Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra Armando Cristóvão Adaptado de "The Tools of Biochemistry" de Terrance G. Cooper Espectrofotometria de Absorção Uma das primeiras características químicas que foram estudadas dos compostos, foi a sua cor. A intensidade da cor é muito usada para diversos ensaios bioquímicos. As substâncias possuem cor devido à sua capacidade em absorver ou/e remover certos comprimentos de onda. Mesmo substâncias consideradas transparentes têm geralmente um espectro de absorção nas zonas ultravioleta e infravermelha. Por exemplo, se uma luz branca atravessa uma garrafa de vinho tinto, o vinho aparece vermelho (ver tabela I para exemplos das cores transmitidas com as cores absorvidas). Parece-nos vermelho porque todos os comprimentos de onda das gamas azuis e amarelas são absorvidos, permitindo apenas a passagem do componente vermelho que é detectado pelo nosso olho. De acordo com a Figura 1, a luz visível detectada pelo olho humano é apenas uma pequena porção do espectro electromagnético (400-800 nm). ENERGIA AUMENTA NMR ESR λ MICROONDA (RADAR) Rotação molecular Infra vermelhos Vibração Molecular VIS. UV UV de vácuo Raios X Raios γ 25 cm 400 µm 25 µm 2,5 µm 400 nm 1 nm 0,1 nm 800 nm 200 nm Figura 1 - Representação esquemática do espectro electromagnético (adaptado de Cooper, 1977) Zoologia (AJC) 1
A teoria dos quanta propõe que cada substância absorva luz de comprimentos de onda específicos. Assim, para cada substância, há uma absorção característica a cada comprimento de onda que representa o seu espectro da absorção. A cor duma substância é determinada pela luz que não está a ser absorvida, como se indica na seguinte tabela: Tabela I - Relação entre as cores e comprimentos de onda da luz. (nm) cor transmitida cor absorvida 400 435 violeta verde-amarelado 435 480 azul Amarelo 480 490 azul esverdeado Laranja 490 500 verde azulado Vermelho 500 560 verde roxo (púrpura) 560 580 verde amarelado Violeta 580 595 amarelo Azul 595 610 laranja azul esverdeado 610 750 vermelho verde azulado A - Alteração na energia dos átomos e das moléculas Para discutir a medição da luz é necessário definir os termos que caracterizam a luz. Se assumirmos que a luz pode ser traduzida num fenómeno de onda, a distância entre dois picos representa o comprimento de onda (λ) e a frequência que é o número de ondas que passam por um dado ponto por unidade de tempo (ν). A relação entre o comprimento de onda e a frequência é: λ = c ν (1) onde c é a velocidade da luz no vácuo. Outro parâmetro muito útil é a quantidade de ondas de luz ( ν ); que é o número de ondas por unidade de distância (normalmente em cm). O número de ondas está relacionado com o comprimento de onda e com a frequência pela seguinte equação: Zoologia (AJC) 2
ν = 1 λ = ν c (2) A energia e a frequência relacionam-se pela equação E=hν (3) ou hν=h ν c onde h é a constante de Planck. Quando a luz passa através de uma substância, uma certa quantidade de energia pode passar para a amostra, passando o estado energético das partículas na solução para níveis mais elevados. A luz que participa nestas transacções pode ser calculada usando e seguinte equação: E = h ν (4) conjuntamente com a equação 2: E = h c λ. Os possíveis tipos de transições de luz são: Nos átomos - Em sistemas que consistem de átomos individuais, as alterações da energia devem-se somente às alterações do arranjo dos electrões, como foi indicado acima. Nas moléculas - No entanto, no caso das moléculas, a energia do fotão é transmitida para a molécula por um ou mais dos seguintes processos: 1. Energia de vibração: átomos individuais podem ser induzidos a vibrar no seu eixo de ligação ao resto da molécula; 2. Energia rotacional: os átomos são induzidos a rodar; 3. Energia electrónica: o nível de energia dos electrões pode alterar-se, como referido. Zoologia (AJC) 3
Como no caso dos electrões dos átomos, há um número limitado de tipos de vibrações e rotações que os átomos de uma molécula podem tomar e, em cada caso, há uma alteração específica na energia da molécula. B - Leis da absorção aplicáveis à determinação da concentração de substâncias em solução B.1. A lei de Bouguer Bouguer foi o primeiro a realizar uma experiência em que relaciona o quantidade de luz que atinge cada molécula numa amostra e a quantidade de luz que passa através da amostra. Ele assumiu que a radiação que incide é 1; e observou que a luz transmitida foi de 50% para uma célula. Da mesma forma só 25% da luz é transmitida no caso de 2 células. Para descrever estas observações de transmitância (T) foram definidas por T = I Io onde I é a quantidade de energia transmitida pela célula; Io é a quantidade de energia que incide na célula. (5) B.2. A Lei de Beer Muito mais tarde que Bouguer, Beer realizou experiências semelhantes, mas expressou-a em termos de concentração. Assim quando uma substância se encontra em solução, a luz absorvida por unidade de espessura é proporcional à concentração da substância que absorve. log Io I = 2 K c (6) onde c é a concentração da substância em solução, expressa em moles/l; e K 2 é a constante de proporcionalidade. Zoologia (AJC) 4
B.3. A lei de Lambert Se considerarmos apenas luz monocromática, a quantidade de luz transmitida é proporcional à intensidade de luz incidente na solução, obtemos a seguinte equação: log Io I = 1 K l (7) onde Io é a intensidade original do feixe; I é a intensidade do feixe após passar a mostra; l a espessura da solução, expressa em cm; e K 1 é a constante de proporcionalidade que depende das características de absorção da substância, da temperatura e do comprimento de onda utilizado. B.4. A lei de Beer-Lambert Se combinarmos as leis de Beer e de Lambert e integrarmos a equação diferencial para a transmissão da luz, resulta a equação fundamental da absorção da luz: log Io I = ε λ c (8) onde ε é o coeficiente de extinção de concentração molar; Io também se designa I por densidade óptica. A expressão log Io I = Absorvância. Como o valor de λ se mantém constante e ε é uma constante, a absorvância é proporcional à concentração, podendo representarse graficamente esta relação da seguinte maneira: Absorvência Concentração Zoologia (AJC) 5
Pode, portanto, usar-se esta relação para determinar a concentração duma substância em solução pela medição da sua absorvância. O coeficiente de extinção molar é característico de cada substância e: 1. depende da substância absorvente; 2. depende do solvente usado; 3. depende do comprimento de onda da luz utilizada na medição; 4. não depende da concentração da substância ou do diâmetro do tubo de medida. Duma maneira restrita, as leis da absorção são aplicáveis somente a luz monocromática. A aplicação da lei de Beer-Lambert é válida apenas para soluções relativamente diluídas. nesta região, a lei de Beer-Lambert é válida nesta região, a lei de Beer-Lambert não é válida Absorvência Concentração Como vemos no gráfico, a altas concentrações da substância perde-se a relação linear entre a concentração e a absorvância. É por isso importante que se determine em cada caso qual a gama de concentrações permissíveis para manter a relação linear. A maneira mais fácil de o conseguir é preparar uma série de soluções da substância de concentrações conhecidas (padrões) e determinar a sua absorvância num espectrofotómetro. Aproveitam-se apenas os resultados das soluções cuja absorvância mantenha uma relação linear com a concentração. Uma vez estabelecida a relação linear entre a concentração da substância em solução e a sua absorvância, pode determinar-se facilmente uma concentração desconhecida da mesma solução da maneira a seguir indicada (ver figura abaixo) Para que se possam fazer estas determinações é essencial que: Zoologia (AJC) 6
1. o solvente usado na preparação dos padrões seja o mesmo usado na preparação das amostras; 2. se subtraia a absorvância do solvente sem substância (vulgarmente designado por branco) das leituras das soluções que contêm a substância a ser determinada. "curva-padrão" Absorvência 0,3 0,2 0,1 absorvência da solução de concentração desconhecida (A = 0,3) concentração da substância desconhecida (6 mg/ml) 0 2 4 6 Concentração (mg/ml) Bibliografia Atkins, P and Jones, Loretta (1997). Chemistry:Molecules,matter and change, 3rd ed, ed W.H.Freeman New York Cooper, Terrance G. (1977). The tools of Biochemistry ed Jonh Wiley and Sons, New York Layne E. (1957). Methods in Enzymology (Colowick S.P. and Kaplan N. O., Eds). Academic Press, New York, Vol. 3, 447-441 Zoologia (AJC) 7