Arq.Biol.Tecnol.40(2):435-491, jun., 1997 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO IN VITRO DE AGIDO INDOL ACÉTICO POR BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS PELO MÉTODO COLORIMETRICO E EM HPLC EVALUATION OF INDOLE ACETIC ACID PRODUCTION BY DIAZOTROPHIC BACTERIA USING A COLORIMETRIC METHOD AND HPLC Elcio L. Balota 1,5, Eli S. Lopes 2,5, Mariangela Hungria 3,5, " " João de Lima 1 & Johanna Dobereiner 1 Instituto Agronômico do Paraná-IAPAR, Caixa Postal 481, CEP 86001-970, Londrina-Pr. 2 Instituto Agronômico de Campinas, Campinas, SP. 3 EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Soja,, Londrina-Pr. 4 EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia, Seropédica, RJ. 5 Bolsista de pesquisa do CNPq. Recebido para publicação em 18 de abril de 1997 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the production of indole acetic acid (IAA) in vitro by diazotrophic bacteria, using a colorimetric method and HPLC. The following bacteria were used: Bacterium E (probably Burkholdería spp.), isolated from cassava plants (E-25 and E-30) and rice (E-247), Azospiríllum lipoferum (M-33 and Sp 59), A. brasilense (Sp7 and Sp245), Herbaspiríllum seropedicae (Z67) and Acetobacter diazotrophicus (PAL 5). Bacteria were inoculated in liquid medium supplemented or not with 0.3 mm triptophan and were grown in the dark with constant agitation. Evaluations were performed 72 hours after inoculation. Using the colorimetric method of Salkowsky, IAA production varied from 6.05 to 82.75 um in the absence of triptophan and from 12 to 285.07 um in the medium enriched with tryptophan. Using the HPLC, these concentrations were of 1.40 to 18.22. um in the medium without triptophan and from 3.78 to 43.00 um with triptophan. Consequently, values obtained with the HPLC were between 2.05 and 11.57 times lower than with the colorimetric method in medium without tryptophan and from 3.00 to 8.55 times lower when the medium was supplemented with the aminoacid. However, a significative linear correlation (r=0.87**) was observed between the data obtained by the two methods, showing that the colorimetric method can be routinely used. Key words: phytohormones, colorimetric method, tryptophan, biological nitrogen fixation INTRODUÇÃO Muitos trabalhos têm evidenciado efeitos benéficos no crescimento das plantas pela inoculação de rizobactérias. Sabe-se que muitos deste efeitos se devem a algumas características das bactérias, como a fixação biológica de N 2, inibição de fitopatógenos, produção de fitohormônios, entre outras (1; 2; 3; 4). Estas bactérias proporcionam alterações nos padrões morfoi fisiológicos das raízes, como: incremento no diâmetro, densidade e comprimento dos pêlos radiculares, maior absorção de nutrientes, aumento nos teores de ácido indol acético (AIA) e ácido indol butírico (AIB) nas raízes e maior atividade 435
Arq.Biol.Tecnol.40(2):485-491.jun.,1997 metabólica e de enzimas nas raízes (5; 6; 7). Alguns destes trabalhos têm mostrado que a inoculação de bactérias apresenta efeito benéfico similar à aplicação de AIA, GA-3 e cinetina (8). O AIA, pertence ao grupo das auxinas, grupo de fitohormônios envolvidos na regulação do crescimento das raízes- (9). O AIA pode ser sintetizado e excretado por bactérias diazotróficas asociativas como as pertencentes ao gênero Azospiríllum (10) a partir do triptofano, que é utilizado como fonte de N (7). Existem, contudo, dificuldades de se trabalhar em condições de rizosfera, pois nem sempre as metodologias disponíveis apresentam sensibilidade suficiente para detectá-los. Por isso, muitos experimentos têm sido conduzidos in vitro com a adição de triptofano, precursor do AIA, o que aumentaria sua produção e, consequentemente, sua detecção (4). O objetivo do trabalho foi avaliar o acúmulo de AIA in vitro por bactérias diazotróficas, pelo método colorimétrico e em HPLC. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas estirpes de bactérias diazotróficas da Bactéria E, provavelmente Burkholderia (11), isoladas da mandioca (E-25 E e-30) e do arroz (E-247) e estirpes padrões como: A. brasilense Sp7 (ATCC 29145) e Sp245, A. lipoferum Sp59 (ATCC 29707), Herbaspiríllum seropedicae Z67 e Acetobacter diazotrophicus PAL5 (ATCC 49037). As bactérias foram pré-cultivadas, por 24 horas, nos seus respectivos meios líquidos (GOC, LGI-P e NFb, com três vezes a concentração de fosfato) (12), centrifugadas a 15.000 g por 30 minutos e lavadas, por três vezes, em solução tampão fosfato 0,06 M esterilizado. A seguir, procedeu-se a uma nova centrifugação, objetivando-se remover possíveis resíduos de fitohormônios e, finalmente, as bactérias foram ressuspensas na mesma solução tampão com mesmo volume. Alíquotas de 0,1 ml desta cultura foram inoculadas em tubos de ensaio contendo 16 ml de meio líquido (GOC, LGI-P e NFb) na ausência ou presença de 0,3 mm de L-triptofano esterilizado via filtro de nitrocelulose (0,22 um) Millipore. Estas bactérias foram cultivadas sob agitação (40 rpm), no escuro, a 28 C, pois a luz oxida o AIA. A quantificação do fitohormônio AIA no meio foi realizada 72 horas após inoculação, em três repetições. As culturas foram centrifugadas a 15.000 g por 30 minutos e o sobrenadante filtrado em membranas de Millipore 0,22 um antes de serem submetidas à metodologia colorimétrica com o reagente de 486
Arq.Biol.TecnoL.40(2):485-491,jun.,1997 Salkowski modificada (13;14). Nesta metodologia, para cada parte do sobrenadante da bactéria foram adicionadas duas partes de FeCI 3 0,01 M em HCIO 4 35% e, após 25 minutos, as leituras da absorbância foram feitas a 530 nm, em três repetições. A quantificação do AIA foi feita através da curva padrão obtida com concentrações de 0 a 250 u M do padrão de AIA. Na avaliação em HPLC, o sobrenadante do meio foi extraído com acetato de etila em ph 2,8 e analisado pela injeção de 20 ul em HPLC Waters mod. 510, utilizando coluna Novapak C18 com 15 cm de comprimento, tendo como solvente metanol:ácido fosfórico 1% em água (40:60, v/v), a um fluxo de 1 ml/min. O detector utilizado foi o UV a 278 nm. O AIA foi quantificado pela integração da área pelo microprocessador do módulo de dados Waters. O tempo de retenção para o pico foi comparado com o pico do AIA padrão. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados de acúmulo de AIA no meio de cultura, em função da adição ou não de triptofano, avaliados pelo método colorimétrico e em HPLC encontram-se na Tabela 1. Pode-se observar que todas as bactérias acumulam AIA no meio, independente da presença de triptofano, e que os valores obtidos pelo método colorimétrico foram superiores aos obtidos em HPLC. Os resultados evidenciam que as bactérias diazotróficas apresentaram acúmulo distintos de AIA no meio, avaliado tanto pelo método colorimétrico como em HPLC. Na avaliação pelo método colorimétrico houve acúmulo de 6,05 a 82,75 um no meio sem triptofano e 12,00 a 285,07 nm com adição de triptofano. Já na avaliação em HPLC, os valores variaram de 1,40 a 18,22 (im no meio sem triptofano e de 3,78 a 43,00 um com a adição de triptofano. A. lipoferum acumulou até 53,25 um em meio sem triptofano e 101,15 um com adição de triptofano pelo método colorimétrico e 10,00 e 14,33 um em-hplc. Os valores obtidos em HPLC foram em tomo de quatro vezes menores para M-33 e nove vezes menores para Sp59, em relação aos valores observados pelo'método colorimétrico no meio sem adição de triptofano. Em experimentos conduzidos anteriormente com A. lipoferum os valores situaram-se entre 28 e 97 um (15) e 86 um em avaliação pelo método colorimétrico (16). Já HOREMANS et ai. (17) observaram valores entre 15 e 51 um após 144 horas de incubação, em avaliações tanto pelo método colorimétrico com em HPLC e CROZIER et al. (16) constataram até 23 um em avaliação pelo HPLC. 437
Arq. Biol.Tecno1.40(2):485-491,jun.,1997 Tabela 1. Acúmulo de ácido indol acético em meio de cultura, avaliado pelo método colorimétrico e em cromatografía líquida de alta pressão (HPLC), após 72 horas de incubação. Médias de três repetições. Para A. brasilense, os valores acumulados foram de até 82,75 e 114,33 um respectivamente em meio sem e com triptofano pelo método colorimétrico e 18,22 e 21,29 um em HPLC. Os valores obtidos em HPLC com a estirpe Sp7 foram 11 e sete vezes inferiores aos obtidos pelo método colorimétrico, respectivamente para os meios com e sem triptofano. Com a Sp 245, os valores obtidos pelo HPLC foram quatro vezes menores aos do método colorimétrico. Em trabalhos utilizando estirpes de A. brasilense isoladas de plantas de cactáceas no México, foram constatados acúmulo de 205 a 428 u.m, avaliando o AIA pelo método colorimétrico (15), enquanto que em outros trabalhos, utilizando A. brasilense (Sp7 e Sp245), foram observados de 15 a 90 u M em meio sem e com triptofano, respectivamente (18). Em estirpes isoladas de raízes de milho avaliados em HPLC foram observados de 1,14 a 25,68 u.m (16), enquanto que em estirpes Cd, foram observados 0,67 um em meio contendo triptofano, utilizando radioisótopos (19). 488
Arq. Biol. Tecnol.40(2):485-491,jun.,1997 Figura 1. Regressão e coeficiente de correlação linear entre acúmulo de AIA no meio determinado pelo método colorimétnco e em HPLC. A. diazotrophicus acumulou 14 vezes mais AIA no meio com triptofano, quando avaliado por coiorimetria, e 4,4 vezes mais na avaliação por HPLC. Os valores observados em HPLC foram em torno de duas e seis vezes menores aos observados por coiorimetria no meio com e sem adição de triptofano, respectivamente. Observações feitas em estirpes isoladas no México evidenciaram acúmulo de até 371 um em avalições pelo método colorimétrico. Neste mesmo trabalho, foi observado que a estirpe PAL5 foi uma das bactérias que apresentaram maior capacidade de acúmulo de AIA no meio (20). O método colorimétrico de Salkowski tem sido questionado como não confiável na avaliação de AIA (16; 20). Entretanto, neste trabalho detectouse uma alta correlação linear dos dados obtidos pelo dois métodos (R=0,87**). Estes resultados, e a similaridade dos valores obtidos em vários trabalhos, evidenciam que, apesar das imperfeições metodológicas, o método colorimétrico pode ser perfeitamente utilizado, pela facilidade e repetibilidade dos resultados, apesar das pequenas modificações inerentes aos materiais e metodologia de cada trabalho. CONCLUSÕES - O método colorimétrico é adequado para avaliação da capacidade de produção de AIA por bactérias diazotróficas. - A adição de triptofano ao meio auxilia na detecção do ácido indol acético. - Os valores encontrados pelo método colorimétrico são inferiores aos obtidos em HPLC, mas existe alta correlação entre os métodos. 489
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