Agrobiotecnologia: ponto de vista técnicocientífico Como se produz uma planta transgénica? Sofia Duque Introdução ao DNA: DNA DNA- Ácido desoxirribonucleico ( deoxyribonucleic acid ) Esta molécula armazena a informação genética do organismo e regula o processo metabólico da vida. Encontra-se em todas as células dos organismos vivos e em alguns vírus (vírus de DNA). Cromossoma Estruturas constituídas por DNA e que permitem a transmissão da informação genética. Cada espécie possui um numero característico de cromossomas (ex: 46 nas células humanas não reprodutoras). 1
Genes Um gene é uma unidade hereditária constituída por uma sequencia de DNA e que ocupa uma posição especifica num cromossoma. Um gene contem a informação necessária para a construção de uma proteína especifica. É responsável por uma característica geneticamente determinada (ex: resistência a um herbicida, resistência a vírus). Informação genética A informação genética está contida na sequencia de quatro moléculas (bases azotadas) que são: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Estas unidades encontram-se ligadas a um açúcar C5 (desoxirribose) e a um ácido fosfórico, criando uma estrutura denominada nucleótido. RNA RNA- Ácido ribonucleico ( ribonucleic acid ) Esta molécula copia a informação que recebe do DNA e traduz essa informação de modo a que sejam produzidas as proteínas necessárias a vida. Transcrição Tradução DNA mrna Proteína Característica Tradução da informação genética A informação genética contida no DNA é copiada para o RNA, por emparelhamento das bases azotadas (C::G) e (A::U). Nota: No RNA a base timina (T) é substituída pelo uracilo (U). No RNA, estas unidades encontram-se ligadas a um açúcar (ribose) e a um acido fosfórico. O RNA e usualmente uma molécula linear. 2
Proteínas Proteínas são longos polímeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Existem 20 aminoácidos diferentes e é a ordem e tipo de aa ligados que caracterizam uma proteína. Os genes codificam para diferentes proteínas, estas podem funcionar como enzimas (catalizadores de reacções químicas), como unidades estruturais ou de armazenamento na célula. O código genético O código genético; que é estabelecido pela ligação sequencial das quatro moléculas anteriormente referidas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T); é posteriormente transcrito para o RNAm (sob a forma de U, G, C e A) e traduzido para ligar aminoácidos com vista a formar proteínas. Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico O que é um OGM? OGMs Organismos geneticamente modificados são organismos que são manipulados por engenharia genética (EG). A EG ou tecnologia do DNA recombinante é o processo de transferência de genes individuais, seleccionados, de um organismo para outro, com o objectivo de reproduzir características da espécie original. Quais as vantagens? Saúde: Produtos mais baratos e mais seguros; fonte mais barata de vacinas; aumento do valor nutricional em alimentos. Agricultura: Resistência a pestes e doenças; tolerância a factores ambientais; resistência a herbicidas; aumento de produtividade; maior tempo de armazenamento; alteração da cor e do sabor. Biotecnologia 3
Exemplos: Produção de fármacos - 1982 - Primeiro fármaco (insulina) produzido por engenharia genética (EG) consistiu na clonagem de DNA humano em bactérias. (Inicialmente a insulina comercial era derivada de suínos). Alguns agentes biofarmacêuticos produzidos por EG e aprovados para comercialização. Nome comercial Substancia Finalidade Laboratorio Humulin Insulina Tratamento da diabetes (Dezembro, 1990). Lilly Farma humana Activase alteplase Tratamento enfarte do miocárdio (Novembro, 1987) Genentech, Inc. recombinante e embolismo pulmonar agudo (Junho, 1990). Adagen adenosina Tratamento de bebés e crianças com Enzon, Inc. diaminase imunodeficiência severa (Março, 1990). Engerix-B - Vacina recombinante contra hepatite B (Setembro, 1989). Humatrope somatropina Tratamento da deficiência na hormona de crescimento em crianças (Março, 1987). SmithKline Beecham Eli Lilly & Co. Plantas geneticamente modificadas Plantas geneticamente modificadas foram patenteadas em 1985. No entanto, só na década seguinte foram comercializadas as primeiras plantas transgénicas (tomate FlavrSavr, Calgene). Fonte:USDA Outros exemplos: Cultivares Bt resistentes a insectos "Bt" de Bacillus thuringiensis. Uma bactéria do solo cujos esporos contem uma proteína cristalina (CRY). No sistema digestivo do insecto esta proteína degrada-se e liberta uma toxina, denominada delta-endotoxina. Esta toxina paralisa o sistema digestivo provocando a morte do insecto. 4
O que são cultivares Bt? Cultivares em que foi inserido, no próprio DNA da planta, uma versão modificada do gene Cry da bactéria. A planta passa a produzir a toxina e quando o insecto se alimenta da planta, ingere a toxina e morre em poucos dias. Fonte:CIB Fonte:USDA Broca do milho (esquerda) e do algodão (direita), são duas pestes controladas pelo milho e algodão Bt, respectivamente. A utilização de variedades Bt reduziu drasticamente o uso de pesticidas químicos. Milho Bt (esquerda) e convencional (direita) Fonte:CIB Campo de milho Bt (Odemira, Portugal)-Out 05 Como se produz uma planta transgénica? Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante Inserção estável, no genoma de uma planta, de uma sequência codificante e expressável. Essa sequência tem que ser transferida e expressa na descendência. 1) Seleccionar genes responsáveis por características de interesse: É o processo mais limitativo desta tecnologia. Consiste no isolamento e caracterização de sequencias de DNA responsáveis por características agronomicamente relevantes. Conhecer os genes responsáveis pelo aumento da produtividade, melhoria na tolerância os stress, alteração de propriedades químicas, ou outros, que possam afectar as características das plantas. Identificar um gene responsável por uma característica não e normalmente suficiente; é necessário conhecer os mecanismos reguladores, que outros efeitos poderá ter na planta e como interactua com outros genes. 5
Que características se podem introduzir nas plantas com recurso à Engenharia Genética? Resistência a insectos, nematodes, fungos, bactérias e vírus. Resistência ao frio, à seca, à salinidade, a determinado herbicida e a determinado metal pesado. Alteração do conteúdo nutricional em aminoácidos, vitaminas, antioxidantes, fibras, ácidos gordos, hidratos de carbono, micronutrientes. Alteração da cor, do sabor, da fragrância, e da textura 2) Clonagem de genes seleccionados Após selecção de um gene de interesse é necessário uma série de modificações antes da efectiva inserção na planta. Isolar e clonar as sequências do DNA Escolher um promotor Possibilidade de alterar o gene clonado (ex: no gene Bt, nucleótidos A-T foram substituídos por G-C, aumentando a produção da proteína em plantas) Incluir uma sequência terminadora Adicionar um gene marcador ou de selecção Acção da enzima de restrição EcoRI Gene de selecção promotor transgene ter 6
3) Métodos de transferência Transformação mediada pelo Agrobacterium As primeiras tentativas de transferência de genes para plantas consistiram na utilização do Agrobacterium tumefaciens utilizando o sistema natural de transferência de DNA que na natureza produz a doença conhecida por crown gall Agrobacterium tumefaciens É uma bactéria do solo (Gram-), capaz de colonizar geneticamente as plantas devido a presença de um plasmídeo, plasmídeo Ti ( tumor inducing ). Uma região do plasmídeo Ti, T-DNA ( Transferred- DNA ), é transferida e integrada no genoma da planta durante o processo de infecção. Célula de Agrobacterium tumefaciens. Nota: A transformação é feita célula a célula Transformação de uma planta com Agrobacterium tumefaciens. 7
Plasmídeo Ti T-DNA region Cytokinin Auxin Opine Left border Right border 12-24 kbp vir genes ori Opine catabolism Como se constrói um vector para transformação 8
1 3 2 Transformação de uma planta com Agrobacterium tumefaciens. 1 - Co-cultura; 2 - Diferenciação em presença de agente selectivo; 3 - interacção entre a bactéria e a célula vegetal. (adaptado de várias publicações) 4) Sistema de selecção dos tecidos transformados Após a inserção do transgene na célula vegetal os tecidos são transferidos para um meio selectivo. Este meio contém um antibiótico ou herbicida, dependendo do gene de selecção que foi introduzido no plasmídeo. Apenas as plantas que expressam o gene de selecção irão sobreviver, assumindo-se que essas plantas também possuem o transgene de interesse. Nos passos subsequentes do processo apenas serão utilizadas plantas que sobreviveram a selecção. Em meio selectivo sobrevivem apenas as plantas que integraram o transgene. 9
5) Sistema de regeneração A indução e diferenciação de embriões somáticos em Medicago truncatula Transformação da M. truncatula Ferimento dos explantes com lâmina infectada numa suspensão de Agrobacterium Meio de indução de embriões (com fitoreguladores : 2,4 D e Zeatina) 5 dias co-cultura, escuras Selecção tecidos transgénicos em 100mg/l Canamicina Eliminação do Agrobacterium em 500 mg/l Carbenicilina Diferenciação e maturação dos embriões somáticos (meio sem fitoreguladores) 10
Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico Aclimatação e transferência para a estufa das plantas in vitro. Resultados Um processo relativamente moroso.. 154 explants 64 embriões somáticos 33 potenciais linhas transgénicas 75 Can R agregados embriogénicos 40 linhas Can R enraizaram em 50 mg/l Can Transferidas para a estufa para obter sementes 1-2 meses 2-3 meses 3-5 meses 9-10 meses 11
Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico 6) Análise dos Transformantes Diferentes passos numa reacção de PCR PCR ( Polymerase Chain Reaction ) Extracção DNA Amplificação exponencial dum gene por PCR Usando primers específicos para o transgene 1.5 Kbp Transformantes WT C+ Verificação do produto de PCR em gel 12
6) Análise dos Transformantes Análise da descendência (segregação de sementes) Plantas Semente Kan 400 mg/l Semente Can R T 1 Plantas T 2 Homozigóticas Plantas T o Plantas T 1 (Plantas auto-polinizadas) No entanto, não basta analisar as plantas transgénicas por métodos de Biologia Molecular É preciso verificar se a expressão destes genes resulta numa alteração fenotípica de valor acrescentado Ensaios de campo! 13
7) Avaliação e Melhoramento Processo de avaliação exaustivo: Actividade do gene introduzido. Estabilidade do gene introduzido (transmissão e expressão na descendência). Inexistência de efeitos indesejáveis no crescimento, qualidade e produtividade. Mesmo que uma planta passe nestes ensaios, provavelmente não será utilizada directamente na agricultura, mas será cruzada com variedades agronomicamente relevantes. (Apenas algumas variedade podem ser eficientemente transformadas e essas não são por vezes as de maior interesse comercial!) O próximo passo no processo são os ensaios em estufas e no campo com vista a testar o efeito do transgene e a performance geral. Nesta fase também se inclui a avaliação do impacto ambiental e segurança alimentar. 14
Fontes: Agbios http://www.agbios.com AgBiotechNet http://www.agbiotechnet.com Agroecology/ Sustainable Agriculture Program http://www.aces.uiuc.edu/asap/ Biotechnology & GMOs http://gmoinfo.jrc.it/ Centro de Informação de Biotecnologia - CIB http://www.cib.biotecnologia.com.pt/ Library of Crop Technology Lesson Modules http://croptechnology.unl.edu Transgenic Crops: An Introduction and Resource Guide http://cls.casa.colostate.edu/transgeniccrops/index.html 15