Fatores de crescimento envolvidos no desenvolvimento de folículos pré-antrais

Fatores de crescimento envolvidos no desenvolvimento de folículos pré-antrais Viviane Bento da Silva Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari Eliane Vianna Costa e Silva RESUMO O ovário dos mamíferos é constituído por milhares de folículos pré-antrais, entretanto cerca de 90% deles nunca atingem a maturidade, sendo seu uso uma alternativa para os programas de reprodução assistida como a produção in vitro de embriões. Porém, um dos fatores limitantes ao emprego de folículos pré-antrais como doadores de ovócitos é a escassez de informações sobre os fatores que regulam as diferentes etapas da foliculogênese. Apesar do desenvolvimento de folículos antrais ter sido amplamente descrito, informações concernentes à fisiologia dos folículos préantrais envolvendo os fatores que promovem a ativação dos folículos primordiais e o mecanismo responsável pelo crescimento de folículos primários e secundários, é pouco conhecido. Acreditase que o desenvolvimento destes folículos independe das gonadotrofinas, mas é influenciado por fatores intraovarianos, como kit ligand (KL) ou fator de células tronco (SCF), fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), proteínas morfogenéticas ósseas (BMP-15), fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), fator de crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento epidermal (EGF), peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e ativina, dentre outros. Desta forma, a presente revisão aborda os mecanismos de controle da fase pré-antral, com foco nos fatores de crescimento envolvidos no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais. Palavras-chave: Fatores intraovarianos. Folículo primordial. Foliculogênese. Growth factors involved in the development of preantral follicles ABSTRACT The mammalian ovary consists of thousands of preantral follicles, but approximately 90% of these never reach maturity, being its use an alternative for the programs of assisted reproduction as in vitro production of embryos. But a major factor limiting the use of preantral follicles as an oocyte donor in these programs is the lack of information about the factors that regulate the different stages of folliculogenesis. Despite the development of antral follicles has been widely described, information concerning the physiology of preantral follicles, factors that promote the activation of primordial follicles and the mechanism responsible for the growth of primary and secondary follicles, is little known. However, it is believed that the development of these follicles is not dependent on gonadotrophins but it is influenced by intraovarian factors Viviane Bento da Silva é Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. FAMEZ/UFMS. Avenida Senador Felinto Müller, 2443, Bairro Ipiranga. Campo Grande/MS, Brasil. CEP 79070-900. Caixa Postal 549. E-mail: biobento@yahoo.com.br Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari e Eliane Vianna Costa e Silva são Profas. Dras. do Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal. FAMEZ/UFMS. E-mails: zuccari@nin.ufms.br; licsilva@nin.ufms.br Veterinária em Foco Veterinária Canoas em Foco, v.8 v.8, n.2, jan./jun. p.121-131 2011 jan./jun. 2011 121

such as kit ligand (KL) or stem cell factor (SCF), growth differentiation factor-9 (GDF-9), bone morphogenetic protein (BMP-15), growth factor-1 insulin-like (IGF-1), fibroblast growth factor (FGF), growth factor keratinocyte (KGF), endothelial growth factor (VEGF), epidermal growth factor (EGF), vasoactive intestinal peptide (VIP) and activin. In this sense, this review highlights the mechanisms controlling the preantral, with main focus on growth factors involved in the in vitro development of preantral follicles. Keywords: Intraovarian factors. Primordial follicle. Folliculogenesis. INTRODUÇÃO O tecido ovariano apresenta uma pequena quantidade de folículos antrais. Dessa forma, seu aproveitamento em programas de reprodução assistida limita o número de gametas femininos disponíveis, assim como a disseminação do material genético de reprodutoras superiores (CUSHMAN et al., 2002). Uma alternativa é a utilização dos folículos pré-antrais presentes aos milhares nos ovários, os quais podem ser recuperados e criopreservados ou cultivados (TELFER, 1996). Portanto, torna-se necessário o estudo da foliculogênese a fim de se compreenderem os mecanismos e fatores envolvidos in vivo nesse processo, para seu emprego no desenvolvimento destes folículos in vitro. A foliculogênese inicia-se com a ativação dos folículos primordiais, processo no qual saem do estádio de quiescência para iniciarem seu crescimento. Porém, os mecanismos que controlam esse processo e a continuidade do crescimento folicular ainda são pouco conhecidos. Sabe-se que em mamíferos o crescimento folicular contínuo é controlado tanto por hormônios gonadotróficos e somatotróficos, como por fatores de crescimento que agem de forma autócrina ou parácrina (MARTINS et al., 2008). Nesse contexto, a identificação e a compreensão das diferentes substâncias envolvidas na promoção do crescimento de folículos pré-antrais são aspectos importantes para subsidiar o desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente que desencadeie este processo in vitro (DEMEESTERE et al., 2005). Com o objetivo de facilitar a compreensão da foliculogênese, serão abordados aspectos relacionados à ação de fatores de crescimento envolvidos na sua ativação e maturação. DESENVOLVIMENTO A foliculogênese compreende o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando com o folículo primordial e culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório (SAUMANDE, 1981). O ovócito, por sua vez, não é um mero receptor de ações parácrinas oriundas das células vizinhas na fase pré-antral e durante a foliculogênese. Ele participa ativamente na indução da proliferação e diferenciação das células da granulosa (GILCHRIST et al., 2004). Para tanto, a comunicação intercelular é proporcionada por processos citoplasmáticos trans-zonais (TZP) e pela secreção de mediadores parácrinos. 122

Os TZPs são extensões das células da granulosa que penetram através da zona pelúcida e atingem a membrana do ovócito, onde junções do tipo gap permitem o transporte bidirecional de moléculas reguladoras (ALBERTINI et al., 2001). Já a comunicação parácrina entre ovócito e células da granulosa, embora também bidirecional, é mediada por vários fatores de crescimento, produzidos por ambos os tipos celulares, como kit ligand (KL) ou fator de células tronco (SCF), fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), proteínas morfogenéticas ósseas (BMP-15), fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), fator de crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento epidermal (EGF), peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e ativina, dentre outros (FIGUEIREDO et al., 2002). Fatores que afetam o crescimento de folículos pré-antrais in vitro Kit ligand (KL) ou fator de células tronco (SCF) O KL é derivado das células da granulosa e seu receptor c-kit é expresso pelo ovócito e células da teca (MAYERHOFER et al., 1997), um excelente exemplo de como as interações parácrinas entre ovócito e células somáticas controlam muitos aspectos da formação e desenvolvimento folicular. Trabalhos realizados com ovários de diferentes espécies mostram que o KL e o c-kit são importantes para a migração, proliferação e sobrevivência de células germinativas primordiais (ZAMA et al., 2005), crescimento e sobrevivência do ovócito (JIN et al., 2005), proliferação das células da granulosa (OTSUKA; SHIMASAKI, 2002), manutenção da competência meiótica (ISMAIL et al., 1997), recrutamento de células da teca e regulação da esteroidogênese (HUTT et al., 2006). Em estudo com caprinos, Silva et al. (2006a) relataram a presença da proteína e do RNAm para o KL, expressos nas células da granulosa, em todos os estádios de desenvolvimento folicular, bem como no corpo lúteo, superfície do epitélio ovariano e tecido medular. A importância da interação c-kit/kl para as fases iniciais da foliculogênese pré-antral foi demonstrada por estudos em que a neutralização do receptor c-kit, por imunização ou mutação inativadora do gene, interrompeu o desenvolvimento folicular (KISSEL et al., 2000). Fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9) O GDF-9 é uma proteína homodimérica, secretada pelo ovócito, pertencente à família dos fatores de transformação do crescimento TGF-β (CHANG et al., 2002). Em ratas promove o crescimento de folículos primários e a proliferação de células da teca (NILSSON; SKINNER, 2002), enquanto em humanos estimula a manutenção da viabilidade folicular, a proliferação de células da granulosa e a sobrevivência e progressão dos folículos ao estádio secundário, após 7 dias de cultivo (HREISSON et al., 2002). 123

Wang e Roy (2004) demonstraram que 10 ng/ml de GDF-9 influenciam a expressão do KL e estimulam o crescimento de folículos primordiais, sendo que em altas doses (200 ng/ml) aumentam a proporção de folículos secundários de hamster. Já em camundongos a deleção do gene GDF-9 causou infertilidade, com foliculogênese bloqueada no estádio primário (DONG et al., 1996). O RNAm para o GDF-9 tem sido localizado em ovócito de bovino, ovino (BODENSTEINER et al., 1999) e caprino (SILVA et al., 2004b). A sua expressão em ovócitos de folículos primordiais de ovelhas e cabras levantou a hipótese de que o GDF-9 é essencial para a ativação de folículos primordiais e seu subsequente desenvolvimento. Proteína morfogenética óssea-15 (BMP-15) Estudos in vitro têm demonstrado que a BMP-15 promove a proliferação das células da granulosa e estimula o desenvolvimento de folículos primordiais e primários em roedores, ou seja, é um importante regulador da mitose das células da granulosa e do desenvolvimento folicular inicial (FORTUNE, 2003). As vias de sinalização do KL, BMP-15 e GDF-9 interagem e se modulam reciprocamente. Enquanto a BPM-15 estimula a expressão do KL, este inibe a expressão da BMP-15, enquanto o GDF-9 parece inibir a expressão do KL nas células da granulosa (JOYCE et al., 2000). O bloqueio da sinalização c-kit/kl, em sistema de cocultivo de células da granulosa e ovócitos, suprimiu a proliferação das células da granulosa induzida pela BMP-15, sugerindo que a BMP-15, via ativação do KL, induz a produção de mitógenos ovocitários, dentre eles o GDF-9 (OTSUKA; SHIMASAKI, 2002). Sendo assim, propôs-se a hipótese de que o desenvolvimento folicular pré-antral seria iniciado pela interação do KL com a BMP-15, enquanto que o GDF-9 seria secretado posteriormente por ovócitos inteiramente crescidos para promover proliferação das células da granulosa e modular a ação do KL (SHIMASAKI et al., 2003). Fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) Em ovários de suínos e roedores o IGF-1 tem sido localizado nas células da granulosa de folículos antrais saudáveis (ZHOU et al., 1996), estando seu receptor presente em células da granulosa de folículos primários, secundários e antrais (MONGET et al., 1989). O IGF-1, adicionado durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais, estimulou o crescimento folicular em humanos (LOUHIO et al., 2000) e bovinos (GUTIERREZ et al., 2000). Em ovinos estimula a proliferação das células da granulosa de pequenos folículos (1-3 mm), mas não de folículos grandes (> 5 mm), por outro lado, estimula a secreção de progesterona pelas células da granulosa apenas de folículos grandes (MONGET; BONDY, 2000). 124

Em ratos, o IGF-1 aumentou significativamente o diâmetro folicular e o conteúdo de DNA. A análise desses folículos, pela microscopia eletrônica de transmissão, mostrou que as microvilosidades entre ovócito e células da granulosa, como as junções gap entre células foliculares aumentaram quando os mesmos foram cultivados na presença de IGF-1, sugerindo que este fator de crescimento promove a manutenção da integridade funcional dos folículos (ZHAO et al., 2001). Fator de crescimento fibroblástico (FGF) O FGF influencia o desenvolvimento folicular sendo o FGF-2 (FGF básico) o mais investigado. O FGF-2 é importante na regulação de várias funções como mitose (ROBERTS; ELLIS, 1999), esteroidogênese (VERNON; SPICER, 1994) e diferenciação das células da granulosa (ANDERSON; LEE, 1993). Van Wezel et al. (1995), trabalhando com ovário bovino, localizaram o FGF-2 nos ovócitos de folículos primordiais e primários, em células da granulosa e da teca de folículos pré-antrais em crescimento e antrais. Os receptores para FGF-2 estão localizados, principalmente, na camada das células da granulosa (WANDJI et al., 1992). Em bovinos, após 6 dias de cultivo in vitro, o FGF-2 (50 ng/ml) promoveu o aumento da multiplicação das células da granulosa e do diâmetro folicular (WANDJI et al., 1996). Em caprinos, Matos et al. (2006) relataram que 50 ng/ml de FGF-2, durante 5 dias de cultivo, preservaram a viabilidade folicular e o aumento significativo dos diâmetros ovocitário e folicular. Fator de crescimento de queratinócitos (KGF) O KGF é produzido pelas células mesenquimais, faz parte da família dos FGF, conhecido como FGF-7, estimula a mitose das células epiteliais (FINCH et al., 1989) e atua por meio de seus receptores do tipo FGFR-2. Estudos têm documentado que o KGF é produzido pelas células da teca de folículos antrais e influencia o crescimento das células da granulosa (PARROT; SKINNER, 1998). Outros trabalhos demonstraram que este fator também estimula o desenvolvimento folicular, pois, quando os ovários de ratas de 4 dias de idade foram cultivados na presença de 50 ng/ml, houve um aumento na transição dos folículos primordiais para primários (SKINNER, 2005). Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) O VEGF é um dos responsáveis pela angiogênese folicular, pois atua estimulando a mitose de células endoteliais e aumenta a permeabilidade vascular (REDMER; REYNOLDS, 1996). 125

As gonadotrofinas, em ratas, estimulam a produção de VEGF pelas células da granulosa (KOOS, 1995), enquanto em humanos esse fator é sintetizado pelas células da teca e granulosa (YAMAMOTO et al., 1997), sendo expressos nelas seus receptores Flk-1 e Flk-1/KDR. SO-YOUNG et al. (2006) demonstraram que o cultivo in vitro durante 24 horas, em 50 ng/ml de VEGF, antes da criopreservação das células da granulosa de ratas, reduziu os danos pela inibição da apoptose. A administração de 500 ng/ml, diretamente nos ovários de ratas, aumentou significativamente, após 48 horas, a proporção de folículos primários e secundários pequenos (DANFORTH et al., 2001). Já em bovinos, o VEGF (10 ng/ml) estimula a transição de folículos primários para secundários, após 10 dias de cultivo (YANG; FORTUNE, 2007). Fator de crescimento epidermal (EGF) A proteína EGF tem sido encontrada no ovócito e células da granulosa de folículos nos estádios iniciais e avançados de desenvolvimento (suíno SINGH et al., 1995; caprino SILVA et al., 2006b), enquanto o receptor EGF (EGF-R) está localizado na membrana celular das células da granulosa, teca e intersticiais e, no ovócito, em todos os estádios de desenvolvimento folicular (CARPENTER, 1999). Estudos mostraram que o EGF estimula a proliferação das células da granulosa de folículos pré-antrais, a transição de folículos suínos do estádio primário para secundário (MORBECK et al., 1993), o aumento do diâmetro de folículos préantrais de bovinos (GUTIERREZ et al., 2000) e promove a ativação de folículos primordiais ovinos e a manutenção da viabilidade por até 6 dias em cultivo (ANDRADE et al., 2005). O EGF (10 ng/ml) adicionado ao meio de cultivo de folículos pré-antrais suínos inibiu a apoptose das células da granulosa e levou a um aumento da formação do antro (MAO et al., 2004). Quando usado em caprinos o EGF (50 ng/ml) preservou a viabilidade ovocitária (ZHOU; ZHANG, 2005) e, numa concentração mais elevada (100 ng/ml), teve efeito benéfico sobre o crescimento de ovócitos de folículos primários (SILVA et al., 2004a). Peptídeo intestinal vasoativo (VIP) O VIP é considerado um neuropeptídeo que já foi identificado em fibras nervosas de folículos ovarianos de roedores (AHMED et al., 1986) e bovinos (HULSHOF et al, 1994). Estudos têm demonstrado que o VIP está envolvido na regulação da esteroidogênese (ZHONG; KASSON, 1994), promove o acúmulo de AMPc (HEINDEL et al., 1996), a maturação ovocitária (APA et al., 1997) e a sobrevivência das células da granulosa por inibição da apoptose (LEE et al., 1999). 126

Ativina O papel da ativina no desenvolvimento de folículos pré-antrais é confirmado por seu efeito estimulante do crescimento folicular e proliferação das células da granulosa, ação esta dependente de sua concentração (THOMAS et al., 2003). A ativina age sinergicamente com o FSH no desenvolvimento folicular. Em ovinos, também se demonstrou que a ativina promove o crescimento de folículos pré-antrais até alcançarem o estádio de formação do antro (THOMAS et al., 2003). Trabalhos de Silva et al. (2006a) indicaram que a ativina-a é capaz de promover a manutenção da viabilidade folicular e estimular o crescimento de folículos inclusos em tecido ovariano de caprinos, bem como de folículos primários isolados. CONCLUSÃO A ativação e o crescimento de folículos pré-antrais é um processo dependente de diversos fatores, que podem agir sobre o ovócito, ou nas células da granulosa e da teca. A atividade destes fatores pode ser isolada ou combinada, e até mesmo modular o efeito de hormônios, o que demonstra que o crescimento folicular é regulado por uma complexa interação entre diversas substâncias intra e extraovarianas. Sendo assim, é imprescindível o desenvolvimento de novas pesquisas, na tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na foliculogênese ovariana, principalmente de espécies domésticas, visando disponibilizar ovócitos viáveis e maturos para utilização nas diferentes biotécnicas de multiplicação animal. REFERÊNCIAS AHMED, C.E.; DEES, W.L.; OJEDA, S.R. The immature rat ovary is innervated by vasoactive intestinal peptide (VIP)-containing fibers and responds to VIP with steroid secretion. Endocrinology, v.118, p.1682-1689, 1986. ALBERTINI, D.F. et al. Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development. Reproduction, v.121, p.647-53, 2001. ANDERSON E; LEE G.Y. The participation of growth factors in simulating the quiescent, proliferative, and differentiative stages of rat granulosa cells grown in a serum-free medium. Tissue Cell, v.25, p.49-72, 1993. ANDRADE, E.R. et al. Interactions of indole acetic acid with EGF and FSH in the culture of ovine preantral follicles. Theriogenology, v.64, p.1104-1113, 2005. APA, R. et al. Effect of pituitary adenylate cyclase-activating peptide on meiotic maturation in follicle-enclosed, cumulus-enclosed, and denuded rat oocytes. Biol. Reprod., v.57, p.1074-1079, 1997. BODENSTEINER, K.J. et al. Molecular cloning of de ovine growth/differentiation factor-9 gene and expression of growth differentiation factor-9 in ovine and bovine ovaries. Biol. Reprod., v.60, p.381-386, 1999. 127

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