USO DA COLORAÇÃO EOSINA-NIGROSINA NA AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDES DE CARNEIROS SUPLEMENTADOS COM MELATONINA 1 Use of eosin-nigrosine staining in assessing plasma membrane integrity of ram spermatozoa supplemented with melatonin 1 1 Wildelfrancys Lima de Souza 2*, 2 Jonathan Maia da Silva Costa 4, 3 Elenice Andrade Moraes 3, 4 Vitória Gomes Coelho 5, 5 Laiane Moreira Vianna Magalhães 2 ; 6 Raimundo Parente Oliveira 6 1 Parte de dissertação do primeiro autor. 2 Mestrandos do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal (CPGCA), Universidade Federal do Vale do São Francisco (Univasf), Petrolina-PE, *email: wilde@zootecnista.com.br 3 Professora do Colegiado de Zootecnia e CPGCA, Univasf, Petrolina-PE. 4 Doutorando do Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (FAVET), Universidade Estadual do Ceará 5 Discente do Curso de Medicina Veterinária, Univasf, Petrolina-PE, 6 Bioestatístico Embrapa Semiárido CPATSA, Petrolina-PE-Brasil.
Introdução Um aspecto fundamental no processo de avaliação seminal, que é em grande parte negligenciado pelos métodos descritivos, é a determinação da integridade estrutural e funcional das membranas lipoprotéicas dos espermatozoides (WATSON, 1995). A membrana espermática tem um importante papel nos processos de capacitação e fertilização do oócito e sua constituição bioquímica é um dos principais pontos de interesse do estudo da fisiologia e patologia espermática (LENZI et al., 1996). Ela é basicamente composta por ácidos graxos e proteínas (FLESH; GADELLA, 2000). Teorias sobre a fusão de membranas (oócito/espermatozoide) sugerem que a fluidez da membrana é pré-requisito para a função normal da célula, e que, a fluidez e a flexibilidade das membranas celulares são dependentes da sua composição lipídica (LENZI et al., 2002). Existem vários testes que podem ser empregados para a determinação da integridade da membrana plasmática, como as colorações supravitais, incluindo Tripan- Blue-Giensa, testes hiposmóticos e, mais recentemente, o uso das sondas fluorescentes que atuam através de reações com enzimas citoplasmáticas ou de ligação com o DNA espermático (ARRUDA et al., 2005), mas é uma técnica pouco aplicável a campo pois há necessidade de equipamentos de custo muito alto como um microscópio de epifluorescência ou um citômetro de fluxo. Enquanto o teste de eosina-nigrosina (HANCOCK, 1951), é um teste muito prático e de baixo custo, podendo ser rotineiramente utilizado à campo para avaliar a integridade da membrana espermática (KUMI-DIAKA; BADTRAM, 1994). Portanto, objetivou-se avaliar o efeito da suplementação de melatonina na integridade da membrana plasmática dos espermatozoides de carneiros após a criopreservação. Material e Métodos O experimento foi desenvolvido no Centro de Pesquisa em Suínos, Espécies Nativas e Silvestre (CPSENS), localizado no Campus de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), Petrolina, Pernambuco. Foram utilizados três carneiros, com idade entre 2 a 4 anos. Os animais foram mantidos em baias individuais, com dieta a base de volumoso e concentrado, com fornecimento de água ad libitum. As colheitas foram realizadas duas a três vezes por semana para cada animal com intervalos de 48 horas. Foi utilizada nas colheitas vagina artificial para ovinos (Minitub ) com água a 50 C acoplada a tubos de centrífuga de 50 ml, utilizando como manequim uma fêmea ovina. Após a coleta o sêmen foi transportado imediatamente para o CPSENS e colocado em banho-maria a 32 C. Cada ejaculado foi avaliado quanto aos parâmetros seminais (volume, aspecto, concentração e a motilidade espermática).
Os ejaculados foram distribuídos em cinco tubos de ensaio de 15 ml e diluídos em Tris-gema de ovo, conforme Souza et al., (2015), para concentração final de 200x10 6 espermatozoides/ml, determinado através da análise no fotômetro SDM6 (Minitub ), e mantidos em banho maria a 32 C. O diluidor foi previamente preparado com as quatro concentrações diferentes de melatonina, de acordo com os tratamentos: Controle; 1 mm; 100 μm; 100 nm; 100 pm de melatonina. Após a diluição as amostras nos tubos de ensaio foram colocadas em um becker com água a 32 C e acondicionadas sobre rack em câmara fria a 5 C por duas horas. Após esse período, as amostras de cada tratamento foram envasadas em palhetas de 0,5 ml e lacradas com seladora UltraSeal (Minitub ) e acondicionadas sob vapores do nitrogênio liquido, por 15 minutos, a 8 cm da lâmina líquida. Decorrido este tempo as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido e descongeladas a 37 C durante 30 segundos. A integridade da membrana plasmática foi determinada utilizando a coloração de Eosina-Nigrosina (E/N) segundo Barth e Oko (1989). Onde as amostras nas palhetas foram descongeladas como descrito acima e o conteúdo esvaziado em tubo de eppendorf de 1 ml. Foi transferido para um segundo tubo 10 μl de cada amostra e adicionados 10 μl do corante. 8 μl de cada amostra foi adicionada entre lâmina e lamínula préaquecidas, e um mínimo de 200 espermatozoides por amostra foram contados em microscópio óptico DM 750 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Suiça) em aumento de 100x. Onde as células com membrana plasmática lesada apresentavam o núcleo corado em rosa da eosina, e aquelas com a membrana plasmática intacta, núcleo corado em escuro da nigrosina. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa SAS 9.2 2002-2008 by SAS Institute Inc. (Cary, NC, USA). Resultados e Discussão Pode-se observar que as amostras suplementadas com 100 µm, 100 nm e 100 pm de melatonina apresentaram maior percentual de células com membranas plasmática íntegras quando comparadas com as amostras sem suplementação e aquelas suplementadas com 100 mm de melatonina (Tabela 1; P<0,05). Entretanto, Perez et al., (2012) e Moraes et al., (2015) encontraram valores percentuais inferiores de membrana plasmática integra 18,31 e 29,1 respectivamente. Demonstrando que a capacidade da melatonina de neutralizar as ERO foi favorecida à medida que o nível de suplementação foi reduzindo, promovendo uma maior resistência e preservação da integrada da membrana plasmática aos danos oxidativos. Conclusão A melatonina manteve a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides
avaliados com Eosina-Nigrosina após o processo de criopreservação. Referências Bibliográficas ARRUDA, R. P.; CELEGHINI, E. C. C.; SOUZA, L. W. O. et al. Importância da qualidade do sêmen em programas de IATF e TETF. Acta Scientiae Veterinariae, Porto Alegre-RS, v. 33, n. 1, p. 145-150, 2005. BARTH, A. D.; OKO, R. J. Abnormal morphology of bovine spermatozoa. Ames: University Press, 1989. 285 p. FLESH, F. M.; GADELLA, B. M. Dynamics of mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization. Biochimica et Biophysica Acta, Amsterdam-NL, v. 1469, p. 197-235, 2000. HANCOCK, J. L. A staining technique for the study of temperature shock in semen. Nature, London, v. 167, p. 323-324, 1951. KUMI-DIAKA, J.; BADTRAM, G. Effect of storage on sperm membrane integrity and other functional characteristics of canine spermatozoa: in vitro biossay for canine semen. Theriogenology, Philadelphia-PA, v. 41, p. 1355-366, 1994. JOINT ANNUAL MEETING-JAM, 2015, Orlando-FL. J. Anim. Sci. Vol. 93, Suppl. s3/j. Dairy Sci. Vol. 98, Suppl. 2. Orlando- FL, 2015. p. 427-428. LENZI, A.; FANDINI, L.; LOMBARDO, F. et al. Polyunsaturated fatty acids of germ cell membranes, glutathione and glutathione-dependent enzyme-phgpx: from basic clinic. Contraception, Philadelphia-PA, v. 65, p. 301-304, 2002. LENZI, A.; PICARDO, M.; GANDINI, L. et al. Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Human Reproduction Update, Oxford-GB, v. 2, p. 246-56, 1996. PEREZ, E. G. A. ; NICHI,M. ; VIANA, C.H,C. et al. Efeito da adição de Glutationa na função e estresse oxidativo em sêmen ovino criopreservado. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science (Impresso), São Paulo-SP, v. 49, p. 262-268, 2012. SAS System for Windows (Statistical Analysis System), versão 9.2. Cary, USA: SAS Institute Inc; 2002-2008. MORAES, E. A.; SOUZA, W. L.; COSTA, J. M. S. et al. Antioxidants improve membrane integrity and acrosome and sperm mitochondrial activity in ram sperm after cryopreservation. In: ADSA - ASAS, SOUZA, W. L.; LIMA, D. I. B.; MORAES, E. A. et al. Adição de diferentes concentrações de crioprotetores e gema de ovo sobre a motilidade espermática progressiva de ovinos após a
criopreservação. In: XXV Congresso Brasileiro de Zootecnia-ZOOTEC, 2015, Fortaleza-CE. Anais do XXV Congresso Brasileiro de Zootecnia. 2015. v. 25. WATSON, P.F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprodution, Fertilility and Development, Melbourne, v. 7, p. 871-891, 1995 Palavras chave: antioxidante. criopreservação. ovino. Key words: antioxidant. cryopreservation. Sheep. Tabela 1. Percentuais de integridade da membrana plasmática (imp), de espermatozoides de carneiros criopreservados após adição de diferentes níveis de suplementação de melatonina (NSM) no sêmen fresco NSM imp % SA 40,05 B 1 mm 44,65 B 100 µm 55,50 A 100 nm 59,06 A 100 pm 61,03 A SA= sem antioxidante (controle). A,B Médias com letras maiúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).