PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TESTES 72741

PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TESTES 72741 DISPOSITIVO PARA A DETECÇÃO QUALITATIVA/QUANTITATIVA DAS IgG ANTI-TOXOPLASMA GONDII NO SORO OU PLASMA HUMANO ATRAVÉS DA TÉCNICA IMUNOENZIMÁTICA IVD Para uso em diagnóstico in vitro Todos os reagentes são fabricados e comercializados no âmbito de um sistema de Qualidade estabelecido, desde a recepção das matérias primas até à distribuição do produto final. Cada lote é submetido ao controlo da qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de validação. A documentação relativa à produção e controlo de cada lote é arquivada.

RESUMO 1- OBJECTIVO DO DOSEAMENTO..........................103 2- INTERESSE CLÍNICO...................................103 3- PRINCÍPIO DO TESTE...................................104 4- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO..........................105 5- PRECAUÇÕES, HIGIENE E SEGURANÇA.....................106 6- MATERIAL NECESSARIO MAS NÃO FORNECIDO..............108 7- RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES, VALIDADE E CONSERVAÇÃO.109 8- AMOSTRAS.........................................110 9- MODO DE OPERAÇÃO.................................111 10- CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS..............112 11- PERFORMANCES E LIMITES DO TESTE.......................115 12- REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS............................119 102

1- OBJECTIVO DO DOSEAMENTO PLATELIA TM TOXO IgG TMB é um kit de diagnóstico in-vitro que permite a detecção qualitativa e quantitativa das IgG séricas, dirigidas contra a Toxoplasma gondii (T. gondii). 2- INTERESSE CLÍNICO T. gondii é um protozoário capaz de infectar inúmeras espécies de mamíferos e aves. Estas infecções são muito comuns no homem e nos animais, manifestando-se, na maior parte dos casos, de forma não aparente do ponto de vista clínico. A prevalência desta infecção na população, detectada através da presença de anticorpos específicos no soro, é variável em função da região atingida e da idade. No caso de uma primo-infecção da mãe durante a gravidez, esta infecção pode desencadear graves sequelas para o feto (em particular uma alteração das funções cerebrais) ou mesmo um aborto. Uma imunidade, mesmo que antiga, por parte da mãe, demonstrada pela presença de anticorpos IgG desde o início da gravidez, protege o feto da infecção por este parasita. A segunda população sensível a esta infecção é representada pelos doentes imunodeprimidos, ou seja, os doentes atingidos pela SIDA. Estas infecções são devidas, quase exclusivamente, a uma infecção a partir de um foco parasitário (quisto) quiescente do doente, pré-existente à infecção pelo vírus HIV. O diagnóstico de confirmação da infecção toxoplasmática é fornecido pela demonstração do parasita, mas a sua detecção por observação directa torna-se difícil, para não dizer até, aleatória. A serologia representa a base do diagnóstico e do acompanhamento da toxoplasmose. A evidenciação de anticorpos específicos permite afirmar uma contaminação por T. gondii; o estudo combinado dos anticorpos pertencentes a diferentes isotipos permite, geralmente, datar a infecção e orientar a terapêutica em caso de infecção recente ou propor medidas profilácticas adaptadas ao risco de instalação de uma toxoplasmose: medidas higienodietéticas nas mulheres grávidas não possuidoras de anticorpos, quimioprofilaxia nos indivíduos imunodeprimidos, seropositivos para T. gondii. 103

3- PRINCÍPIO DO TESTE O princípio desta técnica é uma dosagem imuno-enzimática em fase sólida, designada como técnica de "ELISA indirecta". O antigénio solúvel de T. gondii, utilizado para sensibilizar a microplaca provém de uma preparação proveniente da superfície de taquizoitas altamente concentrada em proteínas membranares. Um anticorpo monoclonal, marcado com peroxidase, específico das cadeias gama humanas (IgG) é utilizado como conjugado. 1 fase Os soros a estudar, assim como as substâncias de controlo, são diluídos a 1/101 e depois depositados nos poços da microplaca. Durante esta incubação, 1 hora a 37, as IgG anti-t.gondii presentes na amostra ligam-se ao antigénio toxoplasmático fixado nos poços da microplaca. As IgG sem especificidade anti-t. gondii e outras proteínas séricas são eliminadas por meio de lavagens efectuadas no final da incubação. 2 fase O conjugado (anticorpo monoclonal específico das cadeias gama humanas, marcado com peroxidase) é depositado em todos os poços da microplaca. Durante esta segunda incubação, 1 hora a 37, o anticorpo marcado vai ligar-se às IgG séricas que reagiram com o antigénio toxoplasmático. O conjugado não ligado é eliminado por meio de lavagens efectuadas no final da incubação. 3 fase A presença do complexo imune (Ag toxoplasmática, IgG séricas anti- T. gondii, conjugado anti-igg) é revelada por adição, em cada poço, de uma solução de revelação enzimática. 4 fase Após 1/2 hora de incubação à temperatura ambiente do laboratório, a reacção enzimática é interrompida por uma solução de ácido sulfúrico 1N. A densidade óptica obtida a 450/620 nm é proporcional à quantidade de IgG anti-t. gondii. A leitura numa gama de referência permite obter a titulação de soro em UI/ml (Unidade Internacional). Os soros de controlo (R4a, R4b, R4c) são calibrados em função do padrão da OMS (TOXM 185). 104

4- COMPOSIÇÃO DO KIT Todos os reagentes destinam-se ao uso exclusivo do diagnóstico in vitro. Etiqueta Natureza dos reagentes Presentação R1 Microplate Microplaca: 12 tiras de 8 poços cada, sensibilizados 1 placa com antigénios de T.gondii (estirpe RH). R2 Concentrated Solução de lavagem: 1 frasco Washing Tampão Tris NaCl, ph 7,4, 1 % Tween 20. 100 ml Solution Concentrado 10 vezes Conservante: 0,01 % Thimerosal. R3 Calibrator 0 Calibrador 0 : Soro humano não reactivo 1 frasco para as IgG anti-t. gondii e negativo em antigénio 1 ml HBs e em anticorpos anti-vih1, anti-vih2 e anti-vhc Conservante: < 0,01% Timerosal R4a Calibrator 6 Calibrador 6 UI/ml: Tampão TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), 1 frasco soro humano reactivo para as IgG anti-t. gondii e 1 ml negativo em antigénio HBs e em anticorpos anti-vih1 anti-vih2 e anti-vhc, albumina bovina, glicerol, E 102 e E 122 Conservante : < 0,01% Timerosal e < 0.5% Proclin. R4b Calibrator 60 Calibrador 60 UI/ml: Tampão TRIS-NaCl (ph 8 ± 0.2), 1 frasco soro humano reactivo para as IgG anti-t. gondii e 1 ml negativo em antigénio HBs e em anticorpos anti-vih1, anti-vih2 e anti-vhc, albumina bovina, glicerol, E 102 e E 122 Conservante : < 0,01% Timerosal e < 0.5 % Proclin. R4c Calibrator 240 Calibrador 240 UI/ml: Tampão TRIS-NaCl 1 frasco (ph 8 ± 0.2), soro humano reactivo para as 1 ml IgG anti-t. gondii e negativo em antigénios HBs e em anticorpos anti-vih1, anti-vih2 e anti-vhc, albumina bovina, glicerol, E 102 e E 122 Conservante : < 0,01% Timerosal e < 0.5% Proclin R6 Conjugate Conjugado: Anticorpo monoclonal de origem 1 frasco (50x) murina anti-cadeias gama humanas, 0.6 ml com ligação a peroxidase; apresentado sob uma forma líquida, concentrada 50 vezes. 105

R7 Diluent Diluente para amostra e conjugado pronto a utilizar: 2 frascos TRIS-NaCl (ph 7,7 ± 0,15), albumina bovina, 80 ml 0,1% de Tween 20 e vermelho de fenol Conservante : < 0,01 % Timerosal R8 TMB Tampão substrato: Solução de ácido cítrico e 1 frasco Substrate de acetato de sódio ph 4,0, 60 ml Buffer contendo 0.015% d H 2 O 2 e 4% de DMSO. R9 Chromogen: Cromogénio: 1 frasco TMB Solution Solução contendo tetrametil benzidina (TMB). 5 ml R10 Stopping Solução de paragem: 1 frasco Solution Solução de ácido sulfúrico 1N. 28 ml Películas adesivas 4 5- PRECAUÇÕES, HIGIENE E SEGURANÇA Precauções A qualidade dos resultados está dependente da observância das Boas Práticas de Laboratório seguintes: Não utilizar reagentes fora do prazo. Não misturar reagentes de lotes diferentes durante um mesmo teste. NOTA: Pode utilizar outros lotes de solução de lavagem (R2 identificado 10 x a azul na etiqueta), de tampão de substrato (R8 identificado TMB buf. a azul), de cromogénio (R9 identificado TMB sol. a verde) e de solução de paragem (R10 identificado 1N a vermelho), além dos fornecidos no dispositivo, desde que utilize um só e do mesmo lote durante o mesmo teste. Estes reagentes podem ser igualmente utilizados com outros dispositivos do nosso catálogo. Contacte os nossos serviços técnicos para obter informações mais detalhadas. Antes de utilizar deverá esperar 30 minutos para que os reagentes fiquem à temperatura ambiente. Reconstitua cuidadosamente os reagentes evitando contaminação. Não realize o teste em presença de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldeídos) ou de poeiras que poderiam alterar a actividade enzimática do conjugado. Utilize material de vidro lavado e enxaguado com água destilada, ou de preferência, material descartável. Não deixe a microplaca secar entre o final da lavagem e a distribuição dos reagentes. 106

A reacção enzimática é muito sensível a todos os metais e iões metálicos. Consequentemente, nenhum elemento metálico poderá entrar em contacto com as diferentes soluções contendo o conjugado ou o substrato. A solução de revelação (tampão substrato + cromogénio) deve ser incolor. O aparecimento de coloração azul nos minutos que se seguem à reconstituíção indica que o reagente está contaminado e que deve ser substituído. Para esta preparação utilize, de preferência, recipientes e material de distribuição de plástico descartável ou de vidro previamente lavado com ácido clorídrico 1N, enxaguado com água destilada e seco. Conserve a solução ao abrigo da luz. Utilize uma ponta de distribuição nova para cada amostra. A lavagem dos poços é uma etapa essencial da manipulação: respeite o número de ciclos de lavagem prescritos e assegure-se de que todos os poços estão cheios e que ficam vazios a seguir. Uma lavagem deficiente pode causar resultados incorrectos. Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de revelação. Verifique a exactidão das pipetas e o bom funcionamento dos aparelhos utilizados. Não modifique o modo operatório. Conselhos de higiene e segurança Todos os reagentes destinam-se à utilização de diagnóstico in vitro. Utilize luvas descartáveis aquando da manipulação dos reagentes. Não pipete com a boca. O material de origem humana utilizado na preparação dos reagentes foi testado e deu não-reactivo em antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs), em anticorpos dirigidos contra o vírus da hepatite C (anti-hcv), em anticorpos dirigidos contra o vírus da imunodeficiência humana (anti-vih-1 e anti-vih-2). Dado o facto de nenhum método poder garantir de forma absoluta a ausência de agentes infecciosos, deve considerar os reagentes de origem humana, bem como todas as amostras de pacientes, como estando potencialmente infectadas, e deve manipulá-los com as devidas precauções de utilização. Considere o material directamente em contacto com as amostras e os reagentes de origem humana, bem como as soluções de lavagem, como produtos contaminados. 107

Evite derrames de amostras ou de solução que as contenham. As superfícies salpicadas devem ser limpas com lixívia diluída a 10%. Se o líquido contaminante for um ácido, as superfícies deverão ser neutralizadas antes com bicarbonato de soda, e limpas com lixívia e secas com papel absorvente. O material utilizado para a limpeza deverá ser colocado dentro de um contentor para resíduos contaminados. As amostras, os reagentes de origem humana, bem como o material e os produtos contaminados deverão ser eliminados após descontaminação: - quer por imersão em lixívia concentrada a 5% com hipoclorito de sódio durante 30 minutos, - quer por autoclavagem a 121ºC durante 2 horas no mínimo. O autoclave a 121ºC, durante 1 hora no mínimo é o melhor processo de inactivação dos vírus VIH e do vírus da hepatite B. ATENÇÃO: NÃO INTRODUZIR NO AUTOCLAVE SOLUÇÕES CONTENDO HIPOCLORITO DE SÓDIO. ATENÇÃO: : certos reagentes contêm: * Pro Clin 300 < 0.5% : PRODUTO IRRITANTE R43 : pode provocar uma sensibilização por contacto com a pele S28/37 : após contacto com a pele, lave imediata e Xi-irritante abundantemente com água e sabão. Deve utilizar luvas apropriadas. A manipulação e eliminação dos produtos químicos deve ser feita de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais. Evite o contacto da pele e mucosas com o tampão de substrato, o cromogénio e solução de paragem (risco de toxicidade, irritação e queimadura). A ficha de dados de segurança encontra-se disponível a pedido. 6- MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO 108 Agitador tipo vortex. Aparelho de leitura* para microplacas (equipado com filtros 450/620nm). Banho-maria ou incubadora a seco*, podendo ser termostatizados a 37±1 C. Contentor de resíduos contaminados. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. Água destilada. Provetas graduadas de 25, 50, 100 e 1 000 ml.

Luvas descartáveis. Óculos de protecção. Papel absorvente. Pipetas, multipipetas automáticas ou semi-automáticas, reguláveis ou fixas podendo distribuir de 10 a 1000 µl e 1, 2 e 10 ml Sistema de lavagem automático*, semi-automático* ou manual para microplacas. Tubos descartáveis. (*) Consulte-nos para mais informações em relação aos aparelhos aprovados pelos nossos serviços técnicos. 7- RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES, VALIDADE E CONSERVAÇÃO O dispositivo deverá ser guardado a +2-8 C. Cada elemento do dispositivo, antes de aberto, conservado a +2-8ºC pode ser utilizado até à data limite indicada na embalagem. Nota: antes de utilizar deixe que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18-30 C). 1) Reagentes prontos a utilizar Reagente 1 (R1): microplaca Cada suporte contendo 12 tiras vem dentro de um saco com fecho. Corte o saco com tesoura ou bisturi 0,5 a 1 cm por baixo do fecho. Abra o saco e retire o suporte. Volte a colocar no saco as tiras que não utilizar. Acondicione o saco e guarde-o a +2-8ºC. As tiras mantêm-se estáveis durante 1 mês. Reagente 3 (R3), reagente 4a (R4a), reagente 4b (R4b), reagente 4c (R4c), reagente 10 (R10): Depois de abertos, os reagentes conservados a +2-8 C, na ausência de contaminação, mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na etiqueta. 2) Reagentes a reconstituir Reagente 2 (R2): solução de lavagem concentrada 10 X Diluir 10 vezes a solução em água destilada (100 ml de R2 para 900 ml de água destilada) a fim de obter a solução de lavagem pronta a utilizar. Deve preparar aproximadamente 350 ml para uma placa de 12 tiras para uma lavagem manual. Após diluição, a solução de lavagem conserva-se 2 semanas a +2-8 C. A solução de lavagem concentrada pode ser conservada a +2-25 C. 109

Solução de trabalho do conjugado: reagente 6 (R6) + reagente 7 (R7) O conjugado R6 apresenta-se sob uma forma líquida concentrada 50 vezes. Para uma microplaca, diluir extemporaneamente 0,5 ml do conjugado (R6) em 25 ml de solução de diluição (R7). Para uma tira, dividir os volumes por 10. O conjugado diluído deve ser utilizado na hora a seguir à reconstituição. Solução de revelação enzimática: reagente 8 (R8) + reagente 9 (R9) Diluir 11 vezes a solução de cromogénio (R9) no tampo substrato (R8) (ex: 1ml de reagente R9 + 10 ml de reagente R8). Após diluição, os reagentes conservados no escuro mantêm-se estáveis durante 6 horas à temperatura ambiente (+18-30 C). 8- AMOSTRAS 110 1.Os testes são efectuados em amostras de soro ou de plasma (recolhidas em anti-coagulantes tais como EDTA, Heparina e Citrato) 2.Respeitar as seguintes instruções para recolha, tratamento e conservação destas amostras de sangue: - Proceder à recolha da amostra de sangue segundo a prática em vigor. - Para os soros, deixar que o coágulo se forme completamente antes de passar à centrifugação. - Conservar os tubos fechados - Após centrifugação, extrair o soro ou o plasma do coágulo ou dos eritrócitos e conservá-lo em tubo fechado. - As amostras devem ser conservadas à temperatura de +2-8 C se a análise for efectuada no prazo de 7 dias. - Se a análise não for realizada no prazo de 7 dias, ou em caso de transporte, as amostras devem ser congeladas a -20 C (ou mais frio). - Não congelar / descongelar as amostras mais de três vezes. - As amostras devem ser cuidadosamente homogeneizadas (vórtex) após descongelação, antes de se proceder à análise. 3. Os resultados não são afectados por amostras contendo 90 g/l de albumina ou 100 mg/l de bilirrubina, amostras lipémicas contendo o equivalente a 36 g/l de trioleína (triglicérido) ou amostras hemolizadas contendo 10 g/l de hemoglobina. 4. Não aquecer as amostras.

9- MODO OPERATÓRIO Siga estritamente o protocolo proposto. Utilize os controlos em cada realização do teste para validar a qualidade do teste. Aplique as Boas Práticas Laboratoriais. 1) Estabeleça cuidadosamente o plano de distribuição e identificação das amostras. 2) Prepare a solução de lavagem diluída (R2) (consulte o capítulo 7). 3) Retire o suporte e as tiras (R1) da embalagem. 4) Lave uma vez todos os poços da microplaca com a solução R2 diluída. Seque a placa, invertendo-a sobre uma folha de papel absorvente. 5) Dilua as amostras a testar e os calibradores de 1/101 : 10 µl de soro + 1 ml de diluente R7. Homogeneizar bem (vortex) 6) Distribua os calibradores e amostras diluídos segundo o esquema seguinte: Poço A1: 200 µl de calibrador 0 (R3) Poço B1: 200 µl de calibrador 6 UI/ml (R4a) Poço C1: 200 µl de calibrador 60 UI/ml (R4b) Poço D1: 200 µl de calibrador 240 UI/ml (R4c) Poços E1, F1, G1, H1: 200 µl de amostras diluídas 7) De preferência, cubra a microplaca com uma película adesiva, pressionando bem sobre toda a superfície para assegurar a estanqueidade. Em seguida, Incube a microplaca em banho-maria termostatizado ou em incubadora a seco de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 ± 1 C. 8) Antes da primeira incubação, prepare a solução de conjugado R6 numa diluição a 1/50: 0,5 ml de conjugado R6 + 25 ml de solução R7 (volume para uma microplaca) (ver o capítulo 7). Homogeneizar bem. 9) No fim da primeira incubação, retire a película adesiva, aspire o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados (contendo hipoclorito de sódio) e proceda a 3 lavagens. Seque a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente. Se dispuser de lavador automático, respeite o mesmo ciclo operatório (ver o capítulo 10). 10)Distribua 200 µl da solução de trabalho de conjugado (R6 + R7) em todos os poços. Esta solução deve ser agitada antes de ser utilizada. 111

11) De preferência, cubra com uma nova película e incube a microplaca em banho-maria termostatizado ou em incubadora a seco de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 ± 1 C. 12)No fim da segunda incubação, retire a película adesiva, aspire o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados e proceda a 4 lavagens. Seque a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente. Se dispuser de lavador automático, respeite o mesmo ciclo operatório. 13) Distribua rapidamente em todos os poços 200 µl da solução de revelação enzimática (R8+R9), previamente preparada. Deixe a reacção desenvolver-se no escuro durante 30 minutos à temperatura ambiente (+18-30 C). Quando se der a incubação não utilize película adesiva. 14)Adicione 100 µl de solução de paragem (R10) adoptando a mesma sequência e o mesmo ritmo de distribuição que para a solução de revelação. 15) Limpe cuidadosamente a parte de baixo das placas. Leia a densidade óptica a 450/620 nm com o auxílio de um leitor de placas nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção. As tiras devem ser sempre conservadas fora do alcance da luz antes da leitura. 16) Antes de transcrever os resultados, certifique-se de que existe concordância entre a leitura e o plano de distribuição e de identificação das placas e das amostras. 10- CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1)Referências de aferição A presença e a quantidade de anticorpos de classe IgG dirigidos contra T. gondii na amostra de teste são determinados por comparação da densidade óptica da amostra com uma gama de controlo (DO = função UI/ml). Os soros de calibração R4a, R4b, R4c são calibrados em relação ao padrão OMS (TOXS M 185). Embora os soros de calibração utilizados neste dispositivo sejam aferidos em função do soro O.M.S., podem observar-se certas discrepâncias de titulo para um mesmo soro, quando testado por diferentes técnicas serológicas. Esta discrepância é devida ao facto de os antigénios toxoplasmáticos utilizados nestas diferentes técnicas terem proporções variáveis de antigénios membranares e solúveis. 112

2)Validação do teste Análise dos resultados obtidos com os calibradores em cada microplaca para cada teste. Para validar a manipulação devem ser respeitados os critérios seguintes: Valores das densidades ópticas: - DO R3 0,200 - DO R4c 1,000 Relação: - DO R4a / DO R3 2 Se estas especificações não forem respeitadas dever-se-à repetir a manipulação. 3)Traçado da curva padrão a) Criação da curva padrão Em papel milimétrico, inscrever no eixo vertical (eixo dos Y), as densidades ópticas dos calibradores (R4a, R4b, R4c) e do R3. Inscrever no eixo horizontal (eixo dos X) a concentração correspondente em UI/ml. Traçar a curva. b) Determinação em UI/ml da amostra testada A partir da DO obtida para cada amostra testada é possível determinar a concentração correspondente em anticorpos IgG dirigidos contra T. gondii. Para isso: 1) procurar no eixo dos Y o valor correspondente à densidade óptica da amostra e, depois, traçar uma linha horizontal até à gama padrão. 2) no ponto de inserção, baixar uma linha vertical até ao eixo dos X. Ler a concentração em UI/ml no ponto de inserção com o eixo dos X. NB: Só se pode calcular as UI/ml de uma amostra se a densidade óptica obtida para essa amostra diluída a 1/101 ou a 1/1010 estiver compreendida dentro do intervalo das densidades ópticas para os valores R4a e R4c da gama padrão. Para os soros diluídos a 1/1010, multiplicar por 10 os UI/ml obtidos no eixo dos X. 4)Interpretação dos resultados A dosagem de IgG anti-t. gondii para o dispositivo Platelia TM Toxo IgG TMB permite definir o estado imunitário de um doente. Titulação < a 6 UI/ml : taxa não significativa nesta técnica = ausência de imunidade. 113

6 UI/ml Titulação 9 UI/ml: taxa não significativa de IgG anti-t. gondii = o resultado desta única dosagem não constitui comprovação suficiente para estabelecer o estado imunitário do doente em relação a T. gondii; em conformidade com as disposições previstas em França pela nomenclatura, deverá ser realizado um controlo numa nova recolha por, pelo menos, 2 técnicas diferentes, uma das quais distinta da utilizada aquando do primeiro exame. 9 UI/ml < Titulação 240 UI/ml: taxa significativa de IgG anti-t.gondii = imunidade antiga ou início de seroconversão. Titulação > 240 UI/ml: taxa de IgG anti-t.gondii elevada = seroconversão recente ou taxa elevada persistente observada em certos indivíduos. Limites do procedimento: O diagnóstico de uma infecção recente pelo parasita só pode ser estabelecido com base num conjunto de dados clínicos e serológicos. O resultado de uma só dosagem não constitui comprovação suficiente para o diagnóstico de uma infecção recente. Apenas um conjunto de dados clínicos e serológicos (aumento significativo do titulo de IgG anti- T. gondii proveniente de 2 soros de um mesmo doente, recolhidos no mínimo com 3 semanas de intervalo e testados durante uma única dosagem, presença de IgM anti-t. gondii a uma taxa significativa) permite o diagnóstico de uma infestação recente pelo parasita. É necessário detectar os IgM anti-t. gondii durante o controlo serológico da mulher grávida, podendo o aparecimento de IgG anti-t.gondii apresentar-se ligeiramente retardado comparativamente às IgM anti-t.gondii (dispositivo Platelia TM Toxo IgM TMB). 5)Causas de erro A origem das reacções não validadas ou não reprodutíveis está, muitas vezes, relacionada com as causas seguintes: Lavagem deficiente das microplacas Contaminação das amostras negativas por um soro ou um plasma contendo titulação elevada de anticorpos. Contaminação pontual da solução de revelação por agentes químicos oxidantes (lixívia, iões metálicos), Contaminação pontual da solução de paragem. 114

6)Exemplos de resultados obtidos com PLATELIA TM TOXO IgG TMB Nota: Os dados seguintes constituem apenas um exemplo e não devem ser utilizados em substituição dos dados obtidos pelo utilizador. Quadro de resultados Soros e DO medida a Concentração Calibradores 450 nm - 620 nm Final em UI/ml CALIBRADORES R3 (negative) 0.121 0 R4a 0.615 6 R4b 1.466 60 R4c 2.099 240 SOROS / DILUIÇÕES Soro n 1 (1/101) 0.108 Negativo Soro n 2 (1/101) 0.675 7 UI/ml Soro n 3 (1/101) 0.808 12 UI/ml Soro n 4 (1/101) 2.080 231 UI/ml Soro n 5 (1/101) 1.283 43 UI/ml NB: Para as diluições a 1/1010, multiplicar o resultado obtido por 10. Validação do teste obtido: - Valor das densidades ópticas:. DO R3 0,200. DO R4c 1,000 - Relação:. DO R4a / DO R3 2 11- PERFORMANCES E LIMITES DO TESTE 1.Performances As performances do dispositivo PLATELIA TM TOXO IgG TMB, a seguir resumidas, foram estabelecidas em 2 locais diferentes, utilizando amostras de soros frescos provenientes de mulheres grávidas, de imunodeprimidos ou de dadores de sangue presumidos de boa saúde, bem como amostras de soros congelados negativos e positivos. 115

Estudos comparativos Os estudos foram conduzidos através da comparação de PLATELIA TM TOXO IgG TMB com outros testes EIA comercializados. A análise dos resultados discordantes foi efectuada por outro método designado de aglutinação directa. A concordância relativa, a especificidade relativa e a sensibilidade relativa nos soros frescos foram determinadas em 1 local (23 amostras duvidosas não incluídas). Platelia TM Toxo IgG TMB Resultado Negativo Positivo Total Outro teste EIA Negativo 488 0 488 Positivo 5 271 276 Total 493 271 764 Resultados do estudo prospectivo Especificidade relativa 488/488 100% (99.0 100.0) Sensibilidade relativa 271/276 98.2% (95.6 99.3) Concordância relativa 759/764 99.3% - (98.8 99.9) Estudos de Especificidade A especificidade do teste Platelia TM Toxo IgG TMB foi determinada em 2 locais independentes. Os testes Toxo IgG ELISA utilizados para a caracterização prévia das amostras estão disponíveis comercialmente. Um teste de aglutinação foi utilizado como 3ª técnica para resolução dos resultados discordantes. Os resultados de especificidade (amostras duvidosas excluídas) são: - local 1: 100% (404/404) - local 2: 100% (488/488) Total: 99,9% (891/892) Estudos de Sensibilidade: A sensibilidade do teste Platelia TM Toxo IgG TMB foi determinada em 2 locais independentes. Os testes Toxo IgG ELISA utilizados para a caracterização prévia das amostras estão disponíveis comercialmente. Um teste de aglutinação foi utilizado como 3ª técnica para resolução 116

dos resultados discordantes. Os resultados de sensibilidade (amostras duvidosas excluídas) são: - local 1: 100% (196/106) - local 2: 98,2% (271/276) Total: 98,9% (467/472) Os painéis de seroconversões (locais 1 e 2) têm controlos de infecção (local 1) correspondentes a: 84 amostras de 33 mulheres grávidas 48 amostras de 14 mulheres grávidas foram testados com Platelia TM Toxo IgG TMB. Os testes Toxo IgG ELISA utilizados para a caracterização prévia das amostras estão disponíveis comercialmente. Um teste de aglutinação foi utilizado como 3ª técnica para resolução dos resultados discordantes. No local 1, Platelia TM Toxo IgG TMB detecta as seroconversões com 1 ou 2 colheitas de avanço em 5 casos, relativamente ao teste EIA adoptado como comparação. No local 2, Platelia TM Toxo IgG TMB apresenta um atraso de 1 ou 2 colheitas em relação ao teste de comparação, em 6 casos. Prevalência A prevalência de resposta positiva para os anticorpos específicos do tipo IgG contra T. gondii é muito variável de um país para outro, ou mesmo de região para região. Na região parisiense é de 67,6%: FREQUÊNCIA 80 70 60 50 40 30 20 10 0 68 69 ESTUDO PROSPECTIVO EM 216 SEROS 0 10 1 1 3 2 5 0 0 0 TITULO UI/ml 30 32 34 31 23 65 <2 [2-4[ [4-6[ [6-8[ [8-10[ [10-20[ [20-40[ [40-80[ [80-160[ 22 17 19 [160-240[ Platelia Toxo G TMB EIA Assay > 240 0 117

2.Precisão Reprodutibilidade intra-testes: 3 amostras positivas e 1 negativa foram testadas 30 vezes na mesma série. Amostra Negativo Positivo 1 Positivo 2 Positivo 3 Ratio Titulação UI/ml Titulação UI/ml Titulação UI/ml Média 0.25 11 38 110 DP 0.02 0.83 1.35 9.53 CV % 6.29 7.57 3.55 8.64 Reprodutibilidade inter-testes: 3 amostras positivas e 1 negativa foram testadas em triplo 5 dias diferentes por 2 técnicos diferentes. Amostra Negativo Positivo 1 Positivo 2 Positivo 3 Ratio Titulação UI/ml Titulação UI/ml Titulação UI/ml Média 0.22 11.8 39.2 127.5 DP 0.08 1.65 5.14 14.13 CV % 34.11 13.90 13.10 11.08 118

3.Reactividade cruzada 141 amostras positivas por marcadores susceptíveis de dar reacções cruzadas: especificidade = 99,29% (140/141) AmostraNúmero Número Comentário / Marcador Reactivo CMV IgG 5 1 Negativo após controlo CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Papeira IgG 7 0 Papeira IgM 3 0 Sarampo IgG 7 0 Sarampo IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Rubéola IgG 5 0 Rubéola IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Mieloma 8 0 Factores reumatóides 15 0 Autoanticorpos (ANA) 10 0 HAMA 3 0 Total 141 1 119

12 REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443. 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581. 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285. 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxo-plasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 18, 271-275. 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315. 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIVinfected patients.aids 1996; 10, 1521-1527. 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.: Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234. 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988). 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906. 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913. 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977. 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. : Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158. 13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158. 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805. 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222. 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262. 17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxo-plasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49. 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332. 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660-663.

20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269. 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983. 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69. 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115. 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.

RESUMO DO MODO OPERATÓRIO 1. Regular a temperatura da incubadora termostatizada a 37±1 C. 2. Diluir a 1/11 o cromogénio R9 no substrato R8 (solução de revelação: R8+R9) 3. Diluir a solução de lavagem R2 a 1/10 (R2d) 4. Lavar todos os poços 1 vez com a solução de lavagem diluída (R2d) 5. Diluir os calibradores e as amostras a 1/101 com R7 6. Distribuir os calibradores e as amostras diluídas a 1/101 nos poços, como segue: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 E5 B R4a E6 C R4b E7 D R4c E8 E E1 E9 F E2 E10 G E3 E11 H E4 E12 7. Incubar durante 1 hora a 37 C. 8. Preparar a solução de trabalho do conjugado, diluindo R6 a 1/50 em R7 9. Aspirar e, depois, lavar 3 vezes com a solução de lavagem diluída (R2d) 10.Distribuir 200 µl de solução de conjugado (R6+R7) em todos os poços. 11.Incubar durante 1 hora a 37 C. 12.Aspirar e, depois, lavar 4 vezes com a solução de lavagem diluída (R2d) 13.Distribuir 200 µl de solução de revelação (R8+R9) em todos os poços. 14.Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente (+18-30 C) ao abrigo da luz. 15.Distribuir 100 µl de solução de paragem (R10) em todos os poços. 16.Ler as absorções no espectrofotómetro a 450/620 nm. 120

0459 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 05/2006 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881002