Produção de Sementes (LPV-5705) Pós-graduação - Fitotecnia Primeiro Semestre de 2014 ANÁLISE DE IMAGENS EM TECNOLOGIA DE SEMENTES Francisco Guilhien Gomes Junior Tecnologia de Sementes Depto de Produção Vegetal USP/ESALQ 11/05/2012 13h10 - Atualizado em 11/05/2012 14h14 Satélite russo registra maior foto já feita da Terra, com 121 megapixels Cada pixel da imagem corresponde a 1 km de distância PIXEL, RESOLUÇÃO E TAMANHO DA IMAGEM Pixel: ( Pictures Elements ) É o menor ponto que forma uma imagem Tamanho O tamanho de uma imagem digital está definido no número de linhas e colunas que a forma Resolução Capacidade que um sistema de captura/reprodução de imagens tem para reproduzir detalhes A resolução de uma imagem é o número de pixels impressos ou exibidos por unidade de medida Imagem digital Representação de uma imagem bidimensional usando números binários codificados de modo a permitir seu armazenamento, transferência, impressão ou reprodução, e seu processamento por meios eletrônicos Tipos de imagens digitais Imagem vetorial CDR, AI e EPS y Imagem bitmap TIFF, JPEG, PNG, GIF, BMP e PSD x Pixel = f(x,y) Cada pixel tem um valor independente de cor Imagens digitais: vetorial e bitmap As imagens vetoriais são geradas a partir de linhas (vetores) e pontos, e são definidas por coordenadas e fórmulas matemáticas A imagem vetorial pode ser redimensionada sem perda de qualidade Imagem Vetorial Imagem Bitmap As imagens bitmap são geradas a partir de uma malha quadriculada, onde a menor unidade é chamada pixel A resolução de uma imagem bitmap deve ser definida antes da impressão e o seu redimensionamento pode causar perda de qualidade Resolução de imagem digital Propriedades das cores Escala de cinzas Teixeira (2004) Esquerda: semente de milho captada em imagem de 100dpi, 256 tons de cinza e 8bits. Direita: ampliada 7x em tela (700%) RGB - Modelo aditivo CMYK - Modelo subtrativo Fonte: Google 1
Bits nos modelos RGB e escala de cinzas Imagem digital x Níveis de cinza Modelo RGB 8 bits y x Pixel = f(x,y) 2 8 x 2 8 x 2 8 16,7 milhões de cores 256 8 bits 128 7 bits 64 6 bits 32 5 bits IMAGEM BINÁRIA Escala de cinzas 8 bits y Pixel = f(x,y) 2 8 256 níveis 16 4 bits 8 3 bits 4 2 bits 2 1 bit Marques Filho e Vieira Neto (1999) Análise de imagens de sementes e de plântulas Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes Microtomografia computadorizada de raios X Tomografia por ressonância magnética Câmera multiespectral Fluorescência de clorofila Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes Avaliação de características físicas e morfológicas de sementes e de plântulas Descritores de cor, forma e tamanho das sementes Avaliação do vigor de sementes com base em imagens digitais de plântulas TESTE DE RAIOS X Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes Descoberta dos raios X Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen (1845-1923) 8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X Fonte: google 2
Características dos raios X Como são gerados os raios X? Elétrons acelerados emitidos pelo cátodo se chocam com um alvo metálico (ânodo de tungstênio) Ao atingir o alvo, os elétrons desaceleram e perdem a energia cinética, cedendo energia aos elétrons do ânodo, gerando energia térmica e radiação Fonte: google : geração O comprimento de onda gerado depende do nível de energia Alto nível de energia: ondas curtas Mais apropriados para objetos grandes e, ou densos Possuem alta absorção e resolução e causam baixo dano aos tecidos Baixo nível de energia: ondas longas São apropriados para objetos pequenos Exemplo: sementes Possuem baixa absorção e resolução e causam alto dano aos tecidos Fatores que afetam o nível de absorção dos raios X pela semente Espessura e densidade dos tecidos Composição da semente Proteínas, carboidratos e lipídios: diferentes graus de hidrofobicidade O teor de água da semente influencia a densidade óptica Comprimento de onda da radiação ionizante de menor comprimento de onda => maior poder de penetração Imagens radiográficas de sementes de Tucumã (Astrocaryum aculeatum) apresentando diferentes graus de umidade Viabilidade da utilização de raios X em sementes A pequena dose de radiação usada durante o teste não exerce influência negativa sobre a germinação (não provoca mutação) CAUSA EFEITO Não inviabiliza a semente (método não destrutivo): relações de causas e efeitos 35% de água 15% de água Radiografia de semente de milho doce Gomes-Junior e Cicero (2012) 3
para análise de sementes para análise de sementes Histórico Primeiro trabalho foi realizado por Lundström em 1903: sementes de coníferas Início da década de 1950 na Suécia: avaliação da qualidade de sementes de Pinus sylvestris L. (Simak e Gustafsson,1953) Pinus sylvestris L. Histórico Primeiro trabalho brasileiro foi realizado por Silvio M. Cicero em 1998: avaliação de danos mecânicos em sementes de milho Setembro de 2001: inauguração do Laboratório de Análise de Imagens do Departamento de Produção Vegetal da USP/Esalq, financiado pela FAPESP (primeiro laboratório para avaliação de sementes utilizando raios X no Brasil) Como interpretar os resultados? Como interpretar os resultados? Conhecer a morfologia interna Conhecer o princípio do teste Como interpretar os resultados? Como interpretar os resultados? tegumento Plúmula Trinca 1 Trinca 2 Trinca 3 radícula cotilédones Raízes seminais hipocótilo Radícula Crotalaria juncea L. plúmula 1 mm 4
Aplicações em Tecnologia de Sementes Detecção de anormalidades em embriões Determinação do estádio de desenvolvimento das sementes Estudos de alterações fisiológicas durante os processos de maturação, secagem, germinação ou condicionamento fisiológico Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores adversos em pré e pós-colheita Seleção de sementes cheias Base para utilização de programas computadorizados na avaliação de alterações da morfologia interna Detecção de anormalidades em embriões Tecoma stans Embrião deformado Embrião com pequeno defeito Embrião sem defeito Socolowski e Cicero (2008) PA PA PN Identificação de injúrias mecânicas Plântula anormal milho doce Identificação de injúrias por umidade Injúrias severas no eixo embrionário Gomes-Junior e Cicero (2012) soja Plântula anormal soja Flor et al. (2004) Injúrias severas na região dos cotilédones Plântula anormal Forti et al. (2010) Identificação de injúrias causadas por secagem Identificação de injúrias causadas por insetos Semente de arroz: secagem a 50 o C Caruncho em feijão-caupi Melo et al. (2010) Percevejo em feijão Menezes et al. (2012) Forti et al. (2008) 5
Seleção de sementes cheias Sementes de mamona Base para utilização de programas computadorizados na avaliação de alterações da morfologia interna Semente de algodão Semente de Xylopia aromatica Totalmente formada Parcialmente formada Não formada (Carvalho et al., 2010) Marcos-Filho et al. (2010) Sokolowski et al. (2011) Área do embrião = 57% Espaço livre interno total = 1,28 mm 2 Detecção de grãos de trigo germinados com base na densidade de pixels no controle de qualidade de sementes Posicionamento da semente Obtenção da imagem radiográfica Análise e processamento dos dados Classificação 1 Moega de entrada de sementes 2 Tubo de raios X 3 Ampliação da imagem 4 Interface de usuário 5 Unidade de classificação Fonte: google (adaptado) Neethirajan et al. (2007) Tomografia computadorizada de raios X (TC) Microtomografia de raios X É uma técnica que permite a visualização de seções transversais (cortes internos) de um objeto de forma não destrutiva A captura é feita através de uma série de pequenas rotações As informações de atenuação da radiação que atravessa o objeto são gravadas para um plano de interesse Um algoritmo processa os dados para formar uma imagem 2D A combinação dessas imagens pode gerar a visualização em 3D Modelo 3D Tubo de raios X Intensificador de imagem Amostra Sistema de circulação Análise das imagens Determinação de parâmetros físicos Câmera CCD Projeções Imagem 3D Algoritmo de reconstrução Seções 6
Microtomografia computadorizada de raios X (microtc) Microtomografia de raios X Posicionamento da amostra: Diferença em relação à TC consiste no grau de resolução da imagem e no tamanho do objeto a ser analisado Apresenta resoluções mínimas de 50 microns, favorecendo a visualização e caracterização da estrutura interna de objetos pequenos, como sementes Microtomógrafo SkyScan 1172: Embrapa Instrumentação Microtomografia computadorizada de raios X Microtomografia computadorizada de raios X Semente de milho 2000 seções transversais Seção coronal SkyScan 1172 Passo de rotação: 0,2 Rotação total: 180 Tamanho do pixel: 6,6µm Seção transversal Seção sagital Seção 572 Seção 690 Imagem radiográfica Faxitron X-ray MX 20 DC 12 digital Imagem detalhada do embrião Tomografia por ressonância magnética A tomografia por ressonância magnética utiliza fortíssimos campos magnéticos e ondas de rádio para formar imagens de uma amostra São utilizados os pulsos de radiofrequência direcionados somente ao hidrogênio contido na amostra O excesso de energia liberado pelos prótons de hidrogênio quando o pulso de radiofrequência é desligado emite um sinal de uma bobina para o computador Por meio de cálculos matemáticos os sinais são transformados em uma imagem 7
Absorbância Resposta relativa 20/03/2014 Imagem por ressonância magnética Monitoramento da secagem de sementes de cevada Imagem por ressonância magnética Monitoramento da hidratação de sementes de soja 5 min 2 h 5 min 5 h 5 min 6 h 5 min Seefeldt et al. (2007) 8 h 5 min 11 h 5 min 12 h 5 min 17 h 5 min Koizumi et al. (2008) Câmera multiespectral Imagem colorida tradicional Imagem multiespectral: imagens de um mesmo objeto, tomadas com diferentes comprimentos de ondas eletromagnéticas (luz visível, infravermelha, ultravioleta, raios X ou qualquer outra faixa do espectro) Utiliza três filtros para as bandas Red, Green e Blue Limite do Infravermelho Comprimento de onda (nm) Imagem RGB Imagem multiespectral Imagem colorida tradicional ultravioleta infravermelho Clorofila b Clorofila a Clorofilas a e b apresentam quase o mesmo sinal RGB Comprimento de onda (nm) 8
Absorbância Intensidade média Número de pixels Número de pixels 20/03/2014 Imagem multiespectral Identificação de fungos em sementes de espinafre Clorofila b Clorofila a Em comprimentos de onda específicos as clorofilas a e b apresentam diferentes sinais e podem sem identificadas Comprimento de onda (nm) Olesen et al. (2011) Identificação de fungos em sementes de espinafre Alternaria Cladosporium Fusarium Stemphylium Sem infecção Verticilium Identificação de fungos em sementes de espinafre Alternaria spp. Cladosporium spp. Fusarium spp. Verticillium spp. Stemphylium spp. Sem infecção Comprimento de onda (nm) Olesen et al. (2011) Intensidade do pixel Olesen et al. (2011) Câmera multiespectral no controle de qualidade de sementes Fluorescência de clorofila Entrada das sementes Esteira móvel Espectômetro e unidade de iluminação Classificação: Sementes maduras e sadias Sementes imaturas Sementes infectadas por fungos A clorofila fluoresce quando excitada em um determinado comprimento de onda Fonte: google (adaptado) Jalink et al. (1998) 1. Um laser ou uma luz de LED excita a clorofila 2. Um filtro de largura de banda estreita filtra a fluorescência 3. A clorofila da semente é determinada 9
Média de FC/pixel x1000 (valor escala de cinza) 20/03/2014 Fluorescência de clorofila em semente de pimenta durante a germinação Fluorescência de clorofila em sementes de soja 50 Sinal de fluorescência, baixo para alto: preto vermelho laranja amarelo verde 40 30 20 68h 20min 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 http://www.phenovation.com Tempo (h) Lote de baixo vigor Ocorrência de sementes esverdeadas http://www.phenovation.com Lote de alto vigor Avaliação de características físicas e morfológicas de sementes e de plântulas Sementes Plântulas Escâner de mesa Câmera CCD Índices RGB como indicadores da viabilidade de sementes Inicial Após envelhecimento Computador e programa para análise de imagens Classificação do vigor de lotes de sementes Imagens em Time-lapse Descritores de cor, forma e tamanho das sementes Construção da imagem da semente Curva de embebição (monitoramento) Taxa de crescimento da raiz Índices médios RGB Descritores biomorfológicos Adaptado de Dell Aquila (2006) Escurecimento do tegumento de sementes de lentilha após o envelhecimento (51 dias a 40 C e teor de água de 14,4%) Dell Aquila (2009) Índices médios RGB como indicadores da viabilidade de sementes Índices médios RGB como indicadores da viabilidade de sementes Onobrychis viciifolia Dell Aquila (2006) Behtari et al. (2014) 10
Índices médios RGB no monitoramento da taxa de crescimento da raiz Semente de rabanete Avaliação automatizada do vigor de sementes baseada em imagens digitais de plântulas Biossíntese incompleta Membranas incompletas MATURIDADE FISIOLÓGICA Degeneração das membranas Redução das atividades respiratórias e biossintéticas Germinação lenta Redução do potencial de conservação Menor taxa de crescimento e de desenvolvimento Menor uniformidade de desempenho Maior sensibilidade a adversidades Redução da emergência de plântulas em campo Aberrações morfológicas (plântulas anormais) Método direto para a identificação de sementes com alto potencial de desempenho Armazenamento das imagens de plântulas Resultados rápidos, objetivos e precisos Perda do poder germinativo Dell Aquila (2009) MORTE Adaptado de Delouche e Baskin (1973) Processamento de uma imagem digital de plântula de milho 256 tons de cinza (8 bits) 300 dpi Imagem binária Esqueleto em imagem binária Algoritmo contador de pixels Cn = média aritmética do comprimento (cm) n = número de plântulas medidas em "pixels" sob resolução (r) dada em dpi. Teixeira et al. (2006) Avaliação automatizada do vigor de sementes alface Hipocótilo Raiz soja Baalbaki et al. (2009) Marcos-Filho et al. (2009) Programas Seed Vigor Imaging System (SVIS) Sistema de Análise de Sementes (SAS) Análise Automatizada do Vigor de Sementes (Vigor-S) Determinação de índices (escala de 0 a 1000) Crescimento Uniformidade de desenvolvimento Vigor Determinação do comprimento médio das plântulas Avaliação automatizada do vigor de sementes de feijão (programa SVIS) Baixo vigor Alto vigor SVIS: índices de vigor para soja (plântulas com três dias de idade) Proposta da Ohio Seed Improvement Association Alto vigor: > 500 Vigor médio: 200-500 Baixo vigor: < 200 Proposta da Ohio State University Comp. plântula em azul: 4,5 cm Índice de Crescimento: 435 Índice de Uniformidade: 925 Índice de Vigor: 582 Gomes-Junior et al. (2014) Comp. plântula em azul: 7,8 cm Índice de Crescimento: 837 Índice de Uniformidade: 947 Índice de Vigor: 870 Vigor excepcional: 800-1000 Alto vigor: 600-799 Bom vigor: 400-599 Baixo vigor: 200-399 Grãos: < 200 11
Avaliação automatizada do vigor de sementes de melão: comparação com métodos tradicionais Cultivar Nitro Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU 6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab 7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c 8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc 9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a 10 99 a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab C.V. (%) 5,5 5,5 6,0 5,3 3,6 2,9 * Comparação na coluna (teste de Tukey: p 0,05) Índice de Vigor Índice de Uniformidade Marcos Filho et al. (2006) Cuidados e limitações Temperatura no germinador Parâmetros SVIS Milho Temperatura C Soja 24 C 25 C 26 C 24 C 25 C 26 C Crescimento 531 B 459 B 734 A 612 B 573 B 731 A Uniformidade 832 B 861 A 859 A 867 A 872 A 870 A Vigor 621 B 579 B 765 A 739 B 722 B 800 A Otoni e McDonald et al. (2005) Uniformidade de umedecimento do substrato Horário de instalação do teste de germinação e aquisição das imagens Comparação entre cultivares com diferentes taxas de crescimento Sementes dormentes 12