OBTENÇÃO DE NANOCELULOSE INTEGRADA A PRODUÇÃO DE ETANOL 2G

OBTENÇÃO DE NANOCELULOSE INTEGRADA A PRODUÇÃO DE ETANOL 2G T. J. BONDANCIA 1,2, J. M.MARCONCINI 2, L.H.C. MATTOSO 2 e C.S. FARINAS 1,2 1 Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, São Carlos, SP, Brasil 2 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Instrumentação, Laboratório Nacional de Nanotecnologia para o Agronegócio (LNNA), São Carlos, SP, Brasil E-mail para contato: thalitajkb@gmail.com RESUMO Uma das etapas da produção de etanol de segunda geração (2G) é a conversão de celulose em glicose por hidrólise enzimática. Nessa etapa é gerada uma fração cristalina de celulose residual que pode ser utilizada para obter a nanocelulose, um produto de alto valor agregado. Neste trabalho foi estudado o desenvolvimento de um bioprocesso para integração da obtenção de nanocelulose e etanol 2G. A influência do teor de sólidos e da carga enzimática na obtenção desses produtos foi avaliada utilizando como matéria-prima a polpa de celulose de eucalipto para a otimização do bioprocesso pela metodologia de planejamento experimental. A produção de glicose variou de 45 a 130 g/l. O sólido residual da hidrólise enzimática foi caracterizado como nanocelulose com índices de cristalinidade de aproximadamente 82% e temperatura inicial de degradação de aproximadamente 320ºC, indicando o grande potencial da estratégia de integração desse processo. 1. INTRODUÇÃO A produção nacional de etanol é proveniente em sua maioria da cana-de-açúcar, mas o estudo por outras fontes de biomassa é fundamental para contribuir no desenvolvimento do processo de produção do etanol de segunda geração (2G). Neste contexto, a utilização da polpa de celulose de eucalipto como biomassa para produção de açúcares fermentescíves permite a implementação de biorrefinarias florestais, podendo contribuir para viabilizar economicamente a produção de etanol 2G e integrando a produção de novos produtos de origem renovável como a nanocelulose (NC) (Mariano, 2015). A hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos é realizada por ação sinérgica de enzimas de um complexo celulolítico, cuja especificidade faz com que a celulose seja convertida em açúcares fermentescíveis. A sinergia entre celulases, hemicelulases e ligninases auxilia na obtenção de maiores

rendimentos da etapa de sacarificação, permitindo a redução da carga de celulases no processo (Hu, Arantes e Saddler, 2011). No entanto, a elevada recalcitrância da celulose faz com que a celulose amorfa seja convertida em maior velocidade que a celulose cristalina, resultando do processo de hidrólise um material com elevada cristalinidade (Zhu, Sabo e Luo, 2011). Este material possui características de nanocelulose, um produto com alto valor agregado e diversas aplicações industriais. Pesquisas recentes que abordam o tema relacionado à integração de processos de produção de etanol celulósico e a obtenção de nanocelulose tem demonstrado o potencial dessa rota tecnológica (Zhu, Sabo e Luo, 2011; Tsukamoto, Duran e Tasic, 2013; Teixeira et al., 2015). Assim, este trabalho teve como objetivo, estudar a viabilização da integração dos processos de obtenção de açúcares fermentescíveis para produção de etanol celulósico utilizando a polpa de celulose de eucalipto como matéria prima e a produção de nanocelulose a partir da fração sólida residual da etapa de hidrólise enzimática. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Materiais O substrato usado para a hidrólise enzimática foi a polpa de celulose comercial de Eucalyptus Urograndis branqueadas pelo processo Kraft, fornecida em bloco pela empresa Suzano papel e celulose S/A. O complexo enzimático comercial utilizado foi a Cellic CTec 3 (Novozymes). 2.2. Métodos Preparação da biomassa: O material foi previamente cortado em blocos menores e em seguida processado em moinho de facas tipo Willey, 500 W Solab, com peneira de 20 mesh. Caracterização química e morfológica: A composição química da polpa de celulose de eucalipto foi realizada de acordo com Gouveia et al. (2009). As análises de índice de cristalinidade foram realizadas por Difração de Raio X (DRX) em equipamento Shimadzu 6000 com radiação CuKa (λ = 1,54 Å) no intervalo de ângulo 2θ variando de 5-40º e velocidade de 2º/min. O índice de cristalinidade foi calculado pelo método de Segal et al. (1959). A avaliação térmica do material de partida e residual da hidrólise foi avaliada por termogravimetria em equipamento TA intruments (TGA Q500 V6.3 build 189) em condições de operação em atmosfera de nitrogênio a vazão de 40 ml/min na balança; atmosfera de ar sintético a vazão de 60 ml/min no forno, em razão de aquecimento de 10 ºC/min e intervalo de aquecimento de 25ºC a 600ºC em porta amostra de platina. As análises microscópicas do sólido residual após a etapa de hidrólise enzimática foi realizada em microscópio eletrônico de varredura com emissão de campo (FEG) em equipamento JEOL (JSM 607 1F), com resolução de 1,0 nm (15kV), com emissor de tungstênio e detector com elétrons secundários espalhados e módulo de Transmissão. A preparação da amostra se deu em água Mili-Q, gotejado em placa de silício e seco em estufa a 85ºC.

Hidrólise enzimática: A polpa de celulose de eucalipto foi submetida à hidrólise enzimática em complexo comercial Cellic Ctec 3 (Novozymes) com tampão citrato 0,1 M, ph 5,0 a 50 C e 200 rpm em incubadora shaker Cienlab Brasil. A concentração de proteínas em mg/ml foi determinada pelo método proposto por Bradford (1976). Para o monitoramento da glicose obtida foi utilizado o kit enzimático GOOD-PAD de análise de glicose (Labtest ), seguindo o procedimento fornecido pelo fabricante. Para o estudo foi utilizado um planejamento fatorial 2 2, incluindo 3 repetições nos pontos centrais e 4 ensaios nas condições axiais, totalizando 11 ensaios, compondo um delineamento central composto rotacional (DCCR). As variáveis estudadas e os níveis são apresentados na Tabela 1. A análise de variância ANOVA para verificar a qualidade do ajuste do modelo e a obtenção da superfície de resposta para a variável glicose (g/l) foram realizadas com auxílio do software Statistica 7. Tabela 1: Variáveis independentes do planejamento DCCR, níveis reais e codificados Variáveis independentes Níveis codificados (-α) -1 0 1 (α) -1,41 1,41 Teor de celulose (%) - TS 8 10 15 20 22 Carga enzimática (mg proteína/ g celulose) - CE 3 5 10 15 17 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES A Tabela 2 apresenta a caracterização química para polpa de celulose de eucalipto que apresentou majoritariamente celulose, seguido de hemicelulose e um baixo teor de lignina. Tais valores sugerem que o material tem potencial para hidrólise da celulose e obtenção de etanol 2G, sem a necessidade de etapas de pré-tratamento.

TS,CE Tabela 2: Composição química da polpa de celulose usada na hidrólise enzimática (%) Celulose Hemicelulose Lignina total Cinzas Total 75,6 ± 2,3 14,6 ± 0,6 6,7 ± 1,2 1,1 ± 0,12 97,5 ± 2,7 A hidrólise enzimática da polpa de celulose foi realizada utilizando diferentes teores de sólidos e cargas enzimáticas, conforme apresentado na Tabela 1. A Figura 1A apresenta as concentrações de glicose (g/l) obtidas após 24 horas de reação para cada condição estabelecida no planejamento experimental e na Figura 1B é apresentada a superfície de resposta obtida para a resposta concentração de glicose (g/l). (A) (B) Glicose (g/l) 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10,5 20,5 10,15 20,15 8,10 22,10 Experimentos 15,3 15,17 15,10 15,10 15,10 Figura 1 (A) Concentração de glicose para cada experimento do planejamento experimental em 24h de reação; (B) superfície de resposta para variável glicose (g/l). O valor mínimo estabelecido como condição aceitável para a concentração de glicose foi de 100 g/l, valor recomendado para favorecer as etapas de fermentação e destilação subsequentes do processo. Concentrações de monossacarídeos de 100 g/l, resultam em títulos de 50 g/l de etanol. Abaixo de 45 g/l de etanol, a etapa de destilação é ineficiente, elevando o consumo de energia no processo (Ximenes et al., 2010). Maiores teores de sólido e maiores concentrações de enzima na hidrólise enzimática produziram maiores concentrações de glicose. Avaliando a superfície de resposta na Figura 1B é possível verificar que concentrações superiores a 100 g/l são alcançadas quando trabalhadas com variáveis acima da região do ponto central. A utilização de TS entre 15 e 22 % e CE a partir de 5 mg de proteína/g de celulose resultaram na região de ótimo para obtenção de glicose. Em contrapartida, para a condições de alto teor de sólidos e baixa concentração de enzima

resultaram em concentrações de glicose abaixo de 50 g/l de glicose, o que esta relacionado a um problema difusivo e de transferência de massa do processo. Considerando teores de sólido menores, como TS 10%, mesmo com altas cargas enzimáticas a concentração de glicose esteve abaixo de 80 g/l, o que é justificável devido a menor disponibilidade de celulose para conversão em glicose. A Tabela 3 apresenta a análise de variância do modelo (ANOVA). Tabela 3 - Coeficientes de regressão obtidos para variável resposta concentração de glicose Coeficientes* p-valor Fatores 91,93 0,000 TS 18,80 0,000 TS 2-1,65 0,603 CE 17,74 0,000 CE 2-7,83 0,047 TS.CE 3,39 0,384 R 0,95 F 42,20 F cal / F tabelado 11,38 R coeficiente de determinação; *nível de significância 0,05 A análise de variância do modelo apresentou valor de F calculado 11,38 vezes maior que o F tabelado e p-valor menor que 0,05, mostrando que o modelo obtido é estatisticamente significativo para a variável concentração de glicose. Após a análise da superfície de resposta, a condição TS 20, CE 15 foi selecionada para caracterização morfológica do sólido residual por apresentar alta concentração de glicose (125 g/l), o que favorece o processo de obtenção de etanol. Na Figura 2 é apresentada a imagem de Microscopia obtida para a condição TS 20, CE 15. É possível observar a presença de hastes alongadas e finas, características de nanocelulose (NC). Pontos de aglomeração também são verificados devido à presença de regiões mais escuras na imagem obtida. A Figura 3 A e 3B apresenta as caracterizações realizadas para a polpa de celulose anterior a hidrólise enzimática e para a condição TS 20, CE 15.

Figura 2 - Nanofibras de celulose obtidas após hidrólise enzimática para condição TS 20, CE 15. (A) (B) Intensidade (u.a) 3000 2500 2000 1500 1000 500 Polpa in_natura TS 20, CE 15 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Massa (%) 0 0 100 200 300 400 500 600 Ângulo (2 ) Figura 3 Caracterização da polpa de celulose in_natura e após hidrólise na condição TS 20, CE 15: (A) Difração de raio X; (B) análise termogravimétrica. A polpa de celulose de eucalipto utilizada como material de partida (Figura 3A) apresentou índice de cristalinidade de 71,9% e estrutura de celulose tipo I, com picos de difração característicos cristalino na faixa de 2θ = 22,5º e a intensidade referente ao alo de celulose amorfa na faixa de 2θ = 18,0º. Para o sólido residual da condição de hidrólise TS 20, CE 15 o índice de cristalinidade passou a ser de 81,5%, indicando que celulose amorfa foi removida elevando a cristalinidade do material. A Figura 3B apresenta a análise termogravimétrica da polpa de celulose e do sólido residual da hidrólise com TS 20, CE 15. O perfil térmico apresentado pela curva de TG é característico dos três principais constituintes de materiais lignocelulósicos, celulose, hemicelulose e lignina (Yang et al., 2007). Pela análise das curvas de TG são observados três estágios iniciais de perda de massa, sendo o primeiro entre 50 e 100ºC, que corresponde a evaporação de água em 3% de massa. O segundo evento térmico, 100 80 60 40 20 Polpa in_natura TS 20, CE 15 Temperatura (ºC)

ocorre em 331ºC para polpa de celulose e em 323ºC para NC, sendo possível observar significativa queda em torno de 70% de massa atribuída à degradação de celulose. (Corradini et al., 2009). Maiores temperaturas iniciais de degradação são esperadas para as NC devido às temperaturas de processamento de materiais poliméricos (a partir de 200ºC para polímeros termoplásticos) (Dufresne, 2012). A aplicação das NC deve ocorrer em polímeros que são processados em temperaturas inferiores a temperatura inicial de degradação da NC devido à possibilidade de degradação além desta temperatura. 4. CONCLUSÃO Os estudos realizados mostraram o potencial da integração dos processos para produção de etanol e nanocelulose a partir da polpa de celulose, já que quando hidrolisada em alto teor de sólidos obteve-se altas concentrações de glicose (125 g/l) e uma fração sólida com alta cristalinidade (83%) e alta temperatura inicial de degradação (323ºC), características de nanocelulose. A realização do planejamento experimental permitiu obter as regiões que favorecem a obtenção de elevadas concentrações de glicose, requeridas para viabilizar os processos de fermentação e destilação de etanol. Por fim, conclui-se que a integração do processo de obtenção de etanol de 2G com a obtenção de nanocelulose mostrou-se promissora, podendo auxiliar na viabilidade econômica da produção de etanol 2G pela agregação de valores aos resíduos gerados. 5. NOMENCLATURA CE carga enzimática (mg proteína/ g de celulose); 2G - 2ª geração; NC nanocelulose; TG termogravimetria; TS teor de sólidos (%). 6. REFERÊNCIAS MARIANO, A. P. How Brazilian Pulp Mills will look in the future? O Papel: Technical article.,v. 76, p. 51-66, 2015.

HU, J.; ARANTES, V.; SADDLER, J. N. The enhancement of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic substrates by the addition of accessory enzymes such as xylanase: is it an additive or synergistic effect? Biotechnology for Biofuels., v. 4:36, 2011. ZHU, J. Y.; SABO, R.; LUO, X. Integrated production of nano-fibrillated cellulose and cellulosic biofuel (ethanol) by enzymatic fractionation of wood fibers. Green Chemistry, 13, 1339-1344, 2011. TSUKAMOTO, J.; DURAN, N.; TASIC, L. Nanocellulose and Bioethanol Production from Orange Waste using Isolated Microorganisms. Journal of the Brazilian Chemical Society., v. 24, n. 9, p. 1537-1543, 2013. TEIXEIRA, R.S.S., DA SILVA, A.S.A., JANG. J-H., KIM, H-W., ISHIKAWA, K., ENDO, T., LEE, S-H., BON, E.. Combining biomass wet disk milling and endoglucanase/beta-glucosidase hydrolysis for the production of cellulose nanocrystals. Carbohydrate Polymers., v. 128, p. 75-81, 2015. GOUVEIA, E.R; NASCIMENTO, R.T; SOUTO-MAIOR, A.M. Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar. Quim. Nova., v. 32, p. 1500-1503, 2009. SEGAL, L.; CREELY, J.J.; MARTIN, A.E.; CONRAD, C.M. An empirical method for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-ray diffractometer. Text. Res. J., v. 29, p. 786-794, 1959. BRADFORD, M. M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1-2, p. 248-254, 1976. XIMENES, E., KIM, Y., MOSIER, N., DIEN, B., LADISCH, M. Inhibition of cellulases by phenols. Enzyme and Microbial Technology., v. 46, p. 170-176, 2010. YANG, H., YAN, R., CHEN, H., LEE, D. H., ZHENG, C.. Characteristics of hemicellulose, cellulose and lignin pyrolysis. Fuel, v. 86, 1781-1788, 2007. CORRADINI, E., TEIXEIRA, E.M, PALADIN, P.D., AGNELLI, J.A., SILVA, O.R.R.F., MATTOSO, L.H.C. Thermal stability and degradation kinetic study of white and colored cotton fibers by thermogravimetric analysis. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry., v. 97, 415-419, 2009. DUFRESNE, A. Nanocellulose: From Nature to High Perfomance Tailored Materials. Berlin:Walter de Gruyter. 2012. 460 p. 7. AGRADECIMENTOS As agências de fomento brasileiras CAPES, CNPq e FAPESP. Ao PPGEQ-UFSCAR e a Embrapa.