83 INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO MICELIAL DE Colletotrichum acutatum POR EXTRATO AQUOSO E ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus (DC) Stapf e Corymbia citriodora Hill & Johnson Marcelo Vivas 1 ; Dalza Gomes da Silva 2 ; Amilton José Pereira 3 ; Janieli Maganha Silva 4. RESUMO - A doença denominada flor-preta causada por Colletotrichum acutatum é uma das doenças mais importante do morango, devido às grandes perdas na produção causada por sua ação. Visando dar subsídios para o seu controle, foram realizados testes in vitro objetivando avaliar o efeito fungitóxico de Corymbia citriodora Hill & Johnson e Cymbopogon citratus (DC) Stapf sobre o patógeno, utilizou-se o extrato aquoso nas concentrações de 0, 05, 10, 15, 20 e 25%, e óleo essencial nas concentrações finais de 0, 500, 1000, 2000, 3000, e 4000 µl/l. Como testemunha foram utilizadas placas contendo apenas BDA. Para cada tratamento, utilizaram-se quatro placas. A incubação foi realizada a temperatura de 25ºC. As avaliações foram feitas através de medições diárias do crescimento radial da colônia em dois eixos ortogonais, tendo inicio 72 horas após a montagem do ensaio e finalizando no momento em que a colônia atingiu ⅔ da placa. Os resultados obtidos demonstraram que o óleo essencial promoveu uma inibição maior, tendo atingido 100% de inibição nas concentrações superiores a 1000 µl/l, enquanto que no extrato aquoso a inibição não foi tão significativa. Unitermos: Antracnose, Eucalipto, Capim-limão, Morango, Controle alternativo. INHIBITION OF THE MYCELIAL GROWTH OF colletotrichum acutatum BY AQUEOUS EXTRACT AND ESSENTIAL OIL OF Cymbopogon citratus (DC) Stapf AND Corymbia citriodora Hill & Johnson ABSTRACT - Anthracnose caused by Colletotrichum acutatum is one of the most important of strawberry crop diseases, due to high production losses is caused by his action. In order to provide subsidies for its control, in vitro tests were performed to evaluate the antifungal activity of Cymbopogon citratus (DC) Stapf and Corymbia citriodora Hill & Johnsonon the pathogen, was used the aqueous extract at concentrations of 0, 05, 10, 15, 20 and 25%, and essential oils at final concentrations of 0, 500, 1000, 2000, 3000, and 4000 ml / L. Were used as control, plates containing only PDA. For each treatment, four plates were used. Incubation was performed at 25 C. The assessments were made by measuring daily radial growth of the colony in two orthogonal axes, having started 72 hours after the mounting of the test and ending when the colony reached ⅔ of the board. The results showed that the oil caused a greater inhibition, reaching 100% of inhibition at concentrations higher than 1000 ml/l, whereas the aqueous extract inhibition was not as significant. Uniterms: Anthracnose, Eucalyptus, Lemongrass, Strawberry, Alternative control. INTRODUÇÃO 1 Biólogo pelo Centro Universitário São Camilo Espírito Santo, Campus I, Cachoeiro do Itapemirim, ES, CEP: 29.304-040. E-mail: mrclvivas@hotmail.com; 2 Professora do Centro Universitário São Camilo Espírito Santo. E-mail: agro.biol@hotmail.com; 3 Biólogo pelo Centro Universitário São Camilo Espírito Santo, Campus I, Cachoeiro do Itapemirim, ES, CEP: 29.304-040. E-mail: amilton.mf@hotmail.com; 4 Biólogo pela Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Alegre, CEP 29500-000, Alegre, ES, Brasil. E-mail: janielims19@yahoo.com.br
84 Dentre os produtos agrícolas cultivados no estado do Espírito Santo, o morango (Fragaria X ananassa Duch) é um dos mais importantes, tanto social quanto economicamente, sendo atualmente uma das principais atividades agrícolas do estado, especialmente da região Centro-Serrana (Balbino & Marin 2004). Envolvendo mais de 2300 pessoas, distribuídas em aproximadamente 420 propriedades apenas na atividade de cultivo (Balbino 2004). O morangueiro pode ser infectado por diferentes patógenos os quais limitam a exportação comercial do fruto quando não devidamente controlados (Tanaka & Passos 1998, Tanaka 2002). Dentre os fitopatógenos merece atenção o fungo Colletotrichum acutatum Simmonds, agente causador da flor-preta (Tanaka et al. 1997a). Encontrando-se largamente distribuída em todas as regiões produtoras do estado, causando prejuízos severos em virtude da suscetibilidade das cultivares em uso (Costa &Ventura 2004). A doença é de difícil controle, tornando-se limitante para a cultura (Tanaka 2002, Costa & Ventura 2004). Henz et al. (1992) reportam que as perdas ocasionadas variam entre 30 e 68 %. Contudo, a destruição total da lavoura pode ocorrer se as condições climáticas forem favoráveis ao fungo. O uso de fungicidas constitui prática importante para garantir a sustentabilidade da produção. Apesar disso, atualmente não existem fungicidas que possam ser oficialmente recomendados para o controle da flor preta, uma vez que os registrados para antracnose do morangueiro, dizem respeito apenas a Colletotrichum fragariae Brooks, com baixíssima eficiência para C. acutatum (Tanaka et al. 1997b). Aliado a isso, o uso indiscriminado de fungicidas tem favorecido a seleção de raças resistentes de patógenos a estas substâncias químicas (Ghimi & Kimati 2000). Tanaka et al. (1997b) avaliaram a resistência de C. fragariae e C. acutatum ao benomyl na cultura do morango no estado de São Paulo. Constataram que todos os isolados de C. acutatum foram resistentes, mesmo na concentração de 1000 ppm. Kososki et al. (2001) analisaram in vitro onze fungicidas e testaram seus efeitos em campo para o controle de Colletotrichum acutatum, constatando que nenhum fungicida controlou a doença satisfatoriamente. Em contrapartida, vários trabalhos têm demonstrado o potencial de plantas medicinais no controle de fitopatógenos, tanto por sua ação fungiotóxica direta, inibindo o crescimento micelial e a germinação de esporos, quanto pela capacidade de induzir o acúmulo de fitoalexinas (Stangarlin et al. 1999, Bonaldo et al. 2004, Moreira et al. 2008, Silva et al. 2009, Dias-Arieira et al. 2010). Diante do exposto, o trabalho objetivou avaliar a atividade dos extratos aquosos e óleos essenciais de Corymbia citriodora (Hook.) K.D. Hill e L.A.S. (Jhonson) e Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf no controle da flor preta no morangueiro. Para isso, avaliou-se a inibição in vitro do crescimento micelial de Colletotrichum acutatum Simmonds. MATERIAL E MÉTODOS O fungo Colletotrichum acutatum Simmonds foi isolado de amostra de plantas doentes de morango (Fragaria X ananassa Duch), provenientes do Centro Regional de Desenvolvimento Rural Centro-Serrano (CRDR-CS) INCAPER, localizado no município de Domingos Martins/ES. O fungo foi isolado de maneira indireta utilizando BDA conforme metodologia descrita por Amorim & Salgado (1995). Após seu isolamento o fungo foi cultivado em BDA por meio de repicagens mensais. Para a obtenção do extrato bruto aquoso e do óleo essencial, foram utilizadas folhas frescas de Corimbia citriodora (E. citriodora Hooker) e Cymbopogon citratus (DC.) Stapf, coletadas no município de Mimoso do Sul/ES, em plantio domiciliar. Na obtenção do extrato bruto aquoso, pesou-se 100g em peso fresco, do material vegetal picado, o qual foi triturado em um processador (liquidificador), juntamente com 200 ml de água, o material foi filtrado em gaze e autoclavado por 20 min, 120ºC, e, 1,5 atm. Os extratos aquosos foram utilizados imediatamente após sua obtenção.
85 O óleo essencial foi extraído por arraste a vapor, conforme metodologia descrita por Santos et al. (2004), no laboratório de Fitoquímica e Farmacologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Alegre FAFIA, no município de Alegre/ES. O extrato bruto aquoso foi adicionado ao meio de cultura BDA de modo a se obter as concentrações finais de 05, 10, 15, 20 e 25%. O óleo essencial foi incorporado ao meio fundente de BDA nas concentrações finais de 500, 1000, 2000, 3000 e 4000µL/L. Como testemunha utilizou-se apenas BDA. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições. Um disco de 7 mm de diâmetro contendo micélio de Colletotrichum acutatum (retirado de colônia com 14 dias) foi repicado para o centro de cada placa, as quais foram mantidas a 25ºC. Após 72 horas mediou-se diariamente o diâmetro das colônias em dois eixos ortogonais, até o momento em que as colônias atingiram ⅔ da superfície da placa, conforme metodologia descrita por Fiori et al. (2000). Os dados de obtido pelas mensurações foram submetidos a análise de variância e teste de média. Posteriormente, conforme apresentado por Silveira et al. (2003), calculou-se a percentagem de inibição do crescimento micelial (PICM), pela fórmula: D t D PICM n * 100 7 ; na qual Dt D n = média das duas medições (mm) de diâmetro das colônias do tratamento n; D t = média das duas medições (mm) na testemunha (sem fungicida); 7 = diâmetro dos discos, em milímetro. Para cada combinação de extrato x concentração estimou-se a DE 50 (concentração inibitória do crescimento micelial em 50%), por meio de regressão linear e transformação log-probit. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos com o extrato bruto aquoso estão apresentados na tabela 01, nota-se uma ligeira inibição no tratamento com Corymbia citriodora, que aumentou na medida em que os meios ficavam mais concentrados chegando a 47,11% de inibição do crescimento micelial, enquanto que com Cymbopogon citratus ao máximo de inibição foi 8%. TABELA 1 - Inibição do crescimento micelial (%) de Colletotrichum acutatum pelo extrato bruto aquoso e óleo essencial de C. citratus e E. citriodora em diferentes concentrações, em BDA. Extrato Bruto Aquoso C. citriodora C. Citratus Concentração (%) 25 20 15 10 05 0 CV % 47,11 a 43,11 a 33,78 b 29,78 b 16,44 c 0,67d 6,10 8,00a 7,56ab 7,11ab 4,89b 0,01c 0,67c 24,53 Óleo Essencial Concentração (μl /L) 4000 3000 2000 1000 500 0 CV % C. citriodora 100,00 a 100,00 a 100,00 a 46,67 b 33,33 b 0,67c 12,68 C. citratus 100,00 a 100,00 a 100,00 a 95,56 a 77,78 a 0,67b 12,99 *Média seguidas da mesma letra na linha não difere entre si pelo teste Tukey a 0,05 de probabilidade. Os resultados observados acima demonstram que os extratos das duas plantas apresentam propriedades fugitóxicas, que inibiram, ainda que discretamente, o crescimento micelial. Nota-se também que o extrato de Corymbia citriodora foi mais eficiente que o extrato de Cymbopogon citratus, o mesmo resultado foi observado por Fiori et al. (2000) que testaram quatro extratos de plantas sobre o crescimento micelial de Didymella bryoniae. O extrato bruto de Eucalyptus citriodora monstrou-se mais eficiente que os outros.
86 Schwan-Estrada et al. (1998) constataram uma inibição no crescimento micelial de Rhizoctonia soloni, Sclerotium rolfssi, Phytophthora sp, Altenaria alternata e Colletotrichum graminicola por extrato bruto de eucalipto em concentrações acima de 20%. Alves et al. (2002) relataram à eficiência dos óleos essenciais das plantas C. citratus, C. nardus (L.) Rendle. e E. citriodora Hook. no controle in vitro, da germinação de conídios e do crescimento micelial de C. musae. Outros autores também relatam as propriedades fungitóxicas dos extratos dessas duas plantas. Bonaldo et al. (2004) constataram que o extrato de eucalipto é um agente potencial para o controle da antracnose em pepino, tanto por sua atividade antifúngica direta quanto pela capacidade de indução local de resistência. Pelos valores de EC 50 apresentados na tabela 2, observa-se a que EC 50 foi superestimada quando analisada para o extrato bruto aquosa de capim-limão. Tal fato é justificável, como em nenhuma concentração houve inibição pronunciada (o máximo foi 8% de inibição média) estatisticamente a concentração EC 50 é superestimada e não faz sentido, uma vez que não existe concentração maior que 100%. TABELA 2 Valores de concentração de extrato bruto aquoso e óleo essencial em meio de BDA que inibi o crescimento micelial em 50% (EC 50 ) de Colletotrichum acutatum. Extrato bruto aquoso EC 50 Limites do Intervalo de Confiança (=5%) Inferior Superior C. citratus * * * C. citriodora 0,39 0,31 0,55 Óleo essencial DE50 Limites do Intervalo de Confiança (=5%) Inferior Superior C. citratus 0,012 0,008 0,017 C. citriodora 0,077 0,073 0,081 * EC 50 não estimada. Por outro lado, quando a EC 50 foi estimadas para os óleos essenciais, observou-se para o óleo de C citratus EC 50 em torno de 0,012%, com intervalo de confiança indo de 0,008 a 0,017% (Tabela 2). Apontando assim, que os óleos essenciais são bastante promissores, pois, oferece possibilidade de controle, ou seja, inibem o crescimento do fungo a concentrações inferiores a 100 ppm ou mg/l. Já para o óleo essencial de C. citriodora, a EC 50 foi de 0,08 %, sendo o intervalo de confiança de 0,073% até 0,081% (95% de probabilidade da média estar neste intervalo) ou seja, de 73 a 81 mg/l ou PPM (tabela 2). Só para ter um comparativo, um fungicida protetor com bom efeito in vitro sobre crescimento micelial, deve ter no mínimo uma EC 50 de 100 ppm em geral, considerase promissor com valores abaixo de 50 ppm. A atividade antifúngica de óleos essenciais sobre espécies de Colletotrichum já foi evidenciada por outros pesquisadores. Silva et al. (2009) avaliaram o efeito de extratos e óleos essenciais de quatorze plantas medicinais e ou nativas, em destaque C. citratus, sobre a germinação de esporos e crescimento micelial do fungo C. gloeosporioides. Segundo esses autores, no teste de crescimento micelial, os óleos essenciais de todas as plantas inibiram completamente o crescimento micelial do fungo (PICM = 100%), exceto o óleo da goiaba branca. Alves et al. (2002) corroborando os resultados deste estudo também relataram à eficiência dos óleos essenciais das plantas C. citratus, C. nardus (L.) Rendle. e E. citriodora Hook. no controle in vitro, da germinação de conídios e do crescimento micelial de C. musae. Quanto aos resultados obtidos com a avaliação do crescimento micelial do fungo Colletotrichum acutatum na presença do óleo essencial de C. citriodora, nota-se uma ligeira inibição nas concentrações mais baixas, nas concentrações acima de 1000µL/L observou-se 100% de inibição (Tabela 1). Ao contrario do observado com o extrato bruto aquoso, o óleo essencial de
87 Cymbopogon citratus teve uma ação mais significativa que o C. citriodora, tendo inibido em 100% o desenvolvimento fúngico nas concentrações superiores a 500µL/L. Os resultados encontrados estão em concordância com os apontados outros autores. Fiori et al. (2000) que observaram uma inibição de 100% trabalhando com o óleo essencial de Eucalyptus citriodora, Cymbopogon citratus no desenvolvimento in vitro do crescimento micelial de Didymella bryoniae. Schwan-Estrada et al. (1997) constataram uma redução no crescimento micelial de 100, 73, 66 e 50% para Sclerotium rolfssi, Rhizoctonia soloni, Phytophthora sp e Altenaria alternata, respectinvamente, para alíquotas de 100 µl do óleo essencial de eucalipto. Valarini et al. (1995) trabalhando com óleo essencial de Cymbopogon citratus (capim-limão) a 10 %, observaram inibição total do crescimento micelial de Fusarium solani f.sp. phaseoli, Sclerotinia sclerotiorum e Rizoctonia solani. Os resultados obtidos demonstraram o potencial para o controle da flor-preta do morangueiro por meio do uso de óleo essencial. Apontando assim, que os óleos essenciais são bastante promissores, pois, oferece possibilidade de controle da doença em baixa dose, ou seja, inibem o crescimento do fungo a concentrações inferiores a 100 ppm ou mg/l, no entanto há de se relatar a necessidade de mais estudos para entendimento da propriedade antifúngicas de tais compostos. Haja vista que, o entendimento das propriedades antimicrobianas e/ou elicitoras dos compostos secundários presentes nas plantas, podem contribuir para a aquisição de novas técnicas de controle de doenças de plantas. REFERÊNCIAS Alves, E.S.S.; Santos, M.P.; Ventura, J.A.; Fernandes, P.M.B. Eficiência de óleos essenciais no controle in vitro da germinação de conídios e do crescimento micelial de Colletotrichum musae. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.27, p.75, 2002. Amorim, L. & Salgado, C.L. Diagnose. In: Bergamin Filho, A., Kimati, H. & Amorim, L. (Eds.) Manual de Fitopatologia Princípios e Conceitos. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. Balbino, J.M. S. & Marin, A.J. Importância socioeconômica da cultura do morango para o estado do Espírito Santo e o Planejamento da Produção Comercial. In: Balbino, J.M. S. (Ed.). Tecnologias para Produção, colheita e Pós-Colheita de Morangueiro. Vitória, ES: Incaper, 2004. (Documentos, 124). Balbino, J.M. S. (Ed.). Tecnologias para Produção, colheita e Pós-Colheita de Morangueiro. Vitória, ES: Incaper, 2004. (Documentos, 124). Bonaldo, S.M.; Schwan-Estrada, K.R.F.; Stangarlin, J.R., Tessmann, D.J. & Scapim, C.A. Fungitoxicidade, atividade elicitora de fitoalexinas e proteção de pepino contra Colletotrichum lagenarium, pelo extrato aquoso de Eucalyptus citriodora. Fitopatologia Brasileira, Lavras, v.29, p.128-134, 2004. Costa, H. & Ventura, J.A. Doenças do Morangueiro: Diagnóstico e Manejo. In: Balbino, J.M. S. (Ed.). Tecnologias para Produção, colheita e Pós-Colheita de Morangueiro. Vitória, ES: Incaper, 2004. (Documentos, 124). Dias-Arieira, C.R.; Ferreira, L.R.; Arieira, J.O.; Miguel, E.G.; Donega, M.A.; Ribeiro, R.C.F. Atividade do óleo de Eucalyptus citriodora e Azadirachta indica no controle de Colletotrichum acutatum em morangueiro. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.36, n.3, p.228-232, 2010. Fiori, A.C.G., Schwan-Estrada, K.R.F., Stangarlin, J.R., Vida, J.B., Scapim, C.A., Cruz, M.E.S. & Pascholati, S.F. Antifungal activity of leaf extracts and essential oils of some medicinal plants against Didymella bryoniae. Journal Phytopathology, v.148, p.483-487, 2000.
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