INFLUÊNCIAS DE INFECÇÕES POR ANAPLASMA MARGINALE NO LEUCOGRAMA E NO METABOLISMO OXIDATIVO DOS NEUTRÓFILOS EM BEZERROS DA RAÇA GIROLANDO

INFLUÊNCIAS DE INFECÇÕES POR ANAPLASMA MARGINALE NO LEUCOGRAMA E NO METABOLISMO OXIDATIVO DOS NEUTRÓFILOS EM BEZERROS DA RAÇA GIROLANDO Marcos Roberto Alves Ferreira 1, Thiago Quirino Arantes 2, Murilo Duarte Silva 3, Márcia Dias 4, Cecília Nunes Moreira 5 1 Graduando em Medicina Veterinária pela Universidade Fed. Goiás, Campus Jataí. 2 Graduando em Zootecnia pela Universidade Federal de Goiás, Campus Jataí. 3 Graduando em Biomedicina pela Universidade Federal de Goiás, Campus Jataí. 4 Professora Adjunto do Curso de Zootecnia pela UFG- Campus Jataí 5 Professora Adjunto do Curso de Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Goiás, Campus Jataí (cissanm@yahoo.com.br). Universidade Federal de Goiás, Campus Jataí, Curso de Medicina Veterinária, Rodovia BR 364, Km 192 n 3.800 - Pq. Industrial, C P 03, CEP 75801-615, Jataí/GO, Brasil. Recebido em: 30/09/2013 Aprovado em: 08/11/2013 Publicado em: 01/12/2013 RESUMO O agente etiológico da anaplasmose bovina, Anaplasma sp., ocorre em áreas tropicais e subtropicais de todo o mundo, a doença é um dos principais entraves na produção de bovinos em muitos países. O patógeno é transmitido por várias espécies de mosquitos, moscas, fômites contaminados, ou biologicamente por carrapatos. A fagocitose realizada pelos neutrófilos é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra a invasão de micro-organismos, podendo ser avaliado pelo teste de redução do Nitroblue Tetrazolium (NBT) um método empregado para determinar a atividade oxidativa dos neutrófilos. Devido à escassez de dados referentes à resposta imune inata de bezerros frente a Anaplasmose, o objetivo do presente estudo foi avaliar as influências de infecções por A. marginale sobre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos através da redução do NBT, e as principais alterações no leucograma ocasionadas por essa enfermidade. Os resultados revelaram que, entre os hematozoários avaliados, A. marginale apresenta alta prevalência (100%) entre os animais com suspeita clínica de anaplasmose no sudoeste do estado de Goiás, Brasil. Quanto a atividade de neutrófilos, não houve diferença entre o grupo de controle (35.85%) e os animais tratados no início (35,23%) e ao final (37,26%) da doença. Na atividade neutrofílica, não houve diferença entre o grupo controle (35.85%) e os animais tratados no início (35,23%) e no final (37,26%) do tratamento. A atividade dos neutrófilos foi ligeiramente mais elevada no final do tratamento evidenciando que o tratamento a longo prazo pode ajudar na resposta contra tais micro-organismos, aumentando a produção de substâncias oxidativas nos neutrófilos. PALAVRAS-CHAVE: Anaplasmose, Leucócitos e Nitroazul de Tetrazólio (NBT) ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1744 2013

INFLUENCE OF ANAPLASMA MARGINALEINFECTION ONWHITE BLOOD CELL COUNTS AND OXIDATIVE METABOLISM OF NEUTROPHILS IN CALVES OF GIROLANDO BREED. ABSTRACT The genus Anaplasma (Anaplasma marginale or A. centrale), etiological agent of the bovine anaplasmosis, occurs in tropical and subtropicalareas throughout the world and the disease is a major constraint to cattle production in many countries. The pathogen is transmitted by various mosquito species either mechanically, by biting flies and contaminated fomites, or biologically, by ticks. The neutrophils phagocytosis is an important host defense mechanism against invading microorganisms and can be evaluated by the Nitroblue Tetrazolium reduction test (NBT), which determine their oxidative activity. Due to scarcity data of innate immune response of calves about anaplasmosis, the objective of this study was to evaluate the influence of A. marginale infections on neutrophil oxidative metabolism and in leukocyte counts caused by this disease. The results obtained in the present study revealed that, among the hematozoa evaluated, A. marginale is high prevalent (100%) among the animals with clinical suspicion of anaplasmosis in the southwestern state of Goiás, Brazil. As to neutrophils activity, there was no difference between the control group (35.85%) and the treated animals at the beginning (35.23%) and end (37.26%) of disease. The slightly higher neutrophil activity at the end of treatment may be an evidence that long-term treatment may assist in the response against such microorganisms by increasing the production of neutrophilic oxidative substances. KEYWORDS: Anaplasmosis, Leukocytes and NitroblueTetrazolium (NBT). INTRODUÇÃO O gênero Anaplasma (Anaplasma marginale ou A. centrale), agente etiológico da anaplasmose bovina ocorre em áreas tropicais e subtropicais de todo o mundo, a doença é um dos principais entraves na produção de bovinos em muitos países, são transmitidos por várias espécies de mosquitos, mecanicamente por picada de moscas, fômites contaminados e biologicamente por carrapatos (CARELLI et al., 2007). Esses micro-organismos intracelulares obrigatórios são responsáveis por doença hemolítica grave nos animais infectados. Na anaplasmose, a gravidade da infecção aumenta de acordo com a idade dos animais, em animais mais velhos essas enfermidades são extremamente graves (MAGONA et al., 2011). Bezerros jovens entre seis e 36 meses apresentam sinais graves da doença, mas animais adultos se não tratados podem vir a óbito (RICHEY & PALMER, 1986; ATIF et al., 2012). O principal método para diagnosticar animais com anaplasmose baseia-se na anamnese, sinais clínicos e exames laboratoriais. Na anamnese deve-se questionar o proprietário sobre a idade e origem dos animais, e se são importados ou provenientes de áreas com baixa ocorrência de A. marginale (KERR, 2003; FARIAS, 2007). A fagocitose realizada pelos neutrófilos é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra a invasão de micro-organismos (TIZARD, 2000). O aumento da produção de substâncias oxidativas no interior do neutrófilo, que ocorre por meio do aumento da atividade respiratória desta célula, é fundamental para a adequada eficiência da resposta imune inata (AZEDO et al., 2008; MULLER, 2009). Segundo RADOSTITS et al. (2002) e FARIAS (2007), animais jovens em ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1745 2013

áreas endêmicas são infectados nos primeiros dias de vida, nesse período estão protegidos por anticorpos colostrais, dos sete aos dez meses os animais são protegidos por imunidade inespecífica, não isentando os animais de casos graves da doença, muitas vezes fatais quando a primo-infecção coincidir com período de queda na imunidade pelos anticorpos do colostro, que ocorre a partir dos 20 dias de idade. A hematologia auxilia no diagnóstico e no monitoramento da evolução do quadro clínico, diferenciando de outras possíveis enfermidades comuns nesse período (FARIAS, 2007). O teste de redução do Nitroblue Tetrazolium (NBT) foi um método desenvolvido para determinar a atividade oxidativa dos neutrófilos. A redução da referida substância no interior dos neutrófilos é indicativo da ingestão normal e da capacidade bactericida celular, permitindo, portanto, a detecção de anormalidades do metabolismo oxidativo destas células. Têm sido observadas baixas taxas de redução do NBT em neutrófilos de animais doentes quando comparadas com valores obtidos para animais saudáveis (COSTA et al., 2008; SILVA et al., 2010). Através do eritrograma, principalmente o hematócrito e esfregaço sanguíneo, chegase ao diagnóstico final para hemoparasitoses. Porém exames complementares como proteínas totais e fibrinogênio plasmático são de grande valia para auxiliar na determinação da resposta imunológica frente a essas infecções nos animais (KERR, 2003; FARIAS, 2007). Devido à escassez de dados referentes a resposta imune inata de bezerros no estado de Goiás frente a anaplasmose, doença muito comum nos primeiros dias de vida dos animais, o objetivo do presente estudo foi avaliar as influências de infecções por A. marginale sobre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos através da redução do NBT, e as principais alterações no leucograma ocasionadas por essa enfermidade. MATERIAL E METODOS Foram avaliados 30 bezerros Girolando incluídos no projeto como amostra de conveniência, não tendenciosa de ambos os sexos e com idades variando entre zero e 180 dias oriundos de propriedades rurais na região Sudoeste do Estado de Goiás, no município de Jataí. Os animais que, durante o período de execução do projeto, apresentaram sinais clínicos indicativos de anaplasmose foram examinados e incluídos no projeto, até se chegar ao grupo experimental composto de 30 animais doentes. Para cada animal enfermo participante do projeto foi avaliado, no mesmo momento, um animal hígido de mesmo sexo, idade e peso aproximado, como controle totalizando 60 animais avaliados. O exame clínico dos bezerros acometidos foi realizado segundo as recomendações de RADOSTITS et al. (2002), sendo observadas as frequências respiratória e cardíaca, temperatura retal, tempo de perfusão capilar, avaliação da desidratação por pregueamento de pele, inspeção e palpação dos animais. Foram verificadas as principais alterações clínicas, sendo preenchidas as fichas de identificação e exame clínico. A confirmação do diagnóstico de Anaplasmose baseou-se na pesquisa do hematozoário em esfregaço sanguíneo. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue no início da enfermidade, considerado dia zero, e sete dias após, período correspondente ao final do tratamento, que correspondeu a aplicação única via ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1746 2013

intrasmucular de 1 mg/kg de peso vivo de Diproprionato de Imidocarb, sendo no total de duas amostras por animal enfermo. A determinação do hemograma foi realizada por punção da veia jugular utilizando tubos vacutainer com anticoagulante obtendo 5 ml de sangue. O hemograma foi realizado em aparelho de automação modelo ABCEVET, marca HORIBA ABX e leucograma diferencial em lâmina. Para a determinação do teste de redução do NBT (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA),obteve-se 500µL de sangue em tubos contendo 2,0µL de heparina (Liquemine 5000UI/mL, Roche, São Paulo, Brasil). Desse volume foi transferido 30 µl do sangue para tubos eppendorf contendo 30 µl de NBT. Após a homogeneização, os tubos foram levados para banho-maria à 37ºC por 15min e por mais 15min descansando em temperatura ambiente. Esfregaços sanguíneos foram preparados, no momento inicial e final do tratamento de cada animal enfermo e controle, corados com Panótico Rápido comercial e posteriormente examinados ao microscópio óptico. Os testes da redução foram realizados pelo método citoquímico descrito por PARK et al. (1968) modificado por COSTA et al. (2008). Os resultados obtidos foram submetidos ao teste de normalidade. Considerando o comportamento das variáveis, foi realizada a análise paramétrica utilizando-se o teste coeficientes de correlação de Pearson para os dados emparelhados ou independentes. Para a realização das análises foi utilizado o teste de Mann-Whitney, pelo programa SAS 2008. O nível de significância adotado em todas as análises foi de 5% de probabilidade (p < 0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos revelaram que no sudoeste do estado de Goiás Brasil há maior prevalência de Anaplasmose (100%) se comparados aos casos de Babesiose. Durante o desenvolvimento do trabalho buscou-se ambos os patógenos, porém não houve diagnóstico para babesiose e não foi observada associação entre ambos os patógenos responsáveis pelo complexo TPB (Tristeza parasitária bovina). A elevada prevalência de Anaplasmose em relação a Babesiose é observada em estudos realizados em outros estados como COSTA et al. (2011) no Nordeste com prevalência de A. marginale varia de 1,8% a 80% e por B. bigemina de 2,06% a 5,21%. E em levantamento epidemiológico realizado por GONÇALVES et al. (2011), em casos de TPB no sudeste do país observaram maior prevalência de parasitemia por Anaplasma sp. (59,7%) e Babesia sp. (21,4%) e por ambos os patógenos (18,9%). A maior prevalência de parasitas do gênero Anaplasma sp. provavelmente se deve ao maior número de vetores que podem transmiti-lo a partir de animais com altas taxas de parasitemia para animais susceptíveis, aumentando assim o número de animais infectados se comparados a Babesia sp. que possui como vetor principal os carrapatos do gênero R. microplus (NIAZI et al., 2008; AL- KHALIFA et al., 2009; AUBRY &GEALE, 2011). Analisando as médias dos valores de leucograma dos animais com anaplasmose no início e no final do tratamento (Tabela 1) não houve diferença significativa nos valores encontrados se comparados aos animais do grupo controle, submetendo os resultados ao teste de Mann-Whitney não houve correlação positiva (p > 0,05) em nenhum dos parâmetros avaliados. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1747 2013

Bovinos apresentam poucas alterações no leucograma mesmo em situações de infecções agudas (THRALL, 2007). No presente estudo não ocorreram variações significativas no leucograma comparando o início da doença (dia zero) e o final do tratamento (sete dias após o início do tratamento) bem como se comparados aos animais do grupo controle. Tanto no dia zero e dia sete, o número total de leucócitos, neutrófilos segmentados e bastonetes encontravam-se dentro dos valores de normalidade para a espécie, observando apenas valores aumentados de fibrinogênio nos animais infectados por A. marginale em comparação ao grupo controle, confirmando que esta proteína de fase aguda da inflamação é o melhor indicativo de processo inflamatório em bovinos (TAYLOR, 2000; SMITH, 2002). Neutrófilos reativos também obtiveram correlação positiva com valores de proteína séricas totais, quando o primeiro parâmetro encontrava-se aumentado o segundo mostrava-se diminuído, corroborando com REIS et al. (2007). TABELA 1 Médias para parâmetros no leucograma de 30 animais no início e final do tratamento para Anaplasma marginale Parâmetros Anaplasmose Média do grupo controle Valor de P Inicio Final Leucócitos Totais (x10³/µl) 12090 12450 13635 0,8707 Neutrófilos totais (x10³/µl) 3263 2909 4362 0,3076 Segmentados (x10³/µl) 3177 2762 4287 0,2008 Bastonetes (x10³/µl) 85 146 74 0,7041 Hematócrito (%) 30 32 32,6 0,7955 Fibrinogênio plasmático (g/dl) 560 476 876 0,2895 Proteínas séricas totais (g/dl) 8,04 7,8 7,7 0,4061 NBT 2 (%) 35,23 37,26 35,85 0,4028 1 Valor-P para teste de Mann-Whitney, 2 Neutrófilos Metabolicamente ativos Avaliando-se a correlação entre os parâmetros de leucograma os dados foram submetidos ao teste Coeficientes de correlação de Pearson no início da doença e ao final do tratamento (Tabela 2). No início da enfermidade foi observada correlação positiva entre o número de segmentados versus leucócitos totais corroborando com outros autores que em bezerros jovens as células predominantes são os neutrófilos (ASSIS et al., 2009; FERREIRA et al., 2009; SILVA et al., 2010), valores de proteína séricas versus número de bastonetes assim como número de neutrófilos reativos versus proteínas séricas. No final do tratamento foram evidenciadas correlações positivas entre os leucócitos totais versus número de segmentados e leucócitos totais versus neutrófilos totais. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1748 2013

TABELA 2 Coeficientes de correlação de Pearson (r p ) entre parâmetros do leucograma nos 30 animais com anaplasmose no início e final do tratamento Animais no início do tratamento Parâmetros Correlacionados Média¹ Média² r p P Conclusão Leucócitos Totais 1 (x10³/µl) Muito versus Segmentados 2 12090 3178 0,52327 0,003 (x10³/µl) Significativo Proteínas séricas totais 1 (g/dl) versus Bastonetes (x10³/µl) 2 7,6 91 0,42365 0,0197 Significativo Leucócitos Totais 1 (x10³/µl) versus Neutrófilos totais 2 (x10³/µl) Neutrófilos reativos (NBT) 1 (%) versus Proteínas séricas totais 2 (g/dl) 1209 3263 0,51591 0,0035 Muito Significativo 35,2 8,04 0,40052 0,0283 Significativo Animais no Final do Tratamento Leucócitos Totais 1 (x10³/µl) versus Segmentados 2 (x10³/µl) 12450 2763 0,64865 0,0001 Leucócitos Totais 1 (x10³/µl) versus Neutrófilos totais 2 12450 2909 0,63689 0,0002 (x10³/µl) Muito Significativo Muito significativo Realizando análise comparativa entre os grupos, observou-se que os animais do grupo controle possuíam estatisticamente atividade neutrofílica semelhante aos animais infectados no início do tratamento (Tabela 3), porém após sete dias de tratamento os animais infectados apresentaram valores de 37,26% de neutrófilos metabolicamente ativos, levemente superiores ao valor do grupo controle, embora não havendo correlação positiva entre os dois momentos (p < 0,05). TABELA 3 Valores médios referentes ao NBT dos bezerros com anaplasmose e seus respectivos controles NBT (%) 1 Bezerros com anaplasmose no início da doença 35,23 Bezerros com anaplasmose no final da doença 37,26 Diferença (valor P) 0,4160 Média geral do grupo controle 35,85 1 Neutrófilos Metabolicamente ativos Apesar da ausência de diferença estatística significativa, observou-se pequeno aumento na atividade dos neutrófilos nos animais do grupo tratado após sete dias, mostrando que em longo prazo o tratamento pode auxiliar na resposta contra invasão de micro-organismos, aumentando a produção de substâncias oxidativas pelos neutrófilos. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1749 2013

CONCLUSÕES A atividade funcional neutrofílica nos animais com tristeza parasitária não diferenciou significativamente no início da doença quando comparados ao final do tratamento. Em todos os casos os animais saudáveis apresentaram maiores valores desta atividade, o que comprova que animais com maior metabolismo oxidativo dos neutrófilos apresentam maior resistência a agentes patogênicos variados. REFERÊNCIAS AL-KHALIFA, M. S.; HUSSEIN, H. S.; DIAB, F. M.; KHALIL, G. M. Blood parasites of livestock in certain regions of Saudi Arabia. Saudi Journal of Biological Sciences., Saudi Arabia, v. 16, p. 63-67, 2009. ASSIS, T. S.; SILVA, N. C. M.; FERREIRA, M. R. A.; MOREIRA, C. N. Influência da transmissão transplacentária do Anaplasma marginale no hemograma e no metabolismo oxidativo dos neutrófilos (NBT) em bovinos. In: Congresso Brasileiro de Buiatria, 8., 2009, Belo Horizonte. Anais eletrônicos... Goiânia: UFG, 2009. Disponível em: <http://www.revistas.ufg.br/index.php/vet/article/view/7875/5699>. Acesso em: 15 set. 2013. ATIF, F. A.; KHAN, M. S.; IQBAL, H. J.; ARSHAD, G. M.; ASHRAF, E.; ULLAH, S. Prevalence of Anaplasma marginale, Babesia bigemina and Theileria annulata infections among cattle in Sargodha District. African Journal of Agricultural Research, Pakistan, v. 7, n. 22, pp. 3302-3307, 12 June, 2012. AUBRY, P.; GEALE, D. W. A review of bovine anaplasmosis. Transboundary Emerging Diseases, Ottawa, v. 58, n. 1, p. 1-30, 2011. AZEDO, M. R.; MASSOCO, C. O.; BLAGITZ, M. G.; SANCHES, B. G. S.; SOUZA, F. N.; BATISTA, C. F.; SAKAI, M.; SÁ-ROCHA, L. C.; KFOURY JUNIOR, J. R.; STRICANGNOLO, C. R.; BENESI, F. J.; DELLA LIBERA, A. M. M. P. Influência da leucose enzoótica bovina na função fagocítica de leucócitos circulantes em animais manifestando linfocitose persistente. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v. 45, n. 5, p. 390-397, 2008. CARELLI, G.; DECARO, N.; LORUSSO, A.; ELIA, G.; LORUSSO, E.; MARI, V.; CECI, L.; BUONAVOGLIA, C. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR. Veterinary Microbiology, [S.I.], v. 124, n. 1-2, p. 107-114, 2007. COSTA, M. C.; FLAIBAN, K. K. M. C.; CONEGLIAN, M. M.; DOGNANI, R.; VETTORATO, E. D.; BALARIN, M. R. S.; LISBÔA, J. A. N. Metabolismo oxidadivo dos neutrófilos de bezerros das raças Nelore e Limousin nos primeiros quatro meses de vida. Pesquisa Veterinária Brasileira, Cidade, v. 28, n. 9, p. 431-436, setembro 2008. COSTA, V. M. M.; RODRIGUES, A. L.; MEDEIROS, J. M. A.; LABRUNA, M. B.; SIMÕES, S. V. D.; RIET-CORREA, F. Cattle tick fever in the semiarid region of the ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 1750 2013

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