UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-1b, FLI-1 e MCP-1 COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASO- CONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL KAROLINA DA COSTA SABINO MANAUS 2014

i KAROLINA DA COSTA SABINO ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-1b, FLI-1 e MCP-1 COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASO- CONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Rajendranath Ramasawmy MANAUS 2014

ii Ficha Catalográfica S116e Sabino, Karolina da Costa. Estudo de associação de polimorfismos dos genes IL-1b, FLI-1 e FOLHA DE JULGAMENTO MCP-1 com leishmaniose cutânea em uma população caso-controle do estado do Amazonas, Brasil / Karolina da Costa Sabino Manaus: Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, 2014. xvii. 93 f.: il. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas UEA/FMT- HVD, 2014. Orientador: Profº. Dr. Rajendranath Ramasawmy 1. Leishmaniose 2.Polimorfismo genético 3. IL-1b 4. MCP-1 5. FLI-1 I. Título. CDU: 616.9 Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana do N. Silva lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA

iii ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL- 1b, FLI-1 e MCP-1 COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL KAROLINA DA COSTA SABINO Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Presidente Membro Membro

iv DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Auxiliadora da Costa Sabino e Mizael da Silva Sabino, pelo apoio constante e incondicional, sem os quais seria impossível completar esta árdua caminhada.

v AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar a Deus, minha fonte de inspiração e sabedoria. Quem me sustentou e me deu forças em todos os momentos dessa jornada. Mesmo nos dias em que eu pensava em desistir e abandonar o sonho da pesquisa, Ele sempre colocava pessoas em meu caminho que pudessem me aconselhar e alegrar meu dia, e me mostrar que toda grande conquista requer uma árdua batalha. Obrigada meu Criador e Consolador, sem Ti não estaria aqui. Aos meus pais, Maria Auxiladora da Costa Sabino e Mizael da Silva Sabino meus sinceros e eternos agradecimentos, pois se fui atrás dos meus sonhos, foi porque vocês foram meus maiores incentivadores e patrocinadores. A vocês dedico todo meu amor, carinho e gratidão, por me educarem tão bem e por serem meus referenciais de caráter, honestidade, perseverança, mansidão e sabedoria. Por me ensinarem com exemplos concretos que a vida é cheia de lutas e dificuldades, mas que com fé e persistência sempre podemos vencer e tirar grandes lições de todas as adversidades. Aos meus queridos irmãos Karinna Sabino e Alexandre Sabino. Obrigada por existirem e por sempre torcerem por mim. Agradeço pelas palavras de incentivo e apoio que sempre liberaram a mim, e por toda ajuda que vocês me deram nessa etapa. Amo vocês de todo meu coração. Ao meu orientador Rajendranath Ramasawmy pela oportunidade de fazer o mestrado. À Dra Cintia Mara Costa de Oliveira, minha primeira e eterna orientadora. Quem me ensinou a dar os primeiros passos na pesquisa e que me inspirou pelo seu exemplo de caráter e seriedade. Obrigada pela amizade e oportunidade. À gerência de Leishmaniose na pessoa do Dr. Jorge Guerra e aos técnicos Amélia Bittencourt, Claudemir Félix e Rita pelo apoio na etapa de recrutamento dos pacientes. À Universidade do Estado do Amazonas (UEA) e à Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT/HVD) pela excelência no ensino e por proporcionarem aos seus alunos um ambiente favorável ao aprendizado.

vi Aos colegas da turma de Pós-Graduação, que tornaram essa caminhada mais agradável. Obrigada pelas risadas, trocas de conhecimentos, confraternizações e convívio diário. Às amigas Luciane Souza e Priscila Bentes, que caminharam lado a lado comigo nesta jornada. Meninas, sem vocês esta caminhada teria sido muito mais árdua. De todo coração agradeço por tê-las em meu caminho, por todas as conversas, lamentações, incertezas, alegrias, gargalhadas e ajuda mútua. Levarei essa experiência para sempre comigo, e vocês certamente farão parte dessas lembranças. É bem verdade que cordão de três dobras não se rompe com facilidade, nós somos prova viva disso. Às amigas de todas as horas Belisa Maia, Brigite Stela e Lorena Sabrina. Presentes de Deus para minha vida e que nessa etapa tão crucial, foram muito mais que amigas, foram irmãs, conselheiras, psicólogas e incentivadoras. Amigas queridas, obrigada por acreditarem em mim, muitas vezes até mais do que eu. Amo vocês. Às amigas e aventureiras Bárbara Yole e Larissa Morais que estiveram comigo desde os tempos de graduação. Seguiram caminhos distintos dos meus, mas sempre estiveram presente para me ouvir, encorajar e torcer pelo meu sucesso. Que eu possa assistir de perto o sucesso de vocês também. A todos os amigos e familiares, tanto presentes quanto ausentes, mas que de alguma forma me deram uma palavra de incentivo e esperança. Que sempre mostraram estar na torcida por mim, desejando que tudo acabasse bem. À Geovana Broto, Heloísa Salomão e Helena D Espindula por tão gentilmente terem nos recebido e ajudado com a parte estatística do projeto. Agradeço de coração, pois vocês nos receberam de modo tão acolhedor, e mesmo sabendo de nossas limitações foram pacientes e atenciosas. You girls are the best! Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas (LPDE), pelos momentos de descontração e gargalhadas. Em especial à dona Maria, pela amizade, carinho, abraços apertados e pelos momentos de descontração, regado a muitas risadas e deliciosos cafezinhos. Às agências de fomento à pesquisa CNPq e CAPES pela bolsa concedida e pelos recursos disponibilizados para a execução do estudo.

vii Meu agradecimento mais do que especial aos pacientes e voluntários sem leishmaniose, que por mais incômodo que fosse, aceitaram participar da pesquisa e depositaram total confiança em nossa equipe, nos recebendo em seus lares de forma tão acolhedora. Por fim, agradeço a todos que contribuíram de alguma forma, direta ou indiretamente, para que esse estudo fosse realizado.

viii DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS À Superintendência da Zona Franca de Manaus SUFRAMA e Fundação de Apoio Institucional Muraki-FMuraki pelo apoio na estrutura do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de pesquisa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento desta pesquisa (MCTI/CNPq/MS-SCTIE) sob numeração: 04181/2012-0.

ix I have no special talent. I am only passionately curious. (Albert Einstein) Nothing worth having was ever achieved without effort. (Theodore Roosevelt)

x RESUMO As leishmanioses representam um complexo de doenças com importante espectro clínico e diversidade epidemiológica, sendo causadas por um protozoário intracelular obrigatório pertencente ao gênero Leishmania. Nas áreas onde a leishmaniose é considerada endêmica, somente uma fração da população exposta ao parasita desenvolve a doença, sugerindo que fatores genéticos tenham um papel fundamental nesse contexto, associado a fatores ambientais, socioeconômicos, culturais, entre outros. Assim, com o propósito de identificar polimorfismos que possam ter influência no controle da susceptibilidade, o presente estudo teve como objetivo verificar o papel de polimorfismos genéticos em IL-1b, FLI-1 e MCP-1 associados com leishmaniose cutânea (LC) em uma população do estado do Amazonas. Para realização do estudo foram recrutados um total de 774 indivíduos, sendo 392 indivíduos com leishmaniose cutânea para compor o grupo caso, oriundos da demanda espontânea do ambulatório de Dermatologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT- HVD); e 382 indivíduos sem a doença para o grupo controle, provenientes da mesma área endêmica dos casos. O DNA genômico foi extraído a partir do creme leucocitário com o kit comercial de extração de DNA, de acordo com as instruções sugeridas pelo fabricante, ou pela técnica de salting-out. No que se refere aos SNPs IL- 1b_rs1143634 (IL-1b 3953 C/T), MCP1_rs1024611 (MCP-1-2518 A/G), FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894, não foram observadas associações genéticas com a susceptibilidade ou resistência à LC na população estudada. Para o SNP IL1b_rs16944 (IL-1b -511 C/T), foram detectadas diferenças estatisticamente significativas na distribuição alélica e genotípica do polimorfismo entre os grupos caso e controle, sugerindo associação do alelo C com susceptibilidade [P=0.027, OR=1.42 IC95% (1.04 1.94)], e do alelo T com resistência [P=0.036, OR=0.66 IC95% (0.45 0.96)] para LC. Para o SNP rs7930515 de FLI-1 foi observado valor de P borderline, podendo-se sugerir que o alelo C está associado com risco para LC [P=0.036, OR=2.38 IC95% (1.07 5.32)]. Os resultados obtidos no presente estudo reforçam o papel dos genes IL1-b e FLI-1 associados com resistência ou susceptibilidade a LC. Descritores: Leishmaniose, polimorfismo genético, IL-1b, MCP-1, FLI-1.

xi ABSTRACT Leishmaniasis represents a complex of diseases with important clinical spectrum and epidemiological diversity, being caused by an obligate intracellular protozoan belonging to the genus Leishmania. In areas where leishmaniasis is considered endemic, just a part of the population exposed to the parasite get sick, suggesting that genetic factors have a key role in this context, associated with socioeconomic, environmental and cultural factors. Thus, in order to identify polymorphisms that might influence the control of susceptibility, this study aimed to determine the role of genetic polymorphisms in IL-1b, FLI-1 and MCP-1 associated with cutaneous leishmaniasis (CL) in a population of the state of Amazonas. To conduct the study were recruited 774 subjects, being 392 subjects with cutaneous leishmaniasis to compound the case group, all of them derived from the spontaneous demand of the dermatology ambulatory of Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD); and 382 individuals without the disease to the control group, from the same endemic area of case group. Genomic DNA was extracted from the buffy coat with the commercial DNA extraction kit according to the instructions suggested by the manufacturer or by the technique of salting-out. In regard to IL-1b_rs1143634 (IL-1b 3953 C/T), MCP1_rs1024611 (MCP-1-2518 A/G), FLI1_rs619521 and FLI1_rs531894 SNPs, were not observed genetic associations with susceptibility or resistance to LC in the studied population. For IL1b_rs16944 (IL-1b -511 C / T) SNP, statistically significant differences were found in allele and genotype distribution of the polymorphism between case and control groups, suggesting an association of the C allele with susceptibility [P = 0.027, OR = 1:42 95 % (1.04-1.94)], and the T allele with resistance [P = 0.036, OR = 0.66 95% (0.45-0.96)] to LC. For rs7930515 SNP of FLI- 1 was observed a borderline P-value, suggesting that the C allele is associated with risk for LC [P = 0.036, OR = 95% 2:38 (1:07 to 5:32)]. The results obtained in this study reinforce the role of IL1-b and FLI-1 genes associated with resistance or susceptibility to LC. Key-words: Leishmaniasis, genetic polymorphism, IL-1b, MCP-1, FLI-1.

xii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ATP Adenosina trifosfato; C3 Convertase 3; CCC Cardiomiopatia chagásica crônica; CCL2 quimiocina CC ligante 2 (gene); CMSP - Células mononucleares do sangue periférico; CMI anti-leishmania Imunidade mediada por células anti-leishmania; CR1 Receptor de complemento 1; CR3 Receptor de complemento 3; DLL1 delta-like 1 (gene); DMSO Dimetilsulfóxido; DNA Ácido desoxirribonucleico; dntp desoxirribonucleotídeo trifosfato; EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético; ETS E26 Transformation-Specific; FLI-1 friend leukemia virus integration 1 (gene); GM-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos; GTP Guanosina trifosfato; Hae III Haemophilus aegyptius III; IFNGR1 interferon gamma receptor 1 (gene); IFN-γ Interferon gama; IL Interleucina; IL-1b Interleucina 1 beta (gene); LCD Leishmaniose Cutâneo-Difusa; LCL Leishmaniose Cutâneo-Localizada; LIT Liver Infusion Triptose; LMC Leishmaniose Mucocutânea; LTA Leishmaniose Tegumentar Americana; LV Leishmaniose Visceral; MCP1 gene para proteína quimioatrativa de monócito tipo 1; M-CSF Fator estimulador de colônia de macrófago; min minuto;

xiii ml mililitro; mm milímetro; mm milimolar; µl microlitro; ng nanograma; NNN Mc Neal, Novy e Nicolle; NRAMP1 proteína 1 do macrófago associado à resistência natural (gene); PCR - Reação em cadeia da polimerase; pm picomolar; RFLP Análise clássica de comprimento do fragmento de restrição; RNA Ácido ribonucleico; rpm rotações por minuto; Sb+5 - Antimônio pentavalente; seg segundos; SF soro fisiológico; SFM Sistema fagocítico mononuclear; SLA - Antígeno solúvel de Leishmania; SNP polimorfismo de nucleotídeo único; TAE tampão Tris-Acetato-EDTA; TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido; TGFB1 fator transformador de crescimento beta 1 (gene); TGF-β Fator transformador de crescimento beta; Th1 T helper 1; Th2 T helper 2; TLR4 Receptor toll-like 4 (gene); TNF-α Fator de necrose tumoral alfa; U Unidades; UV Ultravioleta;

xiv LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características clínicas da leishmaniose humana... 8 Tabela 2. Informações gerais dos marcadores polimórficos genotipados para MCP-1, IL-1b e FLI-1.... 23 Tabela 3. Condições gerais de PCR usadas para o marcador MCP1_rs1024611... 23 Tabela 4. Condições gerais de PCR usadas para os marcadores IL1b_rs16944 e IL1b_rs1143634.... 24 Tabela 5. Condições gerais de PCR usadas para os marcadores FLI1_rs7930515 e FLI1_rs619521.... 24 Tabela 6. Condições gerais de PCR usadas para o marcador FLI1_rs145675082.. 24 Tabela 7. Condições gerais de PCR usadas para o marcador FLI1_rs531894... 25 Tabela 8. Condições gerais usadas na reação de digestão.... 26 Tabela 9. Condições gerais usadas na reação de PCR-RFLP.... 29 Tabela 10. Características gerais da população caso-controle em estudo.... 30 Tabela 11. Comparação das distribuições das frequências genotípicas e alélicas para os marcadores MCP1_rs1024611, IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894.... 34 Tabela 12. Comparação da distribuição das frequências genotípica, alélica e de dominância para o marcador IL1b_rs16944... 34 Tabela 13. Comparação da distribuição das frequências genotípica, alélica e de dominância para o marcador FLI1_rs7930515... 36

xv LISTA DE FIGURAS Figura 1. Morfologia das duas principais formas de Leishmania... 1 Figura 2. Ciclo parasita-hospedeiro das leishmanioses... 2 Figura 3. Distribuição da leishmaniose cutânea no mundo.... 4 Figura 4. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs IL1-B +3953 C/T e IL1-B -511 C/T respectivamente.... 31 Figura 5. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para o SNP MCP1-2518 A/G.... 31 Figura 6. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs FLI1_rs7930515, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894 respectivamente.... 32 Figura 7. Análise de desequilíbrio de ligação entre os SNPs dos genes IL-1b e FLI-1 respectivamente..... 32

xvi SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 1 1.1. Leishmaniose Aspectos Gerais... 1 1.2. Leishmaniose Tegumentar Americana... 6 1.3. Imunopatogênese da leishmaniose... 8 1.4. O Modelo experimental murino para leishmaniose... 11 1.5. Fatores genéticos na leishmaniose... 13 1.5.1. IL-1b... 14 1.5.2. FLI-1... 16 1.5.3. MCP-1... 16 2. OBJETIVOS... 18 2.1. Objetivo Geral... 18 2.2. Objetivos Específicos... 18 3. MATERIAL E MÉTODOS... 19 3.1. Delineamento do estudo... 19 3.2. Área de estudo... 19 3.3. População estudada... 19 3.3.1. Definição de Caso... 19 3.3.2. Recrutamento da população... 20 3.3.3. Grupo caso... 20 3.3.4. Grupo controle... 20 3.4. Coleta do material biológico... 21 3.5. Extração de DNA... 21 3.6. Genotipagem... 22 3.6.1. PCR... 23 3.6.2.Digestão... 25 3.7. Análise estatística... 27 3.8. Aspectos Éticos:... 27 3.9. Suporte Financeiro:... 27

xvii 4. RESULTADOS... 30 4.1. Características Gerais da População em Estudo... 30 4.2. Genotipagem, HWE e DL... 31 4.2.1 Análise dos marcadores MCP1_rs1024611, IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894... 33 4.2.2. Análise do marcador IL1b_rs16944... 33 4.2.3. Análise do marcador FLI1_rs7930515... 33 5. DISCUSSÃO... 37 5.1. MCP-1... 38 5.2 FLI-1... 39 5.3 IL-1b... 40 6. CONCLUSÃO... 43 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 44 8. ANEXOS... 54 Anexo A Fluxograma do Estudo... 54 Anexo B Termo de Consentimento Livre e Esclarecido... 55 Anexo C Questionário... 59 Anexo D Protocolo de Extração... 60 Anexo E Minuta de Artigo... 61

1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Leishmaniose Aspectos Gerais As leishmanioses são consideradas um grande problema de saúde pública, representando um grupo de doenças com importante espectro clínico e diversidade epidemiológica (1,2). São uma das mais diversas e complexas doenças transmitidas por vetores, sendo causadas por um protozoário intracelular obrigatório pertencente ao gênero Leishmania (3). Leishmania é um protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastidae, gênero Leishmania, subgêneros Leishmania e Viannia (4). Sete espécies de Leishmania têm sido associadas como agentes causadores da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Brasil: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) lindenberg, e Leishmania (Leishmania) amazonensis. Contudo, L. (V.) braziliensis é o principal agente etiológico da LTA no Brasil (5). Leishmania apresenta-se com duas formas principais: uma flagelada ou promastigota, encontrada no tubo digestivo do vetor, e outra aflagelada ou amastigota, observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados como parasita intracelular obrigatório das células do sistema fagocitário mononuclear, conforme ilustrado na figura 1 (1). Figura 1. Morfologia das duas principais formas de Leishmania: a) Forma flagelada ou promastigota do parasita. b) Forma aflagelada ou amastigota. Fonte: Ministério da Saúde, 2010.

2 O flebotomíneo responsável pela transmissão do parasito da LTA na América pertence à subfamília Phlebotominae e gênero Lutzomyia (4). No ciclo epidemiológico da LTA (esquematizado na figura 2), o flebotomíneo representa o elo entre os reservatórios e o homem, que se comporta apenas como hospedeiro acidental da Leishmania. Este parasito é dimórfico, assim, ao picar os reservatórios infectados, as fêmeas dos flebotomíneos adquirem as formas amastigotas do protozoário, que rapidamente se transformam em formas promastigotas no intestino dos vetores. Essas formas dividem-se ativamente e no novo repasto, são injetadas na pele do hospedeiro. As promastigotas são as formas infectantes do parasito que interagem com as células do sistema fagocitário mononuclear, perdem o flagelo e, sob a forma amastigota, passam a se multiplicar no interior das células, sendo a infecção combatida pelas defesas do hospedeiro, evoluindo para a cura espontânea; ou evoluindo para uma das diversas manifestações clínicas da leishmaniose (6,7). Figura 2. Ciclo parasita-hospedeiro das leishmanioses Fonte: http://dc236.4shared.com/doc/fenblqec/preview.html As formas clínicas da leishmaniose são diversas, sendo descritas em: leishmaniose visceral (LV) - geralmente fatal quando não tratada; leishmaniose mucocutânea (LMC) - doença mutilante; leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) - doença de longa duração devido à deficiência na resposta imune celular; e leishmaniose

3 cutânea (LC) que é incapacitante quando as lesões são múltiplas (2,8). Segundo estudo realizado por Toleto et al, 2013, a LC afetou a qualidade de vida de todos os pacientes com a doença, com 40% desses indivíduos sendo gravemente afetados LC. Desse modo, puderam concluir que a LC teve um impacto negativo de moderado à alto na qualidade de vida dos pacientes (9). A cada ano, estima-se que 0,7 1,2 milhões de crianças e adultos desenvolvem a forma sintomática da leishmaniose (cutânea 0,7-1,2 milhões; visceral 0,2-0,4 milhões), e ainda, que 350 milhões de pessoas estejam expostas ao risco. A incidência da doença é ainda mais relevante quando as infecções assintomáticas são incluídas (1,2,10). Nas regiões onde a LTA ocorre de forma endêmica, as condições socioeconômicas desfavoráveis da população facilitam uma maior exposição do indivíduo ao vetor, favorecendo o desenvolvimento da doença. Isso explica, por exemplo, a maior incidência da doença em homens brasileiros, trabalhadores rurais ou exploradores de mata (4). Assim, Teles et al., 2013 observaram que 80% dos pacientes estavam envolvidos com atividades que exigiam a permanência na floresta (caça, pesca e exploração de madeira), evidenciando a natureza da transmissão zoonótica da doença (11). As leishmanioses são consideradas endêmicas em noventa e oito países. Os dez países com a contagem mais alta de casos estimados são: Afeganistão, Algéria, Colombia, Costa Rica, Norte do Sudão, Brasil, Irã, Peru, Etiópia e Síria, que juntos correspondem a 70 75% da incidência global estimada de casos de LC, conforme esquematizado na figura 3 (2,3,8,10). A LTA é de ocorrência antiga no Brasil, e apresenta-se como uma doença com diversidade de agentes, de reservatórios e de vetores que apresenta diferentes padrões de transmissão e um conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos, o que a torna de difícil controle (1,5). A partir do início da década de 1980, foram notificados no Brasil casos de LTA em 19 estados e, em 2003, todos os estados registraram autoctonia. A população do Amazonas destaca-se como uma das mais acometidas por LTA no país (12).

4 Figura 3. Distribuição da Leishmaniose cutânea no mundo. Fonte: http://www.who.int/en/ A partir da década de 90, o Ministério da Saúde notificou uma média anual de 32 mil novos casos de LTA. Analisando-se os dados pertinentes em 2003, verificouse a seguinte situação: a Região Norte notificou aproximadamente 45% dos casos, predominando os estados do Pará, Amazonas e Rondônia; a Região Nordeste, 26% dos casos, principalmente no Maranhão, Bahia e Ceara; a Região Centro-Oeste, 15% dos casos, com maior frequência em Mato Grosso; a Região Sudeste, 11% dos casos, predominantemente em Minas Gerais; e a Região Sul, 3,0%, destacando-se o Paraná (6). Em 2011, de acordo com o Ministério da Saúde, foram registrados, no Brasil, 15.731 casos de LTA. A região Norte apresentou novamente o maior número de notificações, 7.362 casos, seguida das regiões Nordeste (5.234), Centro-Oeste (1.732), Sudeste (986) e Sul (324). Dentre os 7.362 casos registrados na região Norte, 2.971 casos foram notificados no Estado do Pará, 1.752 no Amazonas, 781 no Acre, 704 em Rondônia, 504 no Amapá, 368 em Roraima e 282 no Tocantins (13). A real prevalência das diferentes leishmanioses no continente americano é difícil de ser estabelecida em vista das subnotificações, diagnósticos incorretos, infecções inaparentes, variações de resposta do hospedeiro e multiplicidade de agentes etiológicos envolvidos (6).

5 No último ano, a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT- HVD), centro de referência para o tratamento de LTA no estado do Amazonas, registrou 679 casos da doença, sendo 667 dos casos relacionados com a forma cutânea e 12 casos com a forma mucosa da doença. Registrando nos últimos 5 anos aproximadamente 5 mil casos de LTA (14). Quanto ao diagnóstico laboratorial para as leishmanioses, existem muitos métodos de diagnóstico, incluindo parasitológico, imunológico, molecular e os que utilizam animais de laboratório, todos usados na detecção do parasita (15). O exame parasitológico é baseado na demonstração do parasito por meio de exames diretos e indiretos (1,15). Quanto ao arsenal imunológico, pode-se destacar o teste intradérmico (intradermorreação de Montenegro ou da leishmanina) e testes sorológicos (1,16). Tem-se ainda o diagnóstico molecular que é atualmente utilizado para a detecção de micro-organismos patogênicos e baseia-se no emprego de sondas de DNA e/ou RNA espécie especificas e na reação em cadeia de uma polimerase de DNA para aumento de sequências nucleotídicas especificas presentes em amostras clínicas (15 18). Existem muitos estudos na literatura usando a PCR como técnica alternativa com resultados promissores para melhorar o diagnóstico da leishmaniose (19 22). Em se tratando de arsenal terapêutico disponível para tratamento da leishmaniose, este é bastante precário, existindo, até o presente momento, dois grupos de medicamentos em uso: os antimoniais e os não-antimoniais. O tratamento básico da doença consiste na administração de estibogluconato sódico (Pentostan ), antimoniato de N-metil-glucamina (comercializado no Brasil como Glucantime ), ambos drogas de primeira geração e pentamidina ou anfotericina B, ambos de segunda geração (23,24). Em um estudo clínico randomizado, Neves et al., 2011 constataram que a pentamidina e o antimonial apresentam eficácias similares e não satisfatórias para o tratamento da LTA ocasionada por L.(V.) guyanensis. Os baixos resultados de eficácia do antimonial e pentamidina, bem como as dificuldades operacionais relacionadas à anfotericina B, evidenciam a necessidade urgente de novas opções terapêuticas para o tratamento da LTA (25).

6 A miltefosina foi a primeira droga de uso oral utilizada no tratamento da leishmaniose visceral (LV). Existem poucos efeitos adversos, tais como vômito e diarréia. Em relação à LTA, estudos utilizando a miltefosina no tratamento da forma cutânea da doença resultaram em boa eficácia contra L (V.) panamensis, mas para L (V.) braziliensis, não houve eficiência adequada (24). No cenário atual de combate à leishmaniose, nota-se a existência de importantes ferramentas que auxiliam na detecção e combate ao parasita. Podendose citar o diagnóstico, com a visualização de parasitas em tecidos e/ou sorologia através da técnica de exame direto; cultura e detecção do DNA do parasita; além do arsenal terapêutico, com destaque para o tratamento convencional com antimonial pentavalente; contudo, a resistência da leishmaniose em alguns países tem gerado novas abordagens de tratamento, com inserção de novas drogas, como anfotericina B, paromicina injetável e miltefosina oral (1,2,16). Apesar de consideráveis avanços no diagnóstico, tratamento e pesquisa científica básica, a leishmaniose ainda é considerada uma doença negligenciada e atrelada à pobreza. Obstáculos correntes encontrados na prevenção e manejo adequado incluem controle inadequado do vetor, inexistência de vacinas e dificuldade em desenvolver drogas mais acessíveis (2). 1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana Por leishmaniose tegumentar entende-se um conjunto de enfermidades causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania, que acometem a pele e/ou mucosas do homem, e de diferentes espécies de animais silvestres e domésticos, com casos registrados mundialmente, destacando-se o Continente Americano, onde há registro de casos desde o extremo sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, com exceção do Chile e Uruguai. Na Amazônia Brasileira, a LTA é considerada uma infecção zoonótica primária de mamíferos silvestres e secundariamente de animais domésticos, em que o parasita é transmitido entre os animais e o homem pela picada das fêmeas de diversas espécies de flebótomos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) do gênero Lutzomyia. A infecção caracteriza-

7 se pelo parasitismo das células do sistema fagocitário mononuclear (SFM) da derme e das mucosas do hospedeiro vertebrado (monócitos, histiócitos e macrófagos) (1,6,26,27). No Brasil, há várias formas clínico-epidemiológicas relacionadas aos diferentes subgêneros e espécies do parasita (28): Leishmania (Viannia) guyanensis: limitada ao norte da Bacia Amazônica (Amapá, Roraima, Amazonas e Pará) e Guianas. É o agente predominante causador da doença no estado do Amazonas, produzindo lesões menores e mais numerosas, frequentemente localizadas acima da cintura. O acometimento mucoso é pouco frequente. Leishmania (Viannia) braziliensis: ampla distribuição (sul do Pará ao Nordeste), centro-sul do país e Amazônia oriental. A doença caracteriza-se por úlcera cutânea (única ou múltipla) que pode evoluir para o acometimento mucoso (oro ou nasofaringe) por disseminação hematogênica; Leishmania (Leishmania) amazonensis: distribuída pelas florestas da Amazônia, Nordeste (Bahia), Sudeste (Minas Gerais e São Paulo) e Centro-Oeste (Goiás). A doença humana é relativamente rara, podendo se manifestar como lesão ulcerada (geralmente única) ou quadro de leishmaniose cutâneo-difusa. Dependendo da espécie de Leishmania infectante e da resposta imune mediada por células da pessoa infectada, o indivíduo pode desenvolver um espectro de formas clínicas da doença, convencionalmente conhecidas como leishmaniose cutânea localizada (LCL) e leishmaniose mucocutânea (LMC), representando o polo responsivo, e leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) que representa o polo não responsivo (26,29). As principais características clínicas da leishmaniose estão listadas na tabela 1.

8 Tabela 1. Características clínicas da leishmaniose humana. CARACTERÍSTICAS MUCOCUTÂNEA CUTÂNEA VISCERAL Lesão única (ocasionalmente Lesões Destruição ulcerativa do um pequeno número) ulcerada septo nasal com bordas elevadas e centro Órgãos internos necrótico Acentuada proliferação de Reação granulomatosa Resposta inflamatória crônica Histopatologia e número de macrófagos com intenso com pouquíssimos com moderado número de parasitas parasitismo nos órgãos parasitas parasitas hematopoiéticos Nível de anticorpos anti- Leishmania Baixo Baixo Alto CMI anti-leishmania (testes in vivo e in vitro) Fortemente positivo Positivo Negativo Fonte: Adaptado de Oliveira et al, 2004. 1.3 Imunopatogênese da leishmaniose A patogenia da LTA é fortemente influenciada pelo perfil imunogenético do homem e ainda, pela virulência da espécie de Leishmania infectante. Como resultado da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos da resposta imune do homem ocorre um espectro de manifestações clínicas, histopatológicas e imunopatológicas (30). Infecções por Leishmania podem permanecer completamente assintomáticas. Esta observação chama a atenção para fatores do hospedeiro na susceptibilidade e expressão da doença - idade, estado nutricional e a eficácia das respostas imunes inata e adquirida dependentes de células T. Este último pode, por sua vez, ser afetado por polimorfismos imunogenéticos (2). Ao que parece, em humanos, o resultado da doença é influenciado pelo balanço entre as respostas Th1, Th2 e também Th17, além da influência de fatores genéticos do hospedeiro, tamanho do inóculo e a cepa do parasita. (31,32). A resposta imune tem um papel importante na patogênese da leishmaniose tegumentar. Na leishmaniose cutânea e na leishmaniose mucosa, uma intensa resposta Th1, com alta produção de IFN-γ e TNF-α é observada, juntamente com IL- 17, produzida pelas células Th17, responsável pela amplificação da resposta

9 inflamatória. Esse tipo de resposta inflamatória, apesar de estar associada ao controle da multiplicação e disseminação do parasita, se não modulada, pode causar dano tecidual. Por outro lado, a diminuição ou ausência das respostas Th1/Th17 e presença de citocinas regulatórias como IL-10, observada em indivíduos com leishmaniose disseminada e leishmaniose cutânea difusa, favorece a multiplicação e disseminação do parasita (32,33). A infecção humana, pelas espécies de Leishmania que causam a LTA, tem seu início logo após a inoculação das formas promastigotas do parasita na pele, o que acontece durante a hematofagia pelas espécies de flebotomíneos vetores. A partir desse momento, inicia-se um processo de escape do parasita frente às defesas do organismo, o qual, quando vencido pelo parasita, resultará na sua fagocitose pelas células do sistema fagocítico mononuclear (SFM), principalmente o macrófago (30). As células T helper CD4+ tem uma função central no sistema imune, promovendo respostas adaptativas adequadas a patógenos específicos. De acordo com as citocinas que produzem após estimulação antigênica, estas células podem ser separadas em subpopulações, das quais é de interesse mencionar: T helper 1 (Th1), T helper 2 (Th2) e T helper 17(Th17). As células Th1 produzem IFN-γ e IL-12 e estão associadas à proteção contra os patógenos intracelulares, como as leishmanias; células Th17 produzem IL-17A e IL-17F, em adição a outras citocinas tais como IL-21 e IL-22. IL-17 realiza uma importante função no recrutamento de neutrófilos, e uma vez que estas células tem um papel importante na infecção por Leishmania, pode-se dizer que células Th17 tem papel significativo nessa doença. Células Th2 produzem interleucina IL-4, IL-5 e IL-13 que estão envolvidas nos processos alérgicos e na proteção contra agentes extracelulares. No caso das infecções por micro-organismos intracelulares, a ativação das células Th2 leva ao agravamento (1,32,34). Assim, a resistência do hospedeiro está associada à ativação seletiva e diferenciação de células efetoras T helper CD4+ (Th1), as quais secretam um padrão de citocinas específicas, tendo como principais indutores dessa resposta IFN-γ e IL- 12, conhecidos como citocinas guia. IL-4 é responsável pela indução da resposta de

10 células T CD4+ (Th2), além das citocinas IL-23, IL-1, IL-6 e TGF-β para células Th17 (7,34). Considerando-se que a Leishmania é um parasita intracelular obrigatório, a ativação do sistema complemento pode beneficiá-lo, pois ao serem gerados fragmentos da cascata (C3 e C3bi) que se ligam aos receptores dos macrófagos (CR1 e CR3) e também se depositam na parede do parasito, tem-se facilitada sua fagocitose. Além disso, sua entrada, utilizando esses receptores, promove baixo metabolismo oxidativo no macrófago, o que favorece a continuidade do seu ciclo biológico (6,35). A fagocitose dos organismos patogênicos induz os macrófagos a produzir citocinas que controlam vários aspectos da defesa do hospedeiro, incluindo fatores quimiotáticos, tais como as quimiocinas, fatores de ativação tais como TNF-α, IL-12, e IL-1, estimulantes de fase aguda, tais como IL-6, fatores moduladores, tais como a IL-10, e citocinas estimuladoras da hematopoiese, tais como M-CSF e GM-CSF (35). A modulação da resposta imune celular é definida com base no tipo de interação entre a espécie de Leishmania e o perfil imunogenético do hospedeiro, resultando no desenvolvimento de diferentes formas clínicas de leishmaniose. Na leishmaniose cutânea e leishmaniose mucosa, existe uma forte resposta Th1, que controla a multiplicação do parasita, porém há lesão tecidual. Enquanto que, na leishmaniose disseminada e na leishmaniose cutânea difusa, a diminuição ou ausência da resposta Th1 favorece a multiplicação e disseminação da Leishmania (33). Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes com leishmaniose cutânea secretam altos níveis de IFN-γ e TNF-α e baixos níveis de IL-5 e IL-10 quando estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania (SLA), sendo a célula T CD4+ o tipo celular que contribui com a maior parte da produção de IFN-γ tanto no sangue periférico quanto nos tecidos, embora haja participação de células T CD8+ na produção dessa citocina (33). Nas formas cutaneomucosa e mucosa, associadas à forte resposta de hipersensibilidade e proliferação de linfócitos, o perfil de linfócitos T CD8 e CD4 no infiltrado das lesões tem mostrado predomínio de CD4. Desse modo, parece

11 significativo que na forma LCM/LM tenha sido identificado um perfil de células CD4 maior que nas outras formas da LTA, sugerindo a possibilidade de níveis significativos de IFN-γ e TNF-α nessas formas, já que estas citocinas estão fortemente associadas à resposta de hipersensibilidade (30). Em um estudo realizado por Gonzalez-Lombana et al., 2013 foram observados que níveis elevados de IFN-γ promoveram uma infiltração de monócitos aumentada, enquanto IL-17 contribuiu para o aumento de neutrófilos. Contudo, foi constatado que IFN-γ não contribuiu para o agravamento da patologia, ao invés, regulou a resposta de IL-17. Assim, o bloqueio de IFN- γ levou a um aumento significativo de IL-17, neutrófilos e agravamento da doença. Dessa maneira, nota-se que a resposta imune inflamatória é critica no controle dos parasitas da leishmaniose, mas também, se não balanceada, promove a exacerbação da doença (36). Pacientes com leishmaniose cutânea difusa apresentam negatividade do teste de Montenegro, baixa ou ausência de produção de IFN-γ para antígeno de Leishmania, indicando um forte bloqueio da resposta imune celular, impossibilitando aos pacientes o controle da infecção. Células mononucleares de pacientes com leishmaniose cutânea difusa expressam grandes quantidades de IL-10 e IL- 4 e baixas quantidades de IFN-γ durante a fase ativa da doença (30,33). 1.4 O Modelo experimental murino para leishmaniose Modelos experimentais de infecção por Leishmania são modelos bem estudados e apropriados para o entendimento da doença (37). Dentre os modelos existentes, o camundongo oferece vantagens particulares para estudos de biologia e doença humana (38): i) O camundongo, em seu desenvolvimento, plano corpóreo, fisiologia, comportamento e doenças, pode apresentar aspectos que são comuns aos seres humanos; ii) A quase totalidade (99%) dos genes do camundongo tem homólogos em seres humanos; iii) O genoma do camundongo suporta mutagênese direcionada e específica, por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias, permitindo que os genes sejam alterados de forma eficiente.

12 A maior parte do que se conhece sobre a resposta de um indivíduo à infecção por Leishmania e seus mecanismos imunológicos provêm de estudos em camundongos. Algumas linhagens puras de camundongos são susceptíveis à infecção por Leishmania, enquanto outras são extremamente resistentes (3,29). Infecção subcutânea por L. major é um dos modelos mais bem estudados. Acerca desse modelo, características distintas do espectro clínico da leishmaniose humana são reproduzidas em linhagens puras de camundongos (29). Camundongos da linhagem BALB/c são altamente susceptíveis, pois quando infectados, estes desenvolvem grandes úlceras de pele, que expandem e metastizam, levando à morte. Em contraste, camundongos das linhagens C3H/He, CBA, C57BL/6 e 129Sv/Ev são resistentes à infecção por L. major, desenvolvendo pequenas lesões que curam em 10-12 semanas, e também são resistentes a reinfecção (29). Um estudo realizado por Hezarjaribi et al., 2013 demostrou através do modelo experimental murino que IL-22 leva a um aumento na produção de IFN-γ e diminuição na produção de IL-4 e que portanto tem um papel importante na estimulação da resposta do tipo Th1, resultando na cura das lesões (39). A relevância do balanço Th1/Th2 na regulação do desfecho da doença tem sido minuciosamente investigada (29). A análise da resposta imune em camundongos BALB/c tem mostrado que estes respondem de maneira diferente, com uma variação nas respostas Th1 e Th2, dependendo da espécie pelo qual este é infectado, L. major ou L. braziliensis (40). A resistência está ligada a resposta do tipo Th1, com produção de IL-12, IFN-γ e inibição da produção de citocinas Th2, enquanto que a susceptibilidade está relacionada com a predominância da resposta Th2, determinada pela presença de IL- 4. Citocinas Th2 levam ao desenvolvimento de lesões graves em camundongos infectados com L. major, provavelmente inativando células infectadas (29). Dependendo da espécie pelo qual o camundongo é infectado, a análise da resposta imune mostra que este responde de maneira diferente, com uma variação nas respostas Th1, Th2 e Th17 (40). Em camundongos infectados por L. (L.) amazonensis, a definição da progressão e desfecho da infecção é feita com base no

13 conhecimento da genética dos camundongos, além de fatores adicionais como tamanho do inóculo, sítio de inoculação, cepa de Leishmania usada e sua fonte de isolamento, que também podem influenciar nessas características (37). Em estudo realizado por Courret et al., 2003, um modelo para simular, em longo prazo, o parasitismo natural foi proposto, onde baixas doses (10-1000 parasitas) de promastigotas metacíclicas de L. (L.) amazonensis foram inoculadas na orelha de camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que as manifestações cutâneas da lesão dependem do tamanho do inóculo, onde muito raramente, animais infectados com apenas 10 parasitas desenvolveram lesão; a maioria dos animais infectados com 100 parasitas e todos com 1000 parasitas desenvolveram lesão progressiva (41). 1.5 Fatores genéticos na leishmaniose Em genética, doenças complexas são aquelas que não apresentam padrão de herança mendeliana clássica, em que há perfeita correlação entre genótipo e fenótipo. A ocorrência dessas doenças é controlada por componente genético, resultado da ação integrada de um número variado de genes, associado a fatores ambientais, socioeconômicos, culturais, além de fatores inerentes ao hospedeiro, como estado nutricional, idade, gravidez, infecção por HIV, etc. (42,43) O fato de alguns indivíduos não apresentarem nenhum sinal ou sintoma de infecção, enquanto outros desenvolvem formas crônicas ainda não foi claramente elucidado. Acredita-se que a genética do hospedeiro, fatores ambientais ou do parasito podem estar envolvidos na susceptibilidade à doença (44). A resposta imune e o conhecimento da genética do hospedeiro podem ser importantes no entendimento da patogênese da doença. Uma maneira de explorar o papel de moléculas pró e anti-inflamatórias em humanos é determinar se polimorfismos genéticos afetam a expressão ou função de proteínas, e se estas estão associadas com o desfecho da doença (45). Por exemplo, um estudo realizado em Danghã, uma área endêmica para leishmaniose cutânea no norte do Irã demonstrou que mutações no gene TLR4

14 humano estão associadas com um risco aumentado de desenvolver leishmaniose cutânea, podendo levar a um aumento da susceptibilidade e gravidade na infecção por L. major (44). Variantes alélicas de NRAMP1 estão fortemente associadas com leishmaniose visceral, indicando que este é um importante gene de suscetibilidade em humanos (46). Estudos sugerem que as variações genéticas deste gene afetam a suscetibilidade na leishmaniose visceral (45 49). A análise de polimorfismos de TNFα em uma população da Venezuela mostrou que a susceptibilidade para a forma cutâneo-mucosa da doença pode ser diretamente associada com polimorfismos do gene TNFα, evidenciando um alto risco relativo de 7,5 (P<0,001). (51) Alguns estudos demonstraram associação do polimorfismo dos genes IL-6 e CCL2 com o aumento da suscetibilidade para a forma mucosa da leishmaniose (45,52). Variantes do gene DLL1, localizado no cromossomo 6q27, apresentaram-se associadas com a susceptibilidade para LV (53), bem como os polimorfismos do gene TGFB1, uma citocina com uma função biologicamente relevante na história natural da doença, que pode contribuir para a susceptibilidade global na infecção por leishmania per se e para a gravidade da doença clínica na leishmaniose visceral (54). Ainda, polimorfismo no gene IL-4 foi associado na susceptibilidade para leishmaniose visceral, enquanto que IFNGR1 está especificamente relacionado com a susceptibilidade à leishmaniose dermal pós-kalazar (46,55). 1.5.1 IL-1b Entre as citocinas pro-inflamatórias do tipo Th1, interleucina 1 (IL-1) tem papel chave na resposta inflamatória com efeitos pleiotrópicos em muitas células e vias de sinalização, tendo um papel importante no desenvolvimento da patologia. IL-1 consiste de um grupo de três moléculas nomeadas IL-1 alfa, IL-1 beta e IL-1 receptor antagonista (56).

15 IL-1b é classificado como um dos mediadores solúveis mais importantes da inflamação, sendo produzido principalmente por monócitos, macrófagos e células dendríticas e medeia uma ampla gama de reações envolvidas na resposta de fase aguda (57). Polimorfismos genéticos em IL-1b estão associados com a susceptibilidade a doenças autoimunes graves, inflamatórias e infecciosas tais como HIV, TB, gastrite crônica associada com Helicobacter pylori, esclerose múltipla, lupus eritematoso sistêmico, malária e leishmaniose (58 63). Recentemente, um estudo realizado no México sugeriu que a IL-1b possivelmente tem um papel chave na determinação da gravidade da doença em pacientes com leishmaniose cutânea difusa (63). IL-1b é uma citocina com atividade pirogênica que é normalmente ativada em resposta a uma infecção ou injúria (64). Polimorfismo em IL-1b representa uma variável que influencia o risco de desenvolver a doença, em pacientes infectados com o parasita (63). Os inflamassomas tem importante papel na expressão de IL-1b, pois estes são responsáveis por promover a ativação dessa interleucina através de diversos estímulos durante as infecções por micro-organismos (65). Resultados de Lima-Junior et al., 2013 sugerem que independentemente do background genético do camundongo ou das formas parasitárias usadas na infecção (parasitas mortos, atenuados ou vivos), o inflamassoma é de grande importância no controle da infecção parasitária em LC (66). NALP3, que pertence a uma larga família de receptores NOD-like intracelulares, associa-se com outras proteínas por oligomerização para formar NALP3-inflamassoma, que é responsável por ativar caspase-1, enzima responsável por clivar precursor IL1-b inativo em IL1-b ativo (65 67). Lima-Junior et al., 2013 observaram níveis significativos na produção de IL-1b por macrófagos derivados de medula óssea obtidos de camundongos C57BL/6 em resposta a infecção por L. amazonensis, mas o mesmo não foi observado em camundongos que possuíam a deleção do gene produtor de caspase-1. Assim,

16 puderam afirmar que a secreção de IL-1b é dependente da ativação de caspase-1 (66). 1.5.2 FLI-1 Outro importante gene envolvido no controle da susceptibilidade da leishmaniose e que apresenta participação no processo de cura das lesões é o FLI1. Pertencente à família ETs de fatores de transcrição, é preferencialmente expresso em linhagens de células hematopoiéticas e células endoteliais vasculares (68). Resultados apresentados por Asano et al., 2009 estabelecem o gene FLI1 como um regulador chave na homeostase da expressão de colágeno na pele, e, portanto, pode atuar na via de cicatrização das lesões. Além disso, o estudo demonstra que o domínio C-terminal do FLI-1 tem um papel essencial no controle da expressão de colágeno in vivo (69). Ainda, Castellucci et al., 2011 demonstraram associação entre polimorfismos em FLI-1 e susceptibilidade para leishmaniose cutânea causada por L. braziliensis (70). 1.5.3 MCP-1 Uma maneira de explorar o papel das quimiocinas em humanos é determinar se polimorfismos que afetam expressão/função estão associados com o desfecho da doença. Assim, Ramasawmy et al., 2010 demonstraram, através de estudo casocontrole, uma associação entre SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) em MCP-1 e susceptibilidade para leishmaniose mucosa por L. braziliensis. Os dados apresentados pelos autores fornecem evidências de base populacional e familiar para uma associação entre o alelo G do SNP na região promotora CCL2-2518 pb e susceptibilidade para LM. Esses dados foram correlacionados com elevados níveis de MCP-1 no plasma de indivíduos homozigotos para o alelo G, e com alta liberação de MCP-1 por macrófagos estimulados e não estimulados (45). Ainda, dados gerados por De Moura et al., 2005 sugerem que a capacidade leishmanicida de MCP-1 contribui para a cura das lesões causadas por L. braziliensis

17 (71). Também, Rovin et al., 1999 afirmam que variações genéticas ocorrem em regiões reguladoras dos genes de quimiocina, e que tais polimorfismos afetam a transcrição desses genes em resposta a estímulos inflamatórios. Esses polimorfismos em MCP-1 podem, em parte, determinar a gravidade da inflamação nos órgãos em doenças onde a infiltração leucocitária nos tecidos é dependente de MCP-1 (72). Estudo realizado em uma população recrutada no Instituto do Coração no Hospital das Clínicas em São Paulo demonstrou que a variante MCP-1 associada com um baixo nível de transcrição de MCP-1 se comporta como um modificador genético de desfecho clínico para infecção por T. cruzi, e os indivíduos com o genótipo MCP-1-2518 AA tem um risco quatro vezes maior de desenvolver cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) do que aqueles sem esse genótipo, sugerindo que polimorfismos em MCP-1 podem desempenhar papel importante na susceptibilidade a CCC, dependendo do genótipo apresentado por cada indivíduo (73). Diante do exposto, nota-se que a leishmaniose é uma doença infecciosa cuja susceptibilidade é em parte controlada geneticamente. A participação de variantes dos genes IL-1b, FLI-1 e MCP-1 no controle da suscetibilidade de populações humanas a doenças infecciosas causadas por patógenos intracelulares de interesse, tais como a leishmaniose, ainda precisa ser investigada. Dessa forma, entende-se que esforços no sentido de se elucidar os mecanismos moleculares de controle e interação patógeno/hospedeiro e os mecanismos de desenvolvimento da doença tendem a contribuir de forma crítica para um maior entendimento de sua patogênese, levando ao desenvolvimento de melhores estratégias de diagnóstico, tratamento e prevenção.