INDUÇÃO DE MÚLTIPLOS BROTOS DA CULTIVAR DE ALGODÃO BRS-VERDE. * Julita Maria Frota Chagas Carvalho (Embrapa Algodão / julita@cnpa.embrapa.br), Nara Wanderley Pimentel (UEPB), Lívia Wanderley Pimentel (UFPB), Priscila Simone Ribeiro Aires (UEPB), Wellingthon dos Santos (Embrapa Algodão), Roseane Cavalcantidos Santos (Embrapa Algodão) RESUMO - A micropropagação oferece condições para obter plantas de difícil propagação em menor espaço de tempo comparado ao melhoramento convencional. Uma das metodologias empregadas no processo de cultivo de tecidos e micropropagação é o superbrotamento com o qual, a partir de um explante cultivado em condições ideais, possam ser obtidas várias plantas geneticamente idênticas à plântula matriz. Propôs-se neste trabalho induzir a formação de múltiplos brotos no algodão BRS- Verde, determinando o melhor tratamento suplementado com os fitorreguladores (BAP) e (KIN), no explante nó cotiledonar. Na desinfestação das sementes fez-se uso de soluções de hipoclorito de sódio a 1% de cloro ativo. Na indução de múltiplos brotos, utilizou-se sais do meio Murashige e Skoog suplementado com combinações de BAP e KIN nas concentrações 0,0; 1,5; 2,5; 3,0; 3,5 mg.l -1, em 10 frascos, cada um contendo três explantes em um delineamento inteiramente casualizado. As avaliações foram realizadas após 60 dias de cultivo, analisando-se o número de brotos por explante. Constatou-se que a melhor combinação foi a de 1,5 mg.l -1 de BAP com 1,5 mg.l -1 de KIN, por ter proporcionado boa capacidade organogênica, alcançando, no explante nó cotiledonar, a média com 4,53 brotos, estatisticamente semelhante à combinação 1,5 mg.l -1 de BAP com 2,5 mg.l -1 de KIN. Verificou-se que o BAP e o KIN foram eficazes na indução do superbrotamnto. Palavras-chave: micropropagação, algodão, citocinina. INTRODUÇÃO No semi-árido nordestino o algodoeiro é uma das plantas mais cultivadas pelo homem, tendo em vista sua fibra. O aproveitamento da planta do algodão (Gossypium spp.) é um dos mais completos, haja vista que dos seus subprodutos são utilizados o óleo, o línter, a farinha de torta e a casca, todos extraídos da semente ou do caroço. No setor agropecuário o algodão está entre as dez maiores fontes de riqueza. A cultura in vitro compreende a cultura de células, tecidos ou órgãos, em condições de assepsia e meios de cultura artificiais (contendo compostos como água, sais minerais, vitaminas, fonte de carbono e reguladores de crescimento). O aspecto mais relevante da cultura de tecidos está na área de multiplicação de plantas, conhecida como micropropagação ou propagação clonal, vista que os indivíduos produzidos são geneticamente idênticos (RAVEN et al., 2001); desta forma, uma das metodologias empregadas na micropropagação e organogênese é o superbrotamento com o qual, a partir de um único explante cultivado nas condições ideais, possam ser obtidas várias plantas geneticamente idênticas às da plântula matriz e em menor espaço de tempo. * Embrapa Algodão Campina Grande -PB
Segundo Alves (2004), o processo de organogênese é complexo, com atuação de múltiplos fatores externos e internos envolvendo interação entre fonte de explante, meio de cultura e fatores do ambiente, dependendo também da ação de reguladores de crescimento exógenos, em particular auxinas e citocininas e da habilidade do tecido em responder a essas mudanças hormonais, durante o período de cultivo (SUGIYAMA, 1999). O objetivo deste trabalho foi induzir a formação de múltiplos brotos do algodão BRS-Verde, determinando o melhor tratamento suplementado com as citocininas 6-benzilaminopurina (BAP) e cinetina (KIN), no explante nó cotiledonar. MATERIAL E MÉTODOS Para desinfecção das sementes do algodão BRS-Verde, foram lavadas as sementes, que em seguida foram imersas em solução de hipoclorito de sódio a 1% de cloro ativo e adicionado 1 ml de Tween 20 para cada 100 ml de solução, durante 20 minutos em agitação seguida de lavagem tripla em água deionizada esterilizada. Na obtenção da planta matriz as sementes foram inoculadas em meio de Murashige e Skoog, 1962 (MS) suplementado com 30 g.l -1 de glucose e 0,55% de ágar e o ph ajustado para 5,7 antes da autoclavagem a 120ºC; em seguida, os tubos de ensaio foram fechados com papel alumínio e vedados com fitafilme. As culturas foram incubadas no escuro durante 48-72 horas e mantidas na câmara de crescimento por 15 dias a 25±2ºC, sob fotoperíodo de 16h luz e intensidade luminosa de 30 µmol.m -2 s -1, até a obtenção da planta matriz. Na câmara de fluxo laminar e com o auxílio de instrumentos cirúrgicos esterilizados, os explantes foram separados e excisados e, em seguida, inoculados em frascos contendo sais do meio básico MS com adição de 10 ml cloreto de magnésio (MgCl2), suplementados com as seguintes combinações das citocininas: 6-benzilaminopurina (BAP) e cinetina (KIN), conforme os tratamentos: T0 (0,0 mg.l -1 BAP + 0,0 mg.l -1 KIN); T1 (1,5 mg.l -1 BAP + 1,5 mg.l -1 KIN); T2 (1,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l - 1 KIN); T3 (2,5 mg.l -1 BAP + 1,5 mg.l -1 KIN); T4 (2,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN); T5 (2,5 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN); T6 (3,0 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN; T7 (3,0 mg.l -1 BAP + 3,5 mg.l -1 KIN); T8 (3,5 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN). Todos os meios foram suplementados com sacarose a 3% e phytagel a 0,5% e o ph ajustado para 5,8 antes da autoclavagem, a 120ºC. Em todos os casos, a incubação foi mantida a 25± 2ºC, com fotoperíodo de 16h luz e intensidade luminosa de 30 µmol.m -2 s -1. Utilizaramse 10 frascos por tratamento, contendo três explantes cada um. A cada 20 dias os explantes foram transferidos em condições de câmara de fluxo laminar para meios frescos, a fim de se evitar problemas de oxidação. A avaliação foi realizada após 60 dias de cultivo, analisando-se os explantes que superbrotaram e os números de brotos por explante (NBE). O delineamento usado foi o inteiramente casualizado, cujos dados foram analisados mediante o procedimento General Liner Model (GLM) do SAS (2000), version 8.2, e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados das médias alcançadas na indução de número de brotos por explante (NBE) para todas as concentrações utilizadas no explante nó cotiledonar, estão apresentados na Tabela 1, na qual se constata que o T0 não foi responsivo à indução de multibrotações, Figura 1A. Três tratamentos se destacaram o T1 com média de 4,53 brotos por explante, Figura 1B, o T2 com média de 5,19 brotos por explante, Figura 1C, e o tratamento T4 com média de 4,16 brotos por explantes. Os tratamento T1 (1,5 mg.l -1 BAP + 1,5 mg.l -1 KIN), T2 (1,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN) e T4 (2,5 mg.l -1 BAP + 2,5
mg.l -1 KIN) não diferiram estatísticamente e, portanto, o primeiro deve representar o melhor tratamento que proporcionou boa capacidade organogênica em virtude da menor quantidade do fitorregulador cinetina requerida. Os demais tratamentos, T3, T5, T6, T7 e T8, não proporcionaram estímulos satisfatórios na indução de múltiplos brotos. Observa-se que utilizando combinações das citocininas BAP e KIN, obtêm-se resultados favoráveis. Tavares et al., (2005) induzindo a multibrotação in vitro a partir de gemas cotiledonares da cultivar de algodão CNPA 98-1034 com diferentes concentrações de BAP e KIN, concluiram que as combinações de 2,5 mg.l -1 de BAP + 1,0 mg.l -1 de KIN favoreceram o maior superbrotamento. Carvalho et al., (2000), empregando as mesmas citocininas, notaram que o KIN não induziu a formação de brotos, mas só o BAP ou este associado ao KIN induziu superbrotamento. De acordo com os resultados aqui obtidos, percebe-se que a qualidade do explante, o tipo de fitorregulador e as concentrações e combinações utilizadas, desempenham papel fundamental na formação e multiplicação dos brotos, interferindo na variabilidade, integridade e multiplicação do genótipo de algodão utilizado. Tabela 1. Valores médios da variável número de brotos por explante (NBE), com relação ao explante nó cotiledonar do algodão BRS-Verde, induzido por diferentes concentrações BAP e KIN. Tratamentos T0 - (0,0 mg.l -1 BAP + 0,0 mg.l -1 KIN) T1 - (1,5 mg.l -1 BAP + 1,5 mg.l -1 KIN) T2 - (1,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN) T3 - (2,5 mg.l -1 BAP + 1,5 mg.l -1 KIN) T4 - (2,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN) T5 - (2,5 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN) T6 - (3,0 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN T7 - (3,0 mg.l -1 BAP + 3,5 mg.l -1 KIN); T8 - (3,5 mg.l -1 BAP + 3,0 mg.l -1 KIN) Número de brotos por explante (NBE) / médias 1,06 f 4,53 ab 5,19 a 3,49 dc 4,16 bc 2,79 de 3,39 dc 2,39 e 2,79 de Ftratamento 42,64 ** Cv% 18,05 Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade **Significativo (p < 0,01) pelo teste F
Figura 1. Indução de organogênese do genótipo de algodão BRS-Verde, no explante nó cotiledonar. A) Tratamento T0 (controle). B) Multibrotação obtida no tratamento T1 (1,5 mg.l -1 BAP + 1,5 mg.l -1 KIN). C) Multibrotação obtida no tratamento T1 (1,5 mg.l -1 BAP + 2,5 mg.l -1 KIN). CONCLUSÕES As combinações das citocininas 6-benzilaminopurina (BAP) e cinetina (KIN), induzem a formação de múltiplos brotos no explante nó cotiledonar. As concentrações de 1,5 mg.l -1 de BAP e 2,5 mg.l -1 de KIN proporcionaram satisfatória proliferação de múltiplos brotos. As concentrações de 1,5 mg.l -1 de BAP e 1,5 mg.l -1 de KIN representam o melhor tratamento que proporcionou boa capacidade organogênica em virtude da menor quantidade do cinetina utilizada. CONTRIBUIÇÃO PRÁTICA E CIENTÍFICA DO TRABALHO A necessidade de maximizar o número de plantas regeneradas de algodão com a manutenção da fidelidade genética, contribuiu para uma ampla diversificação das condições do cultivo in vitro, tanto para desenvolver novas cultivares como para fornecer outras alternativas para programas de melhoramento genético.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, E. C. S. de C.; XAVIER, A.; OTONI, W. C. Organogênese de explante foliar de clones de eucalyptus grandis x e. urophylla. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 39, n. 5, p. 421-430, 2004. CARVALHO, J.M.F.C.; SOUZA, D.M. de; SANTOS, J.W. dos. Indução de superbrotamento e regeneração de planta in vitro na cultivar de algodão CNPA 7H. Revista de Oleoginosas e Fibrosas. v.4, n.2, p. 61-65,2000. MURASHIGE, T. SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, v.5, p 473-497. 1962. SAS / STAT User s Guide In: SAS INSTITUTE. SAS Online doc: version 8.2. Cary, 2000. CD - ROM SUGIYAMA, M. Organogenesis in vitro. Current Opinion in Plant Biology, v. 2, p. 61-64, 1999 TAVARES, A.C.; M.; PINHEIRO, M.P.N.; JERÔNIMO, J.F.; CARVALHO, J.M.F.; VIDAL, M.S. Indução de multibrotações in vitro, a partir de gemas cotiledonares de algodão (Gossypium hirsutum L.) da cultivar CNPA 98-1034. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ALGODÃO, 5., 2005, Salvador BA. Anais...Campina Grande: Embrapa Algodão,, 2005.p.11.