COMUNICAÇÃO Vilmar Gonzaga & Jaime M. dos Santos Estudo Comparativo de Multiplicação In Vitro de Seis Espécies de Pratylenchus em Cilindros de Cenoura * Vilmar Gonzaga 1 ** & Jaime M. dos Santos 2 ** * Parte da Tese de Doutorado do primeiro autor, apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Universidade Estadual Paulista (FCAV - UNESP), 14884-900 Jaboticabal (SP) Brasil. 1 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.Postal 02372, 70849-970 Brasília (DF) Brasil. 2 FCAV - UNESP, 14884-900 Jaboticabal (SP) Brasil. ** Autores para correspondência: vilmar@cenargen.embrapa.br, jmsantos@fcav.unesp.br Recebido para publicação em 09 / 06 / 2010. Aceito em 17 / 11 / 2010 Editado por Mário Inomoto Resumo - Gonzaga, V. & J. M. dos Santos. 2010. Estudo comparativo de multiplicação in vitro de seis espécies de Pratylenchus em cilindros de cenoura. Populações axênicas de nematoides são úteis para produção de inóculo, estudos taxonômicos, bioensaios em geral e, mais recentemente, estudos moleculares. O presente estudo teve como objetivo comparar a multiplicação in vitro de seis espécies de Pratylenchus obtidas de diferentes culturas. Os nematoides foram axenizados em solução de ampicilina a 0,1 %, seguida da inoculação em condições assépticas em cilindros de cenoura de 30 mm de comprimento por 15 mm de diâmetro, acondicionados individualmente em vidro de 110 mm de altura por 55 mm de diâmetro. Vinte fêmeas de espécies partenogenéticas foram inoculadas por cilindro, e vinte fêmeas e dez machos das espécies anfimíticas, com cinco repetições. Após a inoculação, os cilindros foram mantidos a 25 ± 1 o C em BOD, por 120 dias no escuro. Então, procedeu-se à extração dos nematoides pela flutuação em centrífuga em solução de sacarose com caulim; a população foi estimada com auxílio da câmara de contagem de Peters, ao estereoscópio. A maior média da população final foi obtida para P. penetrans, correspondendo a 156.621 formas ativas e ovos, enquanto P. jaehni exibiu a menor média (40.201). Entretanto, P. jaehni não diferiu estatisticamente de P. brachyurus, P. coffeae, P. vulnus e P. zeae quanto ao número total de espécimes e ovos por cilindro. Portanto, as seis espécies de Pratylenchus utilizadas no presente estudo apresentaram alta multiplicação in vitro em cilindros de cenoura. Palavras-chaves: nematoides das lesões radiculares, populações axênicas, reprodução. Summary - Gonzaga, V. & J. M. dos Santos. 2010. Comparative study of in vitro multiplication of six Pratylenchus species in carrot cylinders. Nematode axenic populations are useful for inoculum production, taxonomic purpose and bioassays in general and, more recently, for molecular studies. The present study was carried out with the objective of comparing the in vitro multiplication of six Pratylenchus species obtained of different cultures. The nematodes were axenized in 0.1 % of ampicilin solution, in aseptic conditions, and inoculated on carrot cylinders of 30 mm length and 15 mm diameter, individually conditioned in glasses of 110 mm height and 55 mm diameter. Twenty females were inoculated by cylinder, in the case of parthenogenetic species, and twenty females and ten males, in the case of the amphimitic species, with five repetitions for each treatment. After inoculation, the glasses were kept in BOD, at 25 ± 1 o C, for 120 days, in the dark. Then, the nematodes were extracted by the sucrose flotation technique with kaolin and the populations were estimated with a Peters slide under stereoscope. The higher final population was reached by P. penetrans, with average of 156,621 active forms and eggs, while P. jaehni showed the lower average (40,201). However, there is no statistical difference in the final population 226 Vol. 34(4) - 2010
Estudo Comparativo de Multiplicação In Vitro de Seis Espécies de Pratylenchus em Cilindros de Cenoura among P. jaehni, P. brachyurus, P. coffeae, P. vulnus and P. zeae. Therefore, this study demonstrated the suitability of using carrot cylinders for Pratylenchus as high multiplication levels were reached for the six species tested. Key words: lesion nematodes, axenic populations, reproduction. Conteúdo Os nematoides das lesões radiculares (Pratylenchus spp.) infectam grande número de espécies vegetais de importância econômica para a agricultura nacional, tais como soja, cana-de-açúcar, citros, milho, café, algodão, batata, dentre outras (Tenente et al., 2002), podendo causar danos apreciáveis a essas culturas. No Brasil e no mundo, esses fitonematoides ocupam o segundo lugar em importância econômica para a agricultura, sendo superados apenas pelos nematoidesdas-galhas, Meloidogyne spp. (Sasser & Freckman, 1987, Lordello, 1992). A multiplicação, em condições axênicas, de nematoides utilizando a técnica de discos de cenoura (Daucus carota) desenvolvida por O Bannon & Taylor (1968) vem sendo utilizada para multiplicação in vitro de diferentes espécies de Pratylenchus (Towson & Lear, 1982; Verdejo-Lucas & Pinochet, 1992; Stoffelen, et al., 1999; Di Vito et al., 2002; Mudiope et al., 2004). Segundo Castro (1986) e também Castro & Ferraz (1989), a utilização de discos de cenoura para multiplicação in vitro de nematoides é uma técnica mais simples e menos onerosa que a técnica de cultura de tecido em calo de alfafa, desenvolvida por Krusberg (1961). No trabalho realizado por O Bannon & Taylor (1968), os discos de cenoura de 2 a 4 mm de espessura foram colocados em placas de Petri contendo ágarágua e antibióticos, proporcionando a obtenção de altas populações de P. brachyurus e Radopholus similis. As melhorias nessa técnica introduzidas por Moody et al. (1973) foram consideráveis. Esses pesquisadores aumentaram a espessura dos discos de cenoura para 10 a 15 mm, colocaram cinco discos por placa de Petri e não utilizaram o meio de ágar-água contendo antibióticos. Com essas alterações da técnica obtiveram, em um período de três a quatro meses após a inoculação de P. vulnus, aumento de 1.000 vezes no número de nematoides inoculados. O presente estudo foi conduzido com o objetivo de adaptar técnicas de multiplicação de Pratylenchus spp. em condições axênicas e comparar a multiplicação in vitro, em cilindros de cenoura, de P. brachyurus, P. coffeae, P. jaehni, P. penetrans, P. vulnus e P. zeae. As procedências das populações de Pratylenchus spp. e as respectivas plantas hospedeiras estão alistadas na Tabela 1. Essas populações foram obtidas de amostras de raízes de plantas de diferentes culturas encaminhadas ao Laboratório de Nematologia do Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV - UNESP), em Jaboticabal (SP) para análise. As espécies foram identificadas com base em dados morfométricos e morfoanatômicos obtidos aos microscópios fotônico e eletrônico de varredura e mantidas em casa-devegetação em seus hospedeiros originais, em vasos contendo substrato autoclavado. Os nematoides foram extraídos das raízes de seus respectivos hospedeiros pela flutuação centrífuga em solução de sacarose, com caulim (Coolen & D Herde, 1972). Em seguida, os nematoides foram axenizados utilizando-se a técnica de Mountain (1955), com modificações. Com efeito, em vez de sulfato de Tabela 1 - Procedência de espécies de Pratylenchus utilizadas no estudo da multiplicação in vitro em cilindros de cenoura. Espécie Origem Hospedeiro Pratylenchus brachyurus Silvania (GO) Sorghum bicolor P. coffeae Franca (SP) Musa sp. P. jaehni Itajobi (SP) Citrus limonia P. penetrans Guaraí (TO) Glycine max P. vulnus Andradas (MG) Rosa sp. P. zeae Onda Verde (SP) Saccharum sp. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 227
Vilmar Gonzaga & Jaime M. dos Santos estreptomicina foi utilizada uma solução de ampicilina a 0,1 %. Os nematoides foram transferidos um a um para vidros tipo BPI, contendo 600 µl da solução de ampicilina; depois de 10 minutos, removeu-se o máximo possível dessa solução e foram acrescentados 200 µl de água esterilizada. Depois de 5 minutos, o máximo possível de água foi removido e 200 µl da solução do antibiótico foram novamente adicionados ao BPI, onde permaneceram por 10 minutos. A seguir, retirou-se 150 µl da solução de antibiótico e o restante (50 µl), contendo os nematoides, foi inoculado, em condições assépticas em câmara de fluxo laminar, utilizando-se uma micropipeta, no topo dos cilindros de cenoura, previamente colocados nos vidros em posição vertical. Os cilindros foram previamente preparados pela técnica de Moody et al. (1973), com modificações. Essas modificações da mencionada técnica constaram do preparo de um cilindro de cenoura de 30 mm de comprimento por 15 mm de diâmetro, por vidro de 180 ml de capacidade (110 mm de altura por 55 mm de diâmetro), em vez de discos de cenoura como descrito por Moody et al. (1973). As cenouras foram previamente imersas em hipoclorito de sódio a 0,05 % por 30 minutos (Chitambar & Raski, 1985). Em seguida, em câmara de fluxo laminar, as cenouras foram cortadas com bisturi flambado, em cilindros de aproximadamente 30 mm de comprimento, os quais foram mergulhados em álcool etílico comercial (92,8 o GL), flambados e, com auxílio de um perfurador também flambado, foram retirados os cilindros centrais. Individualmente, esses cilindros foram transferidos para vidros previamente vedados com papel alumínio e filme de PVC e autoclavados. Após a tranferência dos discos de cenoura os vidros foram mantidos em posição vertical (Figura 1) e em repouso por cinco dias em média; não havendo evidências de contaminação, foram inoculados com Figura 1 - Preparação dos cilindros de cenoura em condições assépticas para multiplicação de espécies de Pratylenchus in vitro. A) Remoção da parte central da raiz com o perfurador em câmara de fluxo laminar. B) Cilindro removido da porção central da raiz. C) Acondicionamento do cilindro em vidro previamente autoclavado e selagem com filme de PVC. D) Cilindros preparados e acondicionados nos vidros no interior da câmara. 228 Vol. 34(4) - 2010
Estudo Comparativo de Multiplicação In Vitro de Seis Espécies de Pratylenchus em Cilindros de Cenoura a suspensão de nematoides axenizados como anteriormente descrito. Na inoculação de espécies anfimíticas (P. coffeae, P. jaehni, P. penetrans e P. vulnus) foram utilizadas vinte fêmeas e dez machos por cilindro de cenoura, e para as espécies partenogenéticas (P. brachyurus e P. zeae), apenas vinte fêmeas. Após a inoculação, os cilindros de cenoura foram mantidos a 25 ± 1 o C em BOD por 120 dias, no escuro. Após esse período, os nematoides foram extraídos dos cilindros pela flutuação centrífuga em solução de sacarose, com caulim (Coolen & D Herde, 1972). A concentração da suspensão de nematoides (espécimes e ovos) obtida por cilindro foi estimada com auxílio de uma câmara de contagem de Peters, ao estereoscópio. Os dados relativos aos números totais de espécimes e ovos, obtidos por cilindro de cenoura, foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 1 % de probabilidade, utilizando-se o aplicativo ESTAT 2.0. Em geral, a partir dos 60 dias após a inoculação dos cilindros de cenoura, foram observadas manchas necróticas escurecidas no topo dos cilindros, correspondendo aos pontos onde a suspensão de nematoides foi depositada, indicando o estabelecimento da população (Figura 2A). Com o acrécimo da população, a necrose cresceu e assumiu o aspecto de anasarca de coloração marrom-escura (Figura 2B). O aumento da área dessa lesão foi tanto mais rápido quanto maior foi a taxa de multiplicação da espécie do nematoide. Moody et al. (1973) já tinham observado tais alterações. A maior média da população final entre as espécies desse estudo foi obtida para P. penetrans, correspondendo a 156.621 formas ativas e ovos, diferindo das populações finais de P. jaehni e de P. brachyurus, porém não diferindo das demais. P. jaehni apresentou o menor número de espécimes e de ovos por cilindro de cenoura (40.201) em relação às demais espécies, entretanto, não diferiu estatisticamente de P. brachyurus, P. coffeae, P. vulnus e P. zeae. Verdejo-Lucas & Pinochet (1992) mencionaram que o modo de reprodução da espécie de Pratylenchus pode influenciar a multiplicação do nematoide in vitro, sendo que espécies anfimíticas tendem a multiplicarse mais que as partenogenéticas. No presente estudo, embora P. jaehni (anfimítica) tenha exibido a menor população final, outras espécies anfimíticas (P. penetrans e P. coffeae) estão entre as que apresentaram as maiores médias de indivíduos e ovos na população final, não diferindo entre elas nem de P. zeae (partenogenética). Figura 2 - Sintomas indicativos do estabelecimento e multiplicação de Pratylenchus spp em cilindros de cenoura. A) Lesão inicial sobre o ponto de inoculação em torno de 60 dias após. B) Lesões encharcadas, de coloração marrom-escura, indicando a progressiva multiplicação dos nematóides. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 229
Vilmar Gonzaga & Jaime M. dos Santos Verificou-se que as seis espécies de Pratylenchus utilizadas no presente estudo apresentaram alta multiplicação in vitro em cilindros de cenoura, podendose utilizar essa técnica, simples e de baixo custo, para a produção massiva desses nematoides. Literatura Citada CASTRO, M.E.A. 1986. Multiplicação in vitro de Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus zeae, Radopholus similis e Tylenchorhynchus sp.. Universidade Federal de Viçosa (MG), 62 p. CASTRO, M.E.A. & S. FERRAZ. 1989. Multiplicação in vitro de Pratylenchus brachyurus, P. zeae, Radopholus similis e Tylenchorhynchus sp. em discos de cenoura. Nematologia Brasileira, 13: 31-38. CHITAMBAR, J.J. & D.J. RASKI. 1985. Life history of Pratylenchus vulnus on carrot disks. Journal of Nematology, 17 (4): 617-619. COOLEN, W.A. & C.J. D HERDE. 1972. A Method for the Quantitative Extraction of Nematodes from Plant Tissue. State Agricultural Research Center, Ghent - Belgium, 77 p. DI VITO, M., F. CATALANO & G. ZACCHEO. 2002. Reproduction of six population of Pratylenchus spp. from the Mediterranean region on selected plant species. Nematologia Mediterranea, 30 (1): 103-105. LORDELLO, L.G.E. 1992. Nematoides das Plantas Cultivadas. Editora Nobel, São Paulo (SP), 314 p. MOODY, E.H., B.F. LOWNSBERY. & J.M. AHMED. 1973. Culture of the root-lesion nematode Pratylenchus vulnus on carrot disks. Journal of Nematology, 5 (3): 225-226. MOUNTAIN, W.B. 1955. A method of culturing plant parasitic nematodes under sterile conditions. Proceeding of the Helminthological Society of Washington, 22 (1): 49-52. MUDIOPE, J., D. COYNE, W. ADIPALA & R.A. SIKORA. 2004. Monoxenic culture of Pratylenchus sudanesis on carrot disks, with evidence of differences in reproductive rates between geographical isolates. Nematology, 6 (4): 617-619. O BANNON, J.H. & A.L. TAYLOR. 1968. Migratory endoparasitic nematodes reared on carrot discks. Phytopathology, 58 (3): 385. SASSER, J.N. & D.W. FRECKMAN. 1987. A world perspective on nematology: the role of the society. In: VEECH, J.A. & D.W. DICKSON (ed). Vistas on Nematology. Society of Nematologists, p. 7-14. STOFFELEN, R., M.I. JIMENEZ, C. DIERCKXSENS, V.T.T. TAM, R. SWENNEN & D. WAELE. 1999. Effect of time and inoculum density on the reproductive fitness of Pratylenchus coffeae and Radopholus similis populations on carrot disks. Nematology, 1 (3): 243-250. TENENTE, R.C.V.T., V. GONZAGA, L.A. M.P. MELO & M.S.M. TENENTE. 2002. Bibliografia Brasileira de Nematoides. EMBRAPA CENARGEN, Brasília, 386 p. (Documentos, 76). TOWSON, A.J. & B. LEAR. 1982. Effect of temperature on reproduction and motility of Pratylenchus vulnus. Journal of Nematology, 14 (4): 602-603. VERDEJO-LUCAS, S. & J. PINOCHET. 1992. Population densities of five migratory endoparasitic nematodes in carrot disk cultures. Journal of Nematology, 24 (1): 96-98. 230 Vol. 34(4) - 2010