Lesões primárias e recidivantes do tumor. odontogênico queratocístico e cisto odontogênico. ortoqueratinizado: casuística e análise histoquímica,

MARCELI MOÇO SILVA Lesões primárias e recidivantes do tumor odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: casuística e análise histoquímica, imuno-histoquímica da proliferação celular e citoqueratinas ARAÇATUBA - SP 2010 1

MARCELI MOÇO SILVA Lesões primárias e recidivantes do tumor odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: casuística e análise histoquímica, imuno-histoquímica da proliferação celular e citoqueratinas Tese apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba Unesp, para a obtenção do grau de Doutor em Odontologia Área de concentração Estomatologia. Orientador: Prof. Adj. Marcelo Macedo Crivelini Co-Orientador: Prof. Dr. Gilberto Aparecido Coclete ARAÇATUBA - SP 2010 2

MARCELI MOÇO SILVA COMISSÃO JULGADORA TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR Presidente...: Dr. Marcelo Macedo Crivelini 2º Examinador...: Dr. Alessandra Marcondes Aranega 3º Examinador...: Dr. Glauco Issamu Miyahara 4º Examinador...: Dr. Luiz Eduardo Blumer Rosa 5º Examinador...: Dr. Décio Dos Santos Pinto Júnior Araçatuba, 20 de outubro de 2010 3

DADOS CURRICULARES MARCELI MOÇO SILVA NASCIMENTO... 23 de outubro de 1980 FILIAÇÃO... João Marcelo Silva Arlete Rodrigues Moço Silva 2000 2004... Curso de Graduação em Odontologia Faculdades Adamantinenses Integradas - FAI 2005 2006... Curso de Mestrado, Programa de Pós-graduação em Odontologia Área de concentração Estomatologia, Faculdade de Odontologia de Araçatuba UNESP. 2008-2009... Curso de Especialização, Programa de Pósgraduação em Odontologia Área de concentração Patologia Bucal, Faculdade São Leopoldo Mandic Campinas SP. 2008 - Atual... Curso de Doutorado, Programa de Pósgraduação em Odontologia Área de concentração Estomatologia, Faculdade de Odontologia de Araçatuba UNESP. 4

Dedicatória AO MEU NAMORIDO Luiz Fernando Bocchi, pela presença constante, apoio, carinho, amor e compreensão em todos os momentos da minha vida, te amo muito! AOS MEUS PAIS Arlete e João Marcelo, pela dedicação, exemplo de vida e incentivo, visando a minha formação, a realização dos meus sonhos e a minha felicidade. AOS MEUS IRMÃOS E SOBRINHOS Mirela, João Marcelo, Anderson, Luan, Kelton, Mariana e Lívia, por todo o apoio e alegria. AOS MEUS PRIMOS Belmiro (Junior), Rose, Sabrina (Bina), Luciano, Patrícia (Paty) e Eduardo (Du) que foram além de primos grandes amigos, sempre me dando força, me ajudando e me cuidando durante esses anos que fiquei longe de casa. 5

Agradecimentos especiais DEUS Pela minha existência, porque nada nos é possível se não for de sua vontade. AO MEU ORIENTADOR Marcelo Macedo Crivelini, que com determinação, seriedade, paciência, competência e vasto conhecimento, contagiou e possibilitou o meu desenvolvimento cientifico, bem como o desenvolvimento deste trabalho. AO MEU CO-ORIENTADOR Gilberto Aparecido Coclete, que com alegria, entusiasmo e sabedoria possibilitou o meu desenvolvimento científico. AO PROFESSOR Alvimar Lima de Castro, por seus ensinamentos e conselhos, os quais foram fundamentais para a minha formação. 6

Agradecimentos FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA DA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP Na pessoa de seu atual diretor Prof. Dr. Pedro Felício Estrada Bernabé e vice-diretora Prof. a Dr. a Ana Maria Pires Soubhia pela oportunidade de realização do curso de Doutorado e pela disponibilidade de todas as instalações a mim proporcionadas. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA A todo o corpo docente pelos ensinamentos transmitidos. DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E PROPEDEUTICA CLÍNICA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA A todas as pessoas do departamento especialmente, Prof. Dr. Alvimar Lima de Castro, Prof. a Dr. a Ana Maria Pires Soubhia, Prof. Dr. Marcelo Macedo Crivelini, Prof. Dr. Gilberto Aparecido Coclete, Prof. a Dr. a Renata Callestini Felipini, Prof. Dr. Norberto Perri Moraes, Prof. Dr. Eder Ricardo Biasoli, Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara, Prof. Dr. Elerson Gaetti Jardim Junior, Prof. a Dr. a Leda Maria Pescinini Salzedas, Prof. a Dr. a Ana Cláudia Okamoto, a Sr. a Marli B. dos Santos, Sr. José Marcelo Tramarin, Sr. a Miriam Regina Mouro Ferraz Lima, Sr. a Elaine C.F. Ferreira, Sr. a Maria Aparecida M. da Silva, Sr. a Luzia M.O. Francischini, Sr. a Katsuko Aparecida Anze Inoue, Sr. Robson Varlei Ranieri pelo apoio e disponibilização de recursos pessoais e materiais para realização dos procedimentos clínicos e laboratoriais que envolveram este projeto e principalmente pela convivência carinhosa e atenciosa que me dispensam. AOS AMIGOS Elaine C.F. Ferreira, José Marcelo Tramarin e Luzia M.O. Francischini que gentilmente se dispuseram a ajudar neste trabalho. 7

A Prof. a Dr. a Maria Lúcia Marçal Mazza Sundefeld Pela paciência e ajuda destinada a estatística deste trabalho. FUNCIONÁRIOS DA SEÇÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA Sr. a Valéria Q.M. Zagatto, Sr. a Marina M.S. Kawagoe e Sr. Diogo Reatto pela presteza e paciência nas corretas orientações. BIBLIOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA Às funcionárias da Biblioteca do Câmpus de Araçatuba, Ana Cláudia M.G. Manzatti, Cláudia S. Frare, Cláudio H. Matsumoto, Isabel Pereira de Matos, Ivone R.L. Munhoz, Izamar S. Freitas, Luzia Anderlini, Maria Cláudia de C Benez, pela boa vontade e competência no atendimento ao público, além da amizade consolidada nesses anos de convivência em que freqüentei a biblioteca. AS MAIS NOVAS AMIGAS Melaine de Almeida Lawall, Claudia Misue Kanno pela amizade, incentivo e colaboração neste trabalho. AOS AMIGOS DA PÓS GRADUAÇÃO Antonio Carlos Marqueti, Lívia Trevelin Arede, Francisco I.N. Ciesielski, Leandro T. Kawata, Daniel Galera Bernabé, Éloa Luvizuto, Ellen Cristina Gaetti Jardim pela oportunidade de convivência e pelos sonhos compartilhados. AOS ALUNOS DO CURSO DE GRADUAÇÃO Pelo respeito, credibilidade e confiança depositados aos alunos da pósgraduação, permitindo-nos realizar nosso grande sonho de atividade acadêmica. 8

À FACULDADE SÃO LEOPOLDO MANDIC Prof. a Dr. a Cristiane Furuse, Prof. a Dr. a Vera Cavalcanti de Araujo, Prof. a Dr. a Regina Garcia Dorta e as funcionárias Jerusa Pinheiro, Audrey Jordão Basso e Nadir S. de Freitas, pelo apoio e disposição em responder as dúvidas laboratoriais quando solicitado. À PREFEITURA MUNICIPAL DE LUCÉLIA E PREFEITURA MUNICIPAL DE OSVALDO CRUZ Nas pessoas dos seus respectivos Prefeitos Sr. João Pedro Morandi e Sr. Valter Luiz Martins e coordenadores de saúde bucal Dr. Eugênio Pardo, Dr. Marco Aurélio Canevare e Dr. a Lucia Helena Delia, pela colaboração para realização deste. Á FACULDADES ADAMANTINENSES INTEGRADAS Na pessoa do Coordenador do curso de Odontologia Dr. Jean Paulo Rodolfo Ferreira e seu Diretor Geral Dr. Roldão Simione. À BIOGEN Na pessoa da Sr. Frances Roveri Marques pelo apoio e colaboração na elaboração da parte laboratorial. À FUNDUNESP - Pelo auxílio financeiro prestado (Processo nº 00286/2009-DFP). A CADA PACIENTE Que, por compartilhar sua história, sofrimento e esperança motivaram-me a continuar na busca do conhecimento sem perder em momento algum a benevolência e o amor a vida. 9

Quais são meus alicerces intelectuais? Serão os meus sucessos, o reconhecimento da teoria e seu uso em teses de mestrado e doutorado? Não! Meus alicerces são as dores que passei, as inseguranças que vivenciei, as angústias que sofri e a superação do meu caos... Augusto Cury 10

Silva MM. Lesões primárias e recidivantes do tumor odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: casuística e análise histoquímica, imunohistoquímica da proliferação celular e citoqueratinas [tese]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2010. RESUMO O queratocisto odontogênico paraqueratinizado foi recentemente reclassificado pela Organização Mundial de Saúde como tumor odontogênico queracístico (TOQ), sendo atualmente considerado uma neoplasia benigna com alta atividade proliferativa e marcada tendência à recidiva. O cisto odontogênico ortoqueratinizado (COO) ainda é classificado como cisto odontogênico, pois apresenta um crescimento mais lento e ausência de recidivas. A opção por um tratamento mais radical ou mais conservador para estas lesões depende destas variações microscópicas. Uma vez que microscopicamente ambas as lesões possuem algumas características em comum, é de interesse clínico e científico o estudo aprofundado delas, incluindo as suas casuísticas. O presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo da casuística, histoquímico com AgNOR e imuno-histoquímica com marcadores de proliferação celular (PCNA, Ki-67 e P53) e citoqueratinas (K7, K10-13, K15, K18 e K19) dos casos de TOQ, recidivas desta lesão e COO diagnosticados no Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Com base nos resultados observados e nas condições em que o trabalho foi desenvolvido, concluiu-se que a maior parte dos TOQs e todos COOs ocorreram preferencialmente em pacientes jovens da raça branca, com lesões assintomáticas, radiolúcidas uniloculares, localizadas principalmente na região posterior de mandíbula. Quanto ao comportamento clínico e características imuno-histoquímicas, o TOQ apresentou maior proliferação celular em relação ao COO, condizente com sua suposta natureza neoplásica, com destaque aos casos com história de recidiva, que apresentaram quantidade maior de células Ki-67 positivas. Palavras-chave: Cistos odontogênicos. Tumores odontogênicos. Queratinas. Proliferação de células. Imunoistoquímica. 11

Silva MM. Primary and recurrent lesions of keratocystic odontogenic tumor and orthokeratinized odontogenic cyst: casuistics and histochemicalimmunohistochemical analysis of cell proliferation and cytokeratins. [tese]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2010. ABSTRACT The odontogenic keratocyst was recently reclassified by the World Health Organization as a keratocystic odontogenic tumor (KCOT), being currently considered a benign neoplasia with high proliferative activity and a marked tendency to recur. The orthokeratinized odontogenic cyst (OOC) is still classified as an odontogenic cyst, since it shows slower growth and no recurrence. Opting for a more radical or more conservative treatment for those lesions depends on those microscopic variations. Once microscopically those lesions have some common features, it is of clinical and scientific interest to study them in depth, including their casuistics. This study aimed to analyze the casuistics of KCOTs, of the recurrences of those lesions, and od OOC diagnosed at the Pathology Laboratory of Araçatuba Dental School, UNESP, as well as to conduct histochemical characterization of those lesions with AgNOR and immunohistochemical analysis with cell proliferation markers (PCNA, Ki-67 and P53) and cytokeratins (K7, K10-13, K14, K18 and K19). Based on the results observed and on the conditions under which the study was carried out, it was concluded that most KCOTs and OOCs occurred preferentially in young white patients, with asymptomatic radiolucent unilocular lesions, located mainly in the posterior mandible. As for the clinical and immunohistochemical features, KCOTs showed greater cell proliferation as compared to OOCs, consistent with their supposed neoplastic nature, especially in the cases with history of recurrence, which showed larger amount of positive Ki-67 cells. Keywords: Odontogenic cysts. Odontogenic tumors. Keratins. Cell Proliferation. Immunohistochemistry. 12

LISTA DE FIGURAS Figura 1 TOQ evidenciando os AgNORs dentro dos núcleos celulares como pontos acastanhados escuros, exibindo principalmente forma arredondada ou ovalada, variando em número e área (AgNOR X1000). 46 Figura 2 Expressão imuno-histoquímica no TOQ evidenciando positividade para PCNA na camada basal e suprabasal (Streptavidina-biotina X400). 48 Figura 3 Expressão imuno-histoquímica no TOQ sem recidiva evidenciando ausência de positividade para Ki-67 (Streptavidina-biotina X400). 48 Figura 4 Expressão imuno-histoquímica do TOQ com recidiva evidenciando positividade para Ki-67 na camada basal e suprabasal (Streptavidina-biotina X400). 49 Figura 5 Expressão imuno-histoquímica do TOQ com recidiva evidenciando positividade para K14 na camada basal (Streptavidina-biotina X400). 49 Figura 6 Expressão imuno-histoquímica do TOQ com recidiva evidenciando positividade para K10-13 nas camadas superiores (Streptavidinabiotina X400). 50 13

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo sexo e raça (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo faixa etária de idade no momento do diagnóstico (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo a sintomatologia (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo a localização e aspectos radiográficos da lesão (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). Diagnósticos clínicos citados nos casos de TOQ e COO (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). Número e porcentagem de pacientes acometidos por recidiva de TOQ*, segundo tempo decorrido para o diagnóstico da recidiva após o tratamento inicial (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). TOQs e COOs: média geral por grupo do número de AgNORs e média da área das AgNORs nas camadas basal e suprabasal do epitélio. 26 27 27 28 29 29 47 14

LISTA DE QUADROS Quadro 1 Anticorpos monoclonais que foram utilizados, com tempo de 45 incubação de 60 minutos em temperatura ambiente. Quadro 2 Marcação imuno-histoquímica* dos TOQs e COOs com os anticorpo PCNA, Ki-67, P53, K7, K10-13, K14, K18, K19. 50 15

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % Porcentagem µm P16 COO g ml Micrômetro (miléssima parte do milímetro) Proteína P16 Cisto Odontogênico Ortoqueratinizado Gramas Mililitro ºC Graus Celsius OMS P53 PATCH Organização Mundial de Saúde Proteína codificada P53 Gene patched que é homologo ao seguimento polarizado da drosófila H.E. X NOR Hematoxilina e eosina Vezes Regiões de organização nucleolar (do inglês Nuclear Organization Regions) PCNA Antígeno de proliferação nuclear celular (do inglês Proliferation Cell Nuclear Antigen) Ki-67 p53 SCNB SP TOQ Antígeno Ki-67 Gene p53 Síndrome do Carcinoma Nevóide Basocelular São Paulo Tumor Odontogênico Queratocístico 16

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL 18 2 CAPÍTULO 1 Lesões primárias e recidivantes do tumor 20 odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: casuística da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. 2.1 Resumo 20 2.2 Abstract 21 2.3 Introdução 22 2.4 Proposição 24 2.5 Material e Método 25 2.6 Resultado 26 2.7 Discussão 30 2.8 Conclusão 33 2.9 Referências 34 3 CAPÍTULO 2 - Lesões primárias e recidivantes do tumor 38 odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: análise histoquímica, imuno-histoquímica da proliferação celular e citoqueratinas. 3.1 Resumo 38 3.2 Abstract 39 3.3 Introdução 40 3.4 Proposição 42 3.5 Material e Método 43 3.6 Resultado 46 3.7 Discussão 51 3.8 Conclusão 56 3.9 Referências 57 ANEXOS 61 17

1 INTRODUÇÃO GERAL O tumor odontogênico queratocístico (TOQ) e o cisto odontogênico ortoqueratinizado (COO) são doenças distintas que possuem características clínicas e histopatológicas importantes em comum. Por exemplo, ambas são exclusivas dos ossos maxilares, geralmente assintomáticas, e quando atingem grandes proporções podem apresentar dor e/ou tumefação (BARNES et al., 2005). O aspecto radiográfico é uni ou multilocular e a histopatologia descreve uma estrutura cística revestida por epitélio escamoso com conteúdo de queratina (CHOW, 1998; LI et al., 1998; SILVA et al., 2008; TSUKAMOTO et al., 2001). Porém, a história clínica, prognóstico e tratamento podem diferir substancialmente, especialmente porque o TOQ apresenta alta taxa de recidiva e associação com a síndrome de Gorlin. Por este motivo estudos comparativos entre ambas devem ser estimulados e não se limitarem a poucos trabalhos publicados. O TOQ (ou queratocisto) é atualmente considerado uma neoplasia cística intra-óssea, apesar de existir controvérsia. Recentemente foi reclassificado de cisto para tumor pela Organização Mundial de Saúde (AGARAM et al., 2004; BARNES et al., 2005). Esta reclassificação teve como base a alta atividade proliferativa celular, o comportamento biológico localmente agressivo, o alto índice de recidiva, e alterações no gene supressor de tumor PTCH (AGARAM et al., 2004; BARRETO et al. 2000; MADRAS, LAPOINTE, 2008). Sua característica histopatológica exibe epitélio estratificado pavimentoso paraqueratinizado fino de aspecto corrugado na superfície e camada basal distinta. A junção epitélio-conjuntivo é relativamente plana e a cápsula fibrosa não raro apresenta cistos filhos ou satélites. Aliado ao seu potencial de proliferação celular os cistos satélites seriam os prováveis causadores de recidiva após o tratamento (BARNES et al., 2005; CHOW, 1998; CROWLEY et al., 1992; REGEZI, 2002; SHEAR a,b, 2002). Conceitos anteriores que consideravam o TOQ uma lesão cística mostraram que 10 a 12% dos cistos odontogênicos de desenvolvimento eram queratocistos (NEVILLE et al. 1997). Tem sido descrita uma predileção do TOQ pelo sexo masculino, ocorrendo em pacientes de diversas idades. Os sítios mais comuns de acometimento são a porção posterior do corpo da mandíbula e o ramo da Referências anexo C 18

mandíbula. Quando presentes em maxila são mais frequentes em região de terceiro molar (MYOUNG et al. 2001). O COO exibe crescimento lento, taxa de recidiva praticamente nula, e continua pertencendo ao grupo dos cistos odontogênicos na classificação da OMS (BARNES et al., 2005). Possui revestimento epitelial estratificado pavimentoso ortoqueratinizado em toda a sua extensão, contendo camada granulosa notável e camada basal pouco evidente. Também apresenta interface plana com a cápsula conjuntiva, mas cistos satélites não são encontrados (MEARA et al., 1998; SILVA et al., 2002). Ambas as lesões apresentam etiologia obscura, e a histogênese provavelmente se relaciona com os remanescentes da lâmina dentária (MYOUNG et al., 2001; SHEAR 2002a,b; TSUKAMOTO et al., 2001). Recentemente sugeriu-se a associação do TOQ com alterações no gene PTCH (AGARAM et al., 2004; BARNES et al., 2005; BARRETO et al., 2000). As técnicas cirúrgicas utilizadas para o tratamento do TOQ e do COO variam de acordo com o tamanho da lesão e a região acometida. A excisão cirúrgica com curetagem óssea periférica ou osteotomia é o método preferido de tratamento, e o prognóstico em geral é favorável (MADRAS, LAPOINTE, 2008; MAURETTE et al., 2006). Considerando estas várias semelhanças e diferenças entre o TOQ e COO, é de interesse clínico e científico o aprimoramento do conhecimento de ambas. A presente pesquisa analisará comparativamente os seus dados clínicos e histopatológicos, com o diferencial de observar as recidivas dos TOQs e respectivos tumores primários, bem como a aplicação de um painel de coloração histoquímicaimuno-histoquímica para avaliar a atividade proliferativa dos epitélios patológicos e expressão das citoqueratinas. 19

2 CAPÍTULO 1 Lesões primárias e recidivantes do tumor odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: casuística da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba. 2.1 RESUMO Conhecimento - O tumor odontogênico queratocístico (TOQ) e o cisto odontogênico ortoqueratinizado (COO) são lesões de aspecto clínico semelhante caracterizados por lesão óssea normalmente unilocular na região posterior de mandíbula, mas diferem no seu comportamento biológico visto que, de acordo com OMS, respectivamente, um foi reclassificado de cisto odontogênico a tumor odontogênico e o outro continua fazendo parte dos cistos, uma vez que é de interesse clínico e científico o aprimoramento do conhecimento sobre as semelhanças e diferenças entre o TOQ e COO o objetivo deste trabalho foi realizar o levantamento da casuística dessas lesões. Métodos - A presente pesquisa realizou um levantamento da casuística dos casos diagnosticados no Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP, para comparar os dados clínicos, radiográficos, recidiva, proservação e tratamento. Resultados - Noventa e um casos foram diagnosticados como tumor odontogênico queratocístico, sendo quinze com recidiva e cinco casos como cisto odontogênico ortoqueratinizado. A maior parte dos TOQs e a totalidade dos COOs analisados ocorreram preferencialmente em pacientes jovens da raça branca, com lesões assintomáticas, radiolúcidas uniloculares, localizadas principalmente na região posterior de mandíbula. Os poucos casos com dor pertenceram exclusivamente ao grupo de TOQs, enquanto que a tumefação ocorreu em alguns TOQs sem história de recidiva, e em um caso de COO. Lesões recidivantes foram constatadas apenas nos TOQs, cujo diagnóstico ocorreu geralmente 01 ano após o tratamento inicial. Conclusão O TOQ e o COO ocorreram em região posterior de mandíbula de pacientes brancos e jovens. A recidiva foi observada apenas no TOQ e geralmente ocorreu 01 ano após o tratamento. Palavras-chave: cistos odontogênicos; tumores odontogênicos; queratinas; recidiva Normalização de acordo com Journal Of Oral Pathology Medidine (anexo B) 20

2.2 ABSTRACT Background - The keratocystic odontogenic tumor and the orthokeratinized odontogenic cyst are lesions characterized by similar clinical appearance, usually unilocular bone lesion in the posterior mandible, but they differ in their biological behavior. Thus the former was reclassified from odontogenic cyst to odontogenic tumor and the latter remains in the category of the cysts, according to the WHO. The improvement of scientific knowledge about the similarities and differences between KCOT and OOC is of great clinical interest therefore held the lifting of casuistic. Methods - This study consisted of a survey of the cases diagnosed at the Pathology Laboratory, Araçatuba Dental School, UNESP, to compare the clinical and radiographic data, recurrence, follow up and treatment. Results - Ninety-one cases were diagnosed as keratocystic odontogenic tumors, 15 of them with recurrence, and five cases as orthokeratinized odontogenic cysts. Most KCOTs and all OOCs analyzed occurred preferentially in young white patients, with asymptomatic radiolucent unilocular lesions located mainly in the posterior mandible. The few cases with pain belonged exclusively to KCOT group, while the swelling occurred in some KCOTs with no history of recurrence, and in one OOC case. Recurrent lesions were observed only in the KCOT group, and the diagnosis was usually 01 year after the initial treatment. Conclusion - KCOTs and OOCs occurred in the posterior mandible of young white patients. Recurrence was observed only in KCOT group and generally occurred 01 year after treatment. Keywords: odontogenic cysts; odontogenic tumors; keratin; recurrence 21

2.3 INTRODUÇÃO O tumor odontogênico queratocístico (TOQ) e o cisto odontogênico ortoqueratinizado (COO) são doenças distintas que possuem características clínicas e histopatológicas importantes em comum. Por exemplo, ambas são exclusivas dos ossos maxilares, geralmente assintomáticas, semelhantes na imagem radiográfica, e histopatologicamente estruturas císticas revestidas por epitélio escamoso com conteúdo de queratina. Porém, a história clínica, prognóstico e tratamento podem diferir substancialmente, especialmente porque o TOQ apresenta alta taxa de recidiva e associação com a síndrome de Gorlin-Goltz (1-5). O TOQ compreende aproximadamente 11% de todos os cistos dos maxilares (6,7). Ocorre em indivíduos em uma ampla faixa etária, sendo mais freqüente na 3 a e 4 a décadas de vida (8-10). Existe maior predisposição para o sexo masculino e a maioria afeta a região posterior da mandíbula (8,11). As características radiografias mostram uma lesão radiolúcida bem definida, que pode ser unilocular ou multilocular. Raramente provoca reabsorção radicular, mas pode causar deslocamento de dentes adjacentes ou projetar-se para os espaços interdentais, inter-radiculares ou medulares. Quando atinge grandes proporções pode não provocar expansão das corticais, porém, em alguns casos, pode levar a fratura patológica (5,9,10,12-16). Um quarto dos casos está associado a dente incluso (17), exigindo o diagnóstico diferencial com um cisto dentígero. Apesar de normalmente assintomático, é conhecido o comportamento clínico agressivo do TOQ. Pode apresentar invasão local, recidivando frequentemente após enucleação cirúrgica simples ou mesmo após tratamento mais extenso (18). Algumas lesões sofrem transformação maligna, dando origem a um carcinoma epidermóide (19,20). Quando associado à síndrome de Gorlin-Goltz, apresenta um potencial de destruição local e tendência à recidiva ainda maior quando comparado com o esporádico (12-14,16). Relatos recentes têm mostrado que TOQs com alta atividade proliferativa estão associados à expressão de genes inibidores da apoptose (9,10,21), ou perda de heterozigose do gene supressor tumoral PTCH (1,22). Referências conforme normas Journal of Oral Pathology & Medicine no Anexo B 22

Histopatologicamente o TOQ é revestido por um epitélio estratificado pavimentoso paraqueratinizado, composto por 5 a 8 camadas de células, exibindo aspecto ondulado na superfície e células basais cubóides dispostas em paliçada. A junção epitélio-conjuntivo é relativamente plana e o tecido conjuntivo adjacente (cápsula) geralmente é fibroso exibindo raras células inflamatórias. O epitélio pode mostrar brotamento da região basal para a cápsula e/ou a cápsula apresentar pequenos cistos denominados cistos filhos ou satélites (6,17), sendo estes os prováveis causadores de recidiva após o tratamento (2,9,10). O tratamento do TOQ pode ser realizado de modo conservador, através de marsupialização e curetagem ou aplicando-se técnicas radicais (18,23). A recidiva é menos frequente quanto mais radical é o tratamento, e ocorre comumente após 5 a 7 anos do tratamento inicial, mas há relatos de recidiva após 25 anos. Por este motivo são necessários 5 a 10 anos de proservação pós-operatória (18,24-26). O COO foi pela primeira vez descrito por Schultz em 1927 (27) como um cisto dermóide e em 1945 foi considerado por Philipsen (28) como um eventual tipo de queratocisto odontogênico. Em 1963, Pindborg e Hansen (29) mostraram as diferenças entre queratocisto odontogênico e COO. Em 1981, Wright (30) especificou seus aspectos clinicopatológicos, assegurando que o COO era uma entidade distinta de outros cistos odontogênicos, incluindo o TOQ. Depois disso, alguns estudos têm discutido a real natureza e classificação histopatológica do COO. Tem sido descrito como uma lesão solitária, normalmente pequena e não expansiva, radiolúcida e assintomática. Geralmente ocorre na região posterior da mandíbula, em pacientes brancos entre a quarta e quinta décadas de vida, sem predileção por sexo. Histopatologicamente possui revestimento epitelial estratificado pavimentoso ortoqueratinizado em toda a sua extensão, contendo camada granulosa notável e camada basal pouco evidente. O epitélio possui interface plana com a cápsula conjuntiva, e cistos satélites não são encontrados (31,32). O tratamento de eleição do COO é o cirúrgico, e praticamente não existem relatos de recidiva (3,11,30,32). 23

2.4 PROPOSIÇÃO Uma vez que é de interesse clínico e científico o aprimoramento do conhecimento sobre as semelhanças e diferenças entre o TOQ e COO, a presente pesquisa teve por objetivo: Realizar o levantamento da casuística dos casos diagnosticados no Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP; Comparar os dados clínicos, radiográficos, recidiva, proservação e tratamento. 24

2.5 MATERIAL E MÉTODO Este projeto tem a aprovação do comitê de ética em pesquisa envolvendo seres humanos (processo FOA 2008-01657). O levantamento dos casos baseou-se nos prontuários e fichas de requisição de exame histopatológico do Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP, no período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009. Em 19754 biopsias foram coletados dados referentes aos pacientes e às características das lesões, tais como: sexo, raça, faixa etária, sintomatologia, localização da lesão, características radiográficas, diagnóstico clínico, histórico de recidiva, e associação com a Síndrome de Gorlin-Goltz. Os casos foram divididos em 4 grupos: 1) TOQs sem recidiva; 2) TOQs primários com história de recidiva; 3) recidivas de TOQs (recidivas dos tumores do grupo 2) e; 4) COO. Foi feita análise descritiva dos dados apresentados em tabelas com frequências absolutas e percentuais. 25

2.6 RESULTADOS Foram encontrados 91 casos de TOQs, sendo 15 com história de recidiva, e 05 COOs. Apenas dois TOQs associaram-se à Síndrome de Gorlin-Goltz, sendo que nenhum deles apresentou história de recidiva. Os principais dados clínicos e características das lesões estão ilustrados nas tabelas de 1 a 6. O tratamento consistiu em enucleação cirúrgica e curetagem óssea simples, sem adotar outros procedimentos trans-operatórios complementares. Tabela 1 - Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo sexo Sexo e raça (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). TOQs sem recidiva % TOQs primários com história de recidiva % Recidivas de TOQs % COO % Masculino 39 51,3 9 60 9 60 3 60 Feminino 37 48,7 6 40 6 40 2 40 Raça Branca 71 93,4 14 93,3 14 93,3 5 100 Negra 4 5,3 1 6,7 1 6,7 0 0 Amarela 1 1,3 0 0 0 0 0 0 TOTAL 76 100 15 100 15 100 5 100 26

Tabela 2 - Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo faixa etária de idade no momento do diagnóstico (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). TOQs sem recidiva % TOQs primários com história de recidiva % Recidivas de TOQs % COO % Faixa etária em anos 0 aos 10 3 3,9 1 6,7 0 0 0 0 11 aos 20 19 25 1 6,7 2 13,3 2 40 21 aos 30 25 32,9 7 46,6 6 40 1 20 31 aos 40 7 9,3 2 13,3 3 20 1 20 41 aos 50 11 14,5 0 0 0 0 0 0 51 aos 60 3 3,9 2 13,3 2 13,3 1 20 61 aos 70 4 5,3 1 6,7 1 6,7 0 0 71 aos 80 1 1,3 1 6,7 1 6,7 0 0 81 aos 90 2 2,6 0 0 0 0 0 0 91 aos 100 1 1,3 0 0 0 0 0 0 TOTAL 76 100 15 100 15 100 5 100 Tabela 3 - Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo a Sintomatologia sintomatologia (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). TOQs sem recidiva % TOQs primários com história de recidiva % Recidivas de TOQs % COO % Com dor 10 13,2 2 13,3 1 6,7 0 0 Sem dor 66 86,8 13 86,7 14 93,3 5 100 Total 76 100 15 100 15 100 5 100 Com tumefação / assimetria facial 26 34,2 2 13,3 2 13,3 1 20 Sem tumefação / assimetria facial 50 65,8 13 86,7 13 86,7 4 80 Total 76 100 15 100 15 100 5 100 27

Tabela 4 - Número e porcentagem de pacientes acometidos por TOQ e COO, segundo a Localização localização e aspectos radiográficos da lesão (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). TOQs sem recidiva % TOQs primários com história de recidiva % Recidivas de TOQs % COO % Anterior de maxila 16 21 3 20 3 20 2 40 Posterior de maxila 5 6,7 0 0 0 0 0 0 Anterior de mandíbula 3 3,9 2 13,4 2 13,4 0 0 Posterior de mandíbula 47 + 2* 64,5 10 66,6 10 66,6 3 60 Seio maxilar 3 3,9 0 0 0 0 0 0 Total 76 100 15 100 15 14,2 5 100 Aspectos Radiográficos Intra-ósseo radiolúcido unilocular Intra-ósseo radiolúcido multilocular Rompimento da cortical óssea Contato radicular Reabsorção radicular 17 + 2* 25 2 13,2 2 13,2 5 100 1 1,3 1 6,6 1 6,6 0 0 2 2,7 1 6,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Não avaliado 54 71 11 73,6 12 80,2 0 0 Total 76 100 15 100 15 100 5 100 * Casos Pertencente à Síndrome de Gorlin-Goltz. 28

Tabela 5 - Diagnósticos clínicos citados nos casos de TOQ e COO (Laboratório de Patologia Diagnóstico clínico da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). TOQs sem recidiva % TOQs primários com história de recidiva % Recidivas de TOQs % COO % TOQ 57 75 13 86,6 15 100 5 100 COO 0 0 0 0 0 0 0 0 Cisto dentígero 3 3,9 0 0 0 0 0 0 Cisto radicular 1 0,9 0 0 0 0 0 0 Ameloblastoma 1 0,9 1 6,7 0 0 0 0 Sem citação 14 18,3 1 6,7 0 0 0 0 Total 76 100 15 100 15 100 5 100 Tabela 6 - Número e porcentagem de pacientes acometidos por recidiva de TOQ*, segundo tempo decorrido para o diagnóstico da recidiva após o tratamento inicial (Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP. Período de janeiro de 1980 a dezembro de 2009). Tempo de diagnóstico da recidiva do TOQ* de pacientes % 1 ano após o tratamento 10 66,67 2 anos após o tratamento 3 20 4 anos após o tratamento 1 6,67 17 anos após o tratamento 1 6,67 TOTAL 15 100,0 *Não houve casos de recidiva para o COO A análise dos dados tabulados mostrou que os casos de todos os grupos tiveram predileção significante pela raça branca, pacientes jovens, com lesões assintomáticas, radiolúcidas uniloculares, localizadas em região posterior de mandíbula. Frequência discretamente maior e insignificante pôde ser constatada nos TOQs com recidivas quanto ao sexo masculino, e nos COO quanto à faixa etária jovem dos 11 aos 20 anos. Os poucos casos com dor foram registrados apenas nos três grupos dos TOQs, sem predileção entre eles. Por outro lado, a tumefação e assimetria facial prevaleceram nos TOQs sem história de recidiva, e em um dos cinco casos de COO. 29

2.7 DISCUSSÃO Neste estudo o perfil típico para ambos os casos de TOQ e COO foi de paciente jovem, da raça branca, com lesão assintomática radiolúcida unilocular na região posterior de mandíbula. As doenças de nossa casuística provavelmente foram descobertas através de exame radiográfico de rotina, mostrando a importância desse exame complementar (2). Porém, uma parcela dos casos de TOQs apresentaram tumefação e assimetria facial, sendo dois com história de recidiva. A sintomatologia dolorosa restringiu-se acerca de 13% dos TOQs primários com ou sem recidiva, e 6,7% de suas recidivas diagnosticadas. A dor e tumefação aparentemente não foram úteis para predizer a probabilidade de um TOQ recidivar. Esta parcela minoritária da casuística concorda com alguns trabalhos que citam como característica clínica principal do TOQ o aumento de volume e dor local, apesar dessas variáveis dependerem da extensão da lesão (15,26). Quanto aos COOs, ficou evidente que raramente causam dor ao paciente, apesar de poderem expandir a face. Nossos resultados colaboraram com a literatura em descrevê-los como lesões solitárias, normalmente pequenas e não expansivas (3,11,30,32). Na maioria dos estudos o TOQ apresenta predileção pelo sexo masculino (1,26,33-37); em outros a predominância é feminina (2,15,24,38,39). Nossos resultados apontaram que apenas os TOQs com história de recidiva demonstraram discreta predominância para o sexo masculino. Devido a estas controvérsias, é provável que o sexo não seja um fator relevante no perfil da lesão uma vez que varia de acordo com a população estudada. Os casos de COO concordaram com a literatura em não apresentar predileção por sexo, apesar do pequeno número da amostra (3,11,30,32). A faixa etária de todos os pacientes com TOQ foi bastante semelhante à apresentada na literatura (8,15,40), com um pico incidência entre os 11 e os 40 anos de idade e rara ocorrência em indivíduos com idade acima dos 70 anos. Já o COO foi discretamente mais prevalente na segunda década de vida, embora tenha também ocorrido na 3ª, 4ª, 5ª décadas, colaborando com a literatura (3,11,30,32). É de se pensar que o COO possa ser um distúrbio de desenvolvimento junto a outras 30

lesões odontogênicas típicas de jovens, como o tumor odontogênico adenomatóide e odontoma. Segundo a literatura, o TOQ e o COO ocorrem mais frequentemente na mandíbula do que na maxila, variando de 65% a 83% (1,2,15,24,38,39). Estes dados estão de acordo com os obtidos neste estudo, sendo a região posterior da mandíbula (ângulo e ramo) a localização mais comum de todas as lesões avaliadas. A literatura descreve os TOQs geralmente como lesões uniloculares, ou por vezes multiloculares quando localizados na maxila. Na mandíbula tendem a se desenvolver no sentido ântero-posterior ao longo dos espaços menos resistentes do tecido ósseo e espaços medulares, podendo chegar a um tamanho considerável sem causar expansão da cortical evidente. (3,9,10,41). Já na maxila, que por ser osso predominantemente esponjoso e próximo do seio maxilar cresce concentricamente podendo ser percebido já nos estágios iniciais. Pode ocorrer reabsorção da raiz dos dentes adjacentes (18,25,42). Dos casos em que foi possível avaliar a radiografia, predominou o padrão radiolúcido unilocular tanto para os TOQs como para os COOs. O comprometimento da cortical óssea só foi descrito em raros TOQs primários, com ou sem história de recidiva. Tem sido evidente que na síndrome do carcinoma basocelular-nevóide o TOQ apresenta uma maior capacidade de crescimento e proliferação em comparação com o TOQ solitário (41). A presença comum de pequenas ilhas de epitélio odontogênico e cistos satélites nestes casos parece justificar o risco de recidiva da lesão (3,6,17). Nossa casuística mostrou dois casos de TOQ associado à síndrome, porém nenhum deles pertenceu ao grupo com história de recidiva, revelando talvez o sucesso do tratamento adotado durante o período de proservação, que foi através de remoção cirúrgica com curetagem óssea. O diagnóstico diferencial inclui várias opções, desde cistos até tumores odontogênicos ou não odontogênicos. As lesões citadas em nosso levantamento foram cisto dentígero e ameloblastoma. Os profissionais suspeitaram mais de TOQ confirmando o diagnóstico, e nenhum profissional suspeitou de COO, talvez pela raridade deste tipo de lesão. O diagnóstico pode não ser conclusivo apenas com 31

base em informações clínicas e radiográficas, sendo de fundamental importância a realização do exame histopatológico (5,31). O TOQ (ou queratocisto) é atualmente considerado uma neoplasia cística intra-óssea, apesar de existir controvérsia devido à pouca compreensão em relação à sua natureza biológica. Recentemente foi reclassificado de cisto para tumor pela Organização Mundial de Saúde (1,6). Essa reclassificação teve como base os avanços na biologia molecular, que associaram alterações no gene PTCH à alta atividade proliferativa da lesão, a um maior índice mitótico e aos altos índices de recorrência observados (3,9,43-45). É consenso que os TOQs são lesões potencialmente agressivas que apresentam uma alta taxa de recorrência, variando de 5 a 62% (18,23,24,39). Este trabalho mostrou um índice de recidiva de 16,5% nos TOQs, e nenhum para o COO. A maior parte ocorreu um ano após a enucleação cirúrgica e curetagem óssea conservadora, embora uma recidiva fosse reportada 17 anos após o tratamento. O tratamento para os TOQs é dividido em conservador ou agressivo, e tem sido amplamente discutido na literatura (37). O tratamento conservador inclui enucleação, com ou sem curetagem, ou marsupialização e descompressão (40). Sua vantagem é a preservação das estruturas anatômicas (incluindo os dentes), que é defendida, já que o TOQ está comumente presente em pacientes mais jovens. O tratamento agressivo inclui ostectomia periférica, curetagem com solução de Carnoy ou ressecção em bloco, sendo que este deve ser indicado em caso de TOQ associado à síndrome do carcinoma nevóide basocelular e a lesões recorrentes (46). A proservação deve ser criteriosa. Recomenda-se que nos primeiros 5 anos os pacientes sejam atendidos anualmente, depois a cada 2 anos, até completar 10 anos de acompanhamento clínico. A literatura alerta que a maior parte das recorrências ocorrem no prazo de 5 anos, mas recidivas tardias podem ocorrer mesmo após 25 anos após o tratamento (26,47). Para o COO o tratamento deve ser conservador, pois não há relato de recidiva nem na literatura, nem em nosso resultado. 32

2.8 CONCLUSÃO A maior parte dos TOQs e a totalidade dos COOs analisados ocorreram preferencialmente em pacientes jovens da raça branca, com lesões assintomáticas, radiolúcidas uniloculares, localizadas principalmente na região posterior de mandíbula. Os poucos casos com dor pertenceram exclusivamente ao grupo de TOQs, enquanto que a tumefação ocorreu em alguns TOQs sem história de recidiva, e em um caso de COO. Lesões recidivantes foram constatadas apenas nos TOQs, cujo diagnóstico ocorreu geralmente 01 ano após o tratamento inicial. 33

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3 CAPÍTULO 2 - Lesões primárias e recidivantes do tumor odontogênico queratocístico e cisto odontogênico ortoqueratinizado: análise histoquímica- imunohistoquímica da proliferação celular e citoqueratinas. 3.1 RESUMO Conhecimento - O tumor odontogênico queratocístico (TOQ) e o cisto odontogênico ortoqueratinizado são lesões com alguns aspectos clínicos e histopatológicos semelhantes, mas diferem no seu comportamento biológico especialmente no potencial infliltrativo e taxa de recidiva. É de interesse científico aprimorar o conhecimento sobre as semelhanças e diferenças histoquímicas e imunohistoquímicas entre ambas as lesões. Métodos Foram analisados 05 (cinco) casos de TOQ sem recidiva, 05 casos de TOQs primários com história de recidiva, 05 casos de recidivas de TOQs e 05 casos de COO, por meio da histoquímica do AgNOR e imuno-histoquímica com os anticorpos PCNA, P53, Ki-67, citoqueratinas K7, K10-13, K14, K18 e K19. A contagem das AgNORs foi analisada pelos testes estatísticos Anova, Student e de Tukey. Resultados Houve diferença no número de AgNORs por núcleo entre os grupos. Os TOQs primários com história de recidiva exibiram o maior valor, e os COO o menor. Na imuno-histoquímica as principais diferenças foram a exclusividade de expressão do PCNA na camada suprabasal dos casos de TOQ, e a exclusividade do Ki-67 nas camadas basal e parabasal das recidivas de TOQ. A distribuição das Ks seguiu o padrão de um epitélio de revestimento do tipo estratificado pavimentoso. Conclusão A recidiva do TOQ não se justifica pela intensa atividade proliferativa celular, e discretas diferenças de expressão das proteínas PCNA e Ki-67 aparentemente refletem a real distinção de classificação entre o TOQ e COO, sendo o Ki-67 um provável marcador de TOQs com potencial de recidiva. Os resultados colaboram com a suposta natureza neoplásica do TOQ, que é diferente do COO, cujo comportamento biológico é inofensivo. Palavras-chave: cistos odontogênicos; tumores odontogênicos; queratinas; proliferação de células; imunoistoquímica; genes P53; antígeno Ki-67 Normalização de acordo com Journal Of Oral Pathology Medidine (anexo B) 38

3.2 ABSTRACT Background The keratocystic odontogenic tumor and the orthokeratinized odontogenic cyst are lesions clinically similar in appearance but different in their biological behavior. Since KCOTs have a high rate of recurrence, it is of clinical interest the improvement of scientific knowledge about the similarities and differences between KCOTs and OOCs by histochemistry and immunohistochemistry. Methods - The present study analyzed, by means of AgNOR staining and immunohistochemistry with PCNA, Ki-67 and P53, as well as cytokeratins K7, K10-13, K14, K 18 and K19, 5 cases of each: KCOT without recurrence, primary KCOT with a history of recurrence, KCOT recurrent lesions and OOC. The results were tabulated and analyzed statistically by ANOVA and Tukey tests. Results There was statistically significant difference in the number of AgNORs per nucleus among groups. The group of primary KCOT with history of relapse exhibited the highest value, and the OOC group the lowest. For Immunohistochemistry, the differences found among the groups were: the exclusive expression of PCNA in the suprabasal layer of KCOT cases; the exclusive expression of Ki-67 in the basal and parabasal layers of KCOT recurrent lesions. The distribution of Ks followed the pattern of a covering stratified squamous epithelium. Conclusion - The histochemical and immunohistochemical markers used showed little difference in cell proliferative activity among the groups; the distribution of Ks in the lesions was similar to the stratified squamous epithelium covering the skin or mucous membranes; K14 is absent in the epithelium detached from the KCOT capsule; KCOT recurrence is not justified by intense cellular proliferative activity; slight differences in PCNA and Ki-67 expression apparently reflected the actual classification distinction between KCOT and OOC, and Ki-67 is a probable marker of KCOTs with potential for relapse; the results corroborate the alleged neoplastic nature of KCOTs, which is different from OOCs, whose biological behavior is harmless. Keywords: odontogenic keratocyst; odontogenic cysts; cell proliferation; Immunohischemistry; p53 genes; Ki-67 Antigen. 39

3.3 INTRODUÇÃO O tumor odontogênico queratocístico (TOQ) e o cisto odontogênico ortoqueratinizado (COO) são doenças distintas que possuem características clínicas e histopatológicas importantes em comum. Por exemplo, ambas são exclusivas dos ossos maxilares, geralmente assintomáticas, e quando atingem grandes proporções podem apresentar dor e/ou tumefação (1). O aspecto radiográfico é uni ou multilocular e a histopatologia descreve uma estrutura cística revestida por epitélio escamoso com conteúdo de queratina (2-4). Porém, a história clínica, prognóstico e tratamento podem diferir substancialmente, especialmente porque o TOQ apresenta alta taxa de recidiva e associação com a síndrome de Gorlin. Por este motivo estudos comparativos entre ambos devem ser estimulados. No ano de 2005, a Organização Mundial de Saúde (OMS) apresentou uma nova classificação de cistos e tumores odontogênicos, e uma das mudanças marcantes envolveu o queratocisto odontogênico que era considerado um cisto de desenvolvimento e foi reclassificado para tumor odontogênico, recebendo a denominação de Tumor Odontogênico Queratocístico (TOQ) (5). Essa reclassificação do queratocisto teve como bases principais a alta atividade proliferativa de suas células, o comportamento biológico localmente agressivo, o alto índice de recidiva e demonstração de alterações no gene PTCH (gene supressor de tumor) (1,5-7). O cisto odontogênico ortoqueratinizado, menos frequente, continua fazendo parte dos cistos odontogênicos, possuindo uma taxa de recidiva praticamente nula e crescimento mais lento (5). A avaliação da atividade proliferativa celular pode ser feita histologicamente por métodos histoquímicos como a evidenciação das regiões de organização nucleolar (NORs) pela prata, e por imuno-histoquímica na detecção das proteínas PCNA, Ki-67, e P53. NORs são segmentos de DNA agregados nos nucléolos, que codificam RNA ribossômico e são responsáveis pelo desenvolvimento do nucléolo, estando envolvidos na síntese de ribossomos e de proteínas. Usualmente as NORs estão agregadas compactamente na célula normal e, na visualização à microscopia de luz após coloração com nitrato de prata, vêem-se geralmente um ou dois pontos enegrecidos por núcleo, denominados AgNORs. Quando a célula está em processo de divisão mitótica, as NORs se desagregam e dispersam, resultando em AgNORs 40

menores e com maior número na histoquímica. Assim, o estudo do número e área das AgNORs nos núcleos permite avaliar a atividade proliferativa celular. O PCNA (do inglês proliferating cell nuclear antigen) é uma proteína auxiliar da DNA polimerase-delta, que se mostra aumentada tardiamente nas fases G1 e S do ciclo celular, diminuindo na fase G2, e alcançando níveis baixos na fase M e em células inativas (G0) (8). O Ki-67 (Kiel-67) é um antígeno nuclear expresso em todas as fases ativas do ciclo celular, normalmente expresso durante as fases G1, S, G2 e M do ciclo celular, mas ausente em células quiescentes (G0) (9-11). A proteína P53 está envolvida na síntese e reparo do DNA, na plasticidade genômica, na morte celular programada e na regulação negativa do ciclo celular (12). Constitui-se num gene supressor tumoral com um importante papel na regulação normal da divisão celular (13). As citoqueratinas (Ks) são constituintes do citoesqueleto das células epiteliais, e a sua detecção imuno-histoquímica em doenças epiteliais tem sido útil para embasar e discutir histogênese e patogênese (14). Foram catalogadas a partir de eletroforese bidimensional, que permite separar as proteínas por seu peso molecular, e ph. Assim, atualmente são divididas em dois grupos: tipo I, ácidas, incluindo as Ks de 9 a 23, e as do tipo II, básicas, Ks de 1 a 8. Distribuídas especificamente em cada tipo de epitélio (15). Este padrão de queratina específica de cada epitélio é supostamente preservada quando suas células sofrem transformação patológica. 41

3.4 PROPOSIÇÃO Considerando a necessidade de incrementar o conhecimento acerca das semelhanças e diferenças entre o TOQ e COO, o presente trabalho teve como proposta: Analisar em ambos o perfil proliferativo celular por meio de histoquímica do AgNOR e imuno-histoquímica com PCNA, P53 e Ki- 67; Estabelecer o perfil das citoqueratinas K7, K10-13, K14, K 18 e K19; Associar os resultados ao comportamento biológico, probabilidade de recidiva, natureza cística ou neoplásica destas lesões, bem como a sua histopatogênese. 42

3.5 MATERIAL E MÉTODO Este projeto tem a aprovação do comitê de ética em pesquisa envolvendo seres humanos (processo FOA 2008-01657). Foram selecionados para o estudo TOQs e COOs diagnosticados pelo Serviço de Histopatologia e Citopatologia da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, UNESP, que foram agrupados em: 1) 5 casos de TOQs sem recidiva; 2) 5 casos de TOQs primários com história de recidiva; 3) 5 casos de recidivas de TOQs (recidivas dos tumores do grupo 2) e; 4) 5 casos de COO. O tratamento consistiu em enucleação cirúrgica e curetagem óssea simples, sem adotar outros procedimentos trans-opretatórios complementares.todos os casos acompanhados por no mínimo 5 anos. Estudo Histoquímico pela técnica AgNORs Foi aplicada, em todas as amostras a coloração histoquímica da AgNOR. Cortes de 6 µm dos materiais de biópsia incluídos em parafina foram desparafinados, hidratados em etanol absoluto e imersos em ácido acético/etanol (30 ml de ácido acético / 70 ml de etanol) durante 5 minutos. Posteriormente, os cortes teciduais sofreram imersão em celoidina a 1%, em éter/etanol (1:1) durante 1 minuto e em etanol a 70% por 5 minutos, seguindo-se a lavagem com água destilada. Os cortes foram incubados por 30 minutos, em estufa a 45 0 C, numa solução preparada com a mistura das soluções A (50 ml de água destilada, 0,5 ml de ácido fórmico e 1 g de gelatina), e B (10 ml de água destilada e 5 g de nitrato de prata). Por fim, foram desidratados com álcool e clareados em três banhos de xilol, e as lâminas foram montadas em resina permount. As análises da quantidade de AgNORs por núcleo e da área média das mesmas foram realizadas com objetiva de imersão (1000X), com auxílio do programa computacional Leica QWin (Image Processing and Analysis System) em microscópio Leica (DMLB com oculares HCPLANs) e câmera fotográfica digital (JVC-TK-C, 1320). Para tanto, foram observados cem núcleos da camada basal e cem núcleos das camadas suprabasais do epitélio cístico. A média do número de AgNORs por núcleo celular (N), bem como a área média das AgNORs (em µm 2 ) foram calculadas, utilizando as seguintes equações: N = (N 0 de AgNORs)/ N 0 de núcleos 43

A = (área das AgNORs)/ N 0 de AgNORs Os dados obtidos foram tabulados e submetidos à análise estatística pelo testes Anova, Anova com medidas repetidas, Student e de Tukey, ao nível de significância de 5%. Estudo imuno-histoquímico com PCNA, P53, Ki-67, K7, K10-13, K14, K18 e K19 Para as colorações imuno-histoquímicas cortes de 3 µm dos materiais das biopsias foram desparafinados em dois banhos de xilol, reidratados em série descendente de etanóis, e imersos em solução de hidróxido de amônia a 10% (10 minutos) para a retirada do pigmento formólico. Para a recuperação dos sítios antigênicos reagentes aos anticorpos anti-pcna, anti-p53 e citoqueratinas, o material foi tratado com ácido cítrico monoidratado (10 mm ph 6.0), utilizando-se forno de microondas por 12 minutos na potência alta. Para o anticorpo anti-ki-67, o tratamento foi realizado em steamer durante 30 minutos. Após nova lavagem, o material foi imerso em solução composta de água oxigenada a 6% e metanol (1:1), em duas trocas de 5 minutos cada, com o objetivo de bloquear a peroxidase endógena tecidual. Repetida a lavagem com água destilada, os cortes permaneceram por duas vezes em solução de tris-hidroxi-metilaminometano (TRIS) ph 7.4, 5 minutos cada. Em seguida, foram, incubados com o soro do anticorpo primário diluído (Quadro 1), preparado juntamente com o soro de albumina bovino (BSA) a 1% por 60 minutos. O anticorpo de ligação foi então incubado durante 30 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, o complexo streptavidinabiotina por 30 minutos, também sob temperatura ambiente. Para a reação de revelação, foi utilizado o cromógeno diaminobenzidina (DAB) (30 mg) por 8 minutos, diluído em TRIS ph 7.4 (100 ml) e ativado pela água oxigenada (1,2 ml). 44

Quadro 1 - Anticorpos monoclonais que foram utilizados, com tempo de incubação de 60 minutos em temperatura ambiente. Anticorpos Clone Fração de diluição PCNA* PC10 1:600 P53* DO-7 1:75 Ki-67** MM1 1:200 K 7** OV-TL 1:50 K 8** TS1 1:50 K10-13** LHP1 1:25 K 14** LL002 1:20 K 18** DC10 1:100 K 19** B170 1:100 * Dako Corporation **Novocastra Laboratories Ltda Os cortes foram então lavados em água destilada e contracorados com hematoxilina de Mayer por 30 segundos. Posteriormente, foram desidratados em cadeia ascendente de etanóis, diafanizados em três banhos de xilol e montados em resina permount para exame em microscopia de luz. As reações tiveram como controle positivo fragmento de biópsia de carcinoma espinocelular. Para o controle negativo o anticorpo primário foi substituído por solução BSA a 1%, diluída em tampão TRIS ph 7.4. Para as citoqueratinas o controle positivo foi de epitélio de revestimento e epitélio de glândula salivar contidos em um fragmento de mucosa bucal. A análise de células marcadas pelo PCNA, P53, Ki-67 foi realizada na microscopia de luz observando-se os núcleos corados em castanho situados nas camadas basal, suprabasal (2 a 3 camadas acima da basal) e superiores. A análise de células marcadas pelas citoqueratinas foi realizada com objetiva de imersão por 2 examinadores. 45

3.6 RESULTADO Na análise histopatológica o TOQ apresentava cavidade revestida por epitélio estratificado pavimentoso paraqueratinizado, composto por 5 a 8 camadas de células, exibindo aspecto ondulado na superfície e células basais cubóides dispostas em paliçada. A junção epitélio-conjuntivo era relativamente plana, com cápsula conjuntiva fibrosa, contendo geralmente raras células inflamatórias. O COO possuía revestimento epitelial estratificado pavimentoso ortoqueratinizado em toda a sua extensão, contendo camada granulosa notável e camada basal pouco evidente. O epitélio também possuía interface plana com a cápsula conjuntiva fibrosa. A cápsula conjuntiva de ambas as lesões, por vezes, apresentava foco de infiltrado inflamatório leve. As AgNORs foram identificadas dentro dos núcleos celulares como pontos acastanhados escuros, exibindo principalmente forma arredondada ou ovalada, variando em número e diâmetro (Figura 1). Os valores do número de AgNORs por núcleo celular e da área das AgNORs em µm 2 estão expressos na tabela 7. Figura 1 TOQ evidenciando os AgNORs dentro dos núcleos celulares como pontos acastanhados escuros, exibindo principalmente forma arredondada ou ovalada, variando em número e área (AgNOR X1000). 46

Tabela 7 TOQs e COOs: média geral por grupo do número de AgNORs e média da área das AgNORs (em µm 2 ) nas camadas basal e suprabasal do epitélio. AgNORs Grupo de lesões Média do número de AgNORs por núcleo Média da área dos AgNORs por núcleo CB* CSB* CB* CSB* Grupo dos TOQs sem recidiva Grupo dos TOQs primários com história de recidiva Grupo das recidivas de TOQs Grupo dos COO M* 1,59 ab 1,75 a 1,34 ab 1,26 b DP* 0,19 0,33 0,13 0,11 M* 1,48 ab 1,51 ab 1,53 ab 1,62 ab DP* 0,44 0,31 0,19 0,08 M* 2,34 2,33 1,84 2,71 DP* 1,82 1,22 1,14 0,33 M* 3,26 2,77 2,09 4,10 DP* 1,01 1,04 0,24 0,55 * CB= camada basal; CSB= camada suprabasal; M= média; DP= desvio padrão Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre as médias dos grupos Houve diferença estatística no número de AgNORs por núcleo entre o TOQ primário com recidiva e o COO na camada basal (p=0,0084). Os TOQs primários com história de recidiva exibiram o maior valor, e os COO o menor. Comparando-se as camadas basal e suprabasal, porém, a diferença não foi significante. Quanto à área das AgNORs os grupos não apresentaram diferença significante, exceto entre as células basais e suprabasais (p=0,0203), sendo estas últimas com maior valor. Os resultados das reações imuno-histoquímicas foram registrados como negativos (-) quando nenhuma célula apresentou marcação consistente; positividade fraca (+/-) quando se apresentaram de forma esporádica, e positivos (+) quando a marcação estava evidente em vários núcleos por campo. O quadro 2 mostra os resultados imuno-histoquímicos. As diferenças encontradas entre os grupos foram: 1) a exclusividade de expressão do PCNA na camada suprabasal dos casos de TOQ (Figura 2); 2) a exclusividade do Ki-67 nas camadas basal e parabasal das recidivas de TOQ (Figura 3 e 4). A distribuição das Ks seguiu o padrão de um epitélio de revestimento do tipo estratificado pavimentoso, com a K14 presente na camada basal (Figura 5), e K10-13 nas camadas suprabasais e superiores (Figura 6), com exceção de um detalhe no COO, na qual a K10-13 ficou mais restrita às camadas superficiais do epitélio. As K7, 18 e 19 não foram reagentes. 47

Figura 2 Expressão imuno-histoquímica no TOQ evidenciando positividade para PCNA na camada basal e suprabasal (Streptavidina-biotina X400). Figura 3 Expressão imuno-histoquímica no TOQ sem recidiva evidenciando ausência de positividade para Ki-67 (Streptavidina-biotina X400). 48

Figura 4 Expressão imuno-histoquímica do TOQ com recidiva evidenciando positividade para Ki-67 na camada basal e suprabasal (Streptavidinabiotina X400). Figura 5 Expressão imuno-histoquímica do TOQ com recidiva evidenciando positividade para K14 na camada basal (Streptavidina-biotina X400). 49

Figura 6 Expressão imuno-histoquímica do TOQ com recidiva evidenciando positividade para K10-13 nas camadas superiores (Streptavidinabiotina X400). Quadro 2 Marcação imuno-histoquímica* dos TOQs e COOs com os anticorpos anti-pcna, Ki-67, P53, K7, K10-13, K14, K18, K19 Grupo de lesões TOQs sem recidiva (n=5) TOQs primários com história de recidiva (n=5) Recidivas de TOQs (n=5) COO (n=5) Anticorpos CB* CSB CS* CB* CSB CS* CB* CSB CS* CB* CSB CS* * * * * PCNA + + - + + - + + - + - - P53 - - - +/- - - - - - +/ - - - Ki-67 - - - + + - + + - - - - K7 - - - - - - - - - - - - K10-13 - + + - + + - + + - - + K14 + - - + - - + - - + - - K18 - - - - - - - - - - - - K19 - - - - - - - - - - - - *(+) = positivo; (-) = negativo; (+/-) = fracamente positivo. CB= camada basal; CSB= camada suprabasal; CS= camadas superiores 50

3.7 DISCUSSÃO Os resultados demonstraram pouca diferença na atividade proliferativa celular entre os grupos estudados, que foi discreta na imuno-histoquímica (PCNA e Ki-67) e insignificante na histoquímica (AgNOR), refletindo supostamente o crescimento lento e benigno tanto do TOQ como COO. A frequente recidiva descrita nos casos de TOQ não se justificaria, portanto, por um índice mitótico alto, mas por outras propriedades biológicas de suas células: sugerimos, por exemplo, a capacidade de induzir a absorção óssea ou ineficiência de apresentar apoptose. Alguns detalhes da marcação imuno-histoquímica merecem destaque, pois parecem refletir a real distinção de classificação entre o TOQ e COO. O PCNA foi expresso nas camadas basal e parabasal de todos os grupos de TOQ estudados, mas no COO apenas na camada basal. Isto vai de encontro à recente classificação neoplásica do TOQ, cujas células apresentariam um ciclo mitótico celular contínuo e duradouro, ao contrário do COO que evolui de modo inofensivo. A expressão da proteína Ki-67 restringiu-se aos TOQs primários e respectivas recidivas, revelando tratar-se de uma linhagem com maior potencialidade de divisão celular, correlacionando com seu alto índice de recidiva. O Ki-67 tem sido utilizado como excelente marcador de proliferação celular por ser reconhecido em todo ciclo celular, com o nível aumentado durante a fase S MIB-1. A literatura mostra a sua superexpressão nos TOQs especialmente na camada suprabasal, sugerindo uma desregulação do ciclo celular nesta camada (3,16-24). Concordamos com Kuroyanagi et al. (25) cujos resultados sugerem que a avaliação da expressão de Ki-67 em TOQ no momento do diagnóstico histopatológico pode ser útil para previnir a recorrência e podem servir como um marcador de prognóstico, visto que foi um marcador para as lesões recidivantes. Baseado em nossos estudos, há possibilidade do Ki-67 poder predizer seu alto potencial de recidivas. Em outros estudos, nenhuma diferença na expressão foi observada entre primários e recorrente (3,28). O gene p53 é supressor tumoral, eficaz na fase G1 do ciclo celular, que participa na detenção do crescimento, inicia reparo, e induz apoptose (13,26,27). A proteína por ele codificada (P53) tem sido demonstrada na camada basal e suprabasal epitelial com diminuição durante a diferenciação dos queratinócitos (3,17,20,24,27-31). No presente estudo não houve casos positivos, concordando 51

com o trabalho de Moreira et al. (32) na qual o gene p53 não foi expresso em TOQ por meio de PCR. Outros pesquisadores, porém, analisaram a P53 no forro epitelial do TOQ e observaram uma fraca positividade (17,24,30). Para Lombardi et al. (28) o comportamento agressivo e de alta taxa de recorrência de tais lesões podem estar relacionados à imunoexpressão dessa proteína, visto ela ter sido superexpressa no seu estudo. Por outro lado, é importante salientar que a P53 é expressa não só nas células que estão proliferando, mas pode se acumular na célula normal em várias situações. Destaca-se o estresse causado pela inflamação, em que a P53 é a principal medidadora da resposta celular ao stress (33,34). As lesões analisadas no presente trabalho não apresentavam reação inflamatória na cápsula cística ou a inflamação era discreta, o que não foi suficiente para influenciar o acúmulo de P53 nas células epiteliais. É importante ressaltar que a substituição do clássico epitélio paraqueratinizado do TOQ por epitélio escamoso não-queratinizado tem sido relatada em casos de inflamação presentes na parede do cisto (16,22). Estes resultados indicam que existe uma associação entre inflamação e morfologia do seu revestimento epitelial. A presença de inflamação pode também estar associado a alterações no potencial proliferativo, afetando o seu comportamento biológico (35,36). Recentemente, Paula et al. (22), em um estudo de 20 casos relataram um aumento significativo no número de AgNORs, PCNA e Ki-67 no revestimento do TOQ inflamado. Nosso trabalho descartou todos os casos com inflamação para não interferir nas análises. A presença de inflamação poderá em parte ser atribuída a possíveis comunicações com a mucosa bucal, através de perfurações da cortical óssea. A inflamação pode também ser introduzida através do ligamento periodontal em casos localizados perto de dentes adjacentes (22). Apesar do PCNA e Ki-67 serem expressos no ciclo celular, os mesmos possuem uma expressão temporal diversa, fornecendo informações distintas. Embora o PCNA seja essencial para a síntese do DNA durante a fase S da mitose, possui uma meia-vida muito longa (excede vinte horas) e está presente em níveis detectáveis em muitas células que já não estão no ciclo. Por outro lado, o Ki-67 tem uma meia-vida mais curta (menos de uma hora) que aquela do PCNA. Sendo assim, o Ki-67 indica com maior certeza o estágio proliferativo da célula no momento da 52

biópsia/exérese da lesão e não representa uma expressão residual, dando a idéia de que a célula esteja ainda passando pelo ciclo celular (10,24). Em nosso estudo houve similaridade na positividade das células positivas no Ki-67 para o PCNA, outros estudos comparando TOQ com cistos odontogênicos tiveram os mesmos resultados (37). O estudo das Regiões Organizadoras Nucleolares parte do princípio de que a condensação das cromátides em cromossomos está entre as mudanças que marcam o início da divisão celular. As constrições secundárias que surgem nesses cromossomos dão origem a porções menores denominadas satélites e estes são associados à formação de nucléolos. Os nucléolos por sua vez, surgem apenas em locais especiais de cromossomos específicos. Esses locais especiais são as regiões organizadoras nucleolares. A síntese protéica depende diretamente da presença do nucléolo, parte crítica e essencial à translação da informação armazenada nos genes. Essa estrutura não é visível nos exames histopatológicos de rotina. A presença abundante de uma proteína denominada nucleolin no interior dos nucléolos e que possibilita a visualização das NORs no exame em questão, pois essa proteína cora com a Prata. O tamanho dos nucléolos reflete a taxa de produção ribossomal, ou seja, a taxa total de síntese protéica envolvida, quer no processo de crescimento celular, quer no processo de secreção de proteínas. Esse fato explica a importância dessa estrutura nas células de crescimento rápido e/ou com grande produção de proteínas. O número de AgNORs não só estaria relacionado à atividade do gene cromossomal, mas por consequência estaria também relacionado à proliferação celular, com possíveis implicações prognósticas. O número de AgNORs em qualquer estágio do ciclo celular parece ser inversamente proporcional ao tempo desse ciclo, ou seja, quanto maior a quantidade de NORs, menor o tempo para o ciclo celular, o que reflete aumento na taxa de proliferação celular (38). Quanto maior for a contagem de AgNORs e menor a sua área nos núcleos celulares de um tecido, é provável que a atividade proliferativa desta população esteja mais intensa. Nossos resultados, ao mostrarem valores menores nos COOs, e maiores nos TOQs primários com história de recidiva, concordaram com o comportamento distinto destas lesões. É possível também que o número de AgNORs por núcleo possa prever potencial de recidiva dos TOQs. Quanto às áreas 53

das AgNORs, a diferença de valor vista apenas entre as camadas celulares corresponderia ao estado funcional e maturação de suas células. A camada basal epitelial, em função renovadora ao gerar células novas, teria menor área de AgNORs em relação à suprabasal, com células já maduras e diferenciadas. Apesar do potencial proliferativo, a razão pela qual o TOQ se apresente como estrutura cística e não como massa tumoral provavelmente seja pela inibição da apoptose na camada basal do epitélio cístico, através da expressão de bcl-2. Por outro lado, a camada intermédiaria (proliferativa) e superficial exibiria apoptose, o que regularia a espessura do epitélio (17). Nos TOQ a bcl-2 é mais expressa do que no COO (39). Mateus et al. (40) comparou a proliferação celular e o número de apoptose e mostrou que no TOQ a proliferação celular é maior que a apoptose, o que reforça o seu potencial de crescimento neoplásico. O centro proliferativo do TOQ é na camada suprabasal. Apoptose foi maior na camada superficial, que deve explicar por que essas lesões, apesar da sua elevada atividade proliferativa são observadas como lesões císticas, mas não como tumor sólido (17). Poucos estudos têm mostrado a imunolocalização das citoqueratinas em COO e TOQ (3,41). Alguns destes estudos utilizaram pan queratinas, de modo que os resultados são de difícil análise (42). No presente estudo o epitélio da estrutura cística tanto do TOQ como COO possuiu um perfil de Ks semelhante ao epitélio estratificado pavimentoso que reveste a pele ou mucosas. Nos casos do COO a K10-13 foi expressa exclusivamente na camada superficial, demonstrando o alto grau de diferenciação do tecido, inclusive marcando camada granulosa. Apesar de ser considerado um cisto odontogênico, destacamos que o COO não difere histopatologicamente do cisto epidermóide, uma lesão hamartomasa derivada do aprisionamento de células epiteliais durante a fusão de arcos braquiais na embriogênese, ou inclusão traumática de pele e anexos por iatrogenia (43). Questionamos se realmente o COO seria de natureza odontogênica, ou uma variação maxilar do cisto epidermóide originário talvez de células totipotentes. Nos TOQs, a K14 apresentou uma contínua e constante expressão na camada basal; no entanto, a intensidade não foi uniforme, sugerindo algum tipo de alteração no mecanismo de diferenciação dos queratinócitos. A ausência de K14 nas 54

áreas onde o revestimento epitelial foi separado do tecido conjuntivo subjacente provavelmente relaciona-se à perda da ancoragem da célula basal junto à zona de membrana basal, que é exercida especificamente por este filamento (23,44). 55

3.8 CONCLUSÃO Houve pouca diferença na atividade proliferativa celular entre os grupos estudados. A K14 desapareceu nos epitélios desprendidos da cápsula dos TOQs. A recidiva do TOQ não se justifica por intensa atividade proliferativa celular. Discretas diferenças de expressão das proteínas PCNA e Ki-67 aparentemente refletiram a real distinção de classificação entre o TOQ e COO, sendo o Ki-67 um provável marcador de TOQs com potencial de recidiva. Os resultados corroboraram com a suposta natureza neoplásica do TOQ, que é diferente do COO, cujo comportamento biológico é inofensivo. 56

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