DECISCAN HCV PLUS 24 tests 72310

DECISCAN HCV PLUS 24 tests 72310 English p. 3 Français p. 11 Español p. 21 Deutsch p. 29 Italiano p. 37 Português p. 45 Svenska p. 53 Dansk p. 61 " Bio-Rad."

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DECISCAN HCV PLUS 24 tests 72310 IMMUNOBLOT FOR THE DETECTION OF ANTI-HCV ANTIBODIES IN HUMAN SERUM OR PLASMA IVD For In Vitro Diagnostic Use Manufacturer Quality Control All manufactured and commercialised reagents are under complete quality system starting from reception of raw material to the final commercialisation of the product. Each lot is submitted to a quality control and only is released on the market when conforming to the acceptance criteria. The records relating to production and control of each single lot are kept within our company. 3

TABLE OF CONTENTS 1 - CLINICAL INTEREST 2 - PRINCIPLE OF THE TEST 3 - KIT CONTENTS 4 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED 5 - HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONS 6 - PRECAUTIONS 7 - SAMPLES 8 - RECONSTITUTION OF THE REAGENTS - VALIDITY - STORAGE 9 - ASSAY PROCEDURE 10 - READING AND INTERPRETATION OF RESULTS 11 - PERFORMANCES 12 - LIMITS OF THE TEST 13 - REFERENCES 4

1 - CLINICAL INTEREST DECISCAN HCV PLUS is a membrane test using an immunoenzymatic technique for the identification of antibodies associated with infection caused by the hepatitis C virus in human serum or plasma. The characterization of these antibodies is an essential supplemental step for a better understanding of HCV serology allowing follow-up of the sera antibody evolution. 2 - PRINCIPLE OF THE TEST DECISCAN HCV PLUS uses, as a solid support, a membrane fixed on a plastic strip with the following sequential coating scheme : 1) Anti-human IgG control This control allows simultaneously : the validation of sample dispensing, the control of the reagents (conjugate, substrate), the reading of the results according to the intensity of the control signal. 2) Fusion protein : GST Genes coding for NS3 and NS4 proteins are fused to the Glutathione S transferase gene. GST protein control for the presence of anti GST antibodies which can induce false positive reactions. 3) HCV antigens Recombinant proteins produced by E.coli from clones selected : in the non structural area : NS3 and NS4 Peptides selected for their high immunogenicity : in the structural area : C1 and C2 in the non structural area : NS4 DECISCAN HCV PLUS Antihuman IgG control GST fusion protein C1 C2 NS3 NS4 The assay procedure includes the following reaction steps : 1) The serum to be tested is incubated with the strip. HCV antibodies, if any, bind to the antigens fixed on the solid phase. 2) The alkaline phosphatase labelled anti-human IgG antibodies, added after washing, bind to the specific antibodies captured on the solid phase. 3) The unbound enzymatic conjugate is removed by washing, and the antigen/antibody complex is revealed by substrate addition. 4) After stopping the reaction, the coloured bands are read and the results interpreted. 5

3 - KIT CONTENTS All reactive are exclusively for in vitro diagnostic use. 6 LABEL REAGENTS PRESENTATION R1 COATED STRIP with recombinant HCV Ag and HCV peptides from Capsid, 24 strips NS3 & NS4 regions R2 CONCENTRATED WASHING SOLUTION/DILUENT (5 x) 1 vial 100 ml R3 NEGATIVE CONTROL SERUM 1 vial Human serum without anti-hcv antibodies, negative for Ag HBs, 0.2 ml anti-hiv1 and HIV2 antibodies. Preservative : < 0.1 % sodium azide R4 POSITIVE CONTROL SERUM 1 vial Human serum positive for anti-hcv antibodies negative for Ag HBs, 0.2 ml anti-hiv1 and HIV2 antibodies, photochemically inactivated Preservative : < 0.1 % sodium azide R5 SAMPLE DILUENT 1 vial Tris/NaCl buffer with milk, phenol red 90 ml Preservative : 0.25 % Kathon R6 CONJUGATE 1 vial Anti-human IgG antibodies (goat) labelled with Alkaline phosphatase 90 ml Tris NaCl buffer with green colorant Preservative : < 0.1 % sodium azide R8 COLOUR DEVELOPMENT SOLUTION 1 vial BCIP/NBT 5-Bromo-4-Chloro-Indolyl Phosphate (BCIP) 90 ml and Nitroblue Tetrazolium (NBT) Preservative : < 0.1 % sodium azide R9 STOPPING SOLUTION 50 mm citric acid 1 vial Preservative : 0.01 % Merthiolate 90 ml 6-COMPARTMENTS RACKS 4 4 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Distilled or deionized water Bleach and sodium bicarbonate Absorbent paper Disposable gloves Protective glasses Automatic or semiautomatic adjustable or preset pipettes to dispense 10 µl Graduated pipettes with 3 ml capacity Graduated cylinders with 100 ml, 250 ml and 500 ml capacity Two dimensional, three-dimensional or rotative shaker (slow shaking) Container for biohazardous waste Vacuum pump with safety plug Shaker-incubator-distributor Systems* (*) Consult us for detailed information about the equipment recommended by our technical department. 5 - HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONS All reagents included in the kit are intended for "in vitro" diagnostic use. Wear disposable gloves when handling kit reagents and wash hands thoroughly afterwards. Do not pipette by mouth. The human serum used in positive control has been photochemically inactivated, however, no known test method can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Consider these reagents and all patient samples as potentially infectious and handle them with the required precautions.

Consider any material directly in contact with specimens and reagents of human origin as contaminated, hence infectious materials. Avoid splashing samples or the solutions containing them. Spills should be rinsed with bleach diluted at 10%. If the contaminating fluid is an acid, spilled surfaces shall be previously neutralized with sodium bicarbonate, then rinsed with bleach and dried with absorbent paper. The material used for cleaning shall be discarded in a special container for contaminated residues. Samples, reagents of human origin as well as contaminated material and products shall be discarded after decontamination : - either by immersion in bleach at a final concentration of 5% of sodium hypochlorite (1 volume of bleach for 10 volumes of contaminated fluid or water) for 30 minutes, - or by autoclaving at 121 C for 2 hours minimum. CAUTION : do not introduce solutions containing sodium hypochlorite into the autoclave. Some reagents contain sodium azide as a preservative. Sodium azide may react with laboratory plumbing to form copper or lead azides. Such azides are explosive. To prevent azide build-up, flush the pipes with a large quantity of water if solutions containing azide are disposed of in the sink after inactivation. 6 - PRECAUTIONS The quality of results is dependent on following good laboratory practices : Do not use expired reagents. Do not mix nor combine reagents from kits having different batch numbers during the same procedure. Before use, wait for 30 minutes for the reagents to stabilize at room temperature. Carefully reconstitute the reagents avoiding any contamination. Do not perform the test in the presence of reactive vapors (acids, alkalines, aldehydes) or dust liable to alter the conjugate enzymatic activity. Use glassware perfectly washed and rinsed with distilled water or, preferably, disposable material. Use a new distribution tip for each serum. Strip washing is a critical step : respect the recommended number of washing cycles and check that the rack compartments are entirely filled, then emptied. Poor washing may lead to incorrect results. Never use the same container or pipette to distribute different reagents. 7 - SAMPLES Collect a blood sample according to current procedures. Serum or plasma may be used for the test. If serum is used : extract it as soon as possible to avoid hemolysis. Hemolysis may seriously alter test performance. Samples containing aggregates must be clarified by centrifugation before testing. Particles or suspended fibrin aggregates may lead to false positive results. The specimens can be stored at +2-8 C if screening is performed within 7 days or they may be deep-frozen at 20 C. Avoid repetitive freezing and thawing. Samples that have been frozen and defrozen more than 3 times cannot be used. If samples are to be transported, pack them according to the regulations for the transport of etiologic agents. DO NOT USE CONTAMINATED, HYPERLIPEMIC OR HEMOLYZED SAMPLES. NOTE : Samples containing up to 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemic samples containing up to the equivalent of 36 g/l trioleine, and hemolyzed samples containing up to 10 g/l hemoglobin do not affect the test results. 8 - RECONSTITUTION OF THE REAGENTS - VALIDITY STORAGE NOTE : Before use, allow the reagents to reach room temperature (18-30 C) Concentrated Washing solution/ Diluent (5x) Dilute washing solution 1:5 in distilled water and mix thoroughly. 20 ml are necessary per strip. The reconstituted washing solution is stable for one month when stored at +2-8 C. All other reagents, when stored at + 2-8 C, are stable until the expiry date indicated on the labels. Mix the sample diluent, the conjugate and the development solution, by turning upside down, before use. 7

9 - ASSAY PROCEDURE Preliminary comments Strictly follow the proposed procedure. Include the negative control and the positive control supplied in the kit in all assays performed during the same day and when a new kit batch number is used. Record the numbers on the strips to correspond with patient identification or positive and negative controls. Prepare the washing solution (part 8). Remove the required number of strips from the cartridge. Take them by their plastic frame to avoid any direct contact with the membrane. Place them in the rack compartments with the membrane upwards. Protocol 1) Dispense 3 ml of sample diluent into each compartment. Allow the strips to rehydrate for 5 minutes at room temperature while shaking. 2) Add 10 µl of sample or control to separate compartment and rinse the pipette tip 3 times in the dispensed diluent. 3) Incubate for 2 hours while shaking at room temperature. 4) Aspirate the entire contents of each compartment using a vacuum pump equipped with a trap filled with bleach. Carefully rinse the pipette between aspirations. Add 3 ml of washing solution per compartment and shake for 2 minutes. 5) Repeat step 4 twice, for a total of 3 washings, then remove the last washing solution. 6) Add 3 ml of conjugate to each compartment. Incubate for 30 minutes while shaking at room temperature. 7) Aspirate the liquid in each compartment. Wash each strip 3 times, as indicated in step 4 and remove the last wash solution. 8) Add 3 ml of development solution to each compartment. Incubate for 6 minutes while shaking at room temperature. 9) Aspirate the liquid in each compartment. 10) Add 3 ml of stopping solution to each compartment. Incubate for 5 minutes while shaking at room temperature. 11) Aspirate the liquid in each compartment and rinse the strips 3 times with distilled water. 12) Remove the strips from each compartment and dry carefully between two absorbent paper sheets. Keep the strips out of light to avoid background appearance. 10 - READING AND INTERPRETATION OF RESULTS 1) READING OF RESULTS The location and identification of control bands and HCV antigen bands on each strip corresponds to the diagram below. The location of antigens on the strip will be validated using positive control serum. The anti-human IgG control is located on the strip extremity (opposite of plastic support) and GST - C1 - C2 - NS3 - NS4 are coated respectively. DECISCAN HCV PLUS Antihuman IgG control GST fusion protein Reading must be performed on dry strips. Strips are dry when the background is white. C1 C2 NS3 NS4 Plastic support Reading The signal intensity of each antigen band is determined by comparing with the signal intensity of the anti-human IgG control band for each strip. 8

Band intensity Mark Any range of signal intensities greater than the anti-igg control signal 3 + Any signal intensity equal to the anti-igg control signal 2 + Any range of signal intensities less than the anti-igg control band 1 + but greater than a trace signal Weak signal appearing only as a slight trace 0.5 + No signal 0 Validation The control band must be clearly visible to the naked eye which validates the sample addition, conjugate addition and development steps. No interpretation is possible if the control band is not validated. Negative control serum : Only the anti-igg control band is visible, no signal is observed on any other bands. Positive control serum : The anti-igg control band and the 4 HCV antigen bands are clearly visible. No signal is observed on the GST band (fusion protein) 2) INTERPRETATION OF RESULTS READING INTERPRETATION No antigen HCV band visible NEGATIVE 1 HCV antigen band visible INDETERMINATE* or 2 capsid bands alone (C1, C2) 2 HCV antigen bands from 2 different gene PROBABLE POSITIVE* products (capsid gene, NS3 gene, NS4 gene) with intensity equal to 0.5+ At least 2 HCV antigen bands from 2 different POSITIVE gene products (capsid gene, NS3 gene, NS4 gene) having an intensity greater than 0.5+ NOTE : if the GST band is visible, only the HCV C1 and C2 antigen bands can be interpreted (synthetic peptides) (*) It is recommended with today's knowledge of HCV serology, that another blood sample be taken at a later time. Examples of Interpretation of Results C1 C2 NS3 NS4 INTERPRETATION A 1+ 2+ 0 0 Indeterminate B 0 0.5+ 0.5+ 0 Probable Positive C 0 0 0 0 Negative D 0 2+ 1+ 0.5+ Positive E 0 0 0.5+ 0 Indeterminate F 0 0.5+ 1+ 0 Probable positive G 0 0 1+ 1+ Positive 11 - PERFORMANCES CHARACTERISTICS Specificity A total of 474 blood donors, found negative by an EIA screening assay were used to test the specificity of the DECISCAN HCV PLUS. No one sample has been found positive, 22 samples showed an indeterminate profile. A total of 240 clinical samples, found negative by an EIA screening assay were also used to test the specificity of the DECISCAN HCV PLUS. No one sample has been found positive, 21 samples showed an indeterminate profile and 2 samples showed a probable positive profile with low intensity bands 0.5+ Sensitivity Sensitivity studies have been performed on 492 positive samples from chronic HCV infected patients. 488 samples were found positive with DECISCAN HCV PLUS, 4 samples showed an indeterminate profile. Among these 4 indeterminate samples, 2 have also shown an indeterminate profile and the two other samples were found positive with a competitor assay. 21 seroconversion panels were studied and compared to a competitor assay. 9

The results are as follow : for 7 seroconversions, the same samples were found positive with DECISCAN HCV PLUS and the competitor assay, for 5 seroconversions, DECISCAN HCV PLUS is late of one sample and 2 samples for one seroconversion, for 6 seroconversions DECISCAN HCV PLUS is in advance for one sample and in advance for 2 samples for 2 seroconversions compared to the competitor assay. A total of 365 positive samples for antibodies anti-hcv were studied, representing genotypes 1 to 5, including 57 of genotype 1-a, 136 of genotype 1-b, 24 of genotype 2-a, 15 of genotype 3-a, 23 of genotype 4-a, 5 of genotype 4-non a and 3 of genotype 5. All these samples showed a positive profile except 3 samples of genotype 4-a which presented an indeterminate profile. Cross Reactivity 91 samples from patients showing different pathologies such as EBV, HSV, EBV, HSV, VZV, HAV, HBV, Toxoplasmosis, Rubella, mumps, HTLV, Rhumatoïd Factor, ANA and also patients suffering from myeloma and pregnant women were studied. One sample from patients suffering from myeloma showed probable positive profile with DECISCAN HCV PLUS and indeterminate profile with a competitor assay. One sample from positive VZF sample showed an indeterminate profile with DECISCAN HCV PLUS and negative profile with a competitor assay. Accuracy Inter assay and intra assay studies has been conducted on 7 samples : one negative, one low positive, 2 positive and 3 indeterminate that have been tested 5 times in the same batch and 5 days. Results shows excellent reproducibility with identical relatives intensities. 12 - LIMITS OF THE TEST This test does not constitute a test for confirmation of an infection by the hepatitis C virus. This is a supplemental test that permits the characterisation of antibodies directed against different regions of the virus. Low reactions could be observed on Desciscan various proteins in case of a lack of positive screening reaction by ELISA assay. Such profiles must be indicated by clinical data and by a serologic follow-up in time about one or more later taking and possibly a search for circulating viral ARN. 13 - REFERENCES See french version 10

DECISCAN HCV PLUS 24 tests 72310 IMMUNOBLOT POUR LA DÉTECTION DES ANTICORPS ANTI-HCV DANS LE SÉRUM HUMAIN OU LE PLASMA HUMAIN IVD Contrôle de qualité du fabriquant Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société BIO-RAD sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot du produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par notre société

TABLE DES MATIÈRES 1 - INTÉRÊT CLINIQUE 2 - PRINCIPE DU TEST 3 - COMPOSITION DE LA TROUSSE 4 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI 5 - CONSIGNES D'HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ 6 - PRÉCAUTIONS 7 - ÉCHANTILLONS 8 - RECONSTITUTION DES RÉACTIFS - VALIDITÉ - CONSERVATION 9 - MODE OPÉRATOIRE 10 - LECTURE ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS 11 - PERFORMANCES 12 - LIMITES DU TEST 13 - RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 12

1 - INTÉRÊT CLINIQUE DECISCAN HCV PLUS est un test unitaire sur membrane utilisant une technique immuno-enzymatique permettant l'individualisation d'anticorps associés à une infection par le virus de l'hépatite C, dans le sérum ou le plasma humain. La caractérisation de ces anticorps détectés est une étape supplémentaire indispensable pour une meilleure compréhension de la sérologie HCV et permet ainsi un suivi de la cinétique d'évolution des anticorps. 2 - PRINCIPE DU TEST DECISCAN HCV PLUS utilise comme support solide une membrane fixée sur une bandelette plastique, où sont coatés successivement : 1) Témoin Anti-IgG humaines Ce témoin permet simultanément : la validation de l'addition de l'échantillon, le contrôle des réactifs (conjugué, substrat), la lecture des résultats au regard de l'intensité du signal. 2) Protéine de fusion : GST Les gènes codant pour les protéines de NS3 et de NS4 ont été fusionnés au gène de la Glutathion S Transférase. La protéine de fusion (GST) permet ainsi de contrôler la présence d'anticorps anti-gst pouvant être à l'origine de réactions faussement positives. 3) Antigènes HCV Des protéines recombinantes produites par E.coli à partir de clones sélectionnés : - dans la région non structurale : NS3 et NS4 Des peptides sélectionnés pour leur haute immunogénicité : - dans la région structurale : C1 et C2 - dans la région non structurale : NS4 DECISCAN HCV PLUS Anti IgG humaines Témoin GST protéine de fusion C1 C2 NS3 NS4 La mise en œuvre du test comprend les étapes réactionnelles suivantes : 1) Le sérum à étudier est incubé avec la bandelette. Si des anticorps anti-hcv sont présents, ils se lient aux antigènes fixés sur la phase solide. 2) Les anticorps anti-igg humaines marqués à la phosphatase alcaline sont ajoutés après lavage. Ils se fixent à leur tour aux anticorps spécifiques retenus sur la phase solide. 3) Après élimination du conjugué enzymatique non lié, le complexe antigène-anticorps est révélé par addition du substrat. 4) Après arrêt de la réaction, lecture des bandes révélées et interprétation des résultats. 13

3 - COMPOSITION DE LA TROUSSE Tous les réactifs sont exclusivement à usage de diagnostic in vitro. ÉTIQUETAGE NATURE DES RÉACTIFS PRÉSENTATION R1 BANDELETTE SENSIBILISÉE par des protéines recombinantes et des peptides 24 bandelettes synthétiques des régions Capside, NS3 et NS4 R2 SOLUTION DE LAVAGE CONCENTRÉE 5 FOIS 1 flacon 100 ml R3 SÉRUM DE CONTRÔLE NÉGATIF 1 flacon Sérum humain ne contenant pas d'anticorps anti-hcv, négatif pour l'ag HBs 0,2 ml et les anticorps anti-hiv1 et anti-hiv2 Conservateur : azide de sodium : < 0,1 % R4 SÉRUM DE CONTRÔLE POSITIF 1 flacon Sérum humain contenant des anticorps anti-hcv, négatif pour l'ag HBs 0,2 ml et les anticorps anti-hiv1et anti-hiv2 inactivé photochimiquement Conservateur : azide de sodium : < 0,1% R5 DILUANT POUR ÉCHANTILLONS 1 flacon Tampon TRIS, NaCl, lait, rouge de phénol, 90 ml Conservateur : Kathon 0,25 % R6 CONJUGUÉ 1 flacon Tampon TRIS, NaCl, vert alimentaire contenant les anticorps de chèvre anti-igg 90 ml humaines marqués à la phosphatase alcaline Conservateur : azide de sodium < 0,1 % R8 SOLUTION DE RÉVÉLATION BCIP/NBT 1 flacon 5-Bromo-4-Chloro-Indolyl Phosphate (BCIP) et Nitroblue Tétrazolium (NBT) 90 ml Conservateur : azide de sodium < 0,1 % R9 SOLUTION D'ARRÊT 1 flacon Acide citrique 50 mm 90 ml Conservateur : Merthiolate 0,01 % RACK DE 6 COMPARTIMENTS 4 4 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI Eau distillée ou complètement déminéralisée. Eau de javel et bicarbonate de soude. Papier absorbant. Gants à usage unique. Lunettes de protection. Pipettes automatiques ou semi-automatiques, réglables ou fixes, pouvant distribuer 10 µl. Pipettes graduées de 3 ml. Eprouvettes graduées de 100 ml, 250 ml et 500 ml. Agitateur bidimensionnel, tridimensionnel ou rotatif (agitation lente). Conteneur de déchets contaminés. Trompe à vide avec fiche de sécurité. Systèmes (Agitateur-incubateur-distributeur)*. (*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils validés par nos services techniques. 5 - CONSIGNES D'HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ Tous les réactifs de la trousse sont destinés à l'usage du diagnostic "in vitro". Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs et des échantillons et se laver les mains soigneusement après leur manipulation. Ne pas "pipeter à la bouche". 14

Le sérum humain utilisé pour le contrôle positif a été inactivé photochimiquement, toutefois aucune méthode ne peut garantir de façon absolue l'absence des virus HIV, HBV, HCV ou d'autres agents infectieux. Considérer les réactifs d'origine humaine, ainsi que les échantillons de patients, comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les précautions d'usage. Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et les réactifs d'origine humaine, ainsi que les solutions de lavage, comme des produits contaminés. Eviter les éclaboussures d'échantillons ou de solutions les contenant. Les surfaces souillées seront nettoyées à l'eau de javel diluée à 10 %. Si le liquide contaminant est un acide, les surfaces souillées seront neutralisées au préalable avec du bicarbonate de soude, puis nettoyées à l'aide de l'eau de javel et séchées avec du papier absorbant. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un conteneur spécial pour déchets contaminés. Les échantillons, les réactifs d'origine humaine ainsi que le matériel et les produits contaminés seront éliminés après décontamination - soit par trempage dans de l'eau de javel à la concentration finale de 5 % d'hypochlorite de sodium (1 volume d'eau de javel pour 10 volumes de liquide contaminé ou d'eau) pendant 30 minutes, - soit par autoclavage à 121 C pendant 2 heures minimum. ATTENTION : ne pas introduire dans l'autoclave des solutions contenant de l'hypochlorite de sodium. Certains réactifs contiennent de l'azoture de sodium comme conservateur. L'azoture de sodium peut former des azotures de plomb ou de cuivre dans les canalisations du laboratoire. Ces azotures sont explosifs. Pour éviter toute accumulation d'azotures, rincer à grande eau les canalisations si les solutions contenant de l'azoture sont éliminées par l'évier après leur inactivation. 6 - PRÉCAUTIONS La qualité des résultats dépend des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. Ne pas mélanger, ni associer des réactifs provenant de trousses portant des numéros de lots différents au cours d'une même manipulation. Avant utilisation, attendre 30 minutes que les réactifs s'équilibrent à la température ambiante. Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination. Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l'activité enzymatique du conjugué. Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de préférence du matériel à usage unique. Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque sérum. Le lavage des bandelettes est une étape essentielle de la manipulation: respecter le nombre de cycles de lavages prescrits, et s'assurer que les compartiments de racks sont complètement remplis, puis complètement vidés. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects. Ne jamais utiliser le même récipient ou pipette pour distribuer des réactifs différents. 7 - ÉCHANTILLONS Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Du sérum ou du plasma peut être utilisé pour le test. Si du sérum est utilisé : l'extraire dès que possible pour éviter toute hémolyse. Une sévère hémolyse peut altérer la réalisation du test. Les échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par centrifugation avant le test. Les particules ou agrégats de fibrine en suspension peuvent donner des résultats faussement positifs. Les échantillons seront conservés à + 2-8 C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés congelés à - 20 C. Eviter les congélations/décongélations répétées. Les échantillons congelés/décongelés plus que 3 fois ne seront plus utilisés. Si les échantillons doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques. NE PAS UTILISER DES SÉRUMS CONTAMINÉS, HYPERLIPÉMIQUES OU HÉMOLYSES. REMARQUE : Aucune interférence n a été mise en évidence sur des échantillons contenant jusqu à 90 g/l d albumine, et 100 mg/l de bilirubine, ainsi que sur des échantillons lipémiques contenant jusqu à 36 g/l de trioleïne et sur des échantillons hémolysés contenant jusqu à 10 g/l d hémoglobine. 15

8 - RECONSTITUTION DES RÉACTIFS - VALIDITÉ - CONSERVATION NOTE : Avant l utilisation des réactifs, les laisser équilibrer à température ambiante (18-30 C) Solution de lavage 5 X - concentrée 5 fois. Diluer au 1/5è la solution de lavage dans de l'eau distillée et agiter jusqu'à complète homogénéisation. 20 ml sont nécessaires par bandelette. La solution de lavage ainsi reconstituée est stable 1 mois conservée à +2-8 C. Tous les autres réactifs, conservés à +2-8 C, sont stables après ouverture jusqu'à la date de péremption indiquée sur les étiquettes respectives. Homogénéiser par retournement, le diluant pour échantillons, le conjugué et la solution de révélation avant utilisation. 9 - MODE OPÉRATOIRE Remarques préliminaires Suivre strictement le protocole Inclure le contrôle négatif et le contrôle positif fournis dans la trousse pour l'ensemble des tests effectués dans la même journée et lorsqu'un nouveau numéro de lot est utilisé. Enregistrer le numéro de la bandelette correspondant à chaque patient ainsi qu'aux contrôles négatif et positif. Préparer la solution de lavage (voir chapitre 8). Sortir de la cartouche le nombre de bandelettes nécessaires en les prenant par le support plastique afin d'éviter tout contact direct avec la membrane. Les déposer dans les compartiments des racks côté membrane vers le haut. Protocole 1) Distribuer 3 ml de diluant pour échantillons par compartiment. Laisser les bandelettes se réhydrater 5 mn à température ambiante sous agitation. 2) Ajouter 10 µl d'échantillon ou contrôle par compartiment en rinçant 3 fois le cône de la pipette dans le diluant. 3) Incuber 2 heures sous agitation à température ambiante. 4) Aspirer entièrement le contenu de chaque compartiment à l'aide d'une trompe à vide munie d'un piège contenant de l'eau de javel, en prenant soin de rincer soigneusement la pipette entre chaque aspiration. Ajouter 3 ml de solution de lavage par compartiment et agiter pendant 2 mn. 5) Répéter l'étape 4 deux fois, soit 3 lavages puis éliminer la solution du dernier lavage. 6) Ajouter 3 ml de conjugué par compartiment. Incuber 30 mn sous agitation à température ambiante. 7) Aspirer le liquide dans chaque compartiment. Laver 3 fois chaque bandelette comme indiqué à l'étape 4 et éliminer la solution du dernier lavage. 8) Ajouter 3 ml de solution de révélation par compartiment. Incuber 6 mn sous agitation à température ambiante. 9) Aspirer le liquide dans chaque compartiment. 10) Ajouter 3 ml de solution d'arrêt par compartiment. Incuber 5 mn sous agitation à température ambiante. 11) Aspirer le liquide dans chaque compartiment et rincer 3 fois les bandelettes en utilisant de l'eau déminéralisée. 12) Retirer les bandelettes de chaque compartiment et les sécher soigneusement entre deux feuilles de papier absorbant. Conserver les bandelettes à l'abri de la lumière pour éviter l'apparition de bruit de fond. 16

10 - LECTURE ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS 1) LECTURE DES RÉSULTATS La localisation et l'identification des bandes de contrôles et des bandes antigènes HCV présentes sur chaque bandelette correspond au schéma suivant et sera validé par le sérum de contrôle positif. Le témoin (anti-igg humaines) se situe à l'extrémité de la bandelette (opposée au support plastique) ; GST - C1 - C2 - NS3 - NS4 - support plastique (n d'identification) sont ensuite coatés successivement : DECISCAN HCV PLUS Anti IgG humaines Témoin GST protéine de fusion C1 C2 NS3 NS4 Support plastique La lecture doit être réalisée impérativement sur bandelettes sèches. Les bandelettes sont sèches quand le bruit de fond est blanc. Lecture L'intensité du signal obtenu sur chaque bande est évaluée par comparaison avec l'intensité du signal de la bande témoin (anti-igg humaines) présente sur chaque bandelette. Intensité de la bande Note Intensités supérieures à l intensité du signal du témoin anti-igg 3 + Intensité égale à l intensité du signal témoin anti-igg 2 + Intensités inférieures à l intensité du signal du témoin anti-igg mais supérieures à l état de trace 1 + Intensité du signal juste visible (trace) 0,5 + Aucune trace 0 Validation La bande témoin doit être visible à l'œil nu sans ambiguïté. Elle valide les étapes de dépôt d'échantillon, de conjugué et de révélation. Aucune interprétation n'est possible si la bande témoin n'est pas validée. Sérum de contrôle négatif : seule la bande témoin anti-igg est visible, aucun signal n'est observé sur les autres bandes. Sérum de contrôle positif : la bande témoin anti-igg est visible, aucun signal n'est observé sur la bande GST (protéine de fusion), et les 4 bandes HCV antigènes sont clairement visibles. 2) INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS LECTURE INTERPRÉTATION Aucune bande antigène HCV visualisée NÉGATIF 1 bande antigène HCV visualisée ou INDÉTERMINÉ* 2 bandes antigènes HCV visualisées sur le gène de la capside (C1, C2) 2 bandes antigènes HCV visualisées provenant POSITIF PROBABLE* de 2 gènes différents (gène de la capside, gène NS3, gène NS4) et avec une intensité de 0.5+ Au moins 2 bandes antigènes HCV visualisées POSITIF provenant de 2 gènes différents (gène de la capside, gène NS3, gène NS4) et avec une intensité supérieure à 0.5+ NB : si la bande GST est visualisée, seules seront interprétées les bandes antigènes HCV C1 et C2 (peptides synthétiques). * Dans l'état actuel des connaissances de la sérologie HCV, un contrôle sur un prélèvement ultérieur doit être effectué. 17

Exemples d'interprétation des Résultats C1 C2 NS3 NS4 INTERPRÉTATION A 1+ 2+ 0 0 Indéterminé B 0 0,5+ 0,5+ 0 Positif probable C 0 0 0 0 Négatif D 0 2+ 1+ 0.5+ Positif E 0 0 0,5+ 0 Indéterminé F 0 0,5+ 1+ 0 Positif probable G 0 0 1+ 1+ Positif 11 - PERFORMANCES Spécificité Sur une population de 474 donneurs de sang dont le test anti-hcv EIA était négatif. Aucun échantillon n a été trouvé positif, 22 ont présentés un profil indéterminé. Sur une population de 240 échantillons provenant de services hospitaliers dont le test Anti-HCV EIA était négatif. Aucun échantillon n a été trouvé positif avec le test DECISCAN HCV PLUS, 21 échantillons ont présenté un profil indéterminé et deux échantillons ont présenté un profil positif probable avec des bandes de faibles intensités 0,5+. Sensibilité La sensibilité a été étudiée sur 492 échantillons porteurs chroniques d Hépatite, 488 ont été trouvés positifs avec DECISCAN HCV PLUS et 4 indéterminés. Parmi les 4 indéterminés, 2 présentaient également un profil indéterminé et les 2 autres étaient positifs dans une technique concurrente. 21 séroconversions ont été testées et comparées à une technique concurrente. Les résultats sont les suivants : Sur 7 séroconversions, les mêmes échantillons ont été trouvés positifs avec DECISCAN HCV PLUS et avec la technique concurrente. Dans 5 séroconversions, DECISCAN HCV PLUS est en retard d'un prélèvement, et de deux prélèvements sur une séroconversion. Dans 6 séroconversions, DECISCAN HCV PLUS est en avance d'un prélèvement et de 2 prélèvements sur 2 séroconversions par rapport à la technique concurrente. Un total de 365 échantillons positifs en anticorps anti-hcv ont été étudiés, représentant les génotypes 1 à 5, dont 57 de génotype 1-a, 136 de génotype 1-b, 24 de génotype 2-a, 15 de génotype 3-a, 23 de génotype 4-a, 5 de génotype 4-non a, et 3 de génotype 5. Tous ces échantillons ont présenté un profil positif à l exception de 3 échantillons de génotype 4-a qui ont présenté un profil indéterminé. Réactions croisées 91 échantillons provenant de patients atteint d autres pathologies telles que : EBV, HSV, VZV, HAV, HBV, Toxoplasmose, Rubéole, oreillons, HTLV, Facteur Rhumatoïde, ANA ainsi que des patients atteint de myélomes et des femmes enceintes ont été testés. 1 échantillon provenant d un patient atteint de myélome a présenté un profil positif probable avec DECISCAN HCV PLUS et un profil indéterminé avec un test concurrent. 1 échantillon provenant d un patient VZV positif a présenté un profil indéterminé avec DECISCAN HCV PLUS et un profil négatif avec un test concurrent. Reproductibilité La reproductibilité a été étudiée sur 7 échantillons, 1 négatif, 1 faiblement positif, 2 positifs et 3 indéterminés testés 5 fois dans la même série et 5 jours différents. L analyse des profils montre une excellente reproductibilité avec des intensités relatives identiques. 12 - LIMITES DU TEST Ce test ne constitue pas un test de confirmation d une infection par le virus de l hépatite C. Il s agit d un test supplémentaire permettant la caractérisation d anticorps dirigés contre différentes régions virales. De faibles réactions peuvent être observées sur les différentes protéines de DECISCAN en l absence d une réaction positive de dépistage en technique ELISA. De tels profils doivent être renseignés par des données cliniques et par un suivi sérologique dans le temps sur un ou plusieurs prélèvements ultérieurs et éventuellement une recherche de l ARN viral circulant. 18

13 - RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. STEVENS C.E., AACH R.D., HOLLINGER F.B. et al, MOSLEY J.W., SZMUNESS W., KAHN R., WERCH J., EDWARDS V. Hepatitis B virus antibody in blood donors and the occurence of Non-A Non- B hepatitis in transfusion recipients : an analysis of the transfusion transmitted virus study. Ann. Int. Med. 1984 ; 101 : 733-738. 2. ALTER H.J., PRINCE A.M.. Transfusion associated Non-A Non-B hepatitis : An assesment of the causative agent and its clinical impact. Transfusion Med. Rev. 1988 ; 2 : 288-293. 3. BRADLEY D.W., MAYNARD J.E., POPPER H., COOK E.H., EBERT J.W., Mc CANSTLAND K.A., SCHABLE C.A., FIELDS H.A. Post transfusion Non-A Non-B hepatitis : physiochemical properties of two distinct agents. J. Infect Dis. 1983 ; 148 : 254-265. 4. CHOO K.L., WEINER A.J., OVERBY L.R., KUO G., HOUGHTON M., BRADLEY D.. Hepatitis C virus : the major causative agent of viral Non- Non-B hepatitis. In : Viral Hepatitis. Editor : AJ. ZUCKERMAN.CHURCHILL LIVINSTONE British Medical Bulletin. 1990, vol. 46 : 423-441. 5. KUO G., CHOO Q.L., ALTER H.J., et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human Non-A Non- B hepatitis. Science 1989 ; 244 : 362-364. 6. TAKEUCHI K., KUBO Y., BOOMAR S., WATANABE Y., KATAYAMA T., CHOO Q.L., KUO G., HOUGHTON M., SAITO I., MIYAMURA T. Nucleotide sequence of core and enveloppe genes of the hepatitis C virus genome derived directly from humans healthy carriers. Nucleic acid research. 1990 ; 18-15. 7. VAN DER POEL C.L., REESINK H.W., LELIE P.N., LEENTVARR-KUYPERS A., CHOO Q.J., KUO G., HOUGHTON M. Anti-Hepatitis C antibodies and Non-A, Non-B post transfusion hepatitis in the Netherlands. Lancet, 1989, 297-299. 8. CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C., GALLEGOS C., COIT D., MEDINA- SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991 ; vol. 88 : 2451-2455. 19

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DECISCAN HCV PLUS 24 pruebas 72310 INMUNOTRANSFERENCIA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VHC EN EL SUERO O EL PLASMA HUMANOS IVD Control de calidad del fabricante Todos los reactivos fabricados y comercializados se someten a un sistema de calidad completo que va desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización final del producto. Cada lote se somete a un control de calidad y sale al mercado sólo cuando está de acuerdo con los criterios de aceptación. Los registros relativos a la producción y al control de cada lote se conservan en nuestra compañía.

ÍNDICE 1 - INTERÉS CLÍNICO 2 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA 3 - CONTENIDO DEL EQUIPO 4 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO 5 - INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDAD 6 - PRECAUCIONES 7 - MUESTRAS 8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS VALIDEZ - CONSERVACIÓN 9 - PROCEDIMIENTO DE VALORACIÓN 10 - LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 11 - RENDIMIENTOS 12 - LÍMITES DE LA PRUEBA 13 - BIBLIOGRAFÍA 22

1 - INTERÉS CLÍNICO DECISCAN HCV PLUS es una prueba de membrana en la que se usa una técnica inmunoenzimática para la identificación de anticuerpos asociados a infección producida por el virus de la hepatitis C en el suero o el plasma humanos. La caracterización de estos anticuerpos es un paso suplementario esencial para conocer mejor la serología del VHC, permitiendo el seguimiento de la evolución de los anticuerpos séricos. 2 - PRINCIPIO DE LA PRUEBA DECISCAN HCV PLUS utiliza, como soporte sólido, una membrana fijada sobre una tira de plástico con el siguiente esquema de revestimiento secuencial : 1) Control de IgG anti-humano Este control permite simultáneamente : la validación de la dispensación de la muestra, el control de los reactivos (conjugado, sustrato), la lectura de los resultados sobre la intensidad de la señal de control. 2) Proteína de fusión : GST Los genes que codifican las proteínas NS3 y NS4 se fusionan con el gen de la glutatión S transferasa. La proteína GST controla la presencia de anticuerpos anti-gst, lo que puede inducir reacciones falsas positivas. 3) Antígenos del VHC Proteínas recombinantes producidas por E. coli de los clones seleccionados : en el área no estructural : NS3 y NS4 Péptidos seleccionados por su alta inmunogenicidad : en el área estructural : C1 y C2 en el área no estructural : NS4 DECISCAN HCV PLUS Antihumano proteína GST IgG de Control fusión C1 C2 NS3 NS4 El procedimiento de valoración incluye los siguientes pasos de la reacción : 1) Se incuba el suero a estudiar con la tira. Los anticuerpos frente a VHC, si los hay, se unen a los antígenos fijados sobre la fase sólida. 2) Los anticuerpos IgG anti-humanos marcados con fosfatasa alcalina, añadidos después del lavado, se unen a anticuerpos específicos capturados en la fase sólida. 3) El conjugado enzimático no unido se retira mediante lavado y se revela el complejo antígeno / anticuerpo mediante la adición de sustrato. 4) Después de detener la reacción, se leen las bandas coloreadas y se interpretan los resultados. 23

3 - CONTENIDO DEL EQUIPO Todos los reactivos son exclusivamente para uso diagnóstico in vitro. ETIQUETA REACTIVOS PRESENTACIÓN R1 TIRA REVESTIDA con Ag VHC recombinantes y con péptidos 24 tiras de las regiones de la cápside, NS3 y NS4 R2 SOLUCIÓN/DILUYENTE DE LAVADO CONCENTRADO (5 X) 1 frasco 100 ml R3 SUERO DE CONTROL NEGATIVO 1 frasco Suero humano sin anticuerpos anti-vhc negativo para Ag HBs, 0,2 ml anticuerpos anti-vih1 y VIH2. Conservante : acida sódica < 0,1% R4 SUERO DE CONTROL POSITIVO 1 frasco Suero humano positivo para anticuerpos anti-vhc, negativo para Ag HBs, 0,2 ml anticuerpos anti-vih1 y VIH2, inactivado fotoquímicamente Conservante : acida sódica < 0,1% R5 DILUYENTE DE LA MUESTRA 1 frasco tampón Tris/NaCl con leche, rojo fenol 90 ml Conservante : Kathon 0,25% R6 CONJUGADO 1 frasco Anticuerpos IgG anti-humanos (carnero) marcados con fosfatasa alcalina 90 ml tampón Tris/NaCl con colorante verde Conservante : acida sódica < 0,1% R8 SOLUCIÓN DE DESARROLLO DEL COLOR BCIP/NBT 1 frasco 5-Bromo-4-Cloro-Indolil fosfato (BCIP) y tetrazolio nitroazul (NBT) 90 ml Conservante : acida sódica < 0,1% R9 SOLUCIÓN DE PARADA 1 frasco ácido cítrico 50 mm 90 ml Conservante : Mertiolato al 0,01% SOPORTES DE 6 COMPARTIMENTOS 4 4 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO Agua destilada o desionizada Lejía y bicarbonato sódico Papel absorbente Guantes desechables Gafas protectoras Pipetas automáticas o semiautomáticas ajustables o prestablecidas para dispensar 10 µl Pipetas graduadas con capacidad de 3 ml Probetas graduadas de 100 ml, 250 ml y 500 ml Agitador bidimensional, tridimensional o rotatorio (agitación lenta) Recipiente para residuos biopeligrosos Bomba de vacío con tapón de seguridad Sistemas agitador-incubador-distribuidor* (*) Consúltenos para información más detallada sobre el equipamiento recomendado por nuestro departamento técnico. 5 - INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDAD Todos los reactivos incluidos en el equipo están previstos para uso diagnóstico in vitro. Lleve guantes desechables cuando maneje reactivos de prueba y lávese las manos cuidadosamente después. No pipetee con la boca. El suero humano empleado en el control positivo ha sido inactivado fotoquímicamente, sin embargo, no hay ningún método conocido que pueda ofrecer una garantía completa de que el VIH, el VHB, el VHC u otros agentes infecciosos estén ausentes. Considere estos reactivos y todas las muestras de pacientes como 24

potencialmente infecciosos y manéjelos con las debidas precauciones. Considere cualquier material directamente en contacto con las muestras y reactivos de origen humano como materiales contaminados y, por tanto, infecciosos. Evite salpicar las muestras o las soluciones que las contienen. Los vertidos deben limpiarse con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, las superficies contaminadas se deben neutralizar antes con bicarbonato sódico, luego se deben limpiar con lejía y se deben secar con papel absorbente. El material usado para la limpieza debe desecharse en un recipiente especial para residuos contaminados. Deben desecharse las muestras, los reactivos de origen humano, así como el material y los productos contaminados después de descontaminarlos : - por inmersión en lejía a una concentración final de hipoclorito sódico al 5% (1 volumen de lejía por 10 volúmenes de líquido contaminado o agua) durante 30 minutos, - o mediante autoclave a 121 C durante un mínimo de 2 horas. PRECAUCIÓN : no introducir en el autoclave soluciones con hipoclorito sódico. Algunos reactivos contienen acida sódica como conservante. La acida sódica puede reaccionar con las tuberías del laboratorio formando acidas de cobre o plomo. Dichas acidas son explosivas. Para impedir la acumulación de acidas, irrigue las tuberías con una gran cantidad de agua si se eliminan las soluciones con acidas por el sumidero después de su inactivación. 6 - PRECAUCIONES La calidad de los resultados depende de las siguientes buenas prácticas de laboratorio : No usar reactivos caducados. No mezclar ni combinar reactivos de los equipos con diferentes números de lote durante el mismo procedimiento. Antes de usar, esperar 30 minutos a que los reactivos se estabilicen a temperatura ambiente. Reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando cualquier contaminación. No realizar la prueba en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvo que pueda alterar la actividad enzimática conjugada. Usar material de vidrio lavado y aclarado concienzudamente con agua destilada o, preferiblemente, material desechable. Usar una nueva punta de dispensación para cada suero. El lavado de las tiras es un paso crítico : hay que respetar el número recomendado de ciclos de lavado y comprobar que los compartimentos del soporte están completamente llenos y luego vacíos. Un lavado incorrecto puede conducir a resultados incorrectos. No utilizar nunca el mismo recipiente o pipeta para distribuir reactivos diferentes. 7 - MUESTRAS Recoja una muestra de sangre según las prácticas actuales. Pueden usarse el suero o el plasma para la prueba. Si se usa suero: extraiga cuanto antes para evitar la hemólisis. La hemólisis puede alterar gravemente el rendimiento de la prueba. Las muestras con agregados deben aclararse mediante centrifugación antes de realizar la prueba. Las partículas o los agregados de fibrina suspendidos pueden llevar a resultados falsos positivos. Las muestras pueden conservarse a +2-8 C si la prueba se realiza en 7 días o se pueden congelar profundamente a 20 C. Evite la congelación y descongelación repetidas. No deben usarse las muestras que se hayan congelado y descongelado más de 3 veces. Si las muestras se van a transportar, enváselas de acuerdo con las normas para el transporte de agentes etiológicos. NO USAR MUESTRAS CONTAMINADAS, HIPERLIPIDÉMICAS O HEMOLIZADAS. NOTA : Las muestras con hasta 90 g/l de albúmina, 100 mg/l de bilirrubina, las muestras lipidémicas con hasta el equivalente a 36 g/l de trioleína y las muestras hemolizadas con hasta 10 g/l de hemoglobina no afectan a los resultados de la prueba. 8 - RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS - VALIDEZ - CONSERVACIÓN NOTA : Antes de usar, permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente (18-30 C). Solución/diluyente de lavado concentrado (5x) Diluya la solución de lavado 1:5 en agua destilada y mezcle cuidadosamente. Se necesitan 20 ml por tira. La solución de lavado reconstituida es estable durante un mes cuando se conserva a +2-8 C. 25

Todos los demás reactivos, cuando se conservan a + 2-8 C, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas. Mezcle el diluyente de la muestra, el conjugado y la solución de desarrollo, invirtiéndola antes de su uso. 9 - PROCEDIMIENTO DE VALORACIÓN Comentarios preliminares Siga estrictamente el procedimiento propuesto. Incluya el control negativo y el control positivo suministrado en el equipo en todas las valoraciones realizadas durante el mismo día y cuando se usa un nuevo número de lote de equipos. Registre los números de las tiras para que correspondan con la identificación del paciente o los controles positivos o negativos. Prepare la solución de lavado (parte 8). Retire el número necesario de tiras del cartucho. Cójalos por su marco de plástico para evitar el contacto directo con la membrana. Colóquelos en los compartimentos del soporte con la membrana hacia arriba. Protocolo 1) Dispense 3 ml del diluyente de la muestra en cada compartimento. Deje que las tiras se rehidraten durante 5 minutos a temperatura ambiente mientras las agita. 2) Añada 10 µl de la muestra o control a un compartimento separado y enjuague la punta de la pipeta 3 veces en el diluyente dispensado. 3) Incube durante 2 horas mientras se agita a temperatura ambiente. 4) Aspire todo el contenido de cada compartimento usando una bomba de vacío equipada con una trampa llena de lejía. Enjuague cuidadosamente la pipeta entre las aspiraciones. Añada 3 ml de solución de lavado por compartimento y agite durante 2 minutos. 5) Repita dos veces el paso 4, para un total de 3 lavados y luego retire la última solución de lavado. 6) Añada 3 ml de conjugado a cada compartimento. Incube durante 30 minutos mientras se agita a temperatura ambiente. 7) Aspire el líquido de cada compartimento. Lave cada tira 3 veces, como se indica en el paso 4 y retire la última solución de lavado. 8) Añada 3 ml de solución de desarrollo a cada compartimento. Incube durante 6 minutos mientras se agita a temperatura ambiente. 9) Aspire el líquido de cada compartimento. 10) Añada 3 ml de solución de parada a cada compartimento. Incube durante 5 minutos mientras se agita a temperatura ambiente. 11) Aspire el líquido de cada compartimento y enjuague las tiras 3 veces con agua destilada. 12) Retire las tiras de cada compartimento y seque cuidadosamente entre dos hojas de papel absorbente. Mantenga las tiras fuera de la luz para evitar la aparición de fondo. 10 - LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 1) LECTURA DE LOS RESULTADOS La localización e identificación de las bandas de control y de las bandas de antígeno del VHC corresponden a las del diagrama siguiente: La localización de los antígenos en la tira se validará usando suero de control positivo. El control de IgG antihumana se encuentra en el extremo de la tira (en la parte opuesta al soporte de plástico) y se disponen, respectivamente, GST C1 C2 NS3 NS4. DECISCAN HCV PLUS 26 Antihumano proteína GST IgG de Control fusión La lectura debe realizarse en tiras secas. Las tiras están secas cuando el fondo es blanco. C1 C2 NS3 NS4 Soporte de plástico

Lectura La intensidad de señal de cada banda de antígeno se determina comparando con la intensidad de señal de la banda control de IgG antihumana para cada tira. Intensidad de la banda Marca Cualquier rango de intensidades de señal mayores que la señal control de anti-igg 3 + Cualquier intensidad de señal igual a la señal de control anti-igg 2 + Cualquier rango de intensidades de señal menores que la banda de control anti-igg 1 + pero mayores que una señal traza Señal débil que aparece sólo como una traza leve 0,5 + Ninguna señal 0 Validación La banda de control debe ser claramente visible a simple vista, lo que valida la adición de la muestra, la adición de conjugado y los pasos de desarrollo. No es posible ninguna interpretación si la banda control no está validada. Suero de control negativo : Sólo es visible la banda de control anti-igg, no se observa señal en ninguna otra banda. Suero de control positivo : La banda de control anti-igg y las 4 bandas de antígenos del VHC son claramente visibles. No se observa señal en la banda de GST (proteína de fusión). 2) INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS LECTURA INTERPRETACIÓN No hay ninguna banda de VHC visible NEGATIVO 1 banda visible de antígeno de VHC INDETERMINADO* o 2 bandas de cápside, sólo (C1, C2) 2 bandas de antígeno de VHC de 2 productos génicos PROBABLE POSITIVO* diferentes (gen de la cápside, gen NS3, gen NS4) con intensidad igual a 0,5+ Al menos 2 bandas de antígeno de VHC de 2 productos POSITIVA génicos diferentes (gen de la cápside, gen NS3, gen NS4) con una intensidad mayor de 0,5+ NOTA : si la banda GST es visible, sólo pueden interpretarse las bandas de antígenos C1 y C2 del VHC (péptidos sintéticos) (*) Se recomienda con el conocimiento actual de la serología del VHC, que se tome otra muestra posteriormente. Ejemplos de interpretación de los resultados C1 C2 NS3 NS4 INTERPRETACIÓN A 1+ 2+ 0 0 Indeterminado B 0 0,5+ 0,5+ 0 Probable positivo C 0 0 0 0 Negativo D 0 2+ 1+ 0,5+ Positivo E 0 0 0,5+ 0 Indeterminado F 0 0,5+ 1+ 0 Probable positivo G 0 0 1+ 1+ Positivo 11- CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Especificidad Se usó un total de 474 donantes de sangre, que resultaron negativos por una valoración de cribado de EIA para estudiar la especificidad de DECISCAN HCV PLUS. Ninguna muestra ha resultado positiva, 22 muestras mostraron un perfil indeterminado. Se usó también un total de 240 muestras clínicas, que resultaron negativas por una valoración de cribado de EIA para estudiar la especificidad de DECISCAN HCV PLUS. Ninguna muestra ha resultado positiva, 21 muestras mostraron un perfil indeterminado y dos muestras presentaron un perfil probable positivo con bandas de bajas intensidades 0,5+. 27