ANA PAULA DE SANTI RAMPAZZO ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI, CHARACIDAE).

ANA PAULA DE SANTI RAMPAZZO ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI, CHARACIDAE). Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Ciências Biológicas Área de concentração Biologia Celular, da Universidade Estadual de Maringá para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. MARINGÁ PARANÁ 2006

ANA PAULA DE SANTI RAMPAZZO ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI, CHARACIDAE). ORIENTADORA: Dr a Isabel Cristina Martins dos Santos. MARINGÁ PARANÁ 2006

Uma das principais razões do êxito na vida é a habilidade de manter um interesse diário pelo trabalho que se faz, de ter um entusiasmo crônico de considerar cada dia especialmente importante. (W.L. Phelps)

Dedico este trabalho Aos meus pais Pedrino e Rosalina Ao meu irmão João Paulo Ao meu marido Reinaldo À minha tia Ina (in memorian).

Agradecimentos Ao Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Estadual de Maringá, por fornecer as condições necessárias à elaboração desta dissertação. Ao NUPELIA, em particular ao Prof o Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior, pelo auxílio na coleta dos espécimes analisados. Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos. À Prof a Dr a Isabel Cristina Martins dos Santos pela orientação, conhecimentos transmitidos, apoio na pesquisa científica e dedicação na realização deste trabalho. Agradeço especialmente pela amizade, pela paciência e por confiar na minha capacidade durante estes sete anos. À Prof a Dr a Ana Luiza de Brito Portela Castro, pelos conhecimentos transmitidos, pelo incentivo e pela amizade. À Prof a Dr a Claudete Aparecida Mangolin por toda a atenção e por estar sempre disposta a compartilhar seus valiosos conhecimentos. Á doutoranda Adriana pela disposição em me atender sempre que solicitei. Às colegas Luciana Ramos Sato e Patrícia Belini Nishiyama pelo auxílio na realização do trabalho. Aos amigos do laboratório de Citogenética de Peixes - Luciana, Sônia Mizogushi, Sônia Carvalho, Marli, Edner, Gisele, Kátia, Alaim, Letícia, Thiago, Leonardo e, em especial ao Alexandre, à Fernanda, ao Cleverson e ao Paulo Emílio, que me ajudaram muito durante o mestrado. Aos professores do curso de pós-graduação em Biologia Celular pela contribuição em minha formação profissional. À Maria José, a auxiliar mais competente, humana e mãe que este laboratório podia ter. Obrigado por você irradiar esta energia que fez os meus dias bem melhores. Aos amigos do coração - Suzana, Leandro, Adriana Sinópolis, Luiz Cristiano e Valéria, pela verdadeira amizade e por todos os momentos de companheirismo. À Rosana e Márcia, pela infinita amizade que resiste ao tempo e á distância. Aos meus pais Pedrino e Rosalina, que me concederam a vida e fizeram dela um aprendizado constante, lutando ao meu lado em busca da realização deste sonho. O grande mérito é de vocês!!!

Ao meu irmão João Paulo, que sempre torceu por mim. Ao maridão Reinaldo, pelo incentivo, por ser o meu porto seguro e compartilhar comigo os momentos mais felizes da minha vida. À minha tia Ina ( Pedra Constantino Santi), que sempre me deu o apoio que uma mãe dá para uma filha, me incentivando, torcendo e rezando por mim em cada etapa da minha vida. Tenho certeza que de onde estiver, está muito orgulhosa e feliz por mais essa conquista. Valeu Tia!!!! Á DEUS, principal força que move cada passo que dou, fonte inesgotável de inspiração e sabedoria. Obrigado pela vida e por ter me dado o dom de saber como conduzi-la.

APRESENTAÇÃO Esta dissertação é composta por três artigos, os quais foram concluídos a partir da análise citogenética de espécies pertencentes à subfamília Cheirodontinae (Serrapinnus notomelas e Serrapinnus sp.1) e Aphyocharacinae (Aphyocharax anisitsi). Os espécimes foram coletados em diferentes localidades na bacia do rio Tietê (rio Pântano, rio Araquá e Córrego Cascatinha) e no rio Paraná (região do município de Porto Rico). Cada artigo está diagramado de acordo com as normas da revista a qual será submetido para publicação. 1 - Análise Citogenética e Descrição de Sistema de Determinação Sexual ZZ/ZW em espécies do Gênero Serrapinnus (Characidae, Cheirodontinae). Revista Genetica. 2 - Polimorfismo Intrapopulacional das Regiões Organizadoras de Nucléolo em Serrapinnus notomelas (Characidae, Cheirodontinae) do rio Paraná, detectado por impregnação pela prata, Banda C e Hibridação Fluorescente in situ. Revista Chromosome Research. 3 - Estudos Citogenéticos em Aphyocharax anisitsi (Characidae, Aphyocharacinae) de ocorrência no rio Paraná SHORT COMMUNICATION. Revista Genetics and Molecular Biology.

ANÁLISE CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DAS SUBFAMÍLIAS CHEIRODONTINAE E APHYOCHARACINAE (TELEOSTEI, CHARACIDAE). Resumo No presente trabalho foram analisadas três espécies de peixes: duas pertencentes à subfamília Cheirodontinae (Serrapinnus notomelas e Serrapinnus sp.1) e uma pertencente à subfamília Aphyocharacinae (Aphyocharax anisitsi), coletados nas bacias do rio Paraná e Tietê. Quatro populações de S. notomelas foram estudadas, provenientes dos rios Araquá e Pântano, Córrego Cascatinha e rio Paraná. Esta última também foi a localidade de coleta das demais espécies. A análise dos resultados mostrou, para os representantes do gênero Serrapinnus, um número diplóide igual a 52 cromossomos para todas as populações analisadas, contudo, diferenças interespecíficas na fórmula cariotípica foram observadas. S. notomelas apresentou 16M+22SM+10ST+4A, com NF=100 para os machos e 16M+23SM+10ST+3A, com NF=101 para as fêmeas. Serrapinus sp.1 apresentou 8M+16SM+4ST+24A, com NF=80 para machos e 8M+15SM+4ST+25A, com NF=79 para fêmeas. A diferença de NF entre os sexos é devido à presença de um par heteromórfico (submetacêntrico/acrocêntrico) nas fêmeas das duas espécies, caracterizando um mecanismo de determinação sexual cromossômica do tipo ZZ/ZW. Este sistema de cromossomos sexuais heteromórficos mostrou-se diferente em relação aos tipos de cromossomo W nas duas espécies; enquanto em S. notomelas o W é um cromossomo submetacêntrico em Serrapinnus sp.1 ele é um acrocêntrico. A técnica de banda C demonstrou um padrão de heterocromatina pericentromérica com NOR banda C positiva em todas as populações de S. notomelas estudadas. Além disso, foi observada a presença de um par de cromossomos submetacêntricos, com banda C intersticial no braço longo, não relacionado à NOR. Em relação às NORs, diferenças intraespecíficas também foram encontradas. Enquanto um sistema AgNOR simples (par 26) foi detectado para três das quatro populações estudadas de S. notomelas, para Serrapinnus sp.1 dois pares cromossômicos estiveram envolvidos com esta região. A população do rio Paraná apresentou variabilidade intrapopulacional com seis padrões distintos de NOR em nove indivíduos analisados, o que nos leva a propor que estes sítios podem corresponder a transposição

de cópias dos cístrons de rdna, fixos no par 26 (NOR preferencial), para diferentes locais no genoma. Isto pode ser corroborado pelo fato das outras populações apresentarem AgNOR simples no par 26. Embora consideremos que o mecanismo de transposição por elementos móveis, seja o mais provável, não podemos descartar a hipótese da ocorrência de outros tipos de rearranjos, tais como translocações, duplicações, amplificações, dentre outros. Além disso, pôde-se observar a coincidência de variação de banda C com os diferentes tipos de padrões estabelecidos. Possivelmente a heterocromatina presente no par 26, flanqueando o genes rdna, acompanhe estes genes por qualquer que seja o mecanismo envolvido nesta variabilidade. A. anisitsi apresentou 2n=50, com fórmula cariotípica consistindo de 4M+4SM+42A e NOR simples que foi detectada pela prata, FISH e CMA 3. Apesar dos escassos estudos realizados dentro desta subfamília pode-se verificar que o número diplóide é conservativo neste gênero, contudo diferenças interespecíficas podem ser observadas, principalmente em relação às regiões organizadoras de nucléolo. Nas análises realizadas até o momento, somente a espécie estudada no presente trabalho apresentou NOR simples, indicando diferenças na evolução cariotípica das mesmas. A banda C apresenta blocos pericentroméricos e teloméricos na maioria dos cromossomos, inclusive nas regiões de NOR. Os dados apresentados neste estudo apresentam mais um suporte à sistemática destas subfamílias e reforçam a necessidade de ampliação dos conhecimentos acerca da citogenética deste grupo, que funciona não só como uma ferramenta para os taxonomistas, mas também como auxílio no esclarecimento de possíveis mecanismos genéticos que possam estar ocorrendo durante a especiação.

Abstract In the present work three fish species were analyzed: two belong to the Cheirodontinae subfamily (Serrapinnus notomelas and Serrapinnus sp.1) and one to Aphyocharacinae subfamily (Aphyocharax anisitsi), collected from basins of the Paraná river and Tietê river. Four S. notomelas populations from the Araquá and Pântano rivers, Cascatinha Stream and Paraná river, were studied. In this last also were the others species. The analysis of the results showed a diploid number the 52 chromosomes for all the analyzed populations in the Serrapinnus genus, however, interespecific differences in the karyotypic formulae, were observed. S. notomelas showed 16M+22SM+10ST+4A, with NF=100 for males and 16M+23SM+10ST+3A, with NF=101 for females. Serrapinnus sp.1 showed 8M+16SM+4ST+24A, with NF=80 for males and 8M+15SM+4ST+25A, with NF=79 for females. The difference in the NF among the sexes is due to presence of one heteromorphic pair (submetacentric/acrocentric) in the females of the two species, characterizing a sexual chromosomal mechanism of the type ZZ/ZW. This sexual heteromorphic chromosomes system showed to be different in relation to the type of W chromosomes in the two species, while that in S. notomelas the W is a submetacentric chromosomes in the Serrapinnus sp.1 is acrocentric. The C band technique demonstrated a pericentromeric heterocromatin pattern with NOR region positive C band in all the S. notomelas populations studied. Moreover, the presence of interstitial C band in long arm of a submetacentric chromosomes pair, was observed. In relation to the NORs, intraespecific differences also were found. While the system simple AgNOR (pair 26) was detected for three of four S. notomelas populations studied, to Serrapinnus sp.1 two chromosomal pairs were involved with this region. The population from Paraná river showed intrapopulational variability and six diferent NOR patterns were distinguished among 9 specimens. This can correspond the copies transposition of rdna citrons, fixed in the 26 pair (preferential NOR), for different locality in the genome. This is corroborated by the fact of other populations showed simple AgNOR, in the 26 pair. Although the mechanism of transposition by mobile elements, are most probabily we not discard the hypothesis of occurrence of other rearrangements types such as translocations, duplications, amplifications, amongst others. Moreover, C band variation coincidence with patterns types different was observed. Probability the heterocromatin that flank the rdna genes of the 26 pair, follow these genes independently of the mechanism involved in this variability.

A. anisitsi showed 2n=50, with karyotypic formulae consisting of 4M+4SM+42A and simple NOR detected by the silver, FISH and CMA 3. Despite the scarce studies carried in this subfamily was verified that the diploid number this genus is conservative. However interespecific differences were observed in relation nucleolus organizers regions. In the analyses carried until moment, only the species studied in present work presented simple NOR, indicating differences in karyotype evolution this species. C-Band showed pericentromeric and telomeric blocks in the majority of the chromosomes and in the NOR regions. The data evidenced in the present study are a support for systematic these subfamilies and also strengthen the necessity of increase the knowledge about of the cytogenetic this group beside the constitutive tool useful for the taxonomists aiding to clear possible genetic mechanisms that have been occurred during the speciation.

Análise citogenética e descrição de um sistema de determinação sexual ZZ/ZW em espécies do gênero Serrapinnus (Characidae, Cheirodontinae). Ana Paula de Santi-Rampazzo 1, Patrícia Belini Nishiyama 2, Paulo Emílio Botura Ferreira 1 & Isabel Cristina Martins-Santos 1 1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, Avenida Colombo 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brasil, 2 Departamento de Biologia- UNIPAR. (E-mail: apsanti1@hotmail.com)

Resumo Foram estudadas quatro populações da espécie Serrapinnus notomelas e uma população da espécie Serrapinnus sp.1, ambas pertencentes à subfamília Cheirodontinae, através da técnica convencional (Giemsa), impregnação por nitrato de prata e bandamento C, afim de detectar possíveis mecanismos de evolução cariotípica. A análise dos resultados mostrou um número diplóide igual a 52 cromossomos para todas as populações analisadas, contudo, diferenças interespecíficas na fórmula cariotípica foram observadas. S. notomelas apresentou 16M+22SM+10ST+4A, com NF=100 para os machos e 16M+23SM+10ST+3A, com NF=101 para as fêmeas. Serrapinnus sp.1 apresentou 8M+16SM+4ST+24A, com NF=80 para machos e 8M+15SM+4ST+25A, com NF=79 para fêmeas. A diferença de NF entre os sexos é devido à presença de um par heteromórfico (submetacêntrico/acrocêntrico) nas fêmeas das duas espécies, caracterizando um mecanismo de determinação sexual cromossômica do tipo ZZ/ZW. Em relação às NORs, diferenças intraespecíficas também foram encontradas. Enquanto um sistema de NOR simples foi detectado para três das quatro populações estudadas de S. notomelas, para Serrapinnus sp.1 dois pares cromossômicos estiveram envolvidos com esta região. A técnica de banda C demonstrou, para S. notomelas, que a heterocromatina está localizada em regiões centroméricas na maioria dos cromossomos do complemento e, em alguns, em posição telomérica, inclusive a região de NOR. Não houve evidência de marcação no par cromossômico sexual. A despeito de S. notomelas e Serrapinnus sp.1 apresentarem o mesmo número diplóide, elas mostraram diferenças na estrutura cariotípica, indicando que mecanismos de inversões pericêntricas estiveram presentes durante a evolução cariotípica deste grupo. Palavras-Chaves: ZZ/ZW, Serrapinnus, Cheirodontinae, cariótipo

Introdução Os peixes da subfamília Cheirodontinae não ultrapassam o comprimento de 10 cm, sendo comuns em vegetação marginal de ambientes lóticos e lênticos de todo o Brasil (Buckup & Malabarba,1983). Segundo Malabarba (1994) a sistemática desta subfamília apresenta muitas divergências, tendo sido discutida por vários autores nos últimos anos. Gregory & Conrad (1938) relataram a possibilidade dos Tetragonopterinae serem derivados da subfamília Cheirodontinae ou pertencentes a um ancestral comum. Ainda, autores como Weitzman & Fink (1983) discutiram a fragilidade da classificação dos caracídeos neotropicais e posteriormente Weitzman & Vari (1988) não mais reconhecem Cheirodontinae separadamente de Tetragonopterinae. Ainda hoje, esta classificação parece incerta e Malabarba (1998) redefine Cheirodontinae como uma subfamília composta por 20 gêneros, entre eles o Serrapinnus. Embora a ictiofauna de águas continentais da região Neotropical possa apresentar até 8000 espécies (Vari & Malabarba, 1998), conclui-se que o estágio atual de conhecimento nessa área é ainda pequeno. Além da análise cariotípica convencional os citogeneticistas de peixe têm buscado caracterizar as espécies através de técnicas de bandamentos como impregnação com nitrato de prata para localizar regiões organizadoras de nucléolos (AgNOR), banda C (heterocromatina constitutiva), fluorocromos (regiões ricas em AT e CG), 5-Bromodeoxiuridina (bandas de replicação), hibridação fluorescente in situ (FISH) e enzimas de restrição, na busca de estabelecer relações filogenéticas e evolutivas mais precisas entre elas. A utilização da técnica AgNOR têm permitido a observação tanto de ocorrência de NORs em um único par de cromossomos, quanto àquelas distribuídas em vários pares (NORs múltiplas). Entre os caracídeos estas últimas têm sido as mais freqüentes.

Embora o padrão das AgNORs positivas seja, em geral, constantes para uma espécie, tem sido demonstrado variações no número e/ou tamanho da região organizadora do nucléolo entre diferentes indivíduos, ou mesmo entre diferentes células de um mesmo indivíduo. Estas variações parecem refletir diferenças no número de pares de genes RNAr decorrentes de quebras durante a associação destas regiões no núcleo interfásico e forte contração durante a prófase, mas também podem representar uma diferença na atividade transcricional desses genes. Dentro do gênero Serrapinnus, S. notomelas tem sido a única espécie descrita de ocorrência na bacia do rio Paraná. Esta espécie tem como característica distintiva as nadadeiras dorsal e anal com pigmentos escuros localizados anteriormente. Contudo, duas outras formas têm sido observadas e separadas morfologicamente: Serrapinnus sp.1, que apresenta as nadadeiras dorsal e anal hialinas e Serrapinnus sp.2 que possui as nadadeiras dorsal e anal com apenas as extremidades escuras (Graça, 2004). Estas diferenças têm levado a supor que as mesmas possam constituir espécies diferentes. Diante disso, e devido ao pequeno porte das espécies de Cheirodontinae são quase inexistentes estudos citogenéticos nesta subfamília. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a caracterização cromossômica das espécies pertencentes a este grupo, coletadas em diferentes localidades das bacias do rio Tietê e no rio Paraná.

Material e Métodos No presente trabalho foram analisados exemplares de quatro populações da espécie Serrapinus notomelas provenientes do rio Paraná (Bacia do rio Paraná), Córrego Cascatinha e rio Araquá da região de Botucatu-SP e rio Pântano da região de São Carlos-SP (Bacia do rio Tietê) e espécimes de Serrapinnus sp.1 coletados no rio Paraná, na região de Porto Rico - Paraná. As preparações do material para análise dos cromossomos mitóticos foram realizadas, utilizando-se células do rim e brânquias, de acordo com a técnica air drying (Egozcue, 1971) e modificada para peixes por Bertollo et al. (1978). Esta técnica consiste basicamente, no tratamento do animal com colchicina por quarenta minutos, a fim de obter uma suspensão celular hipotonizada em KCL 0,075M e fixada em solução de metanol e ácido acético (3:1). Os cromossomos foram identificados de acordo com os critérios de relação de braços (RB), propostos por Levan et al. (1964). Para caracterização das regiões organizadoras do nucléolo (NOR) utilizou-se a técnica de Howell & Black (1980) e para a regiões heterocromáticas, a técnica de banda C (Sumner, 1975).

Resultados S. notomelas apresentou o número diplóide igual a 52 cromossomos para todas as populações analisadas, com o cariótipo composto de 16 cromossomos metacêntricos, 22 submetacêntricos, 10 subtelocêntricos e 4 acrocêntricos com NF=100 para machos (Figura 1a) e de 16 cromossomos metacêntricos, 23 submetacêntricos, 10 subtelocêntricos e 3 acrocêntricos com NF=101 para as fêmeas (Figura 1b), caracterizando um sistema de heterogametia feminina (ZZ/ZW). Além disso, pode-se observar diferença de tamanho entre o primeiro e segundo par. A NOR foi detectada no braço curto de um par de cromossomos acrocêntricos (par 26), para as populações dos rios Pântano e Araquá e Córrego Cascatinha (Figura 1-detalhe). Também nestas localidades, a heterocromatina constitutiva está localizada em posição pericentromérica em todos os cromossomos e, em alguns, em posição telomérica. Blocos conspícuos foram observados na região intersticial do braço longo do par 13 e em posição telomérica no braço curto do par 26 (Figura 3). Neste último, a marcação foi coincidente com a região de NOR. Em Serrapinnus sp.1 foi detectado número diplóide de 2n=52 cromossomos e fórmula cariotípica composta por 8 cromossomos metacêntricos, 16 submetacêntricos, 4 subtelocêntricos e 24 acrocêntricos com NF=80 para machos (Figura 2a) e 8 cromossomos metacêntricos, 15 submetacêntricos, 4 subtelocêntricos e 25 acrocêntricos com NF=79 para as fêmeas (Figura 2b). A NOR foi localizada em um dos homólogos do par 19 e em ambos cromossomos do par 20 (Figura 2-detalhe). Estes últimos se apresentaram fortemente marcados e heteromórficos em tamanho da NOR, demonstrando um sistema de NOR múltipla.

Figura 1- Cariótipo de Serrapinnus notomelas do rio Paraná, representativo das outras populações estudadas: dos rios Araquá e Pântano e do córrego Cascatinha. (a) macho e (b) fêmea. Em detalhe os cromossomos portadores de NOR (par 26).

Figura 2- Cariótipo de Serrapinnus sp.1. (a) macho e (b) fêmea. Em detalhe os cromossomos portadores de NOR (pares 19 e 20).

Figura 3- Metáfase de Serrapinnus notomelas submetida à técnica de Banda C, representativo para as populações dos rios Araquá e Pântano e Córrego Cascatinha. O bloco no par 26 corresponde à região Ag-NOR, em detalhe o par sexual ZW.

Discussão Nestas análises verificou-se que, em Serrapinnus notomelas, todas as populações analisadas apresentaram o mesmo número diplóide e a mesma constituição cariotípica. Contudo, Serrapinnus sp.1 mesmo apresentando o mesmo número diplóide, mostrou diferenças na constituição cariotípica quando comparado à S. notomelas. S. notomelas apresentou uma maior quantidade de cromossomos submetacêntricos (11 pares) e menor de acrocêntricos (3 pares), enquanto Serrapinnus sp.1, apresentou maior quantidade de acrocêntricos (12 pares). Além disso, foram observadas diferenças na relação de tamanho entre o primeiro e o segundo par para as duas espécies. Enquanto S. notomelas apresentou o primeiro par maior que o segundo, em Serrapinnus sp.1 esta diferença não foi significativa. Estas diferenças as caracterizam como espécies distintas, indicando que rearranjos estruturais estiveram presentes durante ou após o processo de especiação das mesmas. Em relação ao número diplóide da subfamília Cheirodontinae, têm sido observadas variações tanto em nível intergenérico, com 2n=32 cromossomos em Paracheirodon innesi (Gydenholm & Scheel, 1971) e 2n=52 cromossomos para a maioria das espécies analisadas, como em nível interespecífico em Cheirodon tronneri (n=25; Scheel, 1973), C. axelroidi (n=24; Post, 1965) (n=26; Scheel, 1973); e ao nível intraespecífico em Paracheirodon innesi com 2n=32 e 36 (Gyldenholm & Scheel, 1971). A despeito da igualdade do número diplóide verificado entre os sexos em S. notomelas e Serrapinnus sp.1, elas apresentaram cromossomos sexuais heteromórficos do tipo ZZ/ZW. Embora as duas espécies apresentem o mesmo tipo de mecanismo de determinação cromossômica sexual, o par e o tipo de cromossomos envolvidos diferem entre elas. Enquanto o cromossomo responsável pela heterogametia feminina em S.

notomelas é um submetacêntrico, em Serrapinnus sp.1 ele é acrocêntrico. Provavelmente esta diferença de par sexual tenha surgido devido às inversões pericêntricas que acompanharam a evolução cariotípica das duas espécies. Wasko et al. (2001) analisando as espécies Odontostilbe paranensis e Holoshestes heterodon, pertencentes à subfamília Cheirodontinae, evidenciaram um número diplóide igual a 52 cromossomos, onde O. paranensis apresentou o mesmo tipo de heteromorfismo sexual cromossômico encontrado no gênero Serrapinnus e especificamente à S. notomelas, apresentando uma maior quantidade de M/SM. A análise de fêmeas de H. heterodon também indicou um provável heteromorfismo sexual cromossômico devido à presença de um cromossomo acrocêntrico e um metacêntrico, ambos sem seus respectivos homólogos. Entretanto, Wasko & Galetti Jr. (1994) não observaram diferença cariotípica entre os sexos em O. claudinae. Estes dados, juntamente com os do presente trabalho, indicam que o mecanismo de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW é o único presente nesta subfamília, bem como na família Characidae até o momento. Conforme dados compilados em Almeida & Toledo (2001), este sistema é o mais freqüente entre os peixes Neotropicais. Na família Characidae foram registrados cromossomos sexuais morfologicamente diferenciados em Triportheus guintheri (Bertollo & Cavallaro, 1992; Artoni et al., 2001; Artoni & Bertollo, 2002), T. albus, T. elongatus e T. flavus (Falcão, 1988), T. cf elongatus e T. paranense (Artoni et al. 2001; Artoni & Bertollo, 2002) todos eles do tipo ZZ/ZW. Portanto, as únicas subfamílias a apresentarem evidências citológicas de heterogametia de cromossomos sexuais entre os caracídeos foram os Cheirodontinae e Triportheinae. Segundo Galetti Jr. et al. (1981), ao contrário do que se pensava, o heteromorfismo de cromossomos sexuais está bem representado entre os peixes. Moreira-Filho (1983) chamou a atenção para este fato, mostrando que entre as

espécies de peixes estudadas no Brasil, 15,8% apresentam mecanismo cromossômico sexual, ocorrendo desde heterogametia simples XX/XY e ZZ/ZW, até casos de mecanismos múltiplos envolvendo mais de um par cromossômico (X 1 X 1 X 2 X 2 /X 1 X 2 Y, XX/XY 1 Y 2 e ZZ/ZW 1 W 2 ). No estudo da região organizadora do nucléolo da espécie S. notomelas verificou-se a presença de AgNOR simples para três das quatro populações estudadas. A população do rio Paraná foi a única a demonstrar variações no padrão de distribuição da NOR (Santi-Rampazzo & Martins-Santos, em preparação). NOR simples foi observado dentro da subfamília Cheirodontinae por Pacheco et al. (2002) para Odontostilbe pequira do rio Cuiabá. Além disso, Wasko & Galetti Jr. (1994) evidenciaram uma constrição secundária no braço curto de um cromossomo acrocêntrico em Odontostilbe paranensis, determinando, provavelmente, a localização da NOR nesta espécie. Na espécie Serrapinnus sp.1, diferentemente da maioria das populações de S. notomelas (rio Pântano, Araquá, e Córrego Cascatinha), um sistema de NOR múltipla foi detectado, com três cromossomos evidenciados pela técnica de AgNOR. Corroborando estes dados foram observados de um a três nucléolos em cada núcleo interfásico. Estes dados estão de acordo com Pacheco et al. (2002), que detectou este mesmo sistema de distribuição da NOR para S. kriege, com marcação em dois cromossomos não homólogos e S. calliurus, com quatro cromossomos marcados. A técnica de banda C demonstrou um padrão de heterocromatina pericentromérica com NOR banda C positiva em todas as populações de S. notomelas estudadas. Além disso, foi observada a presença de um par de cromossomos submetacêntricos, com banda C intersticial no braço longo.

Desta forma, apesar deste ser um dos primeiros relatos em espécies de Serrapinnus, podemos verificar que dados citogenéticos em Cheirodontinae têm contribuído não só com mais uma característica taxonômica, permitindo identificar espécies distintas e apresentando mais um suporte à sistemática desta subfamília, mas também no estudo dos mecanismos de cromossomos sexuais próprios de cada espécie. Agradecimentos Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte financeiro.

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Polimorfismo intrapopulacional das regiões organizadoras de nucléolo em Serrapinnus notomelas (Characidae, Cheirodontinae) do rio Paraná, detectado por impregnação pela prata (AgNOR), banda C e hibridação fluorescente in situ (FISH). Santi-Rampazzo AP 1, Belini PN 2, Ferreira PEB 1 & Martins-Santos IC 1*. 1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá (UEM), Avenida Colombo 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brasil; 2 Departamento de Biologia, (UNIPAR). (E-mail:apsanti1@hotmail.com)

Resumo A análise citogenética de Serrapinnus notomelas, de ocorrência no rio Paraná confirmou 2n=52 cromossomos e mecanismo de determinação sexual do tipo ZZ/ZW. A análise das regiões organizadoras do nucléolo por AgNOR, FISH e Banda C, desta população, detectaram um polimorfismo intrapopulacional dos genes ribossomais classificados em 6 padrões diferentes. Variações intraindividuais de expressão destes genes também puderam ser verificadas. Além disso, foi observado NOR preferencial localizada no par 26, com pelo menos um dos homólogos ativos, em todos os indivíduos. Isto, aliado ao fato da existência de populações da mesma espécie com AgNOR simples neste par, nos levam a propor que estas variações podem corresponder a transposição de cópias dos cístrons de rdna, fixos no par 26, para diferentes locais no genoma, indicando que na população do rio Paraná este gene parece estar se movendo, provavelmente devido a mecanismos de transposase ou via reinserção em sítios que mostram seqüências homólogas com o inserto. Análise de banda C acompanharam esta variabilidade, confirmando a presença dos diferentes padrões observados. Contudo, não podemos descartar a hipótese da ocorrência de outros tipos de rearranjos. Palavras-Chave: polimorfismo NOR, Cheirodontinae, Serrapinnus notomelas, FISH.

Introdução Um aspecto amplamente estudado em peixes é a região organizadora de nucléolo (NOR). Estas regiões têm mostrado serem importantes marcadores para o estudo da evolução cromossômica (Amemiya &Gold, 1988). Vários trabalhos tem sido realizados buscando entender a composição (Zhang et al. 2000) e a localização (Pendás et al. 1993, Brum & Mota 2002, Jesus & Moreira-Filho 2003) dos genes ribossomais, que podem estar distribuídos em um único par cromossômico (Fenocchio & Bertollo 1992, Porto et al. 1993, Margarido & Galetti Jr 1996, Martins-Santos & Tavares 1996, Venere et al. 1997) caracterizando um sistema de NOR simples ou em vários pares (Galetti Jr & Rasch 1993, Pacheco et al. 2001), o que é comumente denominado de NOR múltipla. Além disso, o número e posição de NORs são usualmente característicos de espécies ou populações, embora variabilidades intra e interindividuais destas regiões tenham sido observados em vários organismos (Lourenço et al. 1998). A alta taxa de polimorfismos envolvendo estas regiões tem sido atribuídos a rearranjos cromossômicos (Rodrigues & Collares-Pereira 1996, Vasconcelos & Martins-Santos 2000, Rabová et al 2001,), variação de expressão (Mizoguchi & Martins-Santos 1998) e elementos de transposição por modificações pós-zigóticas (Galetti Jr et al. 1995). De acordo com este autor, o uso combinado de métodos baseados em diferentes mecanismos de ação como coloração pela prata, por cromomicina A 3 e hibridação fluorescente in situ, podem fornecer dados importantes para o entendimento da distribuição dos cístrons ribossomais nos cromossomos. Outro recurso bastante utilizado para o estudo das NORs é a técnica de banda C, visto que, de acordo com Galetti et al. (1984), a heterocromatina constitutiva associada com a região organizadora de nucléolo é praticamente uma constante em animais e plantas, ou seja, a maioria das NORs são banda C positivas (Martins-Santos &Tavares

1996, Rodrigues & Collares-Pereira 1996, Venere et al.1997, Souza et al. 2001, Martins-Santos et al. 2005). Porém, tem-se visto que, em alguns casos, a NOR não está evidentemente associada a blocos heterocromáticos e pode ser caracterizada como banda C negativa (Rabová et al. 2001, Fernandes & Martins-Santos 2004). Assim, no presente estudo, foram utilizadas múltiplas técnicas de bandamento visando descrever o polimorfismo intrapopulacional das regiões organizadoras de nucléolo observado em Serrapinnus notomelas do rio Paraná.

Materiais e métodos Foram analisados 9 indivíduos da espécie Serrapinnus notomelas (5 machos, 4 fêmeas) provenientes do rio Paraná, região de Porto Rico. As preparações do material, para análise dos cromossomos mitóticos, foram realizadas utilizando-se células do rim e brânquias, de acordo com a técnica air drying descrita por Bertollo et al. (1978). Esta técnica consiste, basicamente, em tratar o animal com colchicina por quarenta minutos a fim de obter uma suspensão celular, hipotonizada em KCL 0,075M durante vinte minutos e fixada em solução de metanol e ácido acético (3:1). Os cromossomos foram identificados de acordo com os critérios de relação de braços (RB), propostos por Levan et al. (1964). Para caracterizar as regiões organizadoras do nucléolo (NORs) utilizou-se a técnica de impregnação pelo nitrato de prata (Ag-NOR), descrita por Howell & Black (1980) e a hibridação fluorescente in situ (FISH), realizada através de metodologia descrita por Heslop-Harrison et al. (1991) e Cuadrado & Jouve (1994). Para a obtenção da sonda 18S, o DNA genômico foi extraído de acordo com Sambrook et al., 1989; a amplificação da seqüência de interesse, o PCR 18S foi realizado com os primers NS1 e NS8 (White et al., 1990), e a marcação da sonda seguiu a metologia de Nick Translation, seguindo as especificações do kit Bionick (Gibco). A heterocromatina constitutiva foi evidenciada pela técnica de banda C (Sumner 1972).

Resultados O presente estudo confirmou o número diplóide de 52 cromossomos e o mecanismo de determinação cromossômica sexual ZZ/ZW para Serrapinnus notomelas do rio Paraná (Santi-Rampazzo et al., em preparação). A aplicação das técnicas Ag-NOR e FISH em 118 metáfases de 9 indivíduos (5machos e 4 fêmeas), mostrou a presença de 6 padrões diferentes entre os indivíduos analisados (Tabela 1), revelando assim, diferenças intrapopulacionais na distribuição do DNAr na população de S. notomelas do rio Paraná (Figuras 1 e 2). Os padrões III, IV e VI foram representados por 2 indivíduos cada. A figura 3 mostra o diagrama dos seis padrões distintos, sendo a localização da NOR no par 26, com ao menos um dos homólogos AgNOR positivo, comum a todos os indivíduos. O padrão I apresentou 4 marcações para AgNOR: terminal no braço curto de um submetacêntrico maior (CSM), terminal no braço curto de um submetacêntrico menor (CSm), e no braço curto de um par acrocêntrico (BCA); e 5 para FISH, em que foram marcados os mesmos cromossomos além do homólogo BCA. O padrão II mostra 2 a 6 marcações AgNOR: no braço longo de um submetacêntrico maior (LSM), terminal no braço longo de um subtelocêntrico (LST), terminal no braço curto de um dos homólogos do CSm e no braço curto de um dos homólogos do BCA, enquanto que a FISH produziu 7 marcações que diferiu apenas pela presença de marcação nos homólogos do BCA e do CSm.. O padrão III marcou com AgNOR apenas o par BCA, e, na FISH, além deste par, um dos homólogos do LSM foi marcado. O padrão IV mostrou em ambas metodologias somente o par BCA marcado. O padrão V mostrou marcação AgNOR no BCA e intersticial no braço curto de um metacêntrico (IBM) e na FISH além destes marca o LSM e terminal no braço longo do IBM. No padrão VI os cromossomos marcados pela

prata foram: um dos homólogos LSM, um dos BCA e no braço longo de um submeta médio (LSMe) e a FISH marcou além destes os homólogos dos pares LSM e BCA e um outro cromossomo LSMe, não marcado pela AgNOR (Figura 3). Todas as regiões de NOR demonstraram ser heterocromáticas (banda-c positivas) quando submetidas à técnica de banda C (figura 4), portanto, detectou-se também uma variação intrapopulacional na distribuição da heterocromatina constitutiva. Porém, um bloco intersticial no par 13 não relacionado com a NOR foi detectado em todos os indivíduos (figura 4, cabeça de seta).

Tabela 1 Padrões fenotípicos e quantidade de metáfases analisadas pelas técnicas AgNOR e FISH dos espécimes de Serrapinnus notomelas. M=macho, F=fêmea. AgNOR FISH Padrão Espécimes 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Total I 6 (M) 2 14 7 23 II 31(M) 2 1 3 2 1 3 12 III 32(F),33(F) 10 15 25 IV 34(M),49(F) 12 7 19 V 43 (M) 3 9 17 29 VI 47(F),58 (M) 3 1 6 10 Total 9 63 55 118

Figura 1- Metáfases somáticas de S. notomelas. (a), (c), (e) AgNOR; (b), (d), (f) FISH, para os padrões I; II; III. As setas indicam os sítios de DNAr detectados pelas duas técnicas.

Figura 2- Metáfases somáticas de S. notomelas. (a), (c), (e) AgNOR e (b), (d), (f) FISH, para os padrões IV; V; VI. As setas indicam os sítios de DNAr detectados pelas duas técnicas. Cabeças de seta indicam o par 13.

Figura 3- Idiograma dos padrões de distribuição intrapopulacionais dos cístrons ribossomais (em cinza) encontrados na espécie Serrapinnus notomelas.

Figura 4- Metáfases somáticas submetidas à técnica de banda-c. As setas indicam blocos heterocromáticos polimórficos relacionados com as respectivas variações da NOR. (a) Padrão III, (b) Padrão IV, (c) Padrão V e (d) Padrão VI. As cabeças de seta indicam os blocos heterocromáticos detectados no par 13 que não tem relação com a NOR.

Discussão Em estudos citogenéticos do gênero Serrapinnus (Santi-Rampazzo et al. em preparação) foram observados número diplóide 2n=52 para 4 populações de S. notomelas, sendo que três apresentaram AgNOR simples, enquanto que a do rio Paraná apresentou uma variação intrapopulacional que é descrita no presente trabalho. A análise AgNOR revelou que, entre os espécimes de S. notomelas analisados, há uma alta variabilidade interindividual de padrões de NOR ativos. Considerando que este método indica somente as regiões que exibiram atividade na interfase anterior (Miller et al. 1976), estes dados poderiam ser facilmente explicáveis como sendo devido a diferenças de atividade gênica. De acordo com Almeida-Toledo et al. (1996), as NORs usualmente tem uma localização muito constante em espécies de peixes, tendo sido utilizadas como marcadores cromossômicos espécie-específico. Porém, a análise dos indivíduos por FISH, que detecta sítios de DNAr em nível molecular independente de sua atividade gênica, indicou que este heteromorfismo interindividual não estaria relacionado à expressão gênica, visto que as variações foram confirmadas na análise com FISH e seis padrões puderam ser distinguidos. Contudo, dentro dos distintos padrões, também foram observadas variações intraindividuais devido a não expressão de homólogos. A NOR preferencial foi detectada em um par de cromossomos acrocêntricos (par 26-BCA), tendo sido encontrados pelo menos mais seis pares variáveis entre os indivíduos além do BCA, como mostrado no diagrama, correspondentes aos cromossomos CSM, CSm, LSM, LST, IBM, LSMe. Portanto, podemos propor que o polimorfismo encontrado no presente trabalho consiste em variabilidade de sítios adicionais de NOR ocorrendo em adição a um par nucleolar principal. Além disso, este

par tem mostrado inatividade de um dos homólogos nos padrões II e VI. Esses dados são semelhantes aos apresentados por Lourenço et al. (1998), que detectou em Physalaemus petersi (uma espécie de Anuro) uma variação intrapopulacional distinguindo 7 padrões AgNOR, o qual sugere variabilidade dos locais de NOR. Estes dados, no entanto, diferem do presente trabalho em relação à expressão intraindividual da NOR, pois as análises pelo método AgNOR foram correspondentes aos detectados nos experimentos com FISH. Variações de expressão de NOR detectadas pela técnica de prata são freqüentes e têm sido observadas em Chondrostoma lusitanicum (Rodrigues & Collares-Pereira 1996); Astyanax altiparanae (Pacheco et al. 2001); A. scabripinnis (Mizoguchi & Martins-Santos 1998); Cobitis vardarensis (Rabová et al. 2001); Poecilia latipunctata (Galetti Jr. & Rasch 1993), no gênero Diplodus (Vitturi et al. 1996) entre outros. Almeida-Toledo et al. (1996) utilizando-se de FISH e prata, detectou diferenças interpopulacionais em Eigenmannia sp.1 do rio Mogi-Guaçú, e aponta como principais fatores pequenas translocações ou transposições. Contudo, variações intrapopulacionais analisadas por estes métodos indicando transposições de NOR são menos freqüentes em peixes, sugeridas por Galetti et al. (1995) na análise de um entre dez indivíduos de Leporinus friderici. Os autores propõem que estes cístrons sejam altamente suscetíveis à modificações estruturais pré-pós-zigóticas, como resultados de crossing over desigual, duplicações regionais, transposições e outros rearranjos. Todavia, em anuros, este parece ser um fenômeno comum descrito para várias espécies (Bufo terrestris, Foote et al. 1991; Physalaemus petersi, Lourenço et al. 1998; Hyla nana e Hyla sanborni, Medeiros et al. 2003; entre outros). Estes autores, utilizando-se dos mesmos métodos do presente trabalho, atribuem estes resultados a vários fatores, tais como amplificação de orfan cístrons de rdna, erros de reinserção

durante amplificação extracromossomal de cístrons ribossomais, além da presença de elementos genéticos móveis, translocações e inversões envolvendo segmentos cromossômicos contendo NORs como já citado anteriormente. A observação de que nos distintos padrões encontramos sítios adicionais de NOR em diferentes tipos cromossômicos, coincidentes pelas duas técnicas, aliadas ao fato de não terem sido detectadas alterações na macroestrutura dos cromossomos que apresentaram inserção, nos leva a propor que estes sítios podem corresponder a transposição de cópias dos cístrons de rdna, fixos no par 26, para diferentes locais no genoma. Isto pode ser corroborado pela existência de populações desta espécie com AgNOR simples no par 26 (Santi-Rampazzo et al. em preparação), indicando que na população do rio Paraná este gene parece estar se movendo, provavelmente devido a mecanismos de transposase ou via reinserção em sítios que mostram seqüências homólogas com o inserto. Este mecanismo também é proposto por Foote et al. (1991) em Bufo terrestris. Embora consideremos que o mecanismo de transposição por elementos móveis, seja o mais provável não podemos descartar a hipótese da ocorrência de outros tipos de rearranjos, tais como os observados em Anuros (Foote et al. 1991, Lourenço et al. 1998, Medeiros et al. 2003) Estes resultados acompanham ainda a coincidência de variação de banda C com os diferentes tipos de padrões estabelecidos que ajudaram a identificar as modificações ocorridas. Possivelmente a heterocromatina presente no par 26, flanqueando o genes rdna acompanhe estes genes por qualquer que seja o mecanismo envolvido nesta variabilidade ou, ainda como sugerido por Almeida-Toledo et al. (1996), todos os sítios de NOR associados com heterocromatina tem uma tendência a formar conexões intra e intercromossomos, facilitando as trocas de seqüências. Os resultados do presente

trabalho diferem dos observados por Foote et al. (1991), nos quais o padrão de banda C não acompanha as diferenças observadas para AgNOR e FISH. Marcações de banda C não coincidentes com as de NOR e que, portanto, determinam o padrão da espécie, ocorrem na região pericentromérica da maioria dos cromossomos. Dois pares de cromossomos apresentam marcações mais conspícuas: um com uma marcação intersticial proximal ao centrômero no braço curto do 2º par e o outro com uma marcação intersticial proximal ao centrômero no braço longo do 13º par. Este resultado pode ser observado para as populações de S. notomelas do rio Pântano, rio Araquá e córrego Cascatinha (Santi-Rampazzo et al. em preparação). Devido à presença da banda C no 13º par foi possível identificar um dos sítios de localização da NOR no padrão VI e esta marcação só ocorre em um dos homólogos. Embora alguns dos mecanismos propostos não estejam totalmente esclarecidos, o presente estudo, através da combinação de diferentes metodologias (AgNOR, FISH e Banda C) e análise da freqüência das marcações em diferentes indivíduos, permitiu uma melhor interpretação do polimorfismo de NOR observados na população de S. notomelas do rio Paraná. Desta forma, pela não utilização da técnica de hibridação in situ; a variabilidade, muitas vezes atribuída à inativação gênica, pode tornar a hipótese do mecanismo de transposição por elementos móveis muito mais comum do que tem sido observado. Agradecimentos Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte financeiro.

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