Ficha Informativa nº11 Fundamentos de Engª.Genética

FICHA INFORMATIVA Nº11 FUNDAMENTOS DE ENGª.GENÉTICA Ficha Informativa nº11 Fundamentos de Engª.Genética Durante 25 anos, desde 1950 a 1957, a molécula de DNA foi considerada intocável. A partir da década de 70 do séc. XX, porém ocorreu uma verdadeira revolução biotecnológica ( ). Abriram a molécula de DNA, extraíram genes, transplantaram-nos para outras células, multiplicaram alguns desses genes milhões e milhões de vezes e criaram em tubo de ensaio seres que não surgiram como resultado de milhões de anos de evolução Terra, Universo de Vida, Biologia de 12ºano (Porto Editora) Escola Secundária da Amadora Biologia 12ºano

FICHA INFORMATIVA Nº11 FUNDAMENTOS DE ENGª.GENÉTICA Como já foi falado em anos anteriores, o material genético, denominado DNA (ácido desoxirribonucleico) está empacotado no núcleo das células eucariotas sob a forma de cromossomas (existindo ainda uma pequena parte, de forma circular, no interior das mitocôndrias que se encontram espalhadas no citoplasma) e encontra-se solto no citoplasma nas células procariotas sob a forma de cromossomas e pequenos plasmídeos ambos circulares. Este material ao ser descodificado leva à produção de todas as proteínas existentes num determinado organismo (excepto se este tiver de alguma forma danificado). Esta síntese é unidireccional, tendo esse processo de passar pela seguinte ordem: DNA (Transcrição) mrna (Tradução) Proteínas. Este processo é muito idêntico nas células procariotas e eucariotas, no entanto, no último caso, o mrna tem de sofrer maturação/processamento, onde são retiradas as zonas não codificantes (Intrões) existentes no DNA que foi transcrito (às zonas codificantes dá-se o nome de Exões): DNA (Transcrição) RNA (Processamento) mrna (Tradução) Proteínas. Outra diferença, é o facto da replicação nos procariontes se dar de uma forma contínua (só existe um sítio de iniciação e terminação), enquanto nos eucariontes se dá de uma forma descontínua (através de pequenas porções, pois existem vários pontos de iniciação e terminação da replicação). Escola Secundária da Amadora Biologia 12ºano

FICHA INFORMATIVA Nº11 FUNDAMENTOS DE ENGª.GENÉTICA DE QUE FORMA A ENGENHARIA GENÉTICA VEIO REVOLUCIONAR O NORMAL FUNCIONAMENTO DA SÍNTESE PROTEICA? A descoberta de enzimas de restrição foi um dos primeiros passos para a grande revolução que a eng.genética veio a revelar. Estas Enzimas/Endonucleases de restrição fazem parte de complexos enzimáticos de defesa de algumas bactérias que são infectadas por vírus/bacteriófagos e que digerem o DNA parasita (de notar que a própria bactéria defende o seu DNA através da acção de outras enzimas metilases - que adicionam grupos metil, CH 3, ao DNA evitando que as outras enzimas se liguem ao DNA). Este procedimento evita que o DNA viral seja inserido no seu DNA não permitindo a sua multiplicação e posterior morte da célula hospedeira. A característica interessante destas enzimas é que elas reconhecem sequências específicas de nucleótidos (zonas de restrição) cortando especificamente a hélice dupla do DNA nessa sequência. Cada enzima apenas corta uma zona de restrição (ex.: enzima EcoRI- 5 GAATTC3, e Hind III 5 AAGCTT3 ). Outra descoberta relacionada também com o estudo das infecções virais foi a possibilidade de introduzir DNA estranho no interior de outros organismos, tal como os vírus o faziam. Sob determinadas condições esse DNA recombinante (DNA do organismo receptor mais o DNA do dador/parasita) sofre replicação e é transmitido às células filhas sempre que a célula se divide. Uma última conclusão tirada foi que o DNA viral apresenta uma determinada característica que lhe permite ligar-se ao DNA das bactérias, incorporando-se no seu interior. Mais tarde, os cientistas aperceberam-se das vantagens da utilização de outros Vectores, como os plasmídeos das próprias bactérias, recombinados no exterior, e reintroduzidos novamente nas bactérias (através de processos que aumentam a permeabilidade da sua membrana). Para manipular o material genético, a eng.genética desenvolveu então uma série de técnicas, tais como: 1. Isolamento de ADN 2. Utilização de Enzimas de Restrição/Endonucleases de restrição para cortar pequenos fragmentos de DNA e de Ligases de DNA para ligar os nucleótidos covalentemente entre fragmentos complementares. 3. Utilização de Vectores, transportadores bacterianos e virais, que permitem a entrada de DNA estranho no interior de um organismo receptor. 4. Produção de rdna ( DNA recombinante/recombinado) 4.1. - Produção de cdna (DNA complementar) 4.2. - Clonagem de genes/cdna, formando Bibliotecas de genes/cdna 5. Leitura de Impressões Digitais Genéticas (que permite identificar a paternidade de uma criança, por exemplo) 6. Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR), que permite obter milhares de cópias de DNA em poucos minutos. Escola Secundária da Amadora Biologia 12ºano

Para produzir uma molécula de rdna (DNA recombinante) são necessários 3 elementos: 1. Um DNA dador (de uma célula eucariota ou procariota) 2. Um DNA que sirva de vector transportador (DNA Bacteriano Plasmídeo ou DNA Viral ) 3. Uma célula receptora (ou um organismo receptor se for unicelular) Para transformar o DNA necessitamos de o extrair da célula em que se encontra e separá-lo dos outros constituintes celulares (proteínas, enzimas, mrna e trna). 1. ISOLAMENTO DE DNA Separação dos componentes celulares de uma célula eucariota (imagem 89 do livro adoptado, pág. 213) O procedimento para retirar o DNA de células eucariotas e procariotas varia, uma vez que no primeiro caso o núcleo é a única barreira às enzimas existentes no citoplasma que podem digerir o DNA. Existem técnicas que permitem inactivar a acção dessas enzimas existentes no citoplasma (como diminuir a temperatura) e separar os restantes materiais celulares (DNA, RNA e proteínas). Estes são separados de acordo com a sua dimensão, densidade e afinidade, através de centrifugação (e adição de fenol e clorofórmio). O DNA ficará retido na fase aquosa, mais à superfície, enquanto que os restantes componentes ficarão precipitados no meio ou no fundo (interface ou fase orgânica respectivamente). A fase orgânica, contendo as proteínas, é facilmente retirada, mas ainda resta RNA em suspensão juntamente com o DNA. Por essa razão adicionam-se enzimas que degradam o RNA, e fazem-se várias lavagens (ressuspender e precipitar o DNA várias vezes) para que os vestígios de RNA sejam retirados e tenhamos apenas DNA no final. Nota ver imagem 90 do livro adoptado, pág. 214 (Isolamento do DNa Plasmídico). No caso do ADN bacteriano, a extracção também é realizada por centrifugação (para que o DNA cromossomal seja separado do DNA plasmídico). Neste caso os plasmídeos ligam-se aos compostos densos, ou seja, ficam retidos no fundo, fase orgânica).

2. ENZIMAS /ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO E LIGASES DO DNA O DNA humano apresenta cerca de 300 sequências diferentes de pares de bases (zonas de restrição), que se repetem entre 300000 e 500000 vezes ao longo de todo o genoma. Como já foi referido, as Enzimas de restrição cortam zonas específicas do DNA. As extremidades resultantes desse corte denominam-se extremidades coesivas e podem ligar-se por complementaridade a outro DNA. Se a mesma enzima for utilizada para cortar a abertura de um vector e cortar as duas extremidades do DNA, ao ser introduzido nesse vector as suas extremidades terão exactamente a mesma sequência de bases, podendo ligar-se por complementaridade umas às outras. Contudo existe uma falha entre as ligações do esqueleto açúcar-fosfato. Esta falha pode ser reparada, através de uma enzima reparadora a ligase do DNA, que estabelece uma ligação covalente entre os nucleótidos adjacentes dos dois fragmentos de ADN. Os vectores são moléculas capazes de transportar um fragmento de DNA para uma célula, como já foi referido. 3. VECTORES A ideia de utilizar Plasmídeos (uma pequena molécula de DNA além do DNA cromossomal da bactéria), passou essencialmente pelas suas propriedades: 1. Apresentam genes não essenciais para a sobrevivência da bactéria 2. Podem replicar-se independentemente da molécula principal. 3. Apresentam genes com resistência a antibióticos que podem servir como marcadores, na selecção de bactérias com rdna plasmídico das que não apresentam plasmídeos. 4. Apresenta apenas uma zona de restrição para a enzima EcoRI (5 GAATTC3 ) Normalmente utilizam-se 2 tipos de vectores ou transportadores: a) DNA plasmídico b) DNA viral Para se introduzir este vector novamente no interior da bactéria, é necessária a presença de CaCl 2 e choque térmico para aumentar a permeabilidade da membrana celular da bactéria, e o Plasmídeo entrar no seu interior. É igualmente possível a utilização de bacteriófagos como vectores.

3-TÉCNICA DO RDNA ( DNA RECOMBINADO/RECOMBINANTE) Produção de Insulina recorrendo à técnica do rdna. Tal como o nome indica a técnica do DNA recombinado, significa que se alterou o tipo de informação genética num determinado ADN (neste caso adicionando um gene extra que se quer clonar). Nesta técnica, essa recombinação é apenas um processo intermédio para se poder multiplicar um determinado gene, de modo a produzir-se uma proteína específica e em grandes quantidades (ex. Insulina, hormona do crescimento, etc.), numa célula hospedeira que facilmente se replique (como um vírus ou uma bactéria). O procedimento para a construção de rdna consiste nos seguintes passos: 1. Isolamento do DNA que contém o gene que se quer clonar e do DNA plasmídico. (centrifugação em ambos os casos e a baixas temperaturas se a célula for eucariota, para inibir a acção enzimática). 2. DNA plasmídico+ Enzima de restrição.a (abertura do Plasmídeo) 3. DNA dador + Enzima de restrição A (abertura de todas as zonas de restrição) 4. Isolamento do gene que se quer inserir no Plasmídeo. 5. Gene + Plasmídeo + Ligases de DNA. 6. Temos agora um Plasmídeo com rdna 7. Plasmídeos recombinantes + Bactérias (Indução do aumento de permeabilidade da bactéria (CaCl3 e choque térmico) para que o Plasmídeo possa entrar na bactéria). 8. O gene inserido passa a comandar a síntese da proteína desejada (Nota - os restantes genes do Plasmídeo e do cromossoma primário continuam a sintetizar as restantes proteínas normalmente).

3.1. CDNA (DNA COMPLEMENTAR) Procedimento da técnica: O DNA complementar é um DNA sintético, que é produzido no sentido inverso ao da transcrição (passagem de DNA para mrna). Como este é produzido a partir do mrna, e no caso dos eucariontes, este mrna já sofreu maturação perdendo as zonas não codificantes do DNA original (Intrões), o cdna sintetizado não vai ser igual ao original, uma vez que também não vai apresentar Intrões, no entanto a sua comparação DNA e cdna permite-nos localizar as regiões codificantes(exões) e as zonas não codificantes (Intrões). Esta característica não prejudica a síntese proteica a partir deste novo DNA, uma vez que tem a informação necessária para sintetizar as mesmas proteínas (pois só as regiões codificantes Exões é que são relevantes para esse processo), estando pronto a usar. A grande vantagem é que este DNA facilita a produção de proteínas de eucariontes nas bactérias, já que estas não têm mecanismos de maturação do RNA (quando se introduzem genes de um eucarionte num procarionte que contêm intrões, a sua transcrição será feita de uma forma ininterrupta, produzindo-se uma proteína diferente da pretendida). Mas então como é que podemos reverter o sentido unidireccional da síntese proteica (ou pelo de parte desta, da transcrição)? Mais uma vez, ao estudarem ataques virais, os cientistas aperceberam-se que certos tipos de vírus retrovirus - não apresentavam o seu próprio DNA (ex. HIV). Eles tinham sim, como material genético RNA, e ao infectarem determinadas células é que sintetizavam o seu DNA a partir de uma enzima denominada Transcriptase Reversa. 1º Isola-se do citoplasma todos os mrna funcionais. 2º mrnas (cadeia simples) + Enzimas Transcriptase Reversa Forma-se a 1ªcadeia de cdna complementar ao mrna 3º Faz-se a degradação do mrna. 4º Poli A (Iniciador)*+ DNA polimerase Síntese da 2ªcadeia de DNA complementar Foi a partir da descoberta desta enzima que os cientistas encontram uma nova ferramenta para manipular o material genético. Nota Importante: * Uma vez que a extremidade do cdna apresenta uma sequência com várias Timinas (complementares às extremidades com várias Adeninas do mrna, como defesa à degradação enzimática no citoplasma), necessitamos inserir um pedaço de DNA iniciador (Primer), com uma sequência de várias Adeninas complementares, uma vez que a próxima enzima a utilizar DNA polimerase apenas se consegue ligar ao DNA de cadeia dupla!

Procedimento para a realização de Bibliotecas genómicas: 3.2. BIBLIOTECAS DE GENES/CDNA DNA a clonar Corte com a mesma Endonuclease Inserção dos fragmentos nos plasmídeos ou DNA viral: Clonagem: Bibliotecas de cdna: Todos os cdna que se sintetizam podem ser clonados em bactérias (ou vírus). Se fragmentarmos esse cdna e inserirmos cada segmento numa bactéria, podemos construir as chamadas bibliotecas de cdna, pois cada fragmento fica armazenado na bactéria durante longos períodos de tempo (com as condições adequadas à sua sobrevivência). Estes genes estão prontos a usar caso se queira fazer a síntese proteica. Bibliotecas de genes (DNA): Se por outro lado quisermos clonar todo o genoma de uma célula eucariota, mesmo com os genes não activos /não codificantes, basta utilizar enzimas de restrição, para fragmentar todo o genoma. Os fragmentos resultantes vão ter tamanhos diferentes, no entanto como foram cortados pela mesma endonuclease, vão apresentar extremidades não ligadas, mas complementares entre si. Neste último caso, não temos interesse em fazer a síntese das proteínas desses genes, uma vez que como apresentam ainda intrões, vão ser sintetizadas proteínas diferentes das que esperaríamos se o mrna tivesse sofrido maturação/purificação (quando perde os intrões). Ambos os casos vão ser clonados pela técnica do rdna. Após multiplicar esses fragmentos, podemos voltar a retirá-los dos plasmídeos, usando a mesma enzima de restrição que os cortou inicialmente, separar os plasmídeos dos fragmentos que clonámos e juntar os fragmentos entre si com Ligases de DNA de modo a formar de novo toda o genoma.

6. IMPRESSÕES DIGITAIS GENÉTICAS Em que é que consiste esta técnica? 1º A partir de uma pequena amostra de material biológico (cabelo, unhas, ossos, etc.) extrai-se e isola-se o DNA. 2º Utilizam-se enzimas de restrição e o DNA é fragmentado em segmentos pequenos e de diferentes tamanhos. (o tamanho varia de indivíduo para indivíduo). 3º Colocam-se estes fragmentos num aparelho que contém gel e um campo eléctrico (Electroforese), fazendo deslocar esses segmentos a velocidades e distâncias diferentes. Exceptuando os gémeos verdadeiros, cada indivíduo possui o seu próprio DNA. Com base neste princípio, foi desenvolvida uma técnica denominada Impressão Digital Genética ou DNA Fingerprint. Este método é bastante utilizado nos testes parentais, onde normalmente o filho apresenta cerca de 50% do seu genoma igual ao do pai e o restante igual ao da mãe. Também é muito utilizado na investigação criminal para descobrir a qual dos suspeitos pertencem determinados vestígios de tecido encontrados na zona do crime. (se forem ligeiramente semelhantes, não pertencem à mesma pessoa, só se forem 100% iguais). Nota Um outro material genético muito utilizado, é o DNA mitocondrial (apenas proveniente da mãe). Este DNA é muito semelhante ao dos plasmídeos das bactérias, uma vez que também é uma hélice dupla circular, e não está ligado à produção de proteínas da célula, apenas da própria mitocôndria. 4º Posteriormente observa-se a distância a que cada fragmento se localiza (semelhantes a um código de barras).

7. PCR (REACÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA) Mas afinal como é esse processo? 1º A partir de DNA isolado faz-se aumentar a temperatura (95ºC), que faz o DNA desnaturar (perder as ligações por pontes de hidrogénio que fazem ligar as bases complementares), separando as duas cadeias de DNA. 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 Aumento da 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 temperatura 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 (desnaturação) 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 2º Adiciona-se 2 oligonucleótidos de iniciação (Primers) de cerca de 20 nucleótidos, compostos pelas sequências complementares aos nucleótidos do início de cada uma das cadeias complementares*(aos 55ºC) 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 Iniciador1 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 Iniciador2 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 3º Adicionam-se Nucleótidos (T,G,C,A) +Enzima DNA polimerase (Taq).para sintetizar as cadeias opostas (aos 70ºC) 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 DNA polimerase (-5 3 ) DNA polimerase ( 3 5 ) 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 3 AAATTTCCCGGGATCA 5 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 5 TTTAAAGGGCCCTAGT 3 4º Repetir todos os passos anteriores até obter o nº de cópias desejado! Para trabalhar os genes de um determinado indivíduo necessitamos de cerca de 1micrograma de material genético. O que fazer quando só se tem um cabelo ou outro vestígio orgânico? Em 1983 descobriu-se uma técnica, a PCR, capaz de replicar várias copias de DNA em apenas alguns minutos! (Tal como ocorre na replicação natural mas muito mais lentamente.) Como este processo ocorre a elevadas temperaturas, além do DNA, a própria enzima DNA polimerase era afectada. Contudo, surgiu a ideia de utilizar a mesma enzima, mas de organismos capazes de viver em locais com temperaturas muito altas, como as bactérias térmófilas (que vivem nas proximidades de fontes hidrotermais). A enzima utilizada resiste a todos os ciclos de aquecimento e arrefecimento e tem como nome Taq polimerase, devido à designação da espécie da bactéria em que foi extraída (Thermus aquaticus). *Nota - para inserir os iniciadores certos, os cientistas necessitam conhecer o início das sequências, para produzirem a sequência de nucleótidos complementares correcta.