FUNDAMENTOS DE CITOMETRIA DE FLUXO Dayane Alves Costa Priscilla Ramos Costa Programa de Alergia e Imunopatologia- LIM 6 USP
CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA DE FLUXO CÉLULA MEDIDA MOVIMENTO Caracterização de célula em movimento Primeiro Citômetro 197- Henzenberg
O QUE É A CITOMETRIA DE FLUXO? É uma tecnologia que permite a medida simultânea de múltiplas características de uma única célula. FACS Tamanho relativo Complexidade interna Intensidade de fluorescência
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO LABORATÓRIO CLÍNICO Análise de subpopulação linfocitária; Acompanhamento de pacientes HIV+ Imunofenotipagem de células tumorais (leucemias e linfomas); Análise de DNA (Ciclo celular e ploidia de tumor); Contagem de reticulócitos; Quantificação de células progenitoras stem cell ; Análises de moléculas de sinalização intracelular; Fatores de transcrição
CITOMETRIA DE FLUXO Tipos de Amostras: Células; bactérias; Cromossomos; Beads BD Biosciences
CITOMETRIA DE FLUXO Tamanho da Amostra:,5 mm- 14mm BD Biosciences
Vantagens Mede vários parâmetros em uma única célula; Muitas células analisadas simultaneamente; Variedade de anticorpos específicos; Analisar simultaneamente antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares ;» ~32 Anticorpos Monoclonais- proteínas identificadas (moléculas de superfície, citocinas, moléculas de sinalização intracelular e Intranuclear).
CITOMETRIA DE FLUXO CD- Cluster of differentiation: Moléculas antígenos que se expressam na superfície das células específicas do sistema hematopoiético que as identificam e têm funções diversas.
COMO SÃO DETECTADAS AS CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA? Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Detector de dispersão de luz em ângulo reto Complexidade celular SSC (Side Scatter) Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Clontech Discovery Labware Immunocytometry Systems Pharmingen BD Biosciences
DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Laser Diode (vermelho) a 633 nm, 2º LASER Detectores de fluorescência: FL1 FL2 FL3
DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Laser Diode (vermelho) a 633 nm, 2º LASER Detectores de fluorescência: FL1 FL2 FL3
FLUORESCÊNCIA É o comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos após atingir a absorção máxima da luz do laser. l = 488 nm O H Fluoresceína O l = 53 nm Luz Incidente de maior energía Fluorocromo CO 2 H Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda
Slide da Karina
ESPECTRO DE EMISSÃO 1 8 6 PI FITC: ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEÍNA PE: FICOERITRINA 4 FITC PE 2 APC PerCP 4 45 5 55 6 65 7 PerCP: PERIDININ CLOROPHIL PROTEIN APC: ALOFICOCIANINA PI: IODETO DE PROPÍDEO Comprimento de onda (nm)
COMO SÃO DETECTADAS AS CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA?
O CITÔMETRO NECESSITA DE UM COMBINADO DE SISTEMAS
SISTEMA
FLUXO DA AMOSTRA Aumentando a pressão da amostra aumenta a velocidade do fluxo, permitindo que mais partículas passem através da célula de fluxo, NÃO PERDE a qualidade da detecção mas Aumenta o numero de eventos eliminados por causa da sobreposição. Uma VELOCIDADE DE FLUXO MENOR é geralmente usada para aplicações onde uma RESOLUÇÃO MAIOR É CRÍTICA, como nos estudos quantitativos e para medidas de DNA. Uma ALTA VELOCIDADE DO FLUXO é geralmente usada para medidas qualitativas, tais como imunofenotipagem, onde os dados requerem menor resolução, mas são adquiridos mais rapidamente.
FLUXO DA AMOSTRA
SISTEMA
COMO SÃO DETECTADAS AS CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA? Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm BD Biosciences
SISTEMA
DETECÇÃO DA FLUORESCÊCIA Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm Laser Diode (vermelho) a 633 nm, 2º LASER Detectores de fluorescência: FL1 FL2 FL3
CD38 Ativação Células T CD4+ e CD8+ 25K SSC-A PE FSC-H SSC-A 1 5 1 4 1 3 99.9 25K 2K 15K 1K 25K 2K 15K 1K 25K 2K 15K 1K 94.2 2K 15K 1K 53.8 5K 5K 56.1 5K 5K 5 1 15 Time 95.9 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A Live/dead 1 2 1 3 1 4 1 5 1 2 1 3 1 4 1 5 <PE-Texas Red-A>: CD3 CD3 1 5 42.4.415 1 5 CD8+ 14.6 3.1 1 5 CD4+ 31.9 4.44 25K <AmCyan-A>: CD8 1 4 1 3 1 2 CD8+ 4.4 CD4+ 52.8 1 2 1 3 1 4 1 5 <Pacific Blue-A>: CD4 <PerCP-Cy5-5-A>: CD38 1 4 1 3 1 2 37.6 17.7 1 2 1 3 1 4 1 5 <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR HLA-DR <PerCP-Cy5-5-A>: CD38 1 4 1 3 1 2 57.4 6.24 1 2 1 3 1 4 1 5 <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR 2K 15K 1K 5K 3.15 1 2 1 3 1 4 1 5 CCR5
IMUNOFENOTIPAGEM Células Exemplos anti-cd3 FITC anti-cd4 PE anti-cd8 PerCP anti-il-4 APC + Incubar Lavar Análise no Citômetro Células marcadas Anticorpos
IMUNOFENOTIPAGEM Quanto maior o número de marcadores de superfície, maior a intensidade de fluorescência + + Intensidade de fluorescência BD Biosciences
Slide da Karina
IMUNOFENOTIPAGEM Quanto maior o número de marcadores de superfície, maior a intensidade de fluorescência BD Biosciences
Caracterização de células do Sistema Imune Detecção de marcadores de superfície de células; Detecção de fatores intracelulares; Detecção de fatores detectados pelas células; Detecção do conteúdo de DNA.
IMUNOFENOTIPAGEM IDENTIFICAÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES PELOS SEUS MARCADORES DE SUPERFÍCIE.
IMUNOFENOPTIPAGEM SANGUE TOTAL PBMC Slide da Karina
Marcação INTRACELULAR Slide da Karina
Ontogenia de células T CD27 SSC-A CD27 CD4+ 25K 2K 15K 1K 5K 73.4 22.1 1 2 1 3 1 4 1 5 <FITC-A>: CD45RA CD45RA <PE-A>: CD27 1 5 1 4 1 3 1 2 1 5 73.9 6 CD45RA+ 2.29 23.1.171 5 96.2 1 1 2 1 3 1 4 1 5 <PE-Cy7-A>: CCR7 2.91 SSC-A 25K 2K 15K 1K 5K CD8+ 78.2 2.3 1 2 1 3 1 4 1 5 <FITC-A>: CD45RA CD45RA <PE-A>: CD27 1 5 1 4 1 3 1 2 1 5 74.8 6 22.8 5 CD45RA+ 1 2.29.753 1 2 1 3 1 4 1 5 <PE-Cy7-A>: CCR7 CD45RA- 81.7 CD45RA-.425 <PE-A>: CD27 1 4 1 3 3 2 <PE-A>: CD27 1 4 1 3 3 2 1 2.868 1 2 1 3 1 4 1 5 <PE-Cy7-A>: CCR7 CCR7 Naive/Memória 1- Naïve 4.431 2-Memória Central 3-Memória transicional 4-Memória Efetora 1 2 17.6 4.759 1 2 1 3 1 4 1 5 <PE-Cy7-A>: CCR7 CCR7 5-Efetora Terminal 6-?? CD45RA + - - - + + CD27 + + + - - + CCR7 + + - - - -
1 5 99.2 CD4 CD25 CD4 CD25 CD127 25K 25K 25K 25K 1 4 2K 2K 2K 2K <PE-A>: Foxp3 1 3 1 2 5 1 15 Time FSC-H 15K 1K 5K 95.9 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A SSC-A 15K 1K 5K 69 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A SSC-A 15K 1K 5K live 96.4 1 2 1 3 1 4 1 5 <Indo-1 (Violet)-A>: UV SSC-A 15K 1K 5K 76 CD3+ 1 2 1 3 1 4 1 5 <PE-Texas Red-A>: CD3 Células T CD4+ reguladoras (Tregs) 1 5 <PE-Cy7-A>: CD25 1 4 1 3.867 CD25high 68 5 T reg supressor 46.7 1 2 T regs CD4 1 2 1 3 1 4 1 5 <Pacific Blue-A>: CD4 FoxP3 CD39 Células T CD4+ indutoras (Tind) 1 5 1 4 53.6 1 5 4.89 2.2 1 4 7.77 1 3 1 3 1 2 1 2 1 2 1 3 1 4 1 5 CD3 9.3 2.57 1 2 1 3 1 4 1 5 FoxP3 CD39
2 4 6 8 1 2 1 3 1 4 1 5 <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR Ativação Células T CD4+ e CD8+ 1 5 1 25K 93.2 25K 25K 1 4 2K 2K 2K <PE-A>: CD27 1 3 FSC-H 15K 1K FSC-A 15K 1K 95.7 SSC-A 15K 1K 85.5 1 2 5K 5K 5K Time 5K 1K 15K 2K 25K FSC-A 1 2 1 3 1 4 1 5 <AmCyan-A>: LIVE/DEAD 1 3 1 4 1 5 <PE-Texas Red-A>: CD3 1 5 29.5 5.26 1 5 6.2.128 <PerCP-Cy5-5-A>: CD38 1 4 1 3 1 2 <APC-A>: CD8 1 4 1 3 1 5 61.7 3.57 1 2 1 3 1 4 1 5 <Alexa Fluor 7-A>: HLA-DR 35.2 1.54 1 2 1.6 29.1 1 2 1 3 1 4 1 5 <Pacific Blue-A>: CD 4 <PerCP-Cy5-5-A>: CD38 1 4 1 3 1 2 61 2.33
Prof. Dr. Esper G. Kallas Nádila Millan Todos os colaboradores AGRADECIMENTOS