UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICO NO CULTIVO SUPER-INTENSIVO DO CAMARÃO-BRANCO (Litopenaeus vannamei) EM UM SISTEMA SEM RENOVAÇÃO DE ÁGUA

FFUNDAÇÃO UNIIVERSIIDADE FEDERAL DO RIIO GRANDE PPROGRAMA DE PPÓS- -GRADUAÇÃO EM AQÜIICULTURA UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICO NO CULTIVO SUPER-INTENSIVO DO CAMARÃO-BRANCO (Litopenaeus vannamei) EM UM SISTEMA SEM RENOVAÇÃO DE ÁGUA GUSTAVO QUEIROZ LIMA DE VITA FURG RIO GRANDE, RS. 2008 i

FUNDAÇÃO UNIVEERSSIIDADEE I FEDERAL DO RIIO GRANDEE PROGRAMA DE PPÓS--GRADUAÇÃO EEM AQÜIICULLTURA UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICO NO CULTIVO SUPER-INTENSIVO DO CAMARÃO-BRANCO (Litopenaeus vannamei) EM UM SISTEMA SEM RENOVAÇÃO DE ÁGUA Gustavo Queiroz Lima de Vita Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Aqüicultura no Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura da Fundação Universidade Federal do Rio Grande. Orientador: Prof. Dr. Wilson Wasielesky Junior Rio Grande RS Brasil Fevereiro, 2008 ii

ÍNDICE DEDICATÓRIA... AGRADECIMENTOS... RESUMO... ABSTRACT... iv v vi vii INTRODUÇÃO... 8 OBJETIVOS... 13 MATERIAIS E MÉTODOS... 14 RESULTADOS... 17 DISCUSSÃO... 21 CONCLUSÕES... 25 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 26 iii

Cantar a beleza de ser um eterno aprendiz (Gonzaguinha) Dedico este trabalho aos meus pais, na eterna luta pela minha felicidade e sucesso, Dinorah e José Roberto. iv

AGRADECIMENTOS À Deus, luz da minha vida; Ao Dr. Wilson Wasielesky Junior, pelos indispensáveis conselhos, pessoais e profissionais, buscando sempre minha evolução como profissional e cidadão; Ao Dr. Sílvio Peixoto, por ter contribuído de forma essencial nos meus primeiros passos no mundo científico; À Dra. Maude por aceitar o convite de participação na banca examinadora e por valiosas sugestões na elaboração do manuscrito; Ao Dr. Paulo Abreu por ceder as instalações do laboratório sob sua coordenação para que fossem realizadas algumas análises; Ao Dr. David J.W. Moriarty por ter nos auxiliado na utilização do probiótico; A Eduardo Ballester, sempre disposto a ensinar e passar o que for necessário, tanto para o desenvolvimento da pesquisa quanto para elaboração da dissertação; Ao amigo Charles, braço direito durante a fase experimental; À Ana Paula, não poderia deixar de agradecê-la pela companhia durante o mestrado; Aos amigos conquistados no laboratório. Na ausência destes, esta conquista se tornaria muito mais complicada: Cíntia, Diana, Adriana, Shei, Geraldamas, Klebinho, Renatones, Ângela, Adriana, Paulinha, Marlon, Ricardo, Vivi, Oka, João Sampaio; Ao amigo Arnaldo (Pecinha), pelos seus ricos ensinamentos; Ao Neve, um grande amigo que conquistei que me fez aprender amar as coisas mais simples da vida, o que veio a ser essencial no decorrer do mestrado; Aos amigos de longa data, Diogo e Maurício, sem estes caras eu teria ido embora na primeira semana; Ao Seu Hermes, por abrir seu imenso coração sempre que fosse preciso; A todos os funcionários da EMA, em especial Getuliamas, Santa Casa, Pita e Zezinho; Ao Laboratório de Nutrição Animal pelas análises bromatológicas; À CAPES pelo auxílio financeiro. v

RESUMO O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito do probiótico tanto na qualidade de água, como no crescimento e conversão alimentar de Litopenaeus vannamei cultivado em um sistema super-intensivo sem renovação de água na presença de flocos microbianos. Para tanto, durante 30 dias experimentais, juvenis de L. vannamei com peso médio inicial de 0,047 ± 0,024g foram cultivados em 8 tanques retangulares de concreto pintados com tinta epoxi (1,43 m 2, 750 L) em uma densidade de 300 camarões/m 2 em 2 tratamentos com 4 réplicas. No tratamento Probiótico (P) foi aplicada uma dose inicial de 2 ppm seguida de doses diárias de 0,5 ppm de probiótico (um produto comercial composto por 5,0 x 10 5 ufc/g de Bacillus subtilis e Bacillus licheiniformis; ProW INVE ). Nos tanques do tratamento controle (C) os camarões foram cultivados sem adição de probiótico. Para o desenvolvimento do floco microbiano, todos os tanques foram fertilizados com uma aplicação inicial de melaço e farelo de trigo como fontes de carbono para incentivar o crescimento de bactérias heterotróficas. Além disso, durante o período experimental, a concentração de nitrogênio amoniacal total (TAN) foi monitorada para que fosse calculada a quantidade de melaço a ser adicionado, assumindo que 6 g de carbono são necessárias para converter 1 g de TAN em biomassa bacteriana. Ao final do experimento, o material em suspensão (floco microbiano) foi coletado para análise de composição bromatológica. Não houve diferença significativa entre os parâmetros de qualidade de água monitorados em ambos os tratamentos durante o período experimental. A sobrevivência e conversão alimentar não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos. Da mesma forma, a sobrevivência e o fator de conversão alimentar não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos. Porém, os camarões cultivados no tratamento Probiótico apresentaram peso médio final significativamente maior (p<0,05) (0,78 ± 0,32 g) em relação ao controle (0,66 ± 0,21 g). A composição bromatológica do floco microbiano no tratamento com probiótico apresentou proteína e extrato etéreo significativamente maior que o controle, o que pode ter proporcionado o melhor desempenho dos camarões. Portanto, a utilização de probióticos em meio heterotrófico pode ser recomendada como alternativa para melhorar a qualidade nutricional do floco microbiano e a performande dos camarões. vi

ABSTRACT This study aimed to assess the effect of the use of a probiotic (selected strains of beneficial bacteria) in the water quality, and performance of the white shrimp Litopenaeus vannamei reared in a zero exchange suspended microbial floc based superintensive culture system. Thus, during a 30 days trial, L. vannamei juveniles with an initial mean weight of 0.047 ± 0.024 g were reared in 8 epoxy painted square concrete tanks (1.43 m 2, 750 L) at a density of 300 shrimp/m 2 in two treatments with four replicates. In the treatment Probiotic (P) it was applied an initial dose of 2 ppm followed by daily applications of 0.5 ppm of the probiotic (a commercial product containing 5.0 x 10 5 cfu of Bacillus subtilis and Bacillus licheiniformis; ProW INVE ). In tanks from the control treatment (C) shrimp were reared without probiotic addition. For microbial floc development, all tanks were fertilized with an initial appliance of molasses and wheat bran as Carbon sources to boost heterotrophic bacteria growth, furthermore, during the experimental period total ammonia nitrogen concentration (TAN) was monitored in order to calculate the amount of molasses to be added, assuming that 6g of Carbon are needed to convert 1g of TAN into bacterial biomass. At the end of the trial suspended material (microbial floc) was collected for proximate composition analysis. There were no significant differences among water quality parameters monitored in both treatments throughout the experimental period. As well, survival and feed conversion rate did not showed significant differences between treatments. However, shrimp reared in the Probiotic treatment achieved significant higher (p<0.05) mean final weight (0.78 ± 0.32 g) than shrimp reared in the Control treatment (0.66 ± 0.21 g). Proximate composition analysis of the microbial floc from the Probiotic treatment showed significantly higher (p<0.05) protein and lipid content than the control, which is a possible reason for the better performance of shrimp reared in the presence of probiotic. Therefore, the use of the probiotic in a zero exchange heterotrofic system is recommended as a way to improve microbial floc nutritional quality and enhance shrimp performance. vii

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1 - INTRODUÇÃO Nos últimos anos, pesquisadores do mundo todo se depararam com a necessidade de criar alternativas para a produção de alimentos de origem animal com menor impacto ambiental. Na aqüicultura, algumas atividades têm sido alvo de críticas por danos causados ao oceano e recursos costeiros, destruição de ecossistemas circundantes, descarga de efluentes, invasão de espécies exóticas, disseminação de patógenos e grande dependência de farinha de pescado como fonte de proteína (Naylor et al. 2000; Boyd 2003). Custos excessivos e degradação da qualidade da água são fatores influenciados principalmente pela alta quantidade de nitrogênio protéico administrado em sistemas aquícolas. Os efluentes dos viveiros de cultivo são tipicamente ricos em sólidos suspensos, nutrientes orgânicos particulados, nutrientes inorgânicos dissolvidos e demanda bioquímica de oxigênio (DBO), com as concentrações determinadas principalmente pelos alimentos adicionados (Sandifer & Hopkins 1996). Entretanto, a partir da década de 90, pesquisas nos Estados Unidos demonstraram a possibilidade de se cultivar camarões com pouca ou nenhuma renovação de água (Hopkins et al. 1993). Nunes & Parson (1998) calcularam que apenas 17 % dos nutrientes da ração são despescados como biomassa de camarões ao final do ciclo, o restante acaba sendo perdido para o sedimento e, juntamente com fezes e outros materiais senescentes acumulando-se na forma de detritos orgânicos nas unidades de cultivo. Segundo Lin & Chen (2001), a mineralização destes detritos e a excreção dos animais cultivados resultam em aumento da concentração de nitrogênio amoniacal total (TAN) no sistema. Microrganismos desempenham funções em sistemas de aqüicultura que estão relacionadas com o crescimento dos organismos cultivados, manutenção da qualidade da água, controle do acúmulo de sedimento e mitigação dos riscos de introdução de doenças (Bratvold & Browdy 1998). Segundo Moriarty (1997), a cadeia alimentar microbiana é parte integrante de todos os viveiros e tem impacto direto na produtividade dos organismos cultivados. Thompson et al. (2002) concluíram que nutrientes essenciais para os camarões podem ser fornecidos por meio de microrganismos presentes no ambiente de cultivo, complementando a alimentação e reduzindo custos. 8

Especificamente nos sistemas de produção sem renovação de água a comunidade microbiana é essencial para a manutenção da qualidade da água e como fonte de alimento para os organismos cultivados (Burford et al. 2004, Wasielesky et al. 2006). Neste sistema super-intensivo de cultivo, os animais apresentam um desempenho adequado mesmo com a utilização de dietas com teor protéico abaixo de sua exigência (Tacon et al. 2002). Vitaminas e minerais são supridos pela biota, diminuindo a necessidade de adicionar estes componentes na dieta (Velasco et al. 1998). Isto somente é possível devido à suplementação por meio do material floculado em suspensão formado nos viveiros durante o ciclo de produção, que contém alto número de bactérias e fitoplâncton senescente (Burford et al. 2003). Emerenciano et al. (2007), avaliando o cultivo de Farfantepenaeus paulensis em meio heterotrófico, encontraram na composição bromatológica do material floculado níveis de 30,4 % de proteína bruta e 29,1 % de carboidrato. Wasielesky et al. (2006) concluíram que o material particulado suspenso em sistemas superintensivos de cultivo de Litopenaeus vannamei sem renovação de água pode melhorar significativamente a conversão alimentar, reduzindo custos de produção e descarga de efluentes nitrogenados. Nas unidades tradicionais de criação de camarões, a comunidade microbiana é manejada com a renovação da água, desperdiçando estes possíveis benefícios (Bratvold & Browdy 1998). Além de o sistema heterotrófico ser considerado de pouco impacto, a produção tem se mostrado promissora. Burford et al. (2004) relatam uma produção de 15.000 Kg de camarão/ha/ciclo na Belize Aquaculture Ltda (BAL), uma fazenda piloto onde são utilizados estoques reprodutores selecionados, pós-larvas livres de patógenos específicos, altas densidades de estocagem, renovação zero de água, viveiros forrados com membrana de polietileno de alta densidade e alimentos com baixo nível protéico (20%), situação esta que proporciona uma relação C:N maior, beneficiando as bactérias heterotróficas. A diminuição dos riscos de introdução e disseminação de patógenos e a otimização do uso da água e da terra são outros fatores que proporcionam ao cultivo sem renovação de água menor agressão aos ecossistemas adjacentes. O acúmulo de compostos nitrogenados como amônia e nitrito é um dos maiores problemas de qualidade da água em sistemas intensivos de aqüicultura (Ostrensky & Wasielesky 1995). Em sistemas sem renovação de água é utilizada a adição de carboidratos como estratégia para o controle da concentração de amônia, 9

proporcionando a sua assimilação pelas bactérias heterotróficas que fazem a conversão para proteína microbiana. Bactérias heterotróficas utilizam os carboidratos como fonte de energia e para o crescimento, ou seja, síntese de proteínas e novas células. Para a estruturação química das proteínas e dos materiais celulares, estes organismos precisam do nitrogênio inorgânico disponível na água. Este mecanismo, conhecido como imobilização do nitrogênio inorgânico, é realizado por praticamente todas as populações microbianas (Avnimelech 1999). Porém, para que este processo seja eficiente, a relação Carbono:Nitrogênio nos detritos deve ser maior do que 10:1 (Moriarty 1997). O melaço pode ser utilizado como fonte de carbono, ajustando assim esta relação e incentivando a imobilização do nitrogênio (Samocha et al. 2007). A proteína microbiana associada aos detritos orgânicos e partículas inorgânicas contribui substancialmente com a nutrição dos camarões, reduzindo as exigências de proteínas exógenas nos sistemas sem renovação de água (Burford et al. 2003, 2004). A inoculação seqüencial de microrganismos com o objetivo de melhorar a qualidade da água, saúde e a produção de organismos aquáticos tem sido aplicada em muitas fazendas e laboratórios por meio de probióticos (McIntosh et al. 2000). Gatesoupe (1999) sugere a seguinte definição para probióticos: células microbianas administradas de tal forma que se mantenham vivas no trato gastrintestinal, com o objetivo de melhorar a saúde do animal. A eficácia do uso de suplementos microbianos na aqüicultura ainda não é consenso entre pesquisadores da área. Os processos ecológicos que estão por trás dos possíveis benefícios destes produtos ainda não foram bem definidos, porém, acredita-se que as bactérias adicionadas produzem uma maior diversidade de exoenzimas que atuam diretamente na quebra de compostos orgânicos (Moriarty 1997). Balcázar et al. (2006) citam cinco mecanismos de atuação dos probióticos: exclusão competitiva de bactérias patogênicas, fonte de nutrientes, contribuição enzimática para a digestão, influência sobre a qualidade da água, melhora da resposta imune, efeitos antivirais. Entre as espécies de bactérias probióticas, o Bacillus subtilis é freqüentemente utilizado. Nishijima & Fukami (1995) descreve a espécie como remediadora devido à alta atividade de decomposição de proteína e carboidratos. Além disso, Keysami et al. (2007) observaram melhor sobrevivência e maior rapidez na metamorfose de larvas de 10

Macrobrachium rosenbergii alimentadas com náuplios de Artemia sp. enriquecidos com Bacillus subtilis. Outra bactéria freqüentemente utilizada como probiótico é o Bacillus licheiniformis, Li et al (2007) concluíram que esta espécie administrada em cultivo de L. vannamei inibiu Vibrio sp. por exclusão competitiva e melhorou a imunidade dos camarões. Rengpipat et al. (1998), utilizando Bacillus S11 em dietas de Penaeus monodon, observaram que o probiótico proporcionou uma melhor sobrevivência após os animais serem desafiados por bactérias do gênero Vibrio. McIntosh et al. (2000) testaram o efeito de probiótico para L. vannamei em meio heterotrófico e não encontraram diferenças significativas em quaisquer das variáveis. Ziaei-Nejad et al. (2006) observaram que, quando suplementados com Bacillus sp. na fase larval e durante a engorda, Fenneropenaeus indicus apresentaram conversão alimentar, crescimento específico e produção final mais satisfatórios e atribui o resultado a atividade de enzimas como lípase, amilase e protease. Wang (2007) observou maior crescimento e atividade enzimática em L. vannamei tratados com Bacillus sp. Lin et al. (2004) verificaram maior coeficiente de digestibilidade aparente da materia seca, proteína, lipídeo, fósforo, aminoácidos e ácidos graxos com a utilização de probiótico para L. vannamei. Wang et al. (2005) observaram melhora na qualidade de água em viveiros de L. vannamei tratados com probiótico, já que as unidades apresentaram aumento no oxigênio dissolvido e redução no fósforo reativo dissolvido, nitrogênio inorgânico total e demanda química de oxigênio. Bacillus subtilis e Bacillus licheiniformis são ainda efetivos como probióticos na prevenção de vibriosis e estímulo a microflora intestinal (Balcázar et al. 2007; Balcázar & Rojas-Luna 2007; Li et al. 2007). A adição de probiótico em um sistema heterotrófico sem renovação poderia determinar a persistência de bactérias benéficas ao meio, contribuindo para o desempenho dos organismos cultivados. Além disso, tem-se observado em sistemas de cultivo superintensivo sem renovação o acúmulo excessivo de matéria orgânica, o que aumenta a preocupação com a súbita queda nos níveis de oxigênio das unidades de cultivo (Avnimelech 2001; Boyd & Clay 2002). Desta forma, o probiótico poderia agir na decomposição da matéria orgânica evitando este acúmulo (Moriarty 1997). Existem poucos trabalhos onde a adição de probiótico em meio heterotrófico é avaliada (McIntosh et al. 2000). Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito 11

do probiótico sobre a performance dos camarões e a qualidade da água durante o cultivo super-intensivo sem renovação de água de L. vannamei. 12

2 OBJETIVO Avaliar crescimento, conversão alimentar, qualidade da água e composição do material floculado em sistema de cultivo superintensivo de L. vannamei sem renovação de água utilizando suplemento bacteriano (probiótico). 13

3 - MATERIAL E MÉTODOS As Pós-larvas (PL s) de L. vannamei foram adquiridas em laboratório especializado (Aquatec, Canguaretama, RN, Brasil) 10 dias após a metamorfose para este estágio (PL10). Antes do experimento foi realizada a fase de berçário, quando estes animais foram mantidos em tanques de fibra de vidro com volume útil de 5.000L, aquecimento e aeração constante por um período de 30 dias. Durante esta fase, os camarões foram alimentados com ração comercial com 45 % de proteína bruta e náuplios recém eclodidos de Artêmia sp. (25/mL) em 12 refeições diárias alternadas. O volume útil do tanque era renovado em 30% diariamente. A temperatura média neste período foi de 24,65 ± 1,44 e a salinidade 30. O experimento foi conduzido na Estação Marinha de Aqüicultura da Fundação Universidade Federal do Rio Grande (EMA/FURG) no período de 12 de agosto a 12 de setembro de 2007. As unidades de cultivo foram abastecidas com água filtrada bombeada do mar, e posteriormente inoculadas com 4,5 x 10 4 e 26 x 10 4 células/ml de microalgas diatomáceas Thalassosira weissflogii e Chaetoceros muelleri respectivamente. Foram utilizados 8 tanques retangulares de concreto pintados com tinta epoxi medindo 1,43 m 2 de área de fundo e volume útil de 750 L. Estes tanques contavam com sistema de aeração individual e estavam alocados em sala coberta com telhas transparentes ( greenhouse ). Em cada unidade experimental foram estocados 300 animais/m 2 com peso inicial médio de 0,047 ± 0,024 g e aleatoriamente distribuídos em 2 tratamentos com 4 repetições cada: Tratamento Probiótico (P), nos tanques deste tratamento foi colocada uma dose inicial de 2ppm de probiótico, posteriormente foi realizada a adição diária de 0,5 ppm de probiótico (recomendado pelo fabricante), o produto era adicionado diretamente na água, conforme recomendação do fabricante; Tratamento controle (C), nos tanques deste tratamento não foi feita adição de probiótico. O probiótico utilizado foi um produto comercial (Sanolife PRO-W, INVE, Bélgica) composto por Bacillus subtilis e Bacillus licheiniformis com uma concentração bacteriana de 5,0 x 10 5 unidades formadoras de colônia (UFC)/g. 14

Os 30 dias experimentais foram conduzidos sem nenhuma renovação de água, apenas era completado o volume útil dos tanques em ocasião de evaporação, com água doce submetida à intensa aeração para retirada do cloro. Os tanques foram submetidos à intensa aeração para que o floco microbiano fosse mantido em suspensão. Nos três primeiros dias de experimento foram aplicados, em todos os tanques, 7 g de melaço e 3 g de farelo de trigo como fonte de Carbono e substrato para o crescimento de bactérias heterotróficas. A quantidade destes insumos foi calculada a partir da quantidade de ração fornecida para os camarões com o objetivo de atingir uma relação C:N de aproximadamente 20:1. Posteriormente foi realizada a fertilização conforme sugerido por Avnimelech (1999), ou seja, para manter as concentrações de amônia abaixo de 1mg/L eram adicionadas 6 g de carbono para cada 1,0 g de TAN presente no sistema. Portanto, sempre que a concentração de TAN presente no sistema fosse maior que 1mg/L era adicionado melaço nestas proporções. A análise bromatológica do melaço utilizado revelou que 46 % (peso seco) deste era composto por Carbono. A concentração de amônia (N-NH 3 + NH 4, UNESCO 1983) foi analisada em dias alternados, enquanto que nitrito (N-NO 2, Bendschneider & Robinson 1952), nitrato (N-NO 3, Wood et al. 1967 adaptado por Aminot & Chaussepied 1983) e ortofosfato (P- PO 4, (Aminot & Chaussepied 1983) foram analisados a cada 5 dias. Este mesmo intervalo foi respeitado para as análises de clorofila a (Strickland & Parsons 1972) e volume do floco (VF) (Eaton et al. 1995 adaptado por Avnimelech 2007). Todas as manhãs antes da primeira refeição os parâmetros de temperatura, salinidade, ph e oxigênio dissolvido foram monitorados com o auxílio de um aparelho multiparâmetros (modelo 556 MPS, YSI, EUA). No período da tarde era realizada a leitura do disco de secchi e uma nova medida de temperatura. A cada dez dias foi analisada a alcalinidade (Eaton et al. 1995). Os camarões foram alimentados 2 vezes por dia em bandejas de alimentação com ração comercial com 38 % de proteína bruta. A quantidade de ração fornecida foi fundamentada no trabalho de Jory et al. (2001). Além disso, esta quantidade era ajustada diariamente de acordo com o consumo observado nas bandejas e de acordo com a biometria realizada após 15 dias de experimento. Ao final do experimento, estes 15

dados foram utilizados para calcular o fator de conversão alimentar aparente (FCA) de acordo com a seguinte fórmula: FCA = RF/B i B f, Onde, FCA = Fator de conversão alimentar aparente, RF = quantidade de ração fornecida, B i = Biomassa inicial, B f = Biomassa final Na despesca foram coletadas amostras de material floculado de todos os tanques e congeladas para posterior análise de composição bromatológica. Estas amostras foram obtidas a partir da filtragem dos meios experimentais em malha de 50 micras. As análises foram realizadas no Laboratório de Nutrição Animal LNA da Universidade Federal de Pelotas UFPEL, estado do Rio Grande do Sul, segundo os protocolos da AOAC (1984). Os dados de sobrevivência, crescimento, conversão alimentar dos camarões, parâmetros de qualidade da água e composição bromatológica do floco, foram submetidos ao teste t levando em consideração as premissas necessárias. Para tanto foi utilizado o programa STATISTICA 6.0. 16

4 - RESULTADOS Os parâmetros de qualidade da água temperatura, salinidade, ph, oxigênio dissolvido e alcalinidade não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos. Além disso, não foram observadas diferenças nas concentrações médias de amônia (NH 3 ), nitrito (NO 2 ), nitrato (NO 3 ) e fosfato (PO 4 ) (Tabela 1). Da mesma forma, as médias de clorofila a e volume do floco (FV) não apresentaram diferenças entre os tratamentos, entretanto os resultados de volume de floco mostraram uma tendência de maior quantidade de material em suspensão no tratamento P. As progressões dos compostos nitrogenados, Clorofila a e VF com o tempo estão expressas na Figura 1 e 2 respectivamente. A leitura média do disco de secchi indicou uma transparência significativamente menor da água nos tratamentos em que o probiótico foi aplicado (p<0,05) (Tabela 1). Tabela 1 Parâmetros de qualidade da água dos tratamentos controle (C) e probiótico (P). Parâmetros C P p Temperatura a.m. ( C ) 25,27 (1,97) 25,07 (2,00) 0,3293 Temperatura p.m. ( C ) 25,10 (2,24) 25,11 (1,45) 0,9723 Salinidade (g/l) 30,06 (1,05) 29,86 (0,85) 0,0532 PH 7,76 (0,66) 7,69 (0,63) 0,3002 Oxigênio Dissolvido (mg/l) 7,44 (1,42) 7,43 (1,48) 0,9374 Alcalinidade (mg CaCO3/L) 108,13 (30,34) 109,31 (34,54) 0,9183 Secchi (cm) 31,08 (8,45) a 28,12 (8,67) b 0,0009 Clorofila α (μg/l) 76,69 (83,65) 69,15 (52,27) 0,5083 VF (ml/l) 1,86 (2,55) 4,21 (5,65) 0,0765 Amônia (mg/l) 0,50 (0,60) 0,58 (0,73) 0,4214 Nitrito (mg/l) 10,30 (13,66) 10,90 (14,49) 0,8565 Nitrato N (mg/l) 2,79 (3,49) 2,72 (4,07) 0,9529 Fosfato (mg/l) 0,38 (0,63) 0,42 (0,67) 0,7982 * Letras sobrescritas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (P<0,05) 17

3,5 Amônia Total (mg/l 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0-0,5 C PB 2 4 6 8 10 12 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Tempo (dias) 20 Nitrito (mg/l 15 10 5 C P 0-5 2 4 8 15 21 25 31 Tempo (dias) 12 Nitrato (mg/l) 10 8 6 4 C PB 2 0 0 4 8 25 31 Tempo (dias) Figura 1 - Concentrações médias de amônia total (TAN), nitrito e nitrato no decorrer do tempo em sistema intensivo de criação de L. vannamei sem renovação de água com adição de probiótico (P) e sem probiótico (C). 18

Volume do Floco (VF) 20 ml/l 15 10 C P 5 0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (dias) 400 350 300 250 200 150 100 50 0-50 Clorofila a 5 10 15 20 25 30 C P Figura 2 - Volume do floco (VF) e Concentração de clorofila em sistema intensivo de criação de L. vannamei sem renovação de água com probiótico (P) e controle sem probiótico (C). A sobrevivência e o fator de conversão alimentar foram estatisticamente iguais entre os tratamentos, porém o peso médio final nos tratamentos com adição de probiótico foi superior ao controle (Tabela 2). Os camarões no tratamento P (293,45 ± 62,85 g) consumiram mais ração do que no controle (256,92 ± 46,21 g), porém estes valores não apresentaram diferenças significativas. 19

Tabela 2 Parâmetros de crescimento, sobrevivência, consumo de ração e fator de conversão alimentar de L. vannamei em tratamentos sem probiótico (C) e com probiótico (PB). Parâmetros Tratamento Mínimo Máximo Média (DP) p C 92,00 100,00 97,00 (4,00) Sobrevivência (%) P 93,00 100,00 97,00 (3,00) 0,9695 C 0,55 0,76 0,66 (0,21) a Peso médio final (g) P 0,56 0,97 0,78 (0,32) b 0,0010 C 212,85 307,45 256,92 (46,21) Consumo de Ração (g) P 210,92 361,20 293,45 (62,85) 0,3687 C 0,99 1,05 1,02 (0,03) 0,2843 FCA P 0,91 1,10 0,99 (0,09) * Letras sobrescritas diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (P<0,05) Na tabela 3 estão apresentados os valores médios referentes à composição bromatológica do floco microbiano nos tratamentos. A proteína bruta (PB) e o extrato etéreo (EE) no tratamento com probiótico (P) foram estatisticamente superiores ao controle. Tabela 3 Conteúdo de Proteína Bruta (PB), Extrato Não Nitrogenado (ENN), Fibra Bruta (FB), Extrato Etéreo (EE) e Cinzas no floco microbiano obtido dos tratamentos Controle (C), probiótico (P). TRATAMENTO PB (%) ENN (%) CINZAS (%) FB (%) EE (%) C 27,06 a 12,73 45,63 13,53 1,05 a P 32,42 b 13,61 36,70 13,94 3,33 b * Letras sobrescritas diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (P<0,05) 20

5 - DISCUSSÃO Em sistemas de produção de organismos aquáticos, a qualidade da água é preponderantemente controlada pela degradação microbiana dos resíduos orgânicos (Avnimelech et al. 1995). A utilização de Bacillus spp. em sistemas tradicionais de cultivo tem sido indicada com o objetivo de beneficiar esta degradação (Moriarty 1997; Gatesoupe 1999). Nos sistemas superintensivos sem renovação de água, algumas vezes, observa-se um excessivo acúmulo de material orgânico, aumentando os riscos da degradação da qualidade da água. Porém, no presente estudo, não houve efeito óbvio do probiótico, composto por Bacillus subtilis e Bacillus licheiniformis, sobre a qualidade da água, sendo que, a temperatura, salinidade e ph estiveram dentro da faixa considerada adequada para o crescimento destes Bacillus sp. (Nishijima & Fukami 1995). Com exceção da transparência do disco de secchi, os demais parâmetros de qualidade de água analisados, não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos. Como neste trabalho, outros estudos que avaliaram o efeito de probiótico em sistema sem renovação de água não apresentaram efeitos sobre a qualidade da água (Samocha et al. 1998; McIntosh et al. 2000). Porém, como a biomassa era pequena, podemos supor que, tanto no controle como no tratamento com probiótico, o tempo não foi suficiente para que a matéria orgânica acumulasse. Não existem sérios problemas com qualidade de água durante os estágios iniciais do cultivo de organismos aquáticos, quando os animais são pequenos e suas taxas metabólicas e as quantidades de alimento adicionadas ao sistema são baixas (Farzanfar 2006). Além disso, no floco naturalmente é estabelecida uma comunidade microbiana que pode atuar na degradação da matéria orgânica (Moriarty 1997; Avnimelech 2001; Burford et al. 2004). A temperatura média durante o experimento esteve dentro da faixa de 25 30 C, adequada para o crescimento e sobrevivência de juvenis de L. vannamei (Ponce-Palafox et al. 1997). Rosas et al. (2001) encontraram uma taxa máxima de crescimento da espécie em salinidade 15. Porém, Decamp et al. (2003), estudando diferentes salinidades em sistema sem renovação de água, observaram melhor produção em salinidade 36. Portanto, as salinidades verificadas no presente estudo podem ser consideradas adequadas ao crescimento da espécie. As médias de oxigênio dissolvido, ph e alcalinidade observadas nos tratamentos estiveram dentro dos níveis aceitáveis 21

(Van Wyk & Scarpa 1999). Amônia, nitrito, nitrato estiveram abaixo dos níveis de segurança determinados para as salinidades observadas (Van Wyk & Scarpa 1999; Lin & Chen 2001, Lin & Chen 2003). No presente estudo, os níveis de nitrito e nitrato aumentaram ao longo do tempo, porém não atingiram valores tóxicos. A amônia total foi mantida em níveis baixos durante todo o experimento, provavelmente devido à comunidade bacteriana, que, através da energia do carboidrato do melaço adicionado, utilizou esta fonte de nitrogênio para formar biomassa. Com isso, é possível supor que as comunidades de bactérias nitrificantes que reduzem amônia foram estabelecidas, mas a redução do nitrito a nitrato não foi eficiente, visto que ambos foram acumulando com o tempo. Uma possível estratégia para aumentar a capacidade de nitrificação do sistema seria a utilização de substratos artificiais (Bratvold & Browdy 2001, Ballester et al. 2007). Os parâmetros que indicam a quantidade de microorganismos no meio, VF e clorofila a, não apresentaram diferenças significativas após 30 dias. Entretanto, a significativa menor transparência (secchi) evidenciou uma tendência de existir maior quantidade de material floculado no tratamento que incluía probiótico. Apesar do Disco de Secchi não ser um equipamento de alta precisão, no presente trabalho este recurso mostrou-se relativamente eficiente, pois através do mesmo em trinta dias já foi possível detectar esta tendência. Possivelmente, a maior quantidade de material floculado no tratamento com probiótico esta relacionada com a maior biomassa bacteriana no mesmo. Além disso, é possível que os Bacillus spp. aplicados tenham competido por nutrientes com o fitoplâncton, já que verificou-se uma tendência de menor concentração de clorofila a no tratamento com probiótico. Os probióticos podem ser utilizados tanto como suplemento alimentar quanto como aditivo para a água (Moriarty 1998). Nos organismos aquáticos, o fluxo contínuo de água no interior do organismo aumenta a influência do meio sobre os mesmos. Assim, a microbiota intestinal destes animais pode variar rapidamente com a entrada de microrganismos vindos do alimento e/ou da água (Gatesoupe 1999). Ziaei-Nejad et al. (2006) comprovaram, através de técnicas de contagem de microrganismos, a presença de Bacillus spp no trato instestinal de Fenneropenaeus indicus submetidos a tratamento com probiótico. Segundo Bomba et al. (2002), os probióticos influenciam processos 22

digestivos pelo enriquecimento da população de microrganismos benéficos, atividade de enzimas microbianas e melhor digestibilidade e utilização do alimento. Em sistemas intensivos sem renovação de água, os microrganismos colonizam detritos orgânicos formando os flocos microbianos e estes complementam a dieta dos camarões reduzindo custos de alimentação (Wasielesky et al. 2006). Portanto, os Bacillus spp. aplicados na água das unidades experimentais possivelmente contribuíram com a nutrição dos animais, conforme ficou demonstrado pelo maior crescimento dos camarões. Segundo Irianto & Austin (2002), o uso de probiótico, além de reduzir a utilização de antibióticos, aumenta o apetite e a performance de crescimento das espécies cultivadas. No presente experimento, os camarões apresentaram maior peso médio final no tratamento onde o probiótico foi fornecido, provavelmente devido a fatores nutricionais. Apesar de não ter sido detectada diferença estatística, o consumo alimentar foi em média 13% maior no tratamento com probiótico, indicando um estímulo à alimentação. Além disso, o maior valor nutricional do floco microbiano formado na presença de probiótico provavelmente contribuiu para o melhor desempenho dos camarões. De acordo com Jory (2001) e Tacon et al. (2002) o floco microbiano contém altos níveis de proteína e outros importantes componentes que suplementam a nutrição dos camarões. No presente estudo, a composição do floco microbiano no tratamento com probiótico apresentou estatisticamente maiores níveis de proteína bruta e extrato etéreo comparado ao controle. Os níveis de proteína de 27,06 e 32,42 %, respectivamente para C e P, estão próximos dos valores verificados por Tacon et al. (2002), Soares et al. (2004), Wasielesky et al. (2006) e Emerenciano et al. (2007). No entanto, os níveis de extrato etéreo no tratamento com probiótico foram superiores ao destes experimentos (3,33%) e significativamente maiores do que o controle (1,05%). McIntosh (2000) encontrou 12,5 % de lípideos na composição do floco microbiano. Chamberlain et al. (2001) argumentam que a composição de células microbianas em flocos suspensos varia muito dependendo dos microrganismos específicos e das condições sob as quais estes estão crescendo. Este mesmo autor sugere que, em um certo grau, esta biota que habita o floco pode ser manipulada. Possivelmente o aumento na quantidade de lipídeos esta relacionado ao aumento no número de bactérias devido 23

ao fornecimento de probiótico, porém são necessários estudos mais aprofundados para que seja possível afirmar. Além disso, Zhukova & Kharlamenko (1999) demonstraram que zooflagelados e ciliados são capazes de sintetizar ácidos graxos poliinsaturados a partir de ácidos graxos mais simples ingeridos a partir da predação de bactérias, o que pode significar um incremento da qualidade lipídica no floco e um sinal de que o Microbial Loop esta acontecendo dentro do ambiente de cultivo. Os resultados do experimento estão de acordo com os resultados encontrados por Wang (2007) que observou maior crescimento em juvenis de L. vannamei alimentados com dietas suplementadas com probiótico. O autor atribuiu isto a melhora na atividade enzimática, o que proporcionou melhor eficiência no aproveitamento do alimento. Da mesma forma, Lin et al. (2004) observaram que com a utilização de probiótico, os coeficientes de digestibilidade aparente de nutrientes como proteína, aminoácidos e fósforo podem ser melhorados em L. vannamei. 24

6 CONCLUSÃO A utilização do probiótico no cultivo de L. vannamei em meio heterotrófico mostrou-se eficiente. Os animais cultivados na presença de probiótico apresentaram sobrevivência e conversão alimentar estatisticamente iguais, entretanto foi observado crescimento significativamente maior (p<0,05) dos camarões cultivados no tratamento com adição de probiótico. Estes resultados estão provavelmente relacionados com a melhor qualidade nutricional do floco formado com adição de probiótico e ao estímulo alimentar notado nos camarões deste tratamento. 25

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