

65 A eficácia da terapêutica com 800 mg/dia de imatinib após progressão da doença foi estudada nos dois ensaios clínicos fase III discutidos anteriormente 205, 261, 262. Os doentes com progressão da doença no regime terapêutico com 400 mg/dia de imatinib podiam passar para o braço terapêutico de 400 mg de imatinib duas vezes por dia (800 mg/dia). Em ambos os estudos, os doentes que passaram do grupo com 400 mg/dia de imatinib para o de 800 mg/dia obtiveram benefício de SLP. A abordagem habitual dos doentes com 400 mg de imatinib e progressão do tumor consiste no aumento da dose para 800 mg/dia, com a possível excepção dos GISTs que apresentam mutações resistentes 24. A escalada da dose pode ser particularmente útil nos GISTs com mutação do KIT no exão 9, nos casos que sofrem alterações farmacocinéticas ao longo do tempo, ou possivelmente em casos que apresentem algumas alterações moleculares. Não foi publicado até à data nenhum estudo que tivesse comparado a eficácia e toxicidade do sunitinib com a eficácia e toxicidade do imatinib em dose elevada (800 mg/dia), nos doentes com GISTs que apresentam progressão com 400 mg/dia de imatinib. Um ensaio clínico randomizado fase III, previsto inicialmente para avaliar este tipo de resultados [sunitinib (37,5 mg/dia) vs. imatinib (800 mg/dia)], foi encerrado prematuramente em A escolha terapêutica de segunda linha pode ser influenciada pelos resultados da avaliação molecular, especialmente quando a falência do imatinib resulta de mutações primárias ou de mutações secundárias resistentes, e pelas respostas dos diversos estados mutacionais (ex: mutação no exão 9 do KIT e KIT/PDGFRA wild-type) dos GISTs ao imatinib e ao sunitinib. Eficácia e tolerabilidade do sunitinib O sunitinib é o único agente aprovado para tratamento de segunda linha nos doentes com GISTs irressecáveis e/ou metastáticos que progridem durante a terapêutica com imatinib ou que desenvolvem intolerância terapêutica ao imatinib 24, 138. O sunitinib, administrado por via oral, é um inibidor tirosina-cinásico com múltiplos alvos moleculares: receptor KIT, receptores VEGF (vascular endothelial growth factor)-1 a -3, PDGFRα e -β, receptor do factor neurotrófico derivado de linhas de células gliais (RET /rearranged during transfection), CSF-1R (macrophage colony-stimulating factor 1 receptor), e do FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3 receptor). Estudos pré-clínicos efectuados in vitro e in vivo descreveram que o sunitinib se liga fortemente a diferentes receptores cinásicos responsáveis pelo crescimento dos GISTs (KIT e PDGFRA) 84, 290. Alguns estudos clínicos avaliaram a eficácia e a segurança do sunitinib nos doentes com GIST avançado, após falência da terapêutica de primeira linha com imatinib Num ensaio clínico fase II de doentes com GISTs avançados (n = 97), que apresentaram progressão da doença após tratamento com imatinib 291, o TPT mediano estimado foi de 34 semanas. No momento da análise dos dados, 7% dos doentes evidenciaram resposta parcial (RP) e 29% tinham doença estável (DE) 6 meses. A eficácia do sunitinib nestes casos foi descrita num ensaio clínico randomizado fase III efectuado em doentes com intolerância ao imatinib ou com GISTs resistentes ao tratamento 26 (tabela 3). Os doentes foram randomizados numa proporção de 2:1, para tratamento com 50 mg de sunitinib/dia 65

66 (esquema 4/2: 4 semanas de tratamento /2 semanas de pausa) ou com placebo. A análise dos resultados mostrou que a mediana do TPT foi de 27,3 semanas nos doentes tratados com sunitinib e 6,4 semanas nos doentes com placebo (p<0,0001). A mediana da SLP (24,1 semanas) foi significativamente superior nos doentes tratados com sunitinib, quando comparada com a do grupo com placebo (p<0,0001). O estudo foi aberto precocemente, após análise preliminar dos resultados, e todos os doentes com placebo foram autorizados a passar para o braço terapêutico (sunitinib). Nos doentes transferidos para o grupo com sunitinib, em 10% (6/59) observou-se RP e em 7% (4/59) estabilidade da doença durante pelo menos 26 semanas após a transferência 26. A análise da sobrevida a longo prazo dos doentes incluídos neste estudo 282 não revelou diferença significativa na SG dos doentes que receberam sunitinib, quando comparada com a dos que receberam placebo. No entanto, este resultado encontra-se enviesado pela inclusão dos doentes provenientes do grupo placebo no braço de tratamento activo com sunitinib. Na sequência dos resultados obtidos, o sunitinib foi aprovado pela FDA e pela EMA para o tratamento dos doentes com GIST que apresentam progressão da doença sob terapêutica com imatinib, ou nos casos de intolerância ao imatinib 292. Os efeitos adversos associados ao tratamento com sunitinib no estudo fase III 26 foram descritos como geralmente leves a moderados e controlados com a redução de dose. Os eventos de grau 3-4 mais frequentes foram: fadiga (10%), hipertensão arterial (7%), síndrome hand-foot (6%), diarreia (5%) e astenia (5%). Foram também descritos cinco (2%) eventos adversos de grau 5: insuficiência hepática, insuficiência ventricular esquerda, paragem cardíaca, isquemia cerebral e falência multiorgânica. Apesar dos benefícios clínicos obtidos em doentes com GISTs refractários ao imatinib, o uso de sunitinib pode ser influenciado por toxicidades associadas ao tratamento prolongado. Têm sido descritas cardiotoxicidade e hipotireoidismo nos doentes com ciclos repetidos de tratamento com sunitinib no esquema 4/2 293, 294. Dos 24 doentes avaliados num estudo realizado por Mannavola et al., 46% desenvolveram hipotireoidismo e 25% uma elevação dos níveis da hormona tireo-estimulante (TSH) 294. Noutro estudo que avaliou a segurança terapêutica do sunitinib (n=75) 293, 11% dos doentes desenvolveram um evento cardiovascular após um tempo mediano de tratamento de 34 semanas. Um ensaio clínico fase II avaliou a dosagem diária (37,5 mg/dia) contínua de sunitinib em 60 doentes com GISTs metastáticos que apresentaram intolerância ou resistência ao imatinib 295. Os resultados preliminares deste estudo sugerem que a administração diária contínua de sunitinib constitui um esquema de dosagem alternativo eficaz e bem tolerado. Embora não exista nenhum estudo comparativo formal realizado no âmbito de um ensaio clínico randomizado, o esquema terapêutico com dosagem diária mais baixa e contínua pode ser considerada como opção válida em doentes seleccionados 24. De facto, nos doentes cujos efeitos adversos não são atenuados pelas pausas na dosagem do esquema intermitente, a decisão de reiniciar o tratamento com sunitinib em dosagem diária contínua pode ser uma estratégia mais eficaz, garantir a adesão terapêutica dos doentes e retardar a progressão da doença. 66

67 Há alguns indícios de que o ajuste das dosagens de imatinib de acordo com a monitorização dos níveis séricos pode ser útil em doentes com GIST 296. Esta evidência pode ser aplicável para outros agentes terapêuticos específicos, como o sunitinib, mas carece de validação. A resposta ao sunitinib e o genótipo dos GISTs Nos resultados preliminares de um estudo fase I/II com sunitinib em doentes com GIST descreveu-se benefício clínico em todas as principais mutações KIT 297. Uma extensão deste estudo indica que o benefício clínico do sunitinib se relaciona em parte com o estado mutacional dos tumores, particularmente com o genótipo tirosina-cínase dos GISTs 207. O benefício clínico (RP ou DE 6 meses) foi observado nos três genótipos mais comuns: 34% nos tumores com mutações primárias no exão 11 do KIT, 58% nos casos com mutações no exão 9 e 56% nos tumores wild-type para o gene KIT ou com mutações do PDGFRA; a taxa de RP dos GISTs com mutações primárias no exão 9, em comparação com os que apresentam mutações no exão 11 do KIT, foi de 37 vs. 5%, respectivamente (p=0,002). A mediana da SLP e da SG foi significativamente superior nos doentes com mutações primárias no exão 9 do KIT (19,4 e 26,9 meses, p=0,0005 e p=0,012, respectivamente) e nos tumores com genótipo wild-type (19 e 30,5 meses, p=0,0356 e p=0,0132, respectivamente), quando comparados com os casos que tinham mutações do KIT no exão Estes resultados indicam que o tipo de mutações primárias e secundárias no receptor tirosinacinásico influenciam significativamente a actividade anti-tumoral do sunitinib, e que este pode ser particularmente eficaz nos doentes que têm mutações do KIT no exão 9. O imatinib continua a ser actualmente a opção de escolha no tratamento de primeira linha dos doentes com GISTs irressecáveis e metastáticos. No entanto, a evidência mais recente sugere que o sunitinib poderá ser eficaz como tratamento de primeira linha dos GISTs que têm mutações do KIT no exão 9 e dos GISTs sem mutações KIT/PDGFRA (ex: GISTs pediátricos) 12, 89, 207, 272. Estudos in vitro descreveram que o sunitinib é eficaz nos GISTs que têm mutações secundárias localizadas na bolsa de ligação-atp (exões 13 e 14), mas não em casos com mutações secundárias na ansa de activação cinásica (exões 17 e 18). Estes achados foram concordantes com os resultados clínicos obtidos no estudo publicado por Heinrich et al. 207 : maior benefício clínico (61%) nos doentes com mutações do KIT secundárias no exão 13 ou 14, quando comparado com o obtido (15%) nos doentes com mutações secundárias no exão 17 ou 18 do KIT (p=0,011). A mutação secundária associada a resistência mais frequente nos GISTs que têm mutações primárias no exão 11 do KIT, e que progridem durante o tratamento com imatinib, é a mutação pontual V654A na bolsa de ligação-atp 152, 268. Esta mutação é sensível ao sunitinib, com base em estudos in vitro 207. Diversos autores descreveram que alguns tumores com mutações do KIT no exão 17 resistentes ao imatinib (ex: mutações D816H e D816V) eram também resistentes ao sunitinib 82. Progressão da doença após tratamento com sunitinib À semelhança do que acontece com o imatinib, o desenvolvimento de genótipos resistentes leva à progressão da doença nos doentes tratados com sunitinib. Factores farmacocinéticos podem 67

68 também desempenhar um papel relevante na progressão da doença 298. É possível que mecanismos farmacocinéticos descritos para o imatinib estejam envolvidos noutros inibidores dos receptores tirosina-cinásicos, mas é necessária investigação adicional para conclusões definitivas. 10. d) Opções terapêuticas após falência do tratamento dirigido a alvos moleculares Embora seja possível obter uma resposta prolongada com os agentes terapêuticos (imatinib e sunitinib) dirigidos a alvos moleculares, a maioria dos doentes com GISTs avançados desenvolvem eventualmente resistência. Não há actualmente nenhum agente de terceira linha aprovado para tratamento nos doentes com GIST avançado com progressão após terapêutica de segunda linha. As opções possíveis são a inclusão num ensaio clínico ou a instituição de medidas paliativas. Após falência da terapêutica com imatinib e sunitinib, as orientações internacionais recomendam que deve ser considerada a opção do doente participar num dos ensaios clínicos em curso, testando novas abordagens ou novas combinações terapêuticas para controlo da doença 24, 138. Vários agentes (ex: sorafenid, nilotinib, dasatinib e masitinib) estão a ser avaliados (tabela 4) 28, As combinações de agentes inibidores tirosina-cinásicos devem ser desencorajadas fora dos ensaios clínicos devido ao potencial de toxicidade. Tabela 4. Novas terapêuticas dirigidas a alvos moleculares para o tratamento do GIST avançado (em investigação) Agente Sorafenib Nilotinib (AMN107) Dasatinib (BMS ) Masitinib (AB1010) Motesanib (AMG 706) Vatalanib (PTK787/ZK222584) Regorafenib Cediranib (AZD2171) Panobinostat PKC412 Everolimus Retaspimycin (IPI-504) Alvo(s) KIT, PDGFRA/B, VEGFR2 3, Raf, FLT3, RET KIT, PDGFRA/B, BCR-ABL KIT, PDGFRB, BCR-ABL, SRC KIT, PDGFRA/B, FGFR3 KIT, PDGFRA/B, VEGFR1 3, FLT3 ou RET KIT, PDGFRA/B, VEGFR1 3 KIT, PDGFRB, VEGFR1 3, B-Raf, RET KIT, PDGFRA/B, VEGFR1 3, FLT3, RET Histone deacetylase KIT, PDGFRA/B, VEGFR2, proteína cínase C mtor HSP-90 PDGFRA/B = Platelet-derived growth factor receptor α/β; FLT3 = FMS-like tyrosine kinase 3; RET = glial cell-line derived neurotrophic factor receptor (REarranged during Transfection); BCR- ABL = breakpoint cluster region-abelson gene; SRC = proto-oncogenic tyrosine kinases; FGFR3 = fibroblast growth factor receptor 3; Raf = serine/threonine-protein kinase; mtor = mammalian target of rapamycin; HSP-90 = heat shock protein 90. Tabela adaptada de Reichardt, P

69 Estudos recentes descreveram que os doentes com GISTs que progrediram após diferentes opções terapêuticas (estabelecidas e/ou experimentais) podem obter benefício clínico quando é reintroduzido o mesmo agente terapêutico a que tinham previamente respondido (imatinib; sunitinib) 307, 308. Quando não existe outra opção, a manutenção do tratamento com o mesmo agente pode retardar a progressão da doença. Na ausência de ensaios clínicos para tratamento alternativo, a continuação ou a reintrodução do inibidor tirosina-cinásico a que o doente já foi exposto pode ser uma opção adequada 24,

70 70

71 OBJECTIVOS 71

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73 OBJECTIVOS Objectivo geral O objectivo geral da presente dissertação consistiu na caracterização clínico-patológica, imunohistoquímica e molecular de uma série de doentes consecutivos com GIST, diagnosticados e tratados numa unidade de cuidados terciários de saúde (Hospital de São João) em Portugal. Pretendia-se caracterizar os fundamentos do diagnóstico e clarificar os princípios do tratamento destes tumores, numa perspectiva multidisciplinar, com especial ênfase na terapêutica cirúrgica. Adicionalmente, pela análise da sobrevida dos doentes, pretendia-se clarificar o possível impacto de parâmetros de prognóstico e preditivos da resposta terapêutica em doentes com GIST. Objectivos específicos 1. A ressecção cirúrgica é o tratamento de eleição para os GISTs primários e pode ser curativa. No entanto, o impacto da extensão da ressecção sobre o prognóstico dos doentes continua a ser objecto de discussão. Objectivo: Analisar o valor prognóstico da qualidade das margens cirúrgicas no tratamento dos doentes com GIST primário. 2. Os GISTs em localização extragástrica ou extra-intestinal são menos frequentes e têm sido pouco analisados. Nestes casos, o diagnóstico diferencial com outros tumores mesenquimatosos é particularmente importante, não só pelo risco de comportamento agressivo, mas também pelas implicações terapêuticas específicas, que incluem drogas dirigidas a alvos moleculares. Objectivo: Avaliar os procedimentos de diagnóstico de GIST no esófago, que é uma localização rara deste tipo de tumores, e rever as opções terapêuticas mais adequadas nesta localização. 3. Há evidências que indicam que os GISTs incluem tumores geneticamente muito heterogéneos, com prognósticos distintos e respostas variáveis ao tratamento com os inibidores tirosina-cinásicos aprovados para o tratamento não-cirúrgico (ex: imatinib e sunitinib) dos doentes. Objectivo: Avaliar o estado mutacional dos genes KIT e PDGFRA numa série de doentes, para correlacionar as características clínico-patológicas e moleculares identificadas e o seu impacto no prognóstico dos doentes com GIST. 4. Os GISTs resultam geralmente de mutações oncogénicas nos genes KIT ou PDGFRA, e numa percentagem variável (10-40%) de casos não se identificam alterações genéticas nestes genes (GISTs wild-type). 73

74 Objectivo: Esclarecer as alterações moleculares alternativas em GISTs wild-type, procurando identificar alterações potencialmente úteis para o diagnóstico e eventualmente preditivas de resposta a terapêuticas dirigidas a novos alvos moleculares em doentes com GIST. 5. Os parâmetros com impacto prognóstico importante nos GISTs primários incluem: dimensão maior, localização no tubo digestivo/extragastrointestinal, ruptura tumoral, índice mitótico, tipo de mutações do KIT / PDGFRA e qualidade da ressecção cirúrgica. Contudo, alguns casos continuam a revelar comportamento biológico imprevisível, levando à necessidade da pesquisa de novos marcadores moleculares com valor prognóstico e/ou preditivo para os doentes. Alguns marcadores (ex: proteína RKIP - Raf kinase inhibitory protein) são considerados supressores da metastização e têm sido reconhecidos como parâmetros de prognóstico em diferentes cancros (ex: carcinomas da próstata, colo-rectais e gástricos). Objectivo: Avaliar a expressão de RKIP, a sua associação com diferentes parâmetros clínicopatológicos, e esclarecer o papel deste marcador em doentes com GISTs primários. 74

75 MATERIAL E MÉTODOS 75

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77 MATERIAL E MÉTODOS Uma vez que cada subcapítulo da secção de resultados corresponde a um trabalho publicado com material e métodos, decidiu-se simplificar o mais possível a estrutura deste capítulo nesta dissertação. Foram avaliados os registos clínicos e patológicos e o material relacionado com todos os casos consecutivos de tumores estromais gastrointestinais (GISTs) diagnosticados e tratados no período decorrido entre 1989 e 2006 (18 anos) nos serviços de Cirurgia Geral e Anatomia Patológica do Hospital de S. João do Porto, Portugal. De entre todos os doentes admitidos com o diagnóstico de tumor mesenquimatoso do tubo digestivo neste período, foram identificados 114 casos em que se confirmou o diagnóstico de GIST. 1 - Parâmetros clínicos e cirúrgicos Foram estudados os seguintes parâmetros clínicos dos doentes: género, idade, localização do tumor primário, sintomas clínicos e sinais de apresentação. O tipo de ressecção cirúrgica (enucleação, ressecção atípica/em cunha, ressecção segmentar, ressecção total/subtotal de órgão e ressecção em bloco ) do tumor foi avaliado em cada um dos 96 casos com ressecção macroscópica completa. Os procedimentos cirúrgicos foram agrupados da seguinte forma: enucleação, ressecção em cunha/segmentar, ressecção total/subtotal de órgão e ressecção em bloco. 2 - Parâmetros anátomo-patológicos e imuno-histoquímicos Todo o material anátomo-patológico disponível foi avaliado em cortes de 4-µm corados por hematoxilina-eosina (HE) [número médio de fragmentos estudados por caso: 6,1 (intervalo: 1-26)], e o diagnóstico de GIST foi estabelecido de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) 309. Os parâmetros analisados em cada tumor foram: o maior diâmetro (cm), estado das margens de ressecção [negativas (R0) e positivas (microscópicas/r1 e macroscópicas/r2)], tipo celular (fusiforme, epitelióide e misto), presença ou ausência de necrose, índice mitótico (número de mitoses por 50 CGA) e classificação de risco do GIST muito baixo (MB), baixo (B), intermédio (I) e alto (A) risco 182. Os estudos imuno-histoquímicos foram realizados em cortes de 3-µm representativos de cada tumor usando o princípio do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase. Foram utilizados os 77

78 seguintes anticorpos policlonais anti-humanos de coelho: CD117, actina, desmina, proteína S100 e CD34. Foram também utilizados anticorpos primários dirigidos contra o fosfo-kit, SCF, fosfo- ERK e RKIP. Os procedimentos imuno-histoquímicos foram realizados segundo metodologia já descrita pelo nosso grupo e por outros autores , com algumas modificações. Muito resumidamente, as lâminas desparafinadas e rehidratadas foram incubadas durante 10 minutos em 3% de peróxido de hidrogénio em metanol, para inibir a peroxídase endógena. Após incubação com anticorpo primário, foi aplicado o anticorpo secundário biotinilado anti-polivalente de cabra durante 10 minutos, seguido de incubação com os complexos estreptavidina-peroxídase. A reacção imunológica foi visualizada utilizando DAB (diaminobenzidina) como cromogéneo. Qualquer imuno-reactividade (forte/fraca, focal, moderada ou difusa) membranar (CD117) e/ou citoplasmática (CD117, actina, desmina e CD34), e nuclear (proteína S100) das células foi considerada como positiva. No estudo imuno-histoquímico da expressão de fosfo-kit, SCF, fosfo- ERK e RKIP avaliou-se a extensão e a intensidade da imuno-reactividade. A extensão da imunoreactividade foi avaliada numa escala de 0 a 3 (0, ausência de células positivas; 1, <25% de células positivas; 2, 26-50% de células positivas; e 3,>50% de células positivas) e a intensidade também numa escala de 0 a 3 (0, negativa; 1, fraca; 2, moderada; 3, forte). A pontuação final usada resultou da soma das pontuações atribuídas à extensão e à intensidade (negativa: 0 a 2; moderadamente positiva: 3 e 4; e fortemente positiva: 5 e 6). Foram incluídos controlos positivos e negativos apropriados para cada procedimento. Para os controlos negativos foram omitidos anticorpos primários. Todos os cortes foram contrastados com hematoxilina. 3 - Extracção de ADN As amostras foram obtidas por dissecção de áreas seleccionadas, com pelo menos 85% de tecido tumoral, para um tubo de micro-centrifugação, utilizando agulha esterilizada (Neolus 25G - 0,5 mm). A extracção de ADN foi realizada como previamente descrito 314. Resumidamente, as amostras foram desparafinadas mediante extracção seriada com xilol e etanol em concentrações decrescentes (100%-70%-50%), e secagem ao ar. O ADN foi extraído utilizando o QIAamp DNA Micro Kit da Qiagen. 4 - Análise de mutações nos genes KIT e PDGFRA A análise mutacional do gene KIT foi realizada seguindo metodologia descrita previamente 36, 311, 314. Nos GISTs wild-type para o gene KIT foram ainda investigadas mutações hotspot no gene PDGFRA. O ADN foi submetido a amplificações por reacção de polimerização em cadeia (PCR; polymerase chain reaction) seguida de sequenciação directa, para os exões 11 do KIT e 12, 14 e 18 do PDGFRA, e de uma pré-selecção pela técnica de polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP; single strand conformational polymorphism), seguida de sequenciação directa dos casos positivos, para os exões 9, 13, 14 e 17 do KIT. Resumidamente, a reacção PCR foi realizada com um volume final de 25µL, 78

79 nas seguintes condições: 1x Buffer (Bioron, Germany), 1,5 mm de MgCl 2, 200 µm de dntps (desoxirribonucleotídeos-trifosfato), 0,5 µm de iniciadores e 1 U de SuperHot Taq Polymerase. A análise SSCP dos exões 9, 13, 14 e 17 foi realizada num gel 1x MDE (mutation detection enhancement), com adição de percentagens diferentes de glicerol na análise de diferentes exões. Vinte microlitros de produto da PCR foram incubados a 95ºC durante 10 minutos com um volume igual do tampão de corrida de formamida [98% de formamida, 10 mm de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e 1 mg/ml de azul de bromofenol e xileno cianol]. Os géis SSCP foram processados a 20ºC, e as amostras com padrão SSCP diferente do normal foram sequenciadas directamente. Todos os casos foram confirmados duas vezes, com nova amplificação por PCR e técnicas de SSCP e de sequenciação directa. 5 - Análise de mutações na região 3 do exão 11 do KIT e nos genes H-RAS, K-RAS, N-RAS e BRAF A pré-selecção das regiões hotspot do KIT (região 3 do exão 11), H-RAS, K-RAS, N-RAS [exões 1 (codões 12-13) e 2 (codão 61)] e BRAF (exões 11 e 15) foi efectuada por PCR SSCP, seguida pela realização de sequenciação directa do ADN nas amostras que evidenciaram uma alteração da mobilidade. Resumidamente, a reacção PCR foi realizada com um volume total de 25µL, consistindo em 1 µl de solução de ADN, 0,3 µm de iniciadores paralelos e anti-paralelos, 200 µm de dntps, 1,5 mm de MgCl 2, 1x Taq Buffer incompleto e 1 U de Taq Superhot DNA Polymerase. A reacção consistiu numa desnaturação inicial a 96ºC durante 10 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 96ºC durante 45 segundos, hibridação a 55-60ºC durante 45 segundos e extensão a 72ºC durante 45 segundos, seguida de uma extensão final de 10 minutos a 72ºC, num Thermocycler. As sequências iniciadoras para todos os genes foram como anteriormente descrito Os produtos da PCR foram misturados com quantidade equivalente do tampão desnaturante de formamida [98% de formamida, 10 mm de EDTA, 1 mg ml de azul de bromofenol e xileno cianol]. Após desnaturação a 98ºC durante 10 minutos e arrefecimento em gelo, 20 µl da mistura foram adicionados a um gel 1x MDE e percentagens variáveis de glicerol para os genes KIT, K- RAS, H-RAS e N-RAS, e a um gel 0,8x MDE sem glicerol para o BRAF. As amostras que, na análise SSCP, apresentaram um padrão diferente do habitual foram sequenciadas directamente. Todos os casos foram confirmados duas vezes, com nova amplificação por PCR independente seguida de sequenciação directa. 6 - Análise da metilação no promotor do gene RKIP Foi determinado o padrão de metilação do ADN na região promotora do gene RKIP através da PCR específica para metilação (MSP; methylation-specific PCR), segundo técnica anteriormente descrita 318, com algumas modificações. Foi previamente efectuado tratamento de 200 ng de ADN com bissulfito, usando o EZ DNA Methylation Golf Kit. Foram usados iniciadores específicos para 79

80 distinguir o ADN metilado (produto de PCR com 204 pb) do ADN não metilado (produto de PCR com 205 pb), tal como os controlos de ADN metilado e ADN não metilado adequados. 7 - Follow-up e análise estatística Os dados relativos ao follow-up dos doentes foram obtidos através de entrevistas directas com os doentes ou com familiares, bem como pela análise dos registos hospitalares. A análise da sobrevida dos doentes referenciados e seguidos em regime ambulatório baseou-se na actualização sistemática dos dados da avaliação clínica e imagiológica de cada doente. Foi possível obter informação para todos os casos seleccionados nas diferentes avaliações efectuadas. Os parâmetros clínicos e patológicos estudados foram analisados como possíveis factores de prognóstico para recidiva local ou à distância (metastização) e sobrevida especifica (SE), relacionada com a doença. A sobrevida livre de doença (SLR) foi calculada a partir da data da cirurgia até à primeira evidência de recidiva, local ou à distância (ou ambas), nos tumores submetidos a ressecção macroscópica completa; foram excluídos desta análise os tumores com ressecção R2. A sobrevida foi calculada a partir da data de diagnóstico até à morte relacionada ou não com a doença, ou censurada na data da última observação. A análise da sobrevida global (SG), da SE e da SLR dos casos submetidos a ressecção foram determinadas pelo método de Kaplan-Meier e pelo teste Log rank, com o programa SPSS, versões 14.0 e 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). A associação entre variáveis clínico-patológicas ou moleculares e a recidiva do tumor foi analisada com o teste Qui-quadrado ou com o teste exacto de Fisher, consoante os casos. O hazard ratio (HR) foi calculado (na análise univariada) com o modelo de regressão de Cox separadamente para cada variável, e foi considerado estatisticamente significativo o valor de probabilidade inferior a 0,05 (p 0,05). A análise multivariada foi efectuada com o modelo de riscos proporcionais de Cox e apenas foram incluídas as variáveis consideradas estatisticamente significativas na análise univariada. 80

81 RESULTADOS Os cinco trabalhos que a seguir se apresentam reproduzem os estudos efectuados para o esclarecimento das questões levantadas no capítulo de objectivos desta dissertação. 81

82 82

83 Trabalho I 83

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85 World J Surg (2008) 32: DOI /s Surgical Margin Status and Prognosis of Gastrointestinal Stromal Tumor António M. Gouveia Æ Amadeu P. Pimenta Æ Ana F. Capelinha Æ Dionísio de la Cruz Æ Paula Silva Æ José M. Lopes Published online: 7 August 2008 Ó Société Internationale de Chirurgie 2008 Abstract Background Surgery is the best treatment for primary GIST and may be curative, but resection extension/completeness impact on the prognosis remains controversial. The authors aim was to evaluate the clinicopathological (CP) parameters and surgical margins status influence on GIST patients outcome. Materials and methods The study evaluated 113 consecutive patients with sporadic GIST; the influence of CP parameters on recurrence-free survival (RFS) and diseasespecific survival (DSS) was determined by univariate analysis (UA) and multivariate analysis (MA). Results Of 104 cases, macroscopically complete resection was achieved in 96: R0 surgical margin status in 78 and R1 in 18. Recurrence rates (12.5%) were significantly lower in R0 (9.0%) than in R1 (27.8%). Tumor [10 cm, mitotic count [5/50 high power field (HPF), and high-risk GIST predicted poor RFS and DSS (UA). Disease-specific survival was significantly shorter after macroscopic incomplete (R2) resection, for mixed cellular morphology, and in tumors with necrosis (UA). High-risk GIST (p = 0.016) and R2 resection (p =0.013) predicted poor DSS of patients (MA). A. M. Gouveia A. P. Pimenta Department of Surgery, Hospital de S. João/Porto Medical School, Al. Prof. Hernani Monteiro, Porto, Portugal A. M. Gouveia A. P. Pimenta P. Silva J. M. Lopes (&) Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto (IPATIMUP), R. Dr. Roberto Frias, Porto, Portugal jmlopes@ipatimup.pt A. F. Capelinha D. de la Cruz P. Silva J. M. Lopes Department of Pathology, Hospital de S. João/Porto Medical School, Al. Prof. Hernani Monteiro, Porto, Portugal Conclusions High risk and positive macroscopic surgical margin status are parameters associated with poor diseasespecific survival in GIST patients. Introduction Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common of the mesenchymal tumors, accounting for up to 3% of malignant tumors of the gastrointestinal tract (GI). Lack of reproducible diagnostic criteria led to previous classification of such tumors as leiomyomas, leiomyoblastomas, and leiomyosarcomas, avoiding accurate actual use based on older published work of GI sarcoma surgical management. Recent reports define GIST as a c-kit (CD117) positive mesenchymal tumor [1]. Gastrointestinal stromal tumors vary in their malignant potential, with a spectrum ranging from virtually benign tumors, to tumors with uncertain malignant potential, to highly malignant tumors. The proportion of overtly malignant or high-risk GISTs accounts for 20 45% of diagnosed GISTs [2, 3]. Surgery is the best treatment for primary GISTs and may be curative [4 11]. After successful complete or en bloc removal of the tumor and surrounding tissue, surgery for GIST should establish a complete margin of normal tissue around the primary tumor site [4 7, 12 17]. Incomplete resection is considered a major factor predictive of poor prognosis in GIST patients. However, the effect of completeness and extension of GIST resection on the prognosis of patients remains controversial [4, 7, 12, 13, 16, 17]. Because controversy remains regarding the prognostic value of surgical margins in the management of patients with GIST, we aimed to develop a study in which to 123

86 2376 World J Surg (2008) 32: evaluate prognostic clinicopathological parameters and surgical margins status on the outcome in a series of 113 consecutive patients diagnosed with primary GIST at the University Hospital of S. João, Porto, Portugal. Materials and methods Clinical and pathological files and material related to all consecutively primary gastrointestinal stromal tumors (GISTs) diagnosed in the 18 years between 1989 and 2006 were retrieved from the Surgery and Pathology Departments of Hospital S. João, Porto, Portugal. Clinical and surgical parameters Clinical parameters of the patients included gender, age, primary tumor site, clinical symptoms, and signs at presentation. The type of surgical resection (enucleation, wedge resection, segmental resection, total/subtotal organ resection, en bloc resection) of the tumor was evaluated in each case. Surgical procedures were grouped as follows: wedge/segmental, enucleation, total/subtotal organ resection, and en bloc resection. Pathological parameters All available pathological material was evaluated on 4-lm hematoxylin & eosin stained sections [mean number of fragments studied per case: 6.1 (range: 1 26)], and the diagnosis of GIST was established according to the WHO classification [1]. Analyzed parameters for each tumor included largest size (cm), negative (R0) and positive (microscopic-r1, and macroscopic-r2) resection margin status [18], cell type (spindle, epithelioid, and mixed), presence or absence of necrosis, mitotic activity [number of mitoses per 50 high power field (HPF), 9400], and risk group of the GIST very low (VL), low (L), intermediate (I), and high (H) [19]. The immunohistochemistry analysis was performed on representative 3-lm sections of each tumor using the streptavidin-biotin-peroxidase complex principle. Rabbit polyclonal anti-human antibodies used were raised against CD117 (dilution 1:500; clone A 4502, DAKO A/S, Denmark), actin (dilution 1:100; clone HHF35, DAKO, A/S, Denmark), desmin (dilution 1:50; Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), S100 protein (dilution 1:1000; DAKO A/S, Denmark), and CD34 (dilution 1:40; clone QBEnd/10, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle-upon- Tyne, UK). Briefly, deparaffinized and rehydrated slides were subjected to 10 min incubation in 3% hydrogen peroxide in methanol, in order to inhibit endogenous peroxidase. No antigen retrieval was used. After incubation with primary antibody at room temperature for 30 min, the secondary biotinylated goat anti-polyvalent antibody was applied for 10 min, followed by incubation with the streptavidin-peroxidase complex. The immune reaction was visualized by DAB as a chromogen (Ultravision Detection System Antipolyvalent, HRP/DAB; Lab Vision, Fremont, CA). Any (strong/weak, focal, moderate, or diffuse) membrane (CD117) and/or cytoplasm (CD117, actin, desmin, and CD34), and nuclear (S100 protein) immunoreactivity of the cells was considered as positive staining. Appropriated positive and negative controls were included in each run: interstitial cells of Cajal in a section of normal intestine were used as positive control for CD117; smooth layers, for actin and desmin; small nerves, for S100 protein; and vessels, for CD34. For negative controls, primary antibodies were omitted. Mast cells, smooth layers, small nerves, and vessels were used as internal positive controls in the cases tested. All sections were counterstained with hematoxylin. Follow-up and statistical analysis Follow-up information was collected through direct interview with patients or their relatives, and by review of inhospital patient files. Outcome data were available for all patients as of December Studied clinical and pathological parameters were analyzed as possible prognostic factors for local or distant (metastasis) recurrence and disease-specific survival (DSS). Recurrence-free survival (RFS) was calculated from the time of surgery until the first evidence of recurrence, either distant or local, or both, in tumors with macroscopic complete resection; tumors with R2 resection were excluded for this calculation. Survival was calculated from the time of diagnosis until death related or not with the disease, or censored at the time of latest follow-up. Eight GIST patients with surgically resected tumors were treated with imatinib, as follows: because of tumor recurrence in five patients; as neodjuvant treatment in one case; as adjuvant treatment in one en-bloc-resected high-risk tumor; and because of R2 status margin in one patient. Recurrence-free survival, overall survival (OS), and DSS of all resected tumors were determined by Kaplan- Meier analysis [20], with SPSS software for Windows (version 14.0). Association between clinicopathological variables (e.g., risk group and margin status) and tumor recurrence was evaluated with the chi-square test or Fisher s exact test, as appropriate. Crude hazard ratio (HR) was computed (univariate analysis) with separate Cox regressions for each variable, and a probability value of less than 0.05 (p value\0.05) was considered statistically significant. Multivariate analysis was performed with the Cox proportional hazards model, and only variables that were deemed 123

87 World J Surg (2008) 32: statistically significant by univariate analysis were considered for the final Cox model. Results Clinical data The patients entered into this study were 113 Caucasian patients with 114 sporadic tumors; one patient had metachronous gastric and colon GISTs. The series included 59 (52.2%) women and 54 (47.8%) men, with a median age of 66 years (range: years). At presentation, major symptoms and signs included gastrointestinal bleeding (37.0%), abdominal pain (12.9%), abdominal mass (7.4%), tumor rupture (6.5%), and bowel obstruction (3.7%). Some 24.1% of patients were asymptomatic and their tumors were incidental findings on radiological examination and after surgery for other conditions. By site, the tumors were located as follows: stomach (58.6%), small bowel (30.6%), colon/rectum (4.5%), mesentery (3.6%), esophagus (1.8%), and omentum (0.9%); in three cases accurate localization was not possible because of the large dimension of the tumors. One patient, diagnosed by endoscopic biopsy, was not submitted to surgery because of extensive local disease and poor general condition. Surgical resection was macroscopically complete in 96 (84.9%) and incomplete in 8 tumors. In the remaining 9 (8%) cases, tumor resection was not performed because of the presence of liver metastases and diffuse peritoneal disease (3 cases), and extensive local invasion (6 cases). The median follow-up time of patients was 42.6 months (range: months), and the 5-year cumulative overall survival was 63.8%. Surgical treatment Only patients with surgically resected tumors (n = 104) were considered for further analysis. The mean and median ages of those men and women were 63.4 years and 66 years, respectively (range: years), and the male/ female ratio was 0.8/1. Tumor frequency by primary site was as follows: 62 (59.6%) stomach, 33 (31.7%) small bowel, 4 (3.8%) colon and rectum, 3 (2.9%) mesentery, and 1 each in the esophagus and omentum. The surgical procedures by primary site of tumor were as follows: stomach: wedge resection (29 [46.8%]), enucleation (12), distal/subtotal gastrectomy (12), total gastrectomy (7), and extended en bloc resection (2); small bowel: segmental resection (24 [72.7%]), enucleation (7), pancreaticoduodenectomy (1), and extended resection (1); colon: segmental resection (2), total colectomy (1), and en bloc resection (1); for esophagus: Ivor-Lewis resection (1); for mesentery: enucleation (2) and segmental resection (1); for omentum: enucleation (1). In 7 cases tumor rupture occurred in association with either peritonitis (4 cases) or hemoperitoneum (3 cases); tumor resection was accomplished in 5 patients, and postoperative death occurred secondary to peritonitis and shock/multiorgan failure in two patients; despite tumor resection, peritoneal recurrence leading to death occurred in 2 patients. Pathological parameters The mean and median tumor sizes were 6.8 cm and 5.1 cm, respectively (range: cm). The tumor dimension was B5 cm in 52 cases, from [5 tob10 cm in 30 cases, and [10 cm in 22 cases. Tumor cell morphology of the GISTs was spindle in 66.3%, epithelioid in 12.5%, and mixed in 21.2%. Strong membrane and/or cytoplasm tumor cell immunoreactivity for CD117 was found in variable focal, moderate, or diffuse areas in 96 (92.3%) of the GISTs. In three cases, CD117 immunoreactivity was weak. Eight (7.7%) GISTs did not disclose CD117 immunoreactive tumor cells. Interstitial cells of Cajal and mast cells, as internal positive controls, were variably observed in every case. The frequency and expression features of the other antibodies was variable from case to case, and within the same tumor, as follows: focal/rare tumor cells for actin (52.1%), desmin (6.4%), and S100 protein (17.9%); and moderate/diffuse for CD34 (72.7%) data not shown. Six of eight CD117- negative GISTs expressed CD34 without any tumor cell expression for other markers tested. Tumor necrosis was observed in 55 cases. The mean/ median mitotic rates were 4.6/3.0 mitoses/50 HPF (range: 0 27 mitoses). Mitotic count was B5 mitoses/50 HPF in 80 tumors and [5 mitoses/50 HPF in 24 tumors. The GISTs were classified according to risk group as follows: 70 (67.3%) very low/low/intermediate risk (14 VL; 33 L; 23 I); and 34 (32.7%) high risk. Margin status was classified as R0 in 78 tumors, R1 in 18 (9 enucleations; 9 wedge/segmental resections), and R2 in 8 (1 enucleation; 3 wedge/segmental resections; 2 total/ subtotal organ resections; 2 en bloc resections). Follow-up and outcome The 5-year recurrence-free survival (RFS) was 89.8% and 77.3% at 10 years, with a median follow-up time of 46 months (range: months). The overall recurrence rate was 12.5% (12 cases) distributed as follows: local stomach serosa (1); diffuse peritoneal metastases (4); liver metastases (4); and synchronous peritoneal and liver 123

88 2378 World J Surg (2008) 32: metastases (3). The percentage of recurrence was significantly lower (p = 0.045) in R0 tumors (9.0%) than in R1 (27.8%) tumors. The recurrence rate in very low/low and intermediate risk tumors (4.4% and 4.5%, respectively) was significantly lower (p = 0.001) than in high-risk (34.6%) GISTs. Imatinib treatment (400 mg daily) was carried out in five recurrent GISTs with escalation to 600 mg daily whenever indicated. Surgical treatment was attempted in three cases: (a) R0 resection (local gastric recurrence); (b) R2 resection (extensive peritoneal metastases); and (c) surgical biopsy (synchronous peritoneal and liver metastases). These patients are alive without (a) and with (b, c) evidence of disease at last follow-up. The 5-year/10-year cumulative disease-specific survival (DSS) was 87.7%/81.7%, with a median follow-up time of 45.9 months (range: months). None of the 39 (37.9%) patients who died, 5 of them within the immediate postoperative (one month) period, were submitted to autopsy study. In 13 patients the cause of death was the tumor. In the surviving patients, 5 are with and 59 are without evidence of disease; 7 are under imatinib treatment, without evidence of disease (n = 2), with a partial response (n = 2), and with stable disease (n = 3). Prognostic evaluation Table 1 summarizes clinicopathological parameters of the series. In the univariate analysis, tumor size [10 cm and number of mitoses per 50 HPF [5 were predictive of a poor RFS (HR = 5.61; p = and HR = 4.22; p = 0.013, respectively) and DSS (HR = 8.83; p = and HR = 5.24; p = 0.004, respectively). Patients with high-risk GISTs had a significantly shorter RFS and DSS than those with very low/low/intermediate risk GISTs (HR = 7.63; p = and HR = 22.8; p \ 0.003, respectively). The DSS was shorter after macroscopical incomplete (R2) resection (Fig. 1), and this difference was statistically significant (HR = 13.56; p\0.001); RFS showed a trend to be shorter after R1 resection (HR = 3.03; p = 0.059) Disease-specific survival was shorter for mixed cellular type and in tumors with necrosis (HR = 3.81; p = and HR = 5.73; p = 0.023, respectively). Age, gender, and primary site of tumor were not significant prognostic parameters. Prognostic value of risk group and margin status for DSS was significant in the multivariate study (Table 2): high-risk tumors (p = 0.016) and macroscopic positive (R2) margin status (p = 0.013) were predictive of poor survival in GIST patients. Discussion Gastrointestinal stromal tumors occur predominantly in middle-aged and older patients (median age 63 years [21, 22]), without gender predominance. They are infrequent in patients younger than 40 years. They originate in the GI tract with a frequency as follows: stomach (40 70%), small intestine (20 40%), colon and rectum (5 15%), esophagus (\5%), and rarely in the mesentery, omentum, retroperitoneum, and other intra-abdominal structures [4, 15, 22 28]. Our series, like those in most reports, reveals no influence of either age or gender on the survival of GIST patients. Small GISTs (B2 cm) are virtually benign, usually asymptomatic, and are detected during investigations or surgical procedures for unrelated disease. The symptoms of GIST are most commonly related to mass effect or bleeding. The most common symptom at presentation is GI bleeding [21] resulting from erosion of the tumor into the lumen of the GI tract. Tumor rupture into the abdominal cavity is also possible, causing life-threatening hemorrhage. Patients with GIST may also exhibit various other symptoms that include early satiety, abdominal pain or discomfort, nausea, vomiting, obstruction, abdominal mass, dysphagia, jaundice, and anemia-related symptoms [21, 29]. In our series, asymptomatic GIST comprised 1/4 (24.1%) of all cases, and this may account for the lower incidence of synchronous metastatic disease and more favorable prognosis compared with most of the reported data. Gastrointestinal stromal tumors can be composed of spindle (70%), epithelioid (20%), or mixed cells [19]. Our histological findings are consistent with the results obtained by most groups. Immunohistochemistry, as an important tool in the differential diagnosis from other neoplasms, disclosed 7.7% CD117-negative tumors in our series. Molecular analysis of KIT and PDGFRA hot spot genes described in GISTs and already published by our group [30] fits with reported series and may help the final diagnosis of difficult cases. Many clinical and pathological parameters may influence survival of GIST patients [4, 10, 11, 13, 24, 31 42]. In our study, parameters found in multivariate analysis to significantly influence DSS were incomplete macroscopic (R2) tumor resection and high risk group. Other parameters, such as tumor size[10 cm, mitotic count[5/50 HPF, cellular morphology, and tumor necrosis, showed statistical significance in the univariate analysis for DSS. Prognosis after primary surgical resection is dependant on GIST malignant potential [4, 5], but prognostic grading systems to identify high risk or malignant GIST remain controversial and are still under investigation [10, 19, 36, 43, 44]. With various grading systems, the rate of recurrence after primary surgical treatment of high-grade GISTs reported in the literature is high [5, 10 13, 19, 37, 45] and their prognosis is poor [4, 5, 10, 11, 32, 33, 37, 38, 46, 47]. With the consensus grading system [19], the RFS and OS after 123

89 World J Surg (2008) 32: Table 1 Clinicopathological parameters and recurrence-free survival/disease-specific survival of Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) patients Parameters RFS a DSS n (%) Events (n) HR 95% CI b p Value n (%) Events (n) HR 95% CI b p Value Age c (years) B60 37 (39) (38) 4 1 [60 59 (61) ns 64 (62) ns Gender c Female 54 (56) (55) 4 1 Male 42 (44) ns 46 (45) Tumor site Stomach 60 (63) (59) 6 1 Small bowel 29 (30) ns 33 (32) ns Other 7 (7) ns 9 (9) ns Type of surgery Wedge/segmental resection 53 (55) 6 NA NA 56 (54) 7 NA NA Enucleation 21 (22) 2 NA NA 22 (21) 0 NA NA Total/subtotal organ resection 20 (21) 4 NA NA 22 (21) 4 NA NA En bloc resection 2 (2) 0 NA NA 4 (4) 2 NA NA Tumor size (cm) B5 51 (53) (50) 2 1 [5toB10 29 (30) ns 30 (29) ns [10 16 (17) (21) Cellular morphology Spindle 67 (70) (66) 5 1 Epithelioid 12 (12) ns 13 (13) ns Mixed 17 (18) ns 22 (21) Necrosis Absent 49 (51) (47) 2 1 Present 47 (49) ns 55 (53) Mitotic count (/50 HPF) B5 77 (80) (77) 5 1 [5 19 (20) (23) Risk group Very low/low/intermediate 69 (72) (67) 2 1 High 27 (28) (33) Margin status R0 78 (81) (75) 5 1 R1 18 (19) (17) ns R2 NA 8 (8) \0.001 a Excluded R2 cases b 95% confidence interval for HR c One patient with two metachronous tumors RFS, recurrence-free survival; DSS, disease-specific survival; HR, hazard ratio; HPF, high power field (9400); NA, not applicable; ns, not significant primary surgical treatment of high-risk GIST is short [11, 19, 37, 47]. The recurrence rate in our series was significantly associated with the risk grade of GIST, and high-risk tumors were associated with poor DSS in both the univariate and the multivariate analyses. Several reports showed higher risk for recurrent disease and shorter OS after primary resection of large tumors ([5 cmor[10 cm) [4, 5, 10, 24, 31, 32, 36 38, 46 52]. We found tumor size larger than 10 cm to be a predictive factor for poor DSS in the univariate analysis. Primary tumor site 123

90 2380 World J Surg (2008) 32: Fig. 1 Disease-specific cumulative survival according to margin status of Gastrointestinal Stromal Tumors (GISTs, n = 104). Cumulative survival is significantly lower in cases with R2 tumor resection (p \ 0.001) Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors of diseasespecific survival of GIST patients Parameter HR 95% CI a p Risk group Very low/low/intermediate 1.00 High Margin status R R R a 95% confidence interval for HR (stomach or small bowel) was not correlated with RFS or DSS in our patients. A number of previous reports showed better OS for stomach primary GISTs [24, 53, 54], but the frequency of lower versus higher risk GISTs varies among the different sites. Lower risk tumors usually outnumber malignant GISTs in the stomach, probably because GIST is often an incidental finding in this location [36]. Conventional chemotherapy and external beam radiotherapy are well-known unsuccessful treatments for advanced GISTs. Imatinib has been effective in patients with metastatic and recurrent GIST [55 59]. Furthermore, it may be used as neoadjuvant treatment by experienced multidisciplinary teams, particularly when function-sparing surgery is the goal (e.g., rectal or esophageal tumors). I- matinib treatment is acceptable for patients with high-grade GISTs, after incomplete resection, or tumor rupture, to control the risk of recurrence [15, 44, 58, 60, 61]. The results achieved in the few cases of our series treated with imatinib fit with those reported in literature. Five-year survival rates after GIST resection is reported to range from 32% to 76% [4, 7, 9, 10, 12, 13, 24, 31 33, 36, 37, 39, 52, 62], probably as a result of different clinicopathological features and management procedures of the studied cohorts. Series concerning primary GISTs report higher resectability rates and longer overall survival. In addition, old published series of GI sarcomas may be contaminated with other (non-gist) histology tumor types [4, 24, 52, 63 65]. Only a few series have evaluated the DSS of GIST patients, showing higher 5-year DSS than 5-year OS [4, 10 12, 33, 35, 37 39, 66]. In our series, surgical resection of primary GISTs was associated with 87.7% 5-year DSS, which compares favorably with reported studies. In our patients, 5-year RFS after macroscopic tumor resection was 89.8%. At variance with the findings reported by Ng et al. [33], our results show that only 5/12 recurrences occurred during the first 2 years of follow-up, and 4/12 occurred after 5 years of follow-up. As expected, most recurrences were abdominal metastasis (liver metastasis, peritoneal sarcomatosis, or both), a result reported by others [4, 13, 35, 67]. In one case with local recurrence complete tumor resection was achieved. Because GISTs tend to protrude from the primary site and displace the surrounding organs/structures, wedge or segmental resection is usually an adequate surgical option. The surgeon should make every effort to achieve complete resection of the tumor, which may require a subtotal or total organ resection or the removal of adjacent organs. In our study, resection of the tumor was achieved in 85%, which compares favorably with other reports (range: 48 90%) [4, 7, 9, 44, 52]. Considering extension of the surgical procedure to achieve complete resection, the role of lymphatic dissection may be an issue [4, 5, 7, 12, 13, 33, 65, 68] in the treatment of GISTs. Because of the low rate of reported lymph node involvement (4%) and/or subsequent lymph node metastases [5], there seems to be no added survival benefit from radical resection or extensive lymphadenectomy in the surgical treatment of GISTs. Even in high-grade GISTs, lymphadenectomy is indicated only when there is evidence of lymph node tumor involvement. The postoperative course of patients with preoperative tumor rupture or tumor rupture during resection surgery was similar to that of patients with R2 resection, as in our series, with shorter overall survival (median survival of 17 months) in a reported series of GISTs [33]. Thus, as others do, we believe that laparotomy is in general more appropriate than laparoscopy in the treatment of tumors with features predictive of friability and of large GISTs. Review of major published series shows several authors who emphasize complete macroscopic resection [4, 5, 15, 33, 35, 41, 47], whereas others highlight R0 resections [8 10, 12, 13, 17, 32, 42, 69] as good standard of care in the surgical treatment of GISTs. Some report that 123

91 World J Surg (2008) 32: microscopic (positive or negative) surgical margin status, at variance with reports of other solid malignant tumors, do not influence patient survival or even tumor recurrence in GIST [4, 5, 70]. However, the number of microscopic positive margins after macroscopic complete resection in the published series is relatively small and cannot serve as the basis for sound statistical conclusions. These series included a high number of large and high-grade GISTs, in which complete resection does not seem to avoid tumor recurrence and shorter patient survival. In addition, some of these reports may be biased by adjuvant treatment of advanced, incompletely resected GISTs [4, 48]. Other authors report that microscopic negative surgical margin status (R0) influence GIST prognosis [9 12, 16, 32, 37, 51, 71]. These results may be influenced by a higher number of incomplete resections in high-risk GISTs [37]. In our series, complete surgical resection (R0 or R1) was achieved in 92.3% of GISTs, and microscopic negative margin status (R0) was accomplished in 75% of resected GISTs. The recurrence rate was significantly lower in R0 than in R1 resections, but only the presence of macroscopic residual tumor (R2) was significantly associated with disease progression and short survival of our patients. In accordance with DeMatteo et al. [4] and Pierie et al. [5], our study of a small number of cases confirms that gross tumor resection influences outcome, with shorter DSS in GIST patients with R2 surgical margin status. We believe that surgical resection should include a margin of at least 1 cm of normal tissue [6, 17, 42, 70], and that an intraoperative examination of frozen tissue sections by a pathologist is called for when there is a possibility of a positive tumor margin. Acknowledgment This work was supported in part by Novartis Oncology, Portugal. References 1. Miettinen M, Blay JY, Sobin LH (2000) Mesenchymal tumors of the stomach. In: Hamilton SR, Aaltonen LA (eds) Pathology and genetics of tumors of the digestive system. Lyon, France, IARC Press, pp Nilsson B, Bümming P, Meis-Kindblom JM et al (2005) Gastrointestinal stromal tumors: the incidence, prevalence, clinical course and prognostication in the preimatinib mesylate era a population-based study in western Sweden. Cancer 103: Miettinen M, Lasota J (2001) Gastrointestinal stromal tumors definition, clinical, histological, immunohistochemical, and molecular genetic features and differential diagnosis. Virchows Arch 438: DeMatteo RP, Lewis JJ, Leung D et al (2000) Two hundred gastrointestinal stromal tumors: recurrence patterns and prognostic factors for survival. Ann Surg 231: Pierie JP, Choudry U, Muzikansky A et al (2001) The effect of surgery and grade on outcome of gastrointestinal stromal tumors. Arch Surg 136: DeMatteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM et al (2002) Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Hum Pathol 33: Roberts PJ, Eisenberg B (2002) Clinical presentation of gastrointestinal stromal tumors and treatment of operable disease. Eur J Cancer 38(suppl 5):S37 S38 8. Connolly E, Gaffney E, Reynolds J (2003) Gastrointestinal stromal tumors. Br J Surg 90: Wu P, Langerman B, Ryan C et al (2003) Surgical treatment of gastrointestinal stromal tumors in the imatinib (STI-571) era. Surgery 134: Bucher P, Egger JF, Gervaz P et al (2006) An audit of surgical management of gastrointestinal stromal tumors (GIST). Eur J Surg Oncol 32: Bümming P, Ahlman H, Andersson J et al (2006) Populationbased study of the diagnosis and treatment of gastrointestinal stromal tumors. Br J Surg 93: Langer C, Gunawan B, Schuler P et al (2003) Prognostic factors influencing surgical management and outcome of gastrointestinal stromal tumors. Br J Surg 90: Aparicio T, Boige V, Sabourin J et al (2004) Prognostic factors after surgery of primary respectable gastrointestinal stromal tumors. Eur J Surg Oncol 30: Verreet PR, Clausing TA, Schoepp C (2000) Principles of surgical management of stromal tumor. Chirurg 71: Eisenberg B, Judson I (2004) Surgery and imatinib in the management of GIST: emerging approaches to adjuvant and neoadjuvant therapy. Ann Surg Oncol 11: Lehnert T (1998) Gastrointestinal sarcoma (GIST) a review of surgical management. Ann Chir Gynaecol 87: Hohenberger P, Reichardt P, Gebauer B et al (2004) Gastrointestinal stromal tumors (GIST) current concepts of surgical management. Deutsch Med Wochenschr 129: Greene FL, Page DL, Fleming ID et al (2002) AJCC cancer staging manual, 6th edn. Springer-Verlag, New York 19. Fletcher CDM, Berman JJ, Corless C et al (2002) Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: a consensus approach. Hum Pathol 33: Kaplan EL, Meier P (1958) Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assoc 53: Miettinen M, Sobin LH, Lasota J (2005) Gastrointestinal stromal tumors of the stomach: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 1765 cases with long-term follow-up. Am J Surg Pathol 29: Tran T, Davila JA, El-Scrag HB (2005) The epidemiology of malignant gastrointestinal stromal tumors: an analysis of 1, 458 cases from 1992 to Am J Gastroenterol 100: Kindblom LG, Meis-Kindblom J, Bumming P et al (2003) Incidence, prevalence, phenotype and biologic spectrum of gastrointestinal stromal tumors (GIST): a population-based study of 600 cases (abstract). Ann Oncol 13(suppl 5): Emory TS, Sobin LH, Lukes L et al (1999) Prognosis of gastrointestinal smooth-muscle (stromal) tumors: dependence on anatomic site. Am J Surg Pathol 23: Miettinen M, Lasota J (2003) Gastrointestinal stromal tumors (GISTs): definition, occurrence, pathology, differential diagnosis and molecular genetics. Pol J Pathol 54: Horton KM, Juluru K, Montogomery E et al (2004) Computed tomography imaging of gastrointestinal stromal tumors with pathology correlation. Comput Assist Tomogr 28: Hersh MR, Choi J, Garrett C et al (2005) Imaging gastrointestinal stromal tumors. Cancer Control 12: Gouveia AM, Pimenta AP, Lopes JM et al (2005) Esophageal GIST: therapeutic implications of an uncommon presentation of a rare tumor. Dis Esophagus 18:

92 2382 World J Surg (2008) 32: DeMatteo RPRP, Maki RGRG, Antonescu CC et al (2003) Targeted molecular therapy for cancer: the application of STI571 to gastrointestinal stromal tumor. Curr Prob Surg 40: Gomes AL, Gouveia A, Capelinha AF et al (2008) Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs. An evaluation study of a Portuguese series. J Clin Pathol 61: Shiu MH, Farr GH, Papachristou DN et al (1982) Myosarcomas of the stomach: natural history, prognostic factors and management. Cancer 49: McGrath PC, Neifeld JP, Lawrence WJ et al (1987) Gastrointestinal sarcomas. Analysis of prognostic factors. Ann Surg 206: Ng EH, Pollock RE, Munsell MF et al (1992) Prognostic factors influencing survival in gastrointestinal leiomyosarcomas. Implications for surgical management and staging. Ann Surg 215: Muro-Cacho CA, Cantor AB, Morgan M (2000) Prognostic factors in malignant gastrointestinal stromal tumors. Ann Clin Lab Sci 30: Crosby JA, Catton CN, Davis A et al (2001) Malignant gastrointestinal stromal tumors of the small intestine: a review of 50 cases from a prospective database. Ann Surg Oncol 8: Miettinen M, El-Rifai W, H L Sobin L et al. (2002) Evaluation of malignancy and prognosis of gastrointestinal stromal tumors: a review. Hum Pathol 33: Lin S, Huang M, Zeng C et al (2003) Clinical manifestations and prognostic factors in patients with gastrointestinal stromal tumors. World Gastroenterol 9: Fujimoto Y, Nakanishi Y, Yoshimura K et al (2003) Clinicopathologic study of primary malignant gastrointestinal stromal tumor of the stomach, with special reference to prognostic factors: analysis of results in 140 surgically resected patients. Gastric Cancer 6: Wong NA, Young R, Malcomson RD et al (2003) Prognostic indicators for gastrointestinal stromal tumors: a clinicopathological and immunohistochemical study of 108 resected cases of the stomach. Histopathology 43: Mochizuki Y, Kodera Y, Ito S et al (2004) Treatment and risk factors for recurrence after curative resection of gastrointestinal stromal tumors of the stomach. World J Surg 28: Wu TJ, Lee LY, Yeh CN et al (2006) Surgical treatment and prognostic analysis for gastrointestinal stromal tumors (GISTs) of the small intestine: before the era of imatinib mesylate. BMC Gastroenterol 6: Wardelmann E, Büttner R, Merkelbach-Bruse S et al (2007) Mutation analysis of gastrointestinal stromal tumors: increasing significance for risk assessment and effective targeted therapy. Virchows Arch 451: Corless CL, Fletcher JA, Heinrich MC (2004) Biology of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 22: Bucher P, Villiger P, Egger JF et al (2004) Management of gastrointestinal stromal tumors: from diagnosis to treatment. Swiss Med Wkly 134: Samiian L, Weaver M, Velanovich V (2004) Evaluation of gastrointestinal stromal tumors for recurrence rates and patterns of long-term follow-up. Am Surg 70: Chou FF, Eng HL, Sheen-Chen SM (1996) Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract: analysis of prognostic factors. Surgery 119: Boni L, Benevento A, Dionigi G et al (2005) Surgical resection for gastrointestinal stromal tumors (GIST): experience on 25 patients. World J Surg Oncol 3: He LJ, Wang BS, Chen CC (1988) Smooth muscle tumors of the digestive tract: report of 160 cases. Br J Surg 75: Roy M, Sommers SC (1989) Metastatic potential of gastric leiomyosarcoma. Pathol Res Pract 185: Franquemont DW, Frierson HF Jr (1992) Muscle differentiation and clinicopathologic features of gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol 16: Pidhorecky I, Cheney RT, Kraybill WG et al (2000) Gastrointestinal stromal tumors: current diagnosis, biologic behavior, and management. Ann Surg Oncol 7: Rossi CR, Mocellin S, Mencarelli R et al (2003) Gastrointestinal stromal tumors: from a surgical to a molecular approach. Int J Cancer 107: Dougherty MJ, Compton C, Talbert M et al (1990) Sarcoma of the gastrointestinal tract. Ann Surg 214: Lillemoe KD, Efron DT (2001) Gastrointestinal stromal tumors. In: Cameron JL, Gery L (eds) Current surgical therapy. St. Louis, Mosby, pp Joensuu H, Roberts PJ, Sarlomo-Rikala M et al (2001) Effect of the tyrosine kinase inhibitor STI571 in a patient with a metastatic gastrointestinal stromal tumor. N Engl J Med 344: van Oosterom AT, Judson I, Verweij J et al (2001) Safety and efficacy of imatinib (STI571) in metastatic gastrointestinal stromal tumors: a phase I study. Lancet 358: Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD et al (2002) Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. N Engl J Med 347: Verweij J, Casali PG, Zalcberg J et al (2004) Progression-free survival in gastrointestinal stromal tumours with high-dose i- matinib: randomised trial. Lancet 364: DeMatteo RP (2002) The GIST of targeted cancer therapy: a tumor (gastrointestinal stromal tumor), a mutated gene (c-kit), and a molecular inhibitor (STI571). Ann Surg Oncol 9: Bümming P, Andersson J, Meis-Kindblom JM et al (2003) Neoadjuvant, adjuvant and palliative treatment of gastrointestinal stromal tumours (GIST) with imatinib: a centre-based study of 17 patients. Br J Cancer 89: Nilsson B, Sjölund K, Kindblom LG et al (2007) Adjuvant i- matinib treatment improves recurrence-free survival in patients with high-risk gastrointestinal stromal tumours (GIST). Br J Cancer 96: Trupiano J, Stewart R, Misick C et al (2002) Gastric stromal tumors, a clinicopathological study of 77 cases with correlation of features with nonaggressive and aggressive clinical behaviour. Am J Surg Pathol 26: Sanders L, Silverman M, Rossi R et al (1996) Gastric smooth muscle tumors: diagnostic dilemmas and factors affecting outcome. World J Surg 20: Ludwig DJ, Traverso LW (1997) Gut stromal tumors and their clinical behavior. Am J Surg 173: Miettinen M, Sarlomo-Rikala M, Lasota J (1999) Gastrointestinal stromal tumors: recent advances in understanding of their biology. Hum Pathol 30: Bucher P, Taylor S, Villiger P et al (2004) For small intestinal stromal tumors are there prognostic factors. Am J Surg 187: Mudan SS, Conlon KC, Woodruff JM et al (2000) Salvage surgery for patients with recurrent gastrointestinal sarcoma: prognostic factors to guide patient selection. Cancer 88: Pross M, Manger T, Schulz HU et al (1999) Gastrointestinal stromal tumors problems in diagnosis and therapy. Chirurg 70: Heinrich MC, Corless CL (2005) Gastric GI stromal tumors (GISTs): the role of surgery in the era of targeted therapy. J Surg Oncol 90: Demetri GD, Baker LH, Benjamin RS et al (2007) Soft tissue sarcoma. J Natl Compr Cancer Netw 5: Yan H, Marchettini P, Acherman YI et al (2003) Prognostic assessment of gastrointestinal stromal tumor. Am J Clin Oncol 26:

93 Trabalho II 93

94 94

95 Diseases of the Esophagus (2005) 18, ISDE Blackwell Publishing, Ltd. Original article Esophageal GIST: Therapeutic implications of an uncommon presentation of a rare tumor A. M. Gouveia, 1,3 A. P. Pimenta, 1,3 J. M. Lopes, 2,3 A. F. Capelinha, 2 S. S. Ferreira, 1 C. Valbuena, 2 M. C. Oliveira 1,3 1 Serviço de Cirurgia B and 2 Pathology Department, Oporto Medical School and Hospital de São João and 3 Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Oporto, (IPATIMUP), Oporto, Portugal SUMMARY. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are rarely reported in the esophagus. The authors report a patient with an esophageal GIST, incidentally found after an echocardiogram. CT scan and endoscopic ultrasonography showed the tumor in the dependence of the muscularis propria of the esophageal wall. An Ivor Lewis esophagectomy was performed. The tumor was well-circumscribed involving the submucosal and the muscular layers of the esophagus, measuring cm, without involving the surgical margins. Histologically, the tumor consisted of spindle cells, with low mitotic index (2/50 HPF), that were immunoreactive for KIT (CD117) and CD34, consistent with GIST of high risk of aggressive behavior. No adjuvant therapy was given to the patient, who is alive and without evidence of disease 1 year after surgery. Since esophageal GISTs are rarely reported in the literature and usually have a poor prognosis, the diagnostic differentiation of these tumors from other more common mesenchymal neoplasms is essential, both for therapeutic and prognostic reasons. KEY WORDS: clinical features, esophagectomy, esophagus, GIST, immunohistochemistry, treatment. INTRODUCTION Address correspondence to: Dr António M. Gouveia, Serviço de Cirurgia B, Hospital de São João, Porto, Portugal. am.gouveia@netcabo.pt Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are defined as c-kit (CD117, stem cell factor receptor) positive mesenchymal spindle or epithelioid cell tumors in the gastrointestinal (GI) tract. Depending upon the histologic findings, GISTs were classified for many years as leiomyomas, leiomyoblastomas and leiomyosarcomas, as a result of their apparent origin in the muscularis propria of the GI tract wall. Although rare, they are the most common mesenchymal tumors of the GI tract and account for up to 3% of GI tract malignant tumors. GISTs predominate in the stomach (50 70%) and small bowel (20 33%). In the esophagus, squamous carcinoma and adenocarcinoma are the common malignant tumors and leiomyoma the most frequent mesenchymal neoplasm. GISTs have been documented very rarely (< 5%) in the esophagus. Therefore, the diagnostic differentiation of GISTs from other mesenchymal neoplasms, particularly in the esophagus, is essential not only because the former group has a high risk of malignant behavior, but is usually responsive to a new recently targeted therapy, STI-571 (imatinib mesylate) a receptor tyrosine kinase inhibitor of the activated KIT protein, as frequently observed in GISTs. We report herein an esophageal GIST incidentally found in a patient who underwent an echocardiogram. Clinical presentation, diagnosis, and risk classification of aggressive behavior will be discussed, as well as the available therapeutic options for these tumors. Patient report In the course of a hypertension investigation a 59-year-old man underwent an echocardiogram that raised the suspicion of an aortic dilatation. He had no digestive symptoms and his past medical history was unremarkable. Clinical examination was irrelevant and his hematological and biochemical profile was normal. A CT scan revealed a welloutlined tumor in the posterior mediastinum, apparently originating in the left lateral esophageal wall without involving the lumen of the esophagus (Fig. 1a). The tumor was independent from the 70

96 Esophageal GIST 71 Fig. 1 Esophageal GIST: (a) CT scan disclosing well-circumscribed tumor in the posterior mediastinum; (b) endoscopic ultrasonography showing the intraparietal esophageal location of the tumor; (c) endoscopy showing the endoluminal esophageal aspect of the tumor, without ulcerating the mucosa; and (d) macroscopy of the tumor, after longitudinal section of the esophagus. Note the smooth appearance of the mucosa over the tumor. aorta, and extended from the tracheal bifurcation to the esophagogastric junction: it was a solid lesion, capturing contrast heterogeneously with a poorly outlined central hipocapturing region. An esophagogastroscopy showed deformity of the esophageal wall extending from 35 cm to 40 cm from the incisors, apparently caused by compression of a subepithelial mass (Fig. 1c); no lesions were found in the stomach. Endoscopic ultrasonography confirmed the tumor features revealed by the CT scan and showed that the tumor was located in the muscularis propria (Fig. 1b). An Ivor Lewis esophagectomy was performed to completely resect the tumor and the patient had an uneventful postoperative recovery, without adjuvant chemotherapy or radiotherapy. The patient is asymptomatic and with no clinical evidence of tumor recurrence or metastasis after 12 months of follow-up. Pathologic features The tumor was a well-circumscribed gray-white fibrous mass measuring cm, involving the submucosa and the muscular layers, and sparing the mucosa of the esophagus (Fig. 1d). The cut surface showed foci of hemorrhage, necrosis and cystic areas in the tumor. Histologically, the lesion was composed of a moderately cellular proliferation of spindle cells embedded in a collagenous matrix (Fig. 2b) with foci of hyalinization. The cells had cytoplasmic vacuolization, low pleomorphism and there were some bizarre cells (Fig. 2b-inset). Mitotic index was 2/50 high power fields (HPF: mm 2 ). There were Fig. 2 Esophageal GIST: (a) histologic low power view showing submucosal involvement by the tumor; (b) tumor spindle cells and collagenous stroma, inset: bizarre tumor cells; (c) CD34 immunoreactivity of tumor cells; and (d) CD117 (KIT) immunoreactivity of tumor cells. areas of tumor hemorrhage and necrosis. There was no invasion of the mucosa (Fig. 2a) and the surgical margins were free of tumor. Immunohistochemical studies were performed and tumor cells stained diffusely for KIT (CD117; Fig. 2d), and CD34 (Fig. 2c), and focally for HHF35. None of the cells stained for ps100 or desmin. Proliferation index, using Ki-67, was less than 1%. The diagnosis of esophageal GIST, with high risk of aggressive behavior, was performed using the criteria of the International Consensus on GIST. 1 DISCUSSION Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most common mesenchymal tumors of the human gastrointestinal (GI) tract, but they are rare (1 3%) in the esophagus. 2,3 Gastrointestinal stromal tumor used to be a collective term referring to primary mesenchymal tumors of the GI tract, but now it is considered to be a particular tumor that originates from the interstitial cell of Cajal (ICC), or its precursor, in the GI tract wall and has expression of the tyrosine kinase receptor KIT in almost all cases. 4 7 In 1998 the presence of gain-of-function mutations in the c-kit proto-oncogene were found in GISTs. 4 Those mutations are thought to be responsible for constitutive ligand-independent activation of KIT and subsequent tumor pathogenesis. 1,4,8,9 More recently, PDGFRA activating mutations were described in the small group of GISTs (about 10%) lacking KIT mutations. 10 The specific diagnosis of GIST before biopsy or surgery is quite difficult in any location. Although the diagnosis can be often suspected histologically,

97 72 Diseases of the Esophagus the term GIST is usually applied, as in our case, for neoplasms displaying KIT (CD117) immunopositivity, with very rare exceptions. 1 In a published series of 68 patients with esophageal mesenchymal tumors, 11 Miettinen et al. found 48 (71%) leiomyomas and 17 (25%) GISTs. The GISTs were located in the distal esophagus and dysphagia was the typical symptom. In two patients the tumor was an incidental radiologic finding, as in our case, in spite of the large dimension of the tumor. It is noteworthy that this was the only case with esophageal localization found by us in a series of 78 GISTs. 12 According to the consensus approach for defining risk of aggressive behavior, GISTs are classified into low-, intermediate- and high-risk groups, depending on the size and mitotic index of the tumor. 1 There is a tendency to consider small GISTs (< 2 cm in diameter) with low mitotic activity as having a good prognosis. However, a few GISTs apparently lacking mitotic activity may metastasize, which raises difficulties in predicting the behavior of GISTs on an individual basis. Therefore, we concur that it is important to stress that all patients with GIST must be carefully and regularly followed up for an indefinite period, in light of the uncertainties expressed above and the documented tendency of these tumors to pursue an indolent clinical course with significant risk of late relapse. 1 Some authors reported that esophageal GISTs are often diagnosed late and tend to be associated with a poor prognosis. 1,13 In the paper published by Miettinen et al., out of 17 esophageal GISTs were classified as high risk, as in our case. Complete surgical resection is the standard of treatment for primary GIST, with no need for wide margins or regional lymphadenectomy. In our case, due to the large dimension of the tumor, an Ivor Lewis esophagectomy was performed and the surgical margins were free of tumor. Survival of patients with GIST, after resection of all gross disease, varies considerably in published series. Five-year survival rates for these patients range from 35% to 65%, depending on the inclusion of patients with disseminated disease. 3,14,15 Gastrointestinal stromal tumors appear to serve as a model for molecular-based diagnosis and treatment of solid tumors and for this reason pathologists will play a vital role in the diagnosis and treatment of these cases. 20,22 24 Treatment of GISTs has changed dramatically since the introduction of imatinib mesylate (Glivec/Gleevec; Novartis Oncology). This is a small molecule that selectively inhibits the enzymatic activity of the ABL and BCR-ABL fusion protein, platelet derived growth factor receptor, and KIT tyrosine kinases. Imatinib mesylate inhibits the mutated KIT receptor observed in most GISTs, leading to the onset of apoptosis and decreased proliferation of tumor cells. Preliminary results of several trials indicate that imatinib is an effective and safe treatment in patients with unresectable, recurrent, and metastatic tumors The role of imatinib in the adjuvant setting has also been the subject of recent interest. Bumming et al. reported four patients treated for microscopic positive margins with a recurrence-free interval of 7 13 months. 25 The American College of Surgeons Oncology Group (ACOSOG) is sponsoring two ongoing adjuvant trials, in patients with primary tumors presenting selected risk criteria (larger tumors; intraperitoneal tumor rupture or hemorrhage; multifocal tumors). Although a radical excision of the tumor was performed in all but one patient of the Miettinen et al. series, 11 nine patients of this series died of disease, with a median survival of 29 months, stressing the aggression of GISTs in esophageal localization. Thus, it would be interesting to consider the use of imatinib in the adjuvant setting, particularly in large and high-risk GISTs of the esophagus. References 1 Fletcher C D M, Berman J J, Corless C et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: a consensus approach. Hum Pathol 2002; 33: Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Definition, occurrence, pathology, differential diagnosis and molecular genetics. Pol J Pathol 2003; 54: DeMatteo R P, Lewis J J, Leung D, Mudan S S, Woodruff J M, Brennan M F. Two hundred gastrointestinal stromal tumors: recurrence patterns and prognostic factors for survival. Ann Surg 2000; 231: Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 1998; 279: Kindblom L G, Remotti H E, Aldenborg F, Meis-Kindblom J M. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J Pathol 1998; 152: Sircar K, Hewlett B R, Huizinga J D, Chorneyko K, Berezin I, Riddell R H. Interstitial cells of Cajal as precursors of gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol 1999; 23: Sarlomo-Rikala Kovatich A J, Barusevicius A, Miettinen M. CD117: a sensitive marker for gastrointestinal stromal tumor that is more specific than CD34. Mod Pathol 1998; 11: Lux M L, Rubin B P, Biase T L et al. KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol 2000; 156: Rubin B P, Fletcher J A, Fletcher C D M. Molecular insights into the histogenesis and pathogenesis of gastrointestinal stromal tumors. Int J Sur Pathol 2000; 8: Heinrich M C, Corless C L, Duensing A et al. PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Science 2003; 299: Miettinen M, Sarlomo-Rikala M, Sobin L H, Lasota J. Esophageal stromal tumors: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 17 cases and comparison with esophageal leiomyomas and leiomyosarcomas. Am J Surg Pathol 2000; 24: Gouveia A, Silva P, Costa S, Pimenta A, Oliveira M C, Lopes J M. GIST: The Hospital S. João (Porto) series during the last 13 years (abstract). Hepatogastroenterology 2003; 50: LXIII.

98 Esophageal GIST Miettinen M, El-Rifai W H L, Sobin L, Lasota J. Evaluation of malignancy and prognosis of gastrointestinal stromal tumors: a review. Hum Pathol 2002; 33: Ng E H, Pollock R E, Munsell M F, Atkinson E N, Romsdahl M M. Prognostic factors influencing survival in gastrointestinal leiomyosarcomas. Implications for surgical management and staging. Ann Surg 1992; 215: Roberts P J, Eisenberg B. Clinical presentation of gastrointestinal stromal tumors and treatment of operable disease. Eur J Cancer 2002; 38: S37 S Joensuu H, Roberts P J, Sarlomo-Rikala M et al. Effect of the tyrosine kinase inhibitor STI571 in a patient with a metastatic gastrointestinal stromal tumor. N Engl J Med 2001; 344: van Oosterom A T, Judson I, Verweij J et al. Safety and efficacy of imatinib (STI571) in metastatic gastrointestinal stromal tumours: a phase I study. Lancet 2001; 358: Demetri G D, von Mehren M, Blanke C D et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. N Engl J Med 2002; 347: Heinrich M C, Blanke C D, Druker B J, Corless C L. Inhibition of KIT tyrosine kinase activity: a novel molecular approach to the treatment of KIT-positive malignancies. J Clin Oncol 2002; 20: DeMatteo R P, Heinrich M C, El-Rifai W M, Demetri G. Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Hum Pathol 2002; 33: Blanke C D, von Mehren M, Joensuu H et al. Evaluation of the safety and efficacy of an oral molecularly-targeted therapy, STI-571, in patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors (GISTS) expressing c-kit (CD117) (Abstract). Presented at the 37th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, San Francisco, CA, May 12 15, Blanke C D, Eisenberg B L, Heinrich M C. Gastrointestinal stromal tumors. Curr Treat Options Oncol 2001; 2: Kitamura Y, Hirota S, Nishida T. Gastrointestinal stromal tumors (GIST): a model for molecule-based diagnosis and treatment of solid tumors. Cancer Sci 2003; 94: O Leary T, Berman J J. Gastrointestinal stromal tumors: answers and questions. Hum Pathol 2002; 33: Bümming P, Andersson J, Meis-Kindblom J M et al. Neoadjuvant, adjuvant and palliative treatment of gastrointestinal stromal tumours (GIST) with imatinib: a centre-based study of 17 patients. Br J Cancer 2003; 89:

99 Trabalho III 99

100 100

101 Original article Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs: evaluation of a Portuguese series A L Gomes, 1 A Gouveia, 2,3,5 A F Capelinha, 2,4,5 D de la Cruz, 4 P Silva, 2,4,5 R M Reis, 1 A Pimenta, 3,4,5 J M Lopes 2,4,5 1 Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga, Portugal; 2 IPATIMUP, Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto, Porto, Portugal; 3 Department of Surgery, Porto University, Porto, Portugal; 4 Department of Pathology, H.S. João, Porto University, Porto, Portugal; 5 Medical Faculty of Porto University, Porto, Portugal Correspondence to: Professor Dr José Manuel Lopes, Rua Roberto Frias, s/n, Porto, Portugal; jmlopes@ ipatimup.pt ALG and AG contributed equally to this study. Accepted 10 April 2007 Published Online First 9 November 2007 This paper is freely available online under the BMJ Journals unlocked scheme, see jcp.bmj.com/info/unlocked.dtl ABSTRACT Aim: To assess KIT and PDGFRA mutations frequencies in a Portuguese series of gastrointestinal stromal tumours (GISTs). Methods: 78 GISTs were evaluated for CD117 expression and screened for mutations in KIT (exons 9, 11, 13, 14 and 17) and PDGFRA (exons 12, 14 and 18) genes. Results: KIT activating mutations were identified in 44 (56%) of the 78 GISTs. Forty cases (91%) presented a mutation in KIT exon 11, and 4 (9%) in exon 9. One case showed a 4 bp deletion in intron 14. PDGFRA mutations were observed in 5 cases (6%): 2 (3%) in exon 12 and 3 (4%) in exon 18. Survival analysis was performed in 63 of the 78 GISTs. The presence of mutated KIT was significantly correlated with shorter survival of patients (p = ), and inversely associated with epithelioid histological type of GISTs (p = ). Conclusions: Overall, the incidence of both KIT and PDGFRA mutations in these Portuguese series was 63%, being in agreement with other studies, mainly of Iberian populations. The great majority of mutations were located in KIT exon 11, statistically associated with worse prognosis and indicative of favourable response to imatinib-based therapy in this Portuguese series of GISTs. Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) although rare, are considered to be the most frequent gastrointestinal mesenchymal tumours in humans. 1 A Scandinavian study estimated the incidence of GISTs to be between 20 and 40 per million. 2 In Portugal, as far as we know, an epidemiological study is yet to be done. The cellular origin of GISTs is not fully understood, but they are thought to arise from interstitial cells of Cajal or their precursors, due to their similar positive KIT (CD117) and CD34 staining and negative staining for both desmin and S-100 protein immunostaining. 1 3 GISTs are rarely found outside the gastrointestinal tract, being most commonly found in the stomach (40 70%), small intestine (20 50%) and colon or rectum (5 15%) Nowadays, the diagnosis of GISTs is partially dependent on tumour cells overexpression of CD117 together with CD34. 5 The expression of such immunohistochemistry features is useful to differentiate GISTs from other mesenchymal tumours of the gastrointestinal tract, namely leiomyomas and leiomyosarcomas, nerve sheath tumours, and other primary and metastatic tumours possibly occurring in this location KIT belongs to the class III receptor tyrosine kinases (RTKs), which also include platelet-derived growth factor A and B (PDGFRA, PDGFRB), colony stimulating factor-1 receptor (CSF1R) and FMS-related tyrosine kinase 3 (FLT3). 6 These RTKs are characterised by the presence of an extracellular domain, a transmembrane domain, a juxtamembrane domain, and an intracellular domain where the two kinase domains are lodged. 7 RTK activation occurs when by ligand binding, the receptor dimerises and suffers conformational transformations, which induce activation of the kinase domains. These, in turn, lead to activation of important intracellular signalling pathways, such as RAS/mitogen activated protein kinase (RAS/ MAPK), phosphoinositide-3 kinase (PI3K), and signal transducers and activators of transcription (STAT), which regulate many physiological functions such as cell survival, proliferation, differentiation, adhesion and apoptosis. 7 8 GISTs are molecularly characterised by mutations in KIT oncogene, located in the long arm of chromosome 4 (4q11 12). 9 There is a broad spectrum of KIT mutations in GISTs, ranging from 20% to 80%, most of them being located in the juxtamembrane domain (exon 11), followed by mutations in the extracellular domain (exon 9), and seldom in the kinase (exon 13 and 17) and ATP pocket (exon 14) domains Later studies reported the presence of activating mutations in the PDGFRA oncogene in wild-type KIT bearing GISTs PDGFRA is also located at 4q11 12 and exhibits similar RTK cellular functions. The hotspot regions in this gene lie in the juxtamembrane (exon 12) and kinase (exons 14 and 18) domains, and have been reported in 5 12% of cases. The frequency of KIT/PDGFRA mutations in GISTs varies from series to series, probably reflecting epidemiological and methodological differences in the various studies on record Until recently, the treatment of GISTs was limited to surgical removal of the tumour. Unfortunately, even in patients where the tumour was completely and successfully removed, there was a high probability of recurrence. 1 The development of imatinib mesylate (Glivec/Gleevec, Novartis, Basel, Switzerland), a selective inhibitor of RTKs, has brought new hope for GIST patients. Imatinib targets KIT by competing with its ATP binding site, preventing further phosphorylations of downstream intracellular signalling molecules responsible for its oncogenic properties Several studies have showed the importance of KIT and PDGFRA molecular status in the imatinib response. It has been reported that patients with tumours harbouring exon 11 KIT mutations are more likely to respond to imatinib therapy than those with either exon 9 KIT mutations or undetectable mutations. J Clin Pathol 2008;61: doi: /jcp

102 Original article Figure 1 Morphological and immunohistochemical features of gastrointestinal stromal tumours (GISTs). (A) spindle cell and (B) epithelioid tumour cells with (C) membranar/cytoplasmic and (D) cytoplasmic/paranuclear dot immunoreactivity for CD117. Note immunoreactivity of interstitial cells of Cajal (C, inset). H&E and ABC immunohistochemistry (2006). In Portugal, the incidence of both KIT and PDGFRA mutations in GISTs is, to the best of our knowledge, unknown. Since different genotypic features give rise to different drug responses and thus different prognosis, it becomes important to define which patients will positively respond to imatinib treatment. Therefore, we characterised the occurrence of KIT and PDGFRA mutations in a series of Portuguese GIST patients. MATERIALS AND METHODS Tissue samples Seventy-eight formalin-fixed and paraffin-embedded consecutively diagnosed primary, previously untreated, sporadic GISTs, classified according to World Health Organization criteria 5 and risk group, 17 were retrieved from files ( ) from the Pathology Department of S. João Hospital, Porto, Portugal. All patients were Caucasian and of Portuguese origin, with a mean age of 61.7 years (range 20 88). Thirty-eight (48.7%) patients were female and 40 (51.3%) were male. Follow-up data, managed according to the guidelines of the European Society of Medical Oncology, 18 were available in 63 patients (range months, mean (12.1) months, median (26.8) months) in September Immunohistochemistry The immunohistochemistry procedure was performed according to the streptavidin biotin peroxidase complex principle, using rabbit polyclonal anti-human antibodies raised against CD117 (dilution 1:500; clone A 4502, DAKO, Carpinteria, Denmark), actin (dilution 1:100; clone HHF35, DAKO), desmin (dilution 1:50; Zymed Laboratories, San Francisco, California, USA), S100 protein (dilution 1:1000; DAKO) and endothelial cell marker CD34 (dilution 1:40; clone QBEnd/10, NovoCastra Laboratories, Newcastle-upon-Tyne, UK). Briefly, deparaffinised and rehydrated slides were subjected to 10 min incubation in 3% hydrogen peroxide in methanol, in order to inhibit endogenous peroxidase. No antigen retrieval was used. After incubation with primary antibody at room temperature for 30 min, the secondary biotinylated goat anti-polyvalent antibody was applied for 10 min, followed by incubation with streptavidin peroxidase complex. The immune reaction was visualised by DAB as a chromogen (Ultravision Detection System Anti-polyvalent, HRP/ DAB; Lab Vision, Fremont, California, USA). Any (strong/weak, focal, moderate or diffuse) membrane (CD117) and/or cytoplasm (CD117, actin, desmin, and CD34), and nuclear (S100 protein) immunoreactivity of the cells was considered as positive staining. Appropriated positive and negative controls were included in each run: interstitial cells of Cajal in a section of normal intestine were used as positive control for CD117, smooth layers for actin and desmin, small nerves for S100 protein, and vessels for CD34. For negative controls, primary antibodies were omitted. Mast cells, smooth layers, small nerves, and vessels were used as internal positive controls in the cases tested. All sections were counterstained with haematoxylin. DNA isolation Selected areas containing at least 85% of tumour tissue were macrodissected into a microfuge tube using a sterile needle (Neolus, 25 G, 0.5 mm). DNA isolation was performed as described previously. 19 Briefly, the dissected tissue was deparaffinised by a serial extraction with xylol and ethanol (100% 70% 50%) and allowed to air-dry. DNA was extracted using Qiagen s QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany), following the manufacturer s instructions. DNA samples were stored at 220uC for further analysis. KIT mutation analysis KIT mutation analysis was performed as described previously DNA was subjected to PCR amplifications followed by direct sequencing for exon 11, and pre-screening by single strand conformational polymorphism (SSCP) analysis for exons 9, 13, 14 and 17, followed by direct sequencing of SSCP positive cases. Briefly, the PCR reaction was carried in a final volume of 204 J Clin Pathol 2008;61: doi: /jcp

103 Original article Table 1 Correlation analysis of CD117 with clinical and pathological features of gastrointestinal stromal tumours (n = 63) Parameter (n = 63) CD117 negative (%) CD117 positive (%) p value Age, y (SD) 54.6 (12.1) 61.2 (15.5) 0.37 Gender 0.13 Male Female Location 0.18 Gastric Small intestine Other Dimension (cm) 0.76, > Mitotic index (HPF) 0.34, Risk grade 0.93 VLR LR IR HR Histological type 0.02 Spindle cell Epithelioid Mixed Follow-up, months (SD) 92.3 (32.8) (12.6) 0.96 HPF, high power field (6400); VLR, very low risk; LR, low risk; IR, intermediate risk; HR, high risk. 25 ml, under the following conditions: 16 buffer (Bioron, Ludwigshafen, Germany); 1.5 mm MgCl 2 (Bioron); 200 mm dntps (Fermentas, Hanover, Maryland, USA); 0.5 mm primers (previously described by Corless et al, 21 except for exon 14: 59-TCT CAC CTT CTT TCT AAC CTT TTC TT-39 (forward); 59-CCC ATG AAC TGC CTG TCA AC-39 (reverse); MWG-Biotech, Ebersberg, Germany); and 1 unit of Super Hot Taq Polymerase (Bioron, Germany). SSCP analysis of exons 9, 13, 14 and 17 was performed in a 16 MDE gel (MDE: mutation detection enhancement, Cambrex, Charles City, Iowa, USA), with 6% glycerol addition in the exon 13 analysis, and 3% glycerol addition in exon 14 analysis. PCR product (20 ml) was incubated at 95uC for 10 min with an equal volume of formamide loading buffer (98% formamide, 10 mm EDTA, and 1 mg/ml bromophenol blue and xilene cyanol). SSCP gels were run at 20uC. Samples with a SSCP pattern different from the normal pattern were directly sequenced. All cases were confirmed twice with a new PCR amplification, SSCP and direct sequencing analysis. PDGFRA mutation analysis Tumours bearing a wild-type KIT gene were further screened for hotspot PDGFRA mutations (exons 12, 14 and 18) as previously described Briefly, the PCR reaction was carried out in a final volume of 25 ml, under the following conditions: 16 buffer (Bioron); 1.5 mm MgCl 2 (Bioron); 200 mm dntps (Fermentas); 0.5 mm primers (previously described by Heinrich et al 13 ;MWG- Biotech) and 1 unit of Super Hot Taq Polymerase (Bioron). PCR was followed by direct sequencing. All cases were confirmed twice with a new PCR amplification and direct sequencing analysis. Statistical analysis The available clinical and molecular data were analysed with StatView for Windows, V.5.0. Overall survival time analysis using Kaplan Meyer and log rank tests was performed with SPSS for Windows, V Probability values,0.05 were considered significant. RESULTS Immunohistochemistry Strong membrane and/or cytoplasm tumour cells immunoreactivity for CD117 was found in variably focal, moderate or diffuse areas in 72 (92%) GIST cases (fig 1). In three cases, CD117 immunoreactivity was weak. Six GIST cases (8%) did not show CD117 immunoreactive tumour cells. Interstitial cells of Cajal and mast cells, used as internal positive controls, were always variably observed in each case. Table 1 summarises statistical analysis of CD117 immunostaining and clinical pathological features. CD117 immunoreactivity was significantly associated (p = 0.015) with spindle cell and epithelioid GIST subtypes. The frequency and expression features of the other antibodies was variable from case to case, and within the same tumour, as follows: actin (51%), desmin (6%), S100 protein (18%), and CD34 (73%); immunoexpression was observed in focal areas/rare tumour cells for actin, desmin, and S100 protein, whereas CD34 immunoexpression was found in moderate or diffuse areas (data not shown). Four of the six CD117 negative GISTs expressed CD34 without any tumour cell expression for the other markers tested. KIT mutation analysis Mutation screening analysis revealed that 44 of 78 GISTs (56%) presented KIT activating mutations (table 2). Forty cases showed mutation in exon 11 (91%, 40/44) and four cases in exon 9 (9%, 4/44). Among the exon 11 mutations, we observed 3 54 bp in-frame deletions in 24 tumours (60%, 24/40), either alone (62%, 15/24) or associated with missense mutations or insertions (38%, 9/24), single base substitutions in 15 tumours (38%, 15/40) and an in-frame insertion associated with a point mutation in 1 tumour (2%, 1/40). Additionally, a silent mutation (Y570Y) was detected in two GISTs. The exon 9 sequence alterations consisted of Ala Tyr duplication between codons 502 and 503 in three GIST cases, and a point mutation (G470R) in one case. One silent mutation was detected in both exons 13 and 17 (P627P and S865S, respectively). Also, a 4 bp deletion was detected affecting the intronic sequence following exon 14 (IVS14+24:del4). In addition, to exclude the possibility of false-negatives in the SSCP screening at exons 9, 13, 14 and 17, 10 KIT wild-type GISTs were direct sequenced for all exons. No additional mutations were identified. Table 3 shows statistical analysis of KIT mutations and clinical pathological features. No correlation was detected between KIT mutation status and CD117 expression (p = 0.39). However, all but two GISTs harbouring KIT mutation were positive for CD117 expression. Additionally, the three GISTs with weak CD117 immunoreactivity depicted wild-type KIT. A statistically significant correlation was obtained between the epithelioid morphology and lack of KIT mutation (p = ). The presence of mutated KIT was significantly associated with shorter survival of patients (p = ) (fig 2). No correlation was obtained between any specific type of KIT mutation (point mutation, deletion, or mixed mutation), or its location (exon 9 or exon 11), and patient survival (data not shown). PDGFRA mutation analysis In KIT wild-type GISTs, PDGFRA activating mutations were identified in five cases; two in exon 12, and three in exon 18 J Clin Pathol 2008;61: doi: /jcp

104 Original article Table 2 Amino acid sequence of exons 9 and 11 of wild-type and mutated KIT protein Exon Wild type K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Cases 5, 67, 76, 78 K P M Y E V Q W K D V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 7 K P M Y E V Q W V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q N P Y D H K W E F P R N R L Case 10 K P M Y E V Q W K V V E E I V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Cases 11, 59 K P M Y E V Q W K V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 13 K E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Cases 14, 40 K P M Y E V Q W K V E E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 15 K P M Y E V Q F V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 16 K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V F I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 17 K P M Y E V Q G K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R P Case 19 K P I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Cases 22, 39, 57, 70 K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q P P Y D H K W E F P R N R L Case 24 K P M Y E V Q W K G V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 28 K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T H T Y D H K W E F P R N R L Case 33 K P M Y E V Q W K V D E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 37 K P M Y E V Q W K V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Cases 38, 42, 47 K P M Y E V Q V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 45 Q R K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 48* K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 50 K P M Y E V Q W K V V E E I Y D H K W E F P R N R L Case 51 K P M Y E V K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 55 K P M Y E V Q R K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 64 K P M Y E V Q W N V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 65 I V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 66 K P M Y E V H P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 68 K P M Y E V K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 69 K P M Y E V Q W K V V E E I N G N K V P Y D H K W E F P R N R L Case 73 K P M Y E V P E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 74 K P M Y E V Q W K V V E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H P T Q L P Y D H L Case 75 K P M Y E V Q W E E I N G N N Y V Y I D P T Q L P Y D H K W E F P R N R L Case 77 K P M Y E V Q W P Y D H K W E F P R N R L Exon Wild type F G K T S A Y F N F A F K G N Case 2 F R K T S A Y F N F A F K G N Cases 1, 12, 18 F G K T S A Y A Y F N F A F K, deleted amino acid residues. *Includes an insertion of two residues (histidine and asparagine) in codon 550, besides the represented deletion. 206 J Clin Pathol 2008;61: doi: /jcp

105 Original article Figure 2 Kaplan Meier curve for the 63 patients with gastrointestinal stromal tumours, regarding KIT alterations. Patients having a wild-type KIT (n = 27) have a better prognosis than patients having tumours harbouring mutated KIT (n = 36) (p = 0.046). (table 4). The mutations in exon 12 consisted of a point mutation (D583G) and an in-frame deletion (583del586). Two cases disclosed a point mutation (D842V) in exon 18; there was another case with a point mutation (I843T) together with an inframe deletion (844del847). In addition, we identified two silent mutations, one in exon 12 (D577D) and another in exon 18 (I834I). No mutation was observed in exon 14 of PDGFRA. Furthermore, mutational analysis of exons 12 and 18 showed the presence of a known homozygous substitution A.G (polymorphism R) in the third position of the codon for proline 567 in exon 12, and an insertion in intron 18 (IVS18-50insA). All GISTs with PDGFRA mutations showed CD117 immunoreactive tumour cells. DISCUSSION The intensive cancer research in the last decade has highlighted the fundamental role of RTKs, in particular of KIT and PDGFRA in GIST pathogenesis. 10 These two RTKs are of great value for therapeutic management as a result of the development of RTK inhibitors, such as imatinib and sunitinib There is, however, insufficient epidemiological data on the frequency and type of mutations in the KIT and PDGFRA genes in GISTs from countries in southern Europe countries, such as Portugal. In this study, we have shown that 92% of GISTs express CD117, irrespective of the topography, age or gender, in accordance with previous studies in other populations No statistically significant correlation was depicted between CD117 expression and presence of KIT mutations (p = ). In fact, two of the six CD117-negative GISTs contained a KIT mutation (a missense mutation in exon 9, and a three base-pair deletion in exon 11). Other authors have also encountered KIT mutations in CD117-negative GIST cases. 27 Our molecular study was useful for the definitive diagnosis of GIST in 2/6 CD117 negative cases. The frequency of the CD117-negative wild-type cases for KIT and PDGFRA mutations found in our series (5%), fits with results described in the literature. 27 We showed the presence of KIT mutations in 56% of GIST cases, 91% (40/44) being located in exon 11. These frequencies are in accordance with previously published ranges for other populations (30 80%), particularly those of the Iberian Peninsula In 75% (30/40) of these cases, mutations were Table 3 Correlation of KIT mutations with clinical-pathological features of gastrointestinal stromal tumours (n = 63) Parameter KIT mutation negative (%) KIT mutation positive (%) p value Age, y (SD) 57.2 (16.6) 62.8 (14.2) 0.16 Gender 0.94 Male Female Location 0.27 Gastric Small intestine Other Dimension (cm) 0.93, > Mitotic index (50 HPF) 0.80, Risk grade 0.70 VLR LR IR HR Histological subtype 0.01 Spindle Epithelioid Mixed CD117 expression 0.39 Positive Negative Follow-up, months (SD) (17.1) (12.1) 0.05 HPF, high power field (6400); VLR, very low risk; LR, low risk; IR, intermediate risk; HR, high risk. clustered in the region between codons 550 and 561, known to be the most frequently altered section of exon 11, with 57% (17/ 30) affecting codon 557 or 558. These two codons are reported to be associated with the metastatic behaviour of GISTs. However, of these 17 GIST cases, only four recurred (4/17, 24%). Even though it has been previously reported that all point mutations occur exclusively in codons 557, 559, 560 and 576, we have additionally encountered a novel point mutation in codon 570 (Y570F). 1 Mutations in KIT exon 9 have been correlated with a small intestinal topography, but only one of our four GIST cases harbouring a mutation in this exon was located in the small intestine In the present study, and in agreement with previous reports, KIT mutation positive status was shown to be associated with worse GIST prognosis, translated into shorter patient survival. 10 Table 4 Amino acid sequence of exons 12 and 18 of wild-type and mutated PDGFRA protein Exon Wild type L P Y D S R W E F P Case 4 L P Y G S R W E F P Case 71 L P Y E F P Exon Wild type A R D I M H D S N Y Cases 41, 54 A R V I M H D S N Y Case 34 A R D T N Y, deleted amino acid residues. J Clin Pathol 2008;61: doi: /jcp

106 Original article Take-home messages c c c The frequency of KIT and PDGFRA activating mutations has been described in a series of Portuguese gastrointestinal stromal tumours (GISTs). Of the Portuguese patients with GISTs, 56% harboured KIT mutations and 6% exhibited PDGFRA mutations. The presence of KIT mutations in GISTs was associated with a worse patient prognosis; however, these mutations are indicative of favourable response to imatinib-based therapy. Concerning PDGFRA, mutations were detected in 6% (5/78) of our cases, corresponding to 15% of KIT wild-type GISTs. Two of these mutations are known to be imatinib-resistant (D842V). 22 An association between gastric location and presence of PDGFRA mutation has been reported. 30 In our series, although the number of cases with mutations in PDGFRA is low for statistical evaluation (n = 5), 80% (4/5) of mutations occurred in the stomach. It is now well established that the response of GIST patients to imatinib-based therapy is dependent not only on the presence, but also on the type of KIT and PDGFRA mutation exhibited Specifically, mutations affecting the juxtamembrane domain (exon 11, partial response in up to 84% of cases) or the extracellular domain (exon 9, partial response in up to 48%) predict objective response to imatinib On the other hand, it is also known that some mutations are responsible for imatinib resistance, namely in KIT V654A and W670I (exon 13), D816V and T823D (exon 17), and PDGFRA D842V (exon 18) Of these resistant mutations, only D842V mutation was detected in two GISTs in our series. Recently, the US Food and Drug Administration approved a new RTK inhibitor, sunitinib (Sutent, Pfizer, New York, USA) as a second-line therapy for GIST patients who experience disease progression in spite of increased doses of imatinib, mainly due to primary or acquired secondary imatinib-resistant mutations, or who are unable to tolerate treatment with imatinib. Therefore, with these two RTK inhibitors available, there is an imperative need to redefine GIST pathological (diagnosis/prognostic) evaluation, as well as to consider molecular characterisation of both KIT and PDGFRA, in order to achieve an efficient and predictive tailored therapeutic management for each individual patient. In conclusion, we have reported for the first time the frequency of KIT and PDGFRA mutations in a large series of Portuguese GIST patients. We have shown the presence of KIT mutations in 56% of cases and PDGFRA mutations in 6% of cases. In addition, the presence of mutated KIT was associated with a shorter patient survival. The great majority of KIT activating mutations (91%) were located in exon 11, indicative of a favourable response to imatinib-based therapy in the management of these patients. Finally, our results might be useful to integrate a multi-institutional consortium database for the clarification of the epidemiology, biology and management of GIST patients. Funding: Supported by NOVARTIS Oncology, Portugal. ALG is the recipient of fellowship grant (SFRH/BI/15257/2004) from FCT, Lisbon, Portugal. Competing interests: None declared. REFERENCES 1. Rubin BP. Gastrointestinal stromal tumours: an update. Histopathology 2006;48: Joensuu H, Kindblom LG. Gastrointestinal stromal tumors a review. Acta Orthop Scand Suppl 2004;75: Miettinen M, Virolainen M, Maarit-Sarlomo-Rikala. Gastrointestinal stromal tumors value of CD34 antigen in their identification and separation from true leiomyomas and schwannomas. Am J Surg Pathol 1995;19: Hirota S. Gastrointestinal stromal tumors: their origin and cause. Int J Clin Oncol 2001;6: Miettinen M. Blay JY, Sobin LH. Mesenchymal tumours of the stomach. In: Hamilton SR and Aaltonen LA, eds. Pathology and genetics of tumours of the digestive system. Lyon: IARC Press, 2000: Kitamura Y, Hirotab S. Kit as a human oncogenic tyrosine kinase. Cell Mol Life Sci 2004;61: Roskoski R. Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase the stem cell factor receptor. Biochem Biophys Res Commun 2005;338: Ronnstrand L. Signal transduction via the stem cell factor receptor/c-kit. Cell Mol Life Sci 2004;61: Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 1998;279: Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: review on morphology, molecular pathology, prognosis, and differential diagnosis. Arch Pathol Lab Med 2006;130: Tamborini E, Bonadiman L, Greco A, et al. A new mutation in the KIT ATP pocket causes acquired resistance to imatinib in a gastrointestinal stromal tumor patient. Gastroenterology 2004;127: Tornillo L, Terracciano LM. An update on molecular genetics of gastrointestinal stromal tumours. J Clin Pathol 2006;59: Heinrich MC, Corless CL, Duensing A, et al. PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Science 2003;299: Corless CL, Schroeder A, Griffith D, et al. PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors: frequency, spectrum and in vitro sensitivity to imatinib. J Clin Oncol 2005;23: Baker DE. Imatinib mesylate. Rev Gastroenterol Disord 2002;2: Debiec-Rychter M, Dumez H, Judson I, et al. Use of c-kit/pdgfra mutational analysis to predict the clinical response to imatinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumours entered on phase I and II studies of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. Eur J Cancer 2004;40: Fletcher CD, Berman JJ, Corless C, et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: a consensus approach. Int J Surg Pathol 2002;10: Blay JY, Bonvalot S, Casali P, et al. Consensus meeting for the management of gastrointestinal stromal tumors. Report of the GIST Consensus Conference of March 2004, under the auspices of ESMO. Ann Oncol 2005;16: Gomes AL, Bardales RH, Milanezi F, et al. Molecular analysis of c-kit and PDGFRA in GISTs diagnosed by EUS. Am J Clin Pathol 2007;127: Reis RM, Martins A, Ribeiro SA, et al. Molecular characterization of PDGFR-alpha/ PDGF-A and c-kit/scf in gliosarcomas. Cell Oncol 2005;27: Corless CL, McGreevey L, Haley A, et al. KIT mutations are common in incidental gastrointestinal stromal tumors one centimeter or less in size. Am J Pathol 2002;160: Heinrich MC, Corless CL, Demetri GD, et al. Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor. J Clin Oncol 2003;21: Zalcberg JR, Verweij J, Casali PG, et al. Outcome of patients with advanced gastrointestinal stromal tumours crossing over to a daily imatinib dose of 800 mg after progression on 400 mg. Eur J Cancer 2005;41: Joensuu H. Sunitinib for imatinib-resistant GIST. Lancet 2006;368: Miettinen M, Sobin LH, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors of the stomach: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 1765 cases with long-term follow-up. Am J Surg Pathol 2005;29: Feng F, Liu XH, Xie Q, et al. Expression and mutation of c-kit gene in gastrointestinal stromal tumors. World J Gastroenterol 2003;9: Medeiros F, Corless CL, Duensing A, et al. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol 2004;28: Martin J, Poveda A, Llombart-Bosch A, et al. Deletions affecting codons of the c-kit gene indicate a poor prognosis in patients with completely resected gastrointestinal stromal tumors: a study by the Spanish Group for Sarcoma Research (GEIS). J Clin Oncol 2005;23: Wardelmann E, Losen I, Hans V, et al. Deletion of Trp-557 and Lys-558 in the juxtamembrane domain of the c-kit protooncogene is associated with metastatic behavior of gastrointestinal stromal tumors. Int J Cancer 2003;106: Penzel R, Aulmann S, Moock M, et al. The location of KIT and PDGFRA gene mutations in gastrointestinal stromal tumours is site and phenotype associated. JClin Pathol 2005;58: Frost MJ, Ferrao PT, Hughes TP, et al. Juxtamembrane mutant V560GKit is more sensitive to imatinib (STI571) compared with wild-type c-kit whereas the kinase domain mutant D816VKit is resistant. Mol Cancer Ther 2002;1: Wardelmann E, Merkelbach-Bruse S, Pauls K, et al. Polyclonal evolution of multiple secondary KIT mutations in gastrointestinal stromal tumors under treatment with imatinib mesylate. Clin Cancer Res 2006;12: Prenen H, Cools J, Mentens N, et al. Efficacy of the kinase inhibitor SU11248 against gastrointestinal stromal tumor mutants refractory to imatinib mesylate. Clin Cancer Res 2006;12: J Clin Pathol 2008;61: doi: /jcp

107 Downloaded from jcp.bmj.com on March 4, Published by group.bmj.com Molecular alterations of KIT and PDGFRA GISTs: evaluation of a Portuguese series in A L Gomes, A Gouveia, A F Capelinha, et al. J Clin Pathol : originally published online September 7, 2007 doi: /jcp Updated information and services can be found at: References Open Access alerting service These include: This article cites 32 articles, 13 of which can be accessed free at: Article cited in: Receive free alerts when new articles cite this article. Sign up in the box at the top right corner of the online article. Topic Collections Articles on similar topics can be found in the following collections Unlocked (692 articles) Molecular genetics (2097 articles) Immunology (including allergy) (45065 articles) Notes To request permissions go to: To order reprints go to: To subscribe to BMJ go to:

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109 Trabalho IV 109

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111 Histopathology 2009, 55, DOI: /j x Low frequency of MAP kinase pathway alterations in KIT and PDGFRA wild-type GISTs Olga Martinho, 1 António Gouveia, 2,3,4 Marta Viana-Pereira, 1 Paula Silva, 2,4 Amadeu Pimenta, 2,3,4 Rui Manuel Reis 1 & José Manuel Lopes 2,4,5 1 Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga, 2 IPATIMUP, Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto, 3 Department of Surgery, H.S. João, 4 Medical Faculty of Porto University, and 5 Department of Pathology, H.S. João, Porto, Portugal Date of submission 10 July 2008 Accepted for publication 16 December 2008 Martinho O, Gouveia A, Viana-Pereira M, Silva P, Pimenta A, Reis R M & Lopes J M (2009) Histopathology 55, Low frequency of MAP kinase pathway alterations in KIT and PDGFRA wild-type GISTs Aims: Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are commonly driven by oncogenic mutations in KIT and PDGFRA. However, 10 40% of these patients are wildtype for these genes. The prognostic significance of wild-type GISTs is controversial, and they rarely respond to imatinib. The aim of this study was to elucidate the molecular lesions underlying wild-type GISTs tumorigenesis. Methods and results: Twenty-nine KIT and PDGFRA wild-type GISTs were re-assessed for the presence of cryptic KIT exon 11 duplications. Using a specific polymerase chain reaction assay, three previously undetected mutations were identified. In the remaining 26 wild-type GISTs, KIT, stem cell factor (SCF), phospho-kit and phospho-erk expression was evaluated by immunohistochemistry. Samples were screened for gain-of-function mutations in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade. KIT and SCF co-expression associated with KIT activation was observed in approximately 30% of cases. Furthermore, phospho-erk expression showed that MAPK is activated in approximately 30% of cases. None of RAS family (H-, K- and N-RAS) oncogenes exhibited activating mutations, whereas BRAF mutations were found in approximately 4% of cases. Conclusions: In the absence of RAS mutations, MAPK could be activated through SCF KIT autocrine paracrine mechanisms and or mutated BRAF in a subset of KIT PDGFRA wild-type GISTs. Keywords: activation, GISTs, MAP kinase, mutations, wild-type Abbreviations: DSS, disease-specific survival; EDTA, ethylenediamine tetraaceticacid; GIST, gastrointestinal stromal tumour; MAPK, mitogen-activated protein kinase; MDE, Mutation Detection Enhancement; NSCLC, non-small cell lung cancer; PDGFRA, platelet-derived growth factor receptor a; RTK, receptor tyrosine kinase; SCF, stem cell factor; SSCP, single-strand conformation polymorphism; VEGFR, vascular endothelial growth factor receptor; WHO, World Health Organization Introduction Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are the most common primary mesenchymal tumours of the digestive tract. 1,2 According to the World Health Organization (WHO) classification, GIST diagnosis should be Address for correspondence: J M Lopes, Rua Dr Roberto Frias, s n, Porto, Portugal. jmlopes@ipatimup.pt O.M. and A.G. contributed equally to this work. reserved for KIT (CD117)-positive mesenchymal tumours of the gastrointestinal tract. However, it is currently accepted that a small fraction of GISTs (5 10%) are CD117 negative. 3 7 KIT is an oncoprotein that belongs to the class III receptor tyrosine kinase (RTK) subfamily, being the stem cell factor (SCF) the ligand, also known as KIT ligand, steel factor or mast cell growth factor Upon binding of SCF to KIT homodimers, it induces dimerization and autophosphorylation, which leads to activation of several Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Limited.

112 54 O Martinho et al. intracellular signalling cascades such as mitogen-activated protein kinase (MAPK) (RAS RAF MEK ERK), PI3K AKT and STAT, regulating cellular proliferation and survival of cells. 9,10 In GISTs, KIT overexpression is mainly driven by gain-of-function mutations of KIT gene, with a frequency that varies between studies from 30% to 80%. 11,12 The great majority of KIT mutations occur at exon 11, followed by exon 9 and rarely at exons 13, 14 and ,12 In addition, KIT wild-type GISTs can exhibit activating mutations of other class III RTK genes, the platelet-derived growth factor receptor a (PDGFRA), which affects exon 18 more often, and rarely exons 12 and It has been shown that GIST patients harbouring KIT and PDGFRA activating mutations are effectively treated with specific tyrosine kinase inhibitors such as Imatinib mesilate (Glivec Ò ; Gleevec Ò ). 15,16 KIT and PDGFRA mutation frequency variation in GISTs may depend to some extent on tumour location, methodology and type of tissue used (frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded). 11,12,14,17 Recently, Lasota et al. have suggested that KIT exon 11 duplications may be undetected in formalin-fixed paraffin-embedded samples, due to the preferential polymerase chain reaction (PCR) amplification of the wild-type KIT allele over the large fragment mutant allele. 18 In fact, using a PCR assay specific for the 3 0 region affected by duplications at exon 11, the authors showed the presence of these types of mutation in 4 16 previously considered wild-type KIT formalin-fixed paraffin-embedded GISTs. 18 Contrasting with the extensive knowledge of KIT and PDGFRA activation by gene mutations, few studies have investigated the disruption of KIT signalling independently of these genetic alterations The MAPK (RAS RAF MEK ERK) pathway, one of the KIT downstream cascades, is highly preserved and implicated in cell growth, differentiation, migration and survival. 23 Activated RTK phosphorylates RAS, which binds RAF-1 kinase that phosphorylates MEK1 2, leading to ERK1 2 activation. Phosphorylated ERK translocates into nucleus and regulates gene expression through several transcription factors such as c-myc, CREB and AP-1, ultimately leading to changes in gene expression. 23 In several types of solid tumours, such as pancreatic, colonic, papillary thyroid and melanomas, this signalling pathway can be constitutively upregulated by activating mutations of RAS family genes (N-RAS, K-RAS and H-RAS), or by downstream RAF family member gene BRAF. 9,23 26 Importantly, constitutive activation of this RAS RAF ERK cascade could modulate patient response to anti-rtk therapies, independently of the upstream RTK status. Recently, we assessed KIT and PDGFRA mutation status in a formalin-fixed paraffin-embedded series of GISTs. 27 In the present study we aimed to clarify the poorly characterized molecular picture of KIT and PDGFRA wild-type GISTs. Initially, the presence of cryptic KIT exon 11 duplication mutations was re-evaluated. Then, the activation status of KIT and the pattern of KIT SCF autocrine paracrine stimulation loops were assessed. We also evaluated alterations of the MAPK signalling pathway by the analysis of RAS family and BRAF mutations and the expression levels of phosphorylated ERK. Doing so, we aimed to identify new potential prognostic and therapeutic markers for KIT and PDGFRA wild-type GISTs. Materials and methods tissue samples Twenty-nine formalin-fixed paraffin-embedded primary sporadic GISTs, previously characterized immunohistochemically for CD117, actin, S100, desmin and CD34, and molecularly for KIT and PDGFRA mutations, were retrieved from the Pathology Department of S. João Hospital files ( ), Porto, Portugal. 27 All patients were Caucasian of Portuguese origin. Tumours were classified according to WHO, and the parameters analysed in each case included: age, gender, primary tumour site, tumour size, histological type, mitotic index and risk group. 3,28 Follow-up data were available in all patients, as of December 2007, and collected through direct interview with patients or their relatives, and by review of in-hospital patient files. dna isolation Selected areas containing 85% of tumour tissue were macrodissected into a microfuge tube using a sterile needle (Neolus, 25 G, 0.5 mm; Leuven, Belgium) and DNA isolation was performed using Qiagen s QIAamp Ò DNA Micro kit (Qiagen, Hilden, Germany), as previously described. 27 mutation analysis of specific 3 0 region of kit exon 11, h-ras, k-ras, n-ras and braf Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism Pre-screening of the hotspot regions affecting KIT (3 0 region of exon 11), H-RAS, K-RAS, N-RAS [exons 1 (codons 12 13) and 2 (codon 61)] and BRAF (exons 11 and 15) genes was performed by PCR single-strand Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

113 MAPK pathway in wild-type GISTs 55 conformation polymorphism (SSCP), followed by direct DNA sequencing of samples that showed a mobility shift in the PCR-SSCP analysis. Briefly, the PCR was carried out in a total volume of 25 ll, consisting of 1 ll of DNA solution, 0.3 lm of both sense and antisense primers (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany), 200 lm of dntps (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA), 1.5 mm of MgCl 2 (Bioron, Ludwigshafen, Germany), 1 Taq Buffer incomplete (Bioron) and 1 U of Taq Superhot DNA Polymerase (Bioron). The reaction consisted of an initial denaturation at 96 C for 10 min, followed by 40 cycles of denaturation at 96 C for 45 s, annealing at C for 45 s and extension at 72 C for 45 s, followed by a final extension for 10 min at 72 C, in a Thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Primer sequences for all genes were as previously described. 18,29,30 PCR products were mixed with an equivalent volume of denaturing loading buffer [98% formamide, 10 mm ethylenediamine tetraaceticacid (EDTA), 1 mg ml bromophenol blue and xylene cyanol]. After denaturing at 98 C for 10 min and quenching on ice, 20 ll of the mixture was loaded onto a 1 Mutation Detection Enhancement (MDE) gel (Cambrex, East Rutherford, NJ, USA) and 6% of glycerol for KIT, without glycerol for K-RAS and with 3% glycerol for H-RAS and N-RAS genes and on a 0.8 MDE gel without glycerol for BRAF. The run was performed at 20 C for 16 h. Samples with a SSCP pattern different from the normal were further directly sequenced (Stabvida, Oeiras, Portugal), as described. 27 All cases were confirmed twice with a new and independent PCR amplification followed by direct sequencing. immunohistochemistry analysis of phospho-kit, scf and phospho-erk Representative 3-lm-thick sections were subjected to immunohistochemical analysis according to the streptavidin biotin peroxidase complex system (UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, Horseradish Peroxidase; Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA). Immunohistochemistry procedures were carried out as already published by us and other authors, with some modifications. Briefly, deparaffinized and rehydrated slides were submitted to heatinduced antigen retrieval for 20 min at 98 C with 10 mm citrate buffer (ph 6.0) for phospho-kit and phospho-erk, and with 1 mm EDTA buffer (ph 7.8) for SCF. After incubation with the primary antibodies raised against phospho-kit Tyr703 (dilution 1:30; incubation ON at 4 C; clone ZMD.243; Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA), SCF (dilution 1:200; incubation ON at 4 C; clone G-3; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and phospho-p44 42 MAPK Thr202 Tyr204 (dilution 1:100; incubation ON at 4 C; clone 20G11; Cell Signalling Technology, Beverly, MA, USA), the secondary biotinylated goat anti-polyvalent antibody was applied for 10 min followed by incubation with the streptavidin peroxidase complex. The immune reaction was visualized by 3,3 0 - diamonobenzidine as a chromogen. All sections were counterstained with Gill-2 haematoxylin. Appropriate positive controls were included in each run: human colonic tissue showing extracellular staining of glandular cells was used for SCF, GIST with KIT gene mutation for phospho-kit, and a cell block of a breast carcinoma cell line (MDA-MB-435) with BRAF mutation (V600E) was used for phospho-erk. For negative controls, primary antibodies were omitted and also replaced with a universal negative control antibody (carcinoembryonic antigen, rabbit antihuman; Dako Corp., Carpinteria, CA, USA). Furhtermore, CD117) leiomyoma cases 36 were used as negative controls for phospho-kit expression, as described. 31 Tumour samples were evaluated for both extent and intensity of immunoreactivity. The extent of immunoreactivity was evaluated on a scale of 0 3 (0, absence of positive cells; 1, <25% positive cells; 2, 26 50% positive cells; and 3, >50% positive cells) and the intensity also on a scale of 0 3 (0, negative; 1, weak; 2, moderate; 3, strong). The final score used was the sum of both extent and intensity scores, with values between 0 and 2 being classified as negative, 3 and 4 as moderately positive, and 5 and 6 as strongly positive. statistical analysis The available clinicopathological and immunohistochemical data were analysed with SPSS software for Windows, version 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Correlations between categorical variables were performed using Fisher 0 s exact test. Disease-specific survival (DSS) was calculated from the time of diagnosis until death related to the disease, or censored at the time of latest follow-up. Cumulative survival probabilities were calculated using the Kaplan Meier method. Differences between survival rates were tested with the log rank test. A P-value < 0.05 was considered to be significant. Results re-evaluation of kit mutations Twenty-nine of 78 previously described 27 wild-type KIT and PDGFRA GISTs were screened for KIT mutations Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

114 56 O Martinho et al. using a PCR assay designed to amplify a region in the 3 0 part of KIT exon 11 commonly affected by duplications. 18 The PCR-SSCP followed by direct sequencing analysis allowed identification of three novel cases harbouring KIT exon 11 duplications: case G6 (579_583dup), case G36 (578_591dup) and case G58 (573_580dup), which ranged from 14 to 42 nucleotides (Figure 1A). Consequently, the frequency of wild-type KIT and PDGFRA GISTs in our series was 33.3% (26 78). h-ras, k-ras, n-ras and braf mutations In the remaining 26 KIT and PDGFRA wild-type GISTs, we performed analysis of the hotspot regions of RAS family and BRAF genes. The study of codon of H-RAS gene did not reveal any mutation (Table 1). We identified only a T fi C substitution at codon 27 in two cases, which originates a silent mutation (H27H). The analysis of the other hotspot region, codon 61, did not show any mutation (Table 1). No genetic alterations were identified in the hotspot regions of the other RAS family genes, K-RAS and N-RAS (Table 1). The mutation screening of BRAF exons 11 and 15 showed the presence of the hotspot V600E mutation in one of 26 cases (3.8%) (Table 1 and Figure 1B). In order to determine whether BRAF V600E mutation was also present in GISTs exhibiting KIT or PDGFRA mutations, we extended the analysis of BRAF exon 15 A T A B C A C A A A T G G C A A G T T T C C C A N T A A A C A G G C T T T G G T C T A G C T A C A G T G A A A T C T C G A T G G A G T to the remaining cases of the series. No additional mutation was identified in the 52 KIT or PDGFRA mutated GISTs. Overall, the frequency of BRAF mutation in our GIST series was 1.3% (1 78). The V600E BRAF mutated case (G9) was a bona fide intermediaterisk spindle cell GIST from the small bowel of a 71-year old man (Figure 2). expression of kit (cd117), phosphorylated-kit and scf Table 1 summarizes CD117, phospho-kit and SCF expression. CD117 immunoreactivity was observed in 23 (88.5%) of 26 wild-type KIT and PDGFRA GISTs. 27 In order to evaluate whether KIT was activated in these tumours, we performed immunohistochemical analysis with an antibody to KIT phosphorylated residues Tyr703. Strong cytoplasmic immunoreactivity (Figure 3A) was observed in two, and moderate positivity in three GISTs. To determine whether this KIT activation was associated with an autocrine paracrine stimulation loop, we evaluated the expression of SCF. Positive cytoplasmic SCF expression was observed in 20 (76.9%) of the 26 cases, 10 depicting moderate and 10 strong positivity (Figure 3B). Co-expression of SCF CD117 was present in 65.4% of the cases. All phospho-kit positive GISTs showed co-expression of SCF CD117. expression of phosphorylated erk In order to study MAPK pathway activation, we evaluated the expression of ERK1 2 using an antibody for the p44 42 MAPK phosphorylated at residues Thr202 Tyr204 (ERK1 and ERK2). We found moderate phospho-erk expression in eight cases (30.8%) (Figure 3C). Phospho-ERK stained both nuclear and cytoplasmic compartments. As expected, the case harbouring BRAF activating mutation (case G9) also showed phospho-erk positivity. Furthermore, we observed a significant correlation between phospho- KIT and phospho-erk expression (P = 0.02). All cases expressing both phospho-kit and phospho-erk showed co-expression of SCF. Figure 1. A, DNA sequencing of KIT exon _580dup mutation in case G58; arrow indicates beginning of duplicated DNA sequence. B, DNA sequencing of BRAF exon 15 V600E mutation from case G9; arrow indicates the mutated base. clinicopathological features and statistical analysis Table 2 summarizes the clinicopathological parameters of the 26 re-evaluated KIT and PDGFRA wild-type GISTs. The mean and median age of patients at diagnosis was 59.9 and 62.5 years, respectively (range years), and the male female ratio was Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

115 MAPK pathway in wild-type GISTs 57 Table 1. Immunohistochemistry and molecular analysis of wild-type gastrointestinal stromal tumours Immunohistochemical analysis Molecular analysis Case CD117 p-kit SCF p-erk KRAS mutations HRAS mutations NRAS mutations BRAF mutations G WT WT WT WT G8 + ) + ) WT WT WT WT G WT WT WT V600E G20 + ) + + WT WT WT WT G21 + ) ) ) WT WT WT WT G23 + ) + + WT H27H WT WT G25 + ) ) ) WT WT WT WT G26 + ) + ) WT WT WT WT G27 + ) + ) WT WT WT WT G ) WT WT WT WT G30 ) ) + ) WT H27H WT WT G31 + ) + ) WT WT WT WT G32 + ) ) ) WT WT WT WT G35 + ) + ) WT WT WT WT G WT WT WT WT G44 + ) ) ) WT WT WT WT G46 + ) + ) WT WT WT WT G49 + ) + + WT WT WT WT G52 + ) + ) WT WT WT WT G53 + ) + ) WT WT WT WT G56 + ) ) ) WT WT WT WT G60 + ) ) ) WT WT WT WT G61 ) ) + ) WT WT WT WT G62 ) ) + + WT WT WT WT G63 + ) + ) WT WT WT WT G WT WT WT WT p-kit, phosphorylated KIT; p-erk, phosphorylated-erk; +, positive; ), negative; WT, wild-type The 5-year cumulative DSS was 83.6%, with a median follow-up time of months (mean ± 61.10; range months). All but two patients were submitted to surgical resection of primary GIST. None of the nine (34.6%) deceased patients, one within the postoperative (1 month) period, had an autopsy. In four patients the cause of death was due to the tumour disease. In the remaining patients, one is with and 16 are without evidence of disease. Three patients are currently under imatinib treatment Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

116 58 O Martinho et al. A B C Figure 2. Pathological features of V600E BRAF mutated gastrointestinal stromal tumour (case G9), showing low power of intestinal submucosal tumour (A, H&E), disclosing CD117+ (B) and CD34+ (C) spindle tumour cells. A B C Figure 3. MAP kinase pathway immunohistochemistry markers in wild-type gastrointestinal stromal tumours. A, Positive expression of phospho-kit. B, Positive expression of stem cell factor. C, Positive expression of phospho-erk. without evidence of disease (n = 2) or with stable disease (n = 1). On statistical univariate analysis, we found that a shorter DSS was significantly associated with tumour size >100 mm (P = 0.005) and high-risk GISTs (P = 0.027). Age, gender, primary site of tumour, histological type and mitotic index were not significant prognostic markers (Table 2). Regarding immuno- Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

117 MAPK pathway in wild-type GISTs 59 Table 2. Clinicopathological parameters and correlation with disease-specific survival of wild-type gastrointestinal stromal tumours Parameters (n = 26) N % P-value* Age (years) NS > Gender Male NS Female Tumour local Stomach NS Small bowel Other Tumour size (mm) > > Histological type Spindle NS Epithelioid Mixed Mitotic index (50 HPF) NS > Risk grade VL L I H p-kit Positive NS Negative SCF Positive NS Negative p-erk Positive NS Negative N, number of cases; NS, not significant values (P > 0,05); HPF, high-power field; VL, very low; L, low; I, intermediate; H, high risk; p-kit, phosphorylated KIT; SCF, stem cell factor; p-erk, phosphorylated ERK. *Log rank test histochemical parameters, no significant correlation was found between the analysed molecules and clinicopathological features (Table 2). Discussion The majority of GISTs are driven by KIT and PDGFRA oncogenic mutations. 7,15 Nevertheless, a subset of GIST patients, varying from 10% to 40%, are wild-type for both KIT and PDGFRA genes. 4,7,15,27,37 The prognostic factors of wild-type GISTs are still a matter of debate. Some studies have shown a better prognosis of wildtype GISTs when compared with mutated cases, 12,27 although a recent population-based study has failed to confirm these findings. 38 In the present series, we found that clinicopathological features commonly associated with overall GIST patients outcome, i.e. largest tumour size and high-risk grade, also constitute poor prognostic factors in wild-type GISTs. It has been shown that patients with wild-type GIST rarely respond to imatinib, 39,40 and their response to sunitinib-based therapy is still unclear. 7,15 Thus, these patients raise important therapeutic challenges. Another unexplored and puzzling issue is the molecular lesions underlying KIT and PDGFRA wild-type GIST tumours. In the present study, we have investigated the role of SCF KIT autocrine or paracrine stimulation loops, and the contribution of MAPK (RAS RAF MEK ERK) cascade alterations in a subset of previously described KIT PDGFRA wild-type GISTs. 27 In the light of new findings of undetectable KIT exon 11 duplication type of mutations in formalin-fixed paraffin-embedded tissues, 18 we initially re-assessed all wild-type cases. With this approach, we were able to detect three new cases with duplication-type of mutations in exon 11, leading to 33% of wild-type GISTs in this Portuguese series, which fits with other series, namely from the Iberian Peninsula. 37 The co-expression of both ligand and receptor in approximately 65% of cases and the expression of phospho-kit in approximately 30% of SCF KIT co-expressing cases support the possibility of autocrine paracrine mechanisms in wild-type GISTs. Our findings are in agreement with a recent report that found SCF KIT co-expression in the majority of GISTs, independently of KIT and PDGFRA mutation status. 35 KIT activation, assessed by Western blot in cell lines and frozen tissues, has previously been reported in 70 80% of wild-type GISTs with the same proportion and level found in KIT PDGFRA mutated GISTs. 20,35 Similar to our study, others have also observed that KIT SCF co-expression does not always lead to KIT activation. 35 The observed discrepancy in the number Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

118 60 O Martinho et al. of cases with KIT activation may be explained by the differences in methodologies and tissue fixation of the tumours. In our study, the antibody used recognizes KIT phosphorylation at tyrosine 703, whereas in the aforementioned studies the antibody recognizes tyrosine ,35 Despite the well-known advantages of immunohistochemical evaluation on formalin-fixed paraffin-embedded tissues, this method is less consistent than Western blot analysis for the evaluation of protein phosphorylation status. Therefore, further studies are warranted to determine the frequency of KIT activation and, most importantly, the efficacy of available treatments in wild-type GISTs. Despite the high frequency of RAS family gene mutation in several types of neoplasms such as pancreatic, papillary thyroid, colonic and non-small cell lung cancer (NSCLC), 23,41 none of the 26 analysed GISTs exhibited non-synonymous mutation of the H-RAS, K-RAS and N-RAS hotspot regions. The analysis of BRAF, another important oncogene of the MAPK cascade pathway, showed the presence of hotspot-activating V600E mutation in one wild-type case (approximately 4%). The V600E mutation accounts for 90% of BRAF mutations in human cancers and is associated with higher kinase activity, which stimulates ERK activity independently of RAS status. 42 In our series, no BRAF mutation was identified in KIT or PDGFRA mutated GISTs, suggesting that BRAF, KIT and PDGFRA mutations are mutually exclusive. So far, there are no reports on the analysis of RAS and BRAF gene mutations in GISTs. To elucidate further the role of MAPK pathway in wild-type GISTs, we evaluated phospho-erk expression, which was observed in 30% of our wild-type cases. Previous studies with GIST cell lines have suggested that ERK activation is dependent on KIT signalling 19 and that some KIT wild-type cell lines also exhibit ERK activation. 21 Our results are in agreement with these findings, since phospho-erk expression was significantly (P = 0.02) correlated with phospho-kit expression. However, phospho-erk expression in 50% of our cases without phospho-kit expression suggests that KIT-independent ERK activation is probably driven by other pathways (e.g. AKT PI3K and JAK STAT) in wild-type GISTs. 16,20 Currently, some drugs that target the RAS RAF and MEK molecules are under clinical trials and others in preclinical assays. Hitherto, no ERK1 or ERK2 inhibitors have been reported. 41 The most successful anti- RAF inhibitor is Sorafenib (Nexavar Ò ). Sorafenib is a potent inhibitor of both wild-type and mutant (V600E) BRAF and has proven to target other RTKs also, including KIT, vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-2, VEGFR-3, PDGFRB, i.e. it is a multi-kinase inhibitor. 43 The Food and Drug Administration has approved Sorafenib for advanced renal cell carcinoma. Sorafenib is also being evaluated for NSCLC, prostatic, breast, pancreatic and melanoma tumours. 43,44 Several studies have shown that Sorafenib anti-tumour activity is associated with an antiangiogenic effect. 43,44 In contrast to Sorafenib, small molecule inhibitors of MEK1 2 are highly specific inhibitors. AZD6244 (ARRY ) preclinical studies has been very promising, thus leading to further clinical trials. 45,46 Interestingly, Solit and colleagues have reported that BRAF mutant tumours are very sensitive to MEK inhibition. 47 In conclusion, our study constitutes the most comprehensive analysis of MAPK deregulation in KIT and PDGFRA wild-type GISTs. We have described the absence of RAS mutations, and suggest that MAPK pathway can be activated through SCF KIT autocrine paracrine mechanisms and or mutated BRAF in a subset of wild-type GISTs. Despite the low frequency of MAPK molecular alterations, additional studies are warranted to evaluate the potential role of MAPK pathway targeting in wild-type (KIT and PDGFRA) GISTs. Note: While the present paper was under revision, a study from Agaram NP and colleagues, also reported the presence of the V600E hotspot BRAF mutation in a small fraction of KIT and PDGFRA wild-type GISTs. 48 Acknowledgements The authors thank Drª Joana Paredes (IPATIMUP, Porto, Portugal) for kindly providing the MDA-MB-435 breast tumour cell line. O.M. is the recipient of a PhD fellowship (SFRH BD ) from FCT, Portugal. This study was partially supported by Novartis Oncology, Portugal. References 1. Tryggvason G, Gislason HG, Magnusson MK, Jonasson JG. Gastrointestinal stromal tumors in Iceland, : the Icelandic GIST study, a population-based incidence and pathologic risk stratification study. Int. J. Cancer 2005; 117; Nilsson B, Bumming P, Meis-Kindblom JM et al. Gastrointestinal stromal tumors: the incidence, prevalence, clinical course, and prognostication in the preimatinib mesylate era a populationbased study in western Sweden. Cancer 2005; 103; Miettinen M, Blay JY, Sobin LH. Mesenchymal tumours of the stomach. In Hamilton SR, Aaltomen LA eds. Pathology and genetics of tumours of the digestive system. In World Health Organization classification of tumours. Lyon, France: IARC Press, 2000; Miettinen M, Sobin LH, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors of the stomach: a clinicopathologic, immunohistochemical, and Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

119 MAPK pathway in wild-type GISTs 61 molecular genetic study of 1765 cases with long-term follow-up. Am. J. Surg. Pathol. 2005; 29; Blay JY, Bonvalot S, Casali P et al. Consensus meeting for the management of gastrointestinal stromal tumors. Report of the GIST Consensus Conference of March 2004, under the auspices of ESMO. Ann. Oncol. 2005; 16; Medeiros F, Corless CL, Duensing A et al. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: proof of concept and therapeutic implications. Am. J. Surg. Pathol. 2004; 28; Corless CL, Heinrich MC. Molecular pathobiology of gastrointestinal stromal sarcomas. Annu. Rev. Pathol. 2008; 3; Roskoski R Jr. Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase the stem cell factor receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 338; FletcherJA. Roleof KITandplatelet-derived growthfactor receptors as oncoproteins. Semin. Oncol. 2004; 31 (2 Suppl. 6); Ali S, Ali S. Role of c-kit SCF in cause and treatment of gastrointestinal stromal tumors (GIST). Gene 2007; 401; Tornillo L, Terracciano LM. An update on molecular genetics of gastrointestinal stromal tumours. J. Clin. Pathol. 2006; 59; Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: review on morphology, molecular pathology, prognosis, and differential diagnosis. Arch. Pathol. Lab. Med. 2006; 130; Heinrich MC, Corless CL, Duensing A et al. PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Science 2003; 299(5607); Lasota J, Miettinen M. KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Semin. Diagn. Pathol. 2006; 23; Maki RG. Recent advances in therapy for gastrointestinal stromal tumors. Curr. Oncol. Rep. 2007; 9; Zhu MJ, Ou WB, Fletcher CD, Cohen PS, Demetri GD, Fletcher JA. KIT oncoprotein interactions in gastrointestinal stromal tumors: therapeutic relevance. Oncogene 2007; 26; Wasag B, Debiec-Rychter M, Pauwels P et al. Differential expression of KIT PDGFRA mutant isoforms in epithelioid and mixed variants of gastrointestinal stromal tumors depends predominantly on the tumor site. Mod. Pathol. 2004; 17; Lasota J, Wasag B, Steigen SE, Limon J, Miettinen M. Improved detection of KIT exon 11 duplications in formalin-fixed, paraffinembedded gastrointestinal stromal tumors. J. Mol. Diagn. 2007; 9; Duensing A, Medeiros F, McConarty B et al. Mechanisms of oncogenic KIT signal transduction in primary gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Oncogene 2004; 23; Janeway KA, Liegl B, Harlow A et al. Pediatric KIT-wild-type and platelet-derived growth factor receptor alpha-wild-type gastrointestinal stromal tumors share KIT activation but not mechanisms of genetic progression with adult gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 2007; 67; Bauer S, Duensing A, Demetri GD, Fletcher JA. KIT oncogenic signaling mechanisms in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor: PI3-kinase AKT is a crucial survival pathway. Oncogene 2007; 26; Blair SL, Al-Refaie WB, Wang-Rodriguez J, Behling C, Ali MW, Moossa AR. Gastrointestinal stromal tumors express ras oncogene: a potential role for diagnosis and treatment. Arch. Surg. 2005; 140; Dhillon AS, Hagan S, Rath O, Kolch W. MAP kinase signalling pathways in cancer. Oncogene 2007; 26; Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat. Rev. Cancer 2007; 7; Dhomen N, Marais R. New insight into BRAF mutations in cancer. Curr. Opin. Genet. Dev. 2007; 17; Soares P, Trovisco V, Rocha AS et al. BRAF mutations and RET PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene 2003; 22; Gomes AL, Gouveia A, Capelinha AF et al. Molecular alterations of KIT and PDGFRA in GISTs: evaluation of a Portuguese series. J. Clin. Pathol. 2008; 61; Fletcher CD, Berman JJ, Corless C et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: a consensus approach. Int. J. Surg. Pathol. 2002; 10; Basto D, Trovisco V, Lopes JM et al. Mutation analysis of B-RAF gene in human gliomas. Acta Neuropathol. (Berl) 2005; 109; Di CJ, Marcy M, Vasko V et al. Molecular genetic study comparing follicular variant versus classic papillary thyroid carcinomas: association of N-ras mutation in codon 61 with follicular variant. Hum. Pathol. 2006; 37; Martinho O, Goncalves A, Moreira MA et al. KIT activation in uterine cervix adenosquamous carcinomas by KIT SCF autocrine paracrine stimulation loops. Gynecol. Oncol. 2008; 111; Reis RM, Martins A, Ribeiro SA et al. Molecular characterization of PDGFR-alpha PDGF-A and c-kit SCF in gliosarcomas. Cell. Oncol. 2005; 27; Houben R, Vetter-Kauczok CS, Ortmann S, Rapp UR, Broecker EB, Becker JC. Phospho-ERK staining is a poor indicator of the mutational status of BRAF and NRAS in human melanoma. J. Invest. Dermatol. 2008; 128; Malik SN, Brattain M, Ghosh PM et al. Immunohistochemical demonstration of phospho-akt in high Gleason grade prostate cancer. Clin. Cancer Res. 2002; 8; Theou-Anton N, Tabone S, Brouty-Boye D et al. Co expression of SCF and KIT in gastrointestinal stromal tumours (GISTs) suggests an autocrine paracrine mechanism. Br. J. Cancer 2006; 94; Gomes AL, Bardales RH, Milanezi F, Reis RM, Schmitt F. Molecular analysis of c-kit and PDGFRA in GISTs diagnosed by EUS. Am. J. Clin. Pathol. 2007; 127; Martin J, Poveda A, Llombart-Bosch A et al. Deletions affecting codons of the c-kit gene indicate a poor prognosis in patients with completely resected gastrointestinal stromal tumors: a study by the Spanish Group for Sarcoma Research (GEIS). J. Clin. Oncol. 2005; 23; Braconi C, Bracci R, Bearzi I et al. KIT and PDGFR{alpha} mutations in 104 patients with gastrointestinal stromal tumors (GISTs): a population-based study. Ann. Oncol. 2008; 19; Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. N. Engl. J. Med. 2002; 347; Heinrich MC, Corless CL, Demetri GD et al. Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor. J. Clin. Oncol. 2003; 21; Roberts PJ, Der CJ. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogenactivated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene 2007; 26; Wan PT, Garnett MJ, Roe SM et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell 2004; 116; Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

120 62 O Martinho et al. 43. Flaherty KT. Sorafenib: delivering a targeted drug to the right targets. Expert Rev. Anticancer Ther. 2007; 7; Bracarda S, Caserta C, Sordini L, Rossi M, Hamzay A, Crino L. Protein kinase inhibitors in the treatment of renal cell carcinoma: sorafenib. Ann. Oncol. 2007; 18; Haass NK, Smalley KS, Sproesser K, Contractor R, Herlyn M. The novel MEK1 2 inhibitor AZD6244 (ARRY ) inhibits the growth of melanomas harboring the BRAF V600E mutation in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 2007; 127; S Davies BR, Logie A, Mckay JS et al. AZD6244 (ARRY ), a potent inhibitor of mitogen-activated protein kinase extracellular signal-regulated kinase kinase 1 2 kinases: mechanism of action in vivo, pharmacokinetic pharmacodynamic relationship, and potential for combination in preclinical models. Mol. Cancer Ther. 2007; 6; Solit DB, Garraway LA, Pratilas CA et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature 2006; 439(7074); Agaram NP, Wong GC, Guo T. Novel V6OOE BRAF mutations in imatinib-naive and imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumors. Genes Chromosomes Cancer 2008; 47: Ó 2009 The Authors. Journal compilation Ó 2009 Blackwell Publishing Ltd, Histopathology, 55,

121 Trabalho V 121

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123 Virchows Arch (2009) 455: DOI /s z ORIGINAL ARTICLE Loss of RKIP expression is associated with poor survival in GISTs Olga Martinho & António Gouveia & Paula Silva & Amadeu Pimenta & Rui Manuel Reis & José Manuel Lopes Received: 8 June 2009 /Revised: 17 July 2009 /Accepted: 30 July 2009 /Published online: 25 August 2009 # Springer-Verlag 2009 Olga Martinho and António Gouveia contributed equally to the study. O. Martinho : R. M. Reis Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga, Portugal A. Gouveia : P. Silva : A. Pimenta : J. M. Lopes (*) IPATIMUP, Institute of Molecular Pathology and Immunology of the University of Porto, Rua Dr. Roberto Frias, s/n, Porto, Portugal jmlopes@ipatimup.pt A. Gouveia : A. Pimenta Department of Surgery, Porto, Portugal J. M. Lopes Department of Pathology, H.S. João, Porto, Portugal A. Gouveia : P. Silva : A. Pimenta : J. M. Lopes Medical Faculty of Porto University, Porto, Portugal Abstract Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are rare mesenchymal tumours of the digestive tract and are commonly driven by oncogenic mutations in KIT and PDGFRA genes. Tumour size, location, mitotic index and KIT/PDGFRA mutations are the most important prognostic parameters in GISTs. However, additional studies screening for new molecular prognostic markers in GISTs are missing. Raf kinase inhibitor protein (RKIP) has been considered as a suppressor of metastasis and a prognostic marker in several neoplasms. In the present study we aimed to examine whether RKIP expression is associated with GIST clinical pathological features. Using immunohistochemistry, we determined RKIP expression levels in a wellcharacterised series of 70 GISTs. We found that RKIP is expressed in the great majority of cases, and absent in approximately 9% of GISTs. Additionally, we found that loss of RKIP expression was not due to the promoter methylation as assessed by methylation-specific PCR. Loss of RKIP expression was associated with poor diseasespecific survival and with tumour necrosis in GISTs. Furthermore, a statistical tendency was observed between the positive RKIP expression and absence of metastasis. So far, this is the first study assessing RKIP expression levels in GISTs. We conclude that loss of RKIP expression could have an important role as prognostic marker in GISTs. Keywords RKIP. Expression. Survival. GISTs Introduction Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) are rare mesenchymal tumours of the digestive tract [1, 2]. Gain-offunction mutations in KIT and PDGFRA oncogenes have been identified in a great majority of GISTs and are considered to be one of the first molecular events in their pathogenesis [3, 4]. The tyrosine kinase inhibitor imatinib mesylate is the gold standard in the treatment of metastatic GISTs, leading up to 75% response rates [5]. Several studies have shown the importance of KIT and PDGFRA molecular status in imatinib response [6, 7]. Tumour size, location and mitotic index are the most important prognostic parameters of GISTs [8, 9]. Several authors have proven the usefulness of these and other classification parameters in GISTs clinical follow-up [10, 11]. Moreover, other studies have shown that molecular

124 278 Virchows Arch (2009) 455: genetic markers, such as the type of KIT and PDGFRA mutations, might also have prognostic value [12, 13]. However, a part of GISTs behave unpredictably leading to the need of screening new molecular prognostic markers. The MAP kinase (RAS/RAF/MEK/ERK) pathway, one of the KIT downstream cascades, is highly preserved and implicated in cell growth, differentiation, migration and survival [14]. Activated RTK phosphorylates RAS, which binds RAF-1 kinase that phosphorylates MEK1/2, leading to ERK1/2 activation. Phosphorylated ERKs translocates into nucleus and regulates gene expression through several transcription factors like c-myc, CREB and AP-1, ultimately leading to changes in gene expression [14]. Recently, we and others observed activation of this pathway in GISTs by presence of BRAF activating mutations [15, 16]. In addition, we described the absence of RAS mutations, and suggest that MAP kinase could also be activated through SCF/KIT autocrine/paracrine mechanisms in a subset of KIT/PDGFRA wild-type GISTs [16]. Raf kinase inhibitory protein (RKIP; also known as PEBP, for phosphatidylethanolamine-binding protein) was originally identified as an endogenous inhibitor of the RAS/ RAF/MEK/ERK pathway by interfering with the phosphorylation and activation of MEK by Raf-1 [17, 18]. Subsequently, RKIP was shown also to suppress the activation of the nuclear factor Kappa B (NFkB) cell survival pathway by blocking the inactivation of the inhibitor of NFkB, namely IkB [19]. In mammals, RKIP is also a negative regulator of G-protein coupled receptors [GPCRs] by inhibiting GRK-2 [20], and may be involved in regulating the partitioning of chromosomes and mitosis progression through RKIP binding to centrosomal and kinetochore regions of metaphase chromosomes [21]. The collective evidence indicates that RKIP regulates the activity and mediates the crosstalk between several important cellular signalling pathways including cell differentiation, cell cycle, apoptosis and cell migration. Attenuation of RKIP function is implicated in several human diseases, such as neurologic diseases and metastases in cancer [22, 23]. RKIP is a widely expressed and highly conserved protein [24 26], which is downregulated in several tumours, including highly metastatic prostate carcinoma, breast, colon and gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, melanoma, insulinoma and ovarian carcinoma [27 36]. Furthermore, RKIP is also a prognostic marker in prostate, colorectal and gastric carcinomas [34, 36 38]. The molecular mechanisms underlying RKIP downregulation in cancer is not yet fully understood. Some authors suggested RKIP promoter methylation as a potential RKIP silencing event [21, 39]. In the present study we aimed to clarify the role of RKIP in the prognosis of GISTs. Materials and methods Tissue samples Seventy formalin-fixed paraffin-embedded primary sporadic GISTs, classified according to WHO criteria and risk group [40], previously characterised immunohistochemically for CD117, actin, S100, desmin and CD34, and molecularly for KIT and PDGFRA mutations, were retrieved from the Pathology Department of S. João Hospital files ( ), Porto, Portugal [10, 41]. All patients were Caucasian and of Portuguese origin, with a mean age of 62.1 years (range 20 88). Thirty-six (51.4%) patients were female and 34 (48.6%) were male. Most frequent tumour location was gastric (n=40) and small intestine (n=23); other location were: colon (n=2), rectum (n=1), oesophagus (n=1) and omentum/mesentery (n=3). Three GIST patients with surgically resected tumours were treated with imatinib (400 mg daily, with escalation to 600 mg daily whenever indicated), because of tumour recurrence. Of these patients, two are alive with stable disease and one died due to the disease. Follow-up data was available in all patients, as at December 2007, and collected through direct interview with patients or their relatives, and by review of in-hospital patient files. The median follow-up time of patients was 54.1 months (range, 1 206). The diagnosis of metastases, including the two cases with very limited biopsy material, was based on definitive imagiological evidence obtained during the follow-up of the patients. Immunohistochemistry analysis for RKIP Representative 3-µm thick sections were subjected to immunohistochemical analysis according to the streptavidin biotin peroxidase complex system (UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP; Lab Vision Corporation). Briefly, deparaffinised and rehydrated slides were submitted to heat-induced antigen retrieval for 20 min at 98 C with 10 mm citrate buffer (ph6.0). After incubation with the primary antibodies raised against RKIP (dilution 1:600; incubation 2 h at RT; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), the secondary biotinylated goat anti-polyvalent antibody was applied for 10 min followed by incubation with the streptavidin peroxidase complex. The immune reaction was visualised by 3,3 -diamonobenzidine as a chromogen. All sections were counterstained with Gill-2 haematoxylin. For negative controls, primary antibody was replaced by a universal negative control antibody (CEA, rabbit anti-human, DAKO Corporation, Carpinteria, CA). A prostate carcinoma was used as positive control. Tumour samples were evaluated for both extension and intensity of the immunoreactions. The score used was the

125 Virchows Arch (2009) 455: sum of the percentage of positive cells (0, negative; 1, less than 25% positive cells; 2, 26% to 50% positive cells and 3, more than 50% positive cells) and the staining intensity (0, negative; 1, weak; 2, moderate and 3, strong). Scores between 0 and 2 were classified as negative, 3 and 4 as moderate positive and 5 and 6 as strongly positive. DNA isolation Selected areas contained at least 85% of tumour tissue were macrodissected into a microfuge tube using a sterile needle (Neolus, 25G-0.5 mm) and DNA isolation was performed using Qiagen s QIAamp DNA Micro Kit, as previously described [42]. Methylation analysis of RKIP promoter DNA methylation pattern in the promoter region of the RKIP gene was determined by methylation-specific PCR (MSP), as previously described [39] with some modifications. Briefly, bisulphite treatment of 200 ng DNA was done using EZ DNA Methylation Golf Kit (Zymo Research Corporation, USA) according to the manufactures instructions. The PCR was carried out in a total volume of 15µl, consisting of 1µl of bisulphite modified DNA, 0.2µM of both sense and anti-sense primers (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany), 200µM of dntps (Fermentas, USA), 1,5 mm of MgCl2 (Bioron, Germany), 1 Taq Buffer incomplete (Bioron, Germany) and 1 U of Taq Superhot DNA Polymerase (Bioron, Germany). The reaction consisted of an initial denaturation at 95 C for 10 min, followed by 40 cycles with denaturation at 95 C for 30 s, annealing at C for 30 s and extension at 72 C for 30 s, followed by a final extension for 10 min at 72 C, in a Thermocycler (BioRad). To MSP reaction, were used specific primers to distinguish methylated DNA (204 bp PCR product) from unmethylated DNA (205 bp PCR product), as described [39]. CpGenome Universal Methylated DNA (Chemicon International, USA) was used as methylated control. Blood DNA of a young healthy individual was used as unmethylated control. Statistical analysis The available clinical pathological and immunohistochemistry data were analysed with SPSS software for Windows, Fig. 1 Immunohistochemistry analysis of RKIP in GISTs. a Weak expression ( 200), b strong expression ( 200), c negative expression ( 200), d positive expression of RKIP in normal adjacent tissue ( 200)

126 280 Virchows Arch (2009) 455: Fig. 2 Agarose gel (2%) showing MSP result for methylation analysis of RKIP gene in the two cases with RKIP loss of expression (G30 and G60). Un unmethylated, M methylated, L 100 bp ladder version Correlations between categorical variables were performed using Fischer s exact test. Disease-specific survival (DSS) was calculated from the time of diagnosis until death related with the disease, or censored at the time of latest follow-up, as described [10]. Cumulative survival probabilities were calculated using the Kaplan Meier method. Differences between survival rates were tested with the log-rank test. p value inferior to 0.05 was considered significant. Table 1 Association between RKIP expression and clinical pathological parameters in GISTs (n=70) Parameter RKIP expression N Negative (%) Positive (%) p a N number of cases, HPF high power field ( 400) *p<0.05, statistically significant values a Fischer s exact test b One case low and one case intermediate risk c Log-rank test CD117 expression Negative 6 2 (33.3) 4 (66.7) Positive 64 4 (6.3) 60 (93.7) KIT/PDGFRA mutations Mutant 44 4 (9.1) 40 (90.9) Wild-type 26 2 (7.7) 24 (92.3) Age (years) (6.7) 28 (93.3) > (10) 36 (90) Gender Male 34 3 (8.8) 31 (91.2) Female 36 3 (8.3) 33 (91.7) Tumour local Small intestine 23 0 (0) 23 (100) Gastric 40 4 (10) 36 (90) Other 7 2 (28.6) 5 (71.4) Risk grade Very low/low/intermediate 41 2 b (4.9) 39 (95.1) High 29 4 (13.8) 25 (86.2) Cellular morphology Spindle 45 4 (8.9) 41 (91.1) Epithelioid 8 0 (0) 8 (100) Mixed 17 2 (11.8) 15 (88.2) Tumour size (cm) (3.4) 28 (96.6) >5 to (8.7) 21 (91.3) > (16.7) 15 (83.3) Mitotic index (50/HPF) (6) 47 (94) > (15) 17 (85) Necrosis Absent 29 0 (0) 29 (100) 0.038* Present 41 6 (14.6) 35 (85.4) Metastasis Absent 58 3 (5.2) 55 (94.8) Present 12 3 (25) 9 (75) Mean survival time (months ± SD) ± ± * c