Bolsista de iniciação Científica PIBIC/EEL/USP, discente do curso de Engenharia Bioquímica

TRATAMENTO DO RESÍDUO DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL A PARTIR DE ÓLEO DE ALGODÃO PARA O CULTIVO DE Bacillus thuringiensis var. israelensis VISANDO A PRODUÇÃO DE INSETICIDA BIOLÓGICO 1 Alan M. Fernandes, 2 Arnaldo Márcio R. Prata 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/EEL/USP, discente do curso de Engenharia Bioquímica 2 Professor da Escola de Engenharia de Lorena da USP 1,2 Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo. C. P.: 116. Lorena - SP, CEP 12602-810 e-mail: 1 alanmfernandes@ig.com.br, 2 armprata@debiq.eel.usp.br RESUMO O aproveitamento do glicerol é objeto de pesquisas devido à sua disponibilidade como subproduto da fabricação do biodiesel. No entanto, a glicerina bruta contém impurezas e necessita de um tratamento adequado. Neste trabalho propõe-se empregar diferentes tratamentos para o resíduo da produção de biodiesel com óleo de algodão, para utilizá-lo como substrato no cultivo de Bacillus thuringiensis var. israelensis, visando a produção de bioinseticida. Esta bactéria produz toxinas eficientes contra larvas de dípteros, como o Aedes aegypti. Foram empregados tratamentos de acidificação da glicerina bruta com o H 2 SO 4 e H 3 PO 4 a diferentes valores de ph, seguida de decantação. Também foi empregado o tratamento com carvão ativo, seguido de filtração. Todos os resíduos tratados foram submetidos a ensaios fermentativos com a bactéria para se avaliar a toxicidade do meio fermentado. Os resíduos tratados por acidificação se revelaram satisfatórios em relação ao crescimento e ao consumo de substrato. Porém, o mesmo não aconteceu com o tratamento com carvão ativo. A maior atividade larvicida foi obtida quando utilizou-se resíduo tratado com H 3 PO 4 a ph 6, que matou 40% das larvas de Aedes aegypti em menos de 24 horas. Assim, pode-se considerar o glicerol em estudo como promissor para a produção de bioinseticida. Palavras-Chave: tratamento, glicerol, bioinseticida, Bacillus thuringiensis var. israelensis INTRODUÇÃO Glicerol como subproduto do biodiesel O biodiesel é um combustível alternativo que é obtido pela transesterificação de óleos vegetais e gorduras animais com metanol ou etanol. A Figura 1 mostra o fluxograma da produção do biodiesel. Após a transesterificação, obtém-se uma massa constituída de duas fases, que são separadas por decantação ou centrifugação. A fase mais densa é a glicerina bruta, impregnada dos excessos de álcool, de água e de impurezas (Knothe; Gerpen, 2006), dentre as quais podem estar NaOH, ácidos graxos livres, sais de ácidos graxos, ésteres, compostos de enxofre, proteínas e minerais (Thompson; He, 2006). Pela presença dessas impurezas, a glicerina bruta possui baixo valor agregado, sendo necessário implantar um processo de purificação. Rehman et al. (2008) purificou a glicerina bruta empregando acidificações com ácido fosfórico a diferentes valores de ph, para a precipitação de sais de ácidos graxos, seguidas de decantação e posterior aquecimento a 70ºC por 4 horas para remoção do metanol residual. Figura 1 Fluxograma do processo de produção de biodiesel gerando glicerol como subproduto (Knothe; Gerpen, 2006) VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

Bacillus thuringiensis var. israelensis Bacillus thuringiensis é uma bacteria do solo, gram-positiva, em forma de bastonete, anaeróbica facultativa, formadora de um cristal protéico adjacente ao esporo, responsável pela ação tóxica contra insetos susceptíveis. (Stahly et al. 1990). Em situações desfavoráveis, como na ausência de nutrientes ou acúmulo de metabólitos indesejáveis, Bacillus thuringiensis entra em processo de esporulação (Paramatha, 2000). O ciclo completo do crescimento desta bactéria começa com a germinação do esporo e, na fase vegetativa, a reprodução é por fissão binária, iniciando em seguida novo ciclo de esporulação. (Xiaoyan et al. 2005). A Figura 2 apresenta a imagem de uma observação microscópica de um cultivo da bactéria, evidenciando uma célula vegetativa, um esporo e um cristal protéico adjacente. O cristal protéico é composto por quatro principais endotoxinas denominadas Cry4A, Cry4B, Cry11A e Cyt1A. Essas proteínas são chamadas coletivamente de δ-endotoxinas, proteínas Cry ou proteínas inseticidas (Crickmore et al. 1998). Nenhuma das frações exerce, individualmente, um efeito tóxico correspondente àquele demonstrado pelo conjunto de toxinas. Figura 2 Fases do ciclo de vida de Bacillus thuringiensis: células vegetativas, esporos e o cristal protéico adjacente ao esporo. A ação tóxica dessas proteínas é específica contra larvas e não exerce qualquer atividade sobre seres humanos e outros animais (Aronson; Shai, 2001). O cristal protéico é primeiramente ingerido pela larva. O ph do seu trato intestinal, assim como a ação de proteases, proporciona a solubilização do cristal e a consequente liberação das toxinas na sua forma ativa (Glazer; Nikaido, 1995). Estas ligam-se a receptores específicos, formando poros na membrana do epitélio intestinal e desestabilizam os gradientes osmótico e iônico (Knowles, 1994). Ocorre em seguida a germinação de esporos de Bacillus thuringiensis e a multiplicação de células vegetativas. A bactéria invade os tecidos larvais, a alimentação é interrompida e a larva morre (Aronson; Shai, 2001). A Figura 3 mostra o processo de solubilização e ligação das endotoxinas com os recptores do epitélio. Figura 3 Solubilização do cristal protéico no intestino da larva, ligação das endotoxinas aos receptores específicos do epitélio e formação de poro na membrana epitelial. Bacillus thuringiensis var. israelensis vem sendo usado desde 1980 para o controle de mosquitos vetores de doenças (Maldonado- Blanco et al. 2003). As proteínas desta bactéria apresentam os melhores resultados no combate às larvas de dípteros de importância sanitária, especialmente culicídeos dos gêneros Aedes, Culex e Anopheles, insetos vetores de doenças como a dengue, a elefantíase e a malária, respectivamente, e simulídeos do gênero Simulium, transmissores de vírus, protozoários e filárias (Aronson; Shai, 2001). Os meios de cultivo para Bacillus thuringiensis var. israelensis devem conter em sua composição uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais minerais, em concentrações adequadas à obtenção de elevadas concentrações celulares, altas taxas de esporulação e de síntese de δ-endotoxinas. (Bernhard; Utz, 1993) MATERIAIS E MÉTODOS Tratamento da glicerina bruta A glicerina bruta foi fornecida pela empresa BIOVERDE Indústria e Comércio de Biocombistíveis LTDA, proveniente da produção de diodiesel a partir de óleo de algodão, com hidróxido de potássio como catalisador. Foram empregados diferentes tratamentos para purificação do glicerol neste resíduo. Tratamento com ácido fosfórico: Três porções da glicerina foram acidificadas com H 3 PO 4 até 4, 5 e 6, conforme proposto por Rehman et al. (2008). A acidificação promove a precipitação de sais de ácidos graxos e para separá-los, as porções foram submetidas a decantação por 24 horas. Tratamento com ácido sulfúrico: O procedimento foi similar ao tratamento com ácido fosfórico. Entretanto foram utilizadas duas

porções da glicerina, que foram acidificadas com H 2 SO 4 até ph 2 e 1, uma vez que não houve precipitação de sais em ph maior do que 2. O restante do procedimento foi idêntico ao anterior. Tratamento com carvão ativo: Foi feita uma diluição da glicerina bruta na proporção de 1:10 com água deionizada, para amenizar os efeitos da viscosidade. Em seguida, foi feita a mistura com carvão ativo 3% (m/v). A mistura foi transferida para frascos Erlenmeyer de 500 ml, contendo 200 ml cada. Os frascos foram colocados em incubadora de movimento circular a 30 ºC e 200 rpm por uma hora. Em seguida, para remoção do carvão, foram feitas duas filtrações à vácuo, em papel de filtro qualitativo. Todos os resíduos tratados foram utilizados como substrato para fermentação com Bacillus thuringiensis var. israelensis. Também foi realizado um ensaio com glicerol sintético para controle. Microorganismo O microorganismo utilizado em todos os experimentos foi a bactéria Bacillus thuringiensis var. israelensis (sorotipo H-14) IPS 82, obtida no Instituto Pasteus de Paris. A cultura é mantida na forma esporulada sob refrigeração a 4 ºC, em meio Agar Nutriente sólido, composto por extrato de carne (3,0 g/l), peptona de carne (5,0 g/l) e Agar-agar (18,0 g/l). Meio de cultivo O meio denominado GLYS foi utilizado como meio de cultivo, apresentando a seguinte composição (em g/l): glicerol (20,0), extrato de levedura (12,0), (NH 4 ) 2 SO 4 (3,0), CaCl 2.2H 2 O (0,12), MgSO 4.7H 2 O (1,5), MnSO 4.H 2 O (0,09), K 2 HPO 4 (1,5) e KH 2 PO 4 (1,5). Para o inóculo foi utilizado glicose (10,0 g/l) como fonte de carbono ao invés de glicerol e os demais componentes foram adicionados nas mesmas concentrações do meio de cultivo. Ensaios fermentativos Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 1.000 ml, contendo 200 ml de meio, cobertos com fina manta de algodão e gase presa com elástico. Os frascos foram inoculados com o pellet resultante da centrifugação de 10 ml do inóculo (5%, v/v), o qual foi ressuspenso com o próprio meio de fermentação. Os frascos foram colocados em incubadora de movimento recíproco a 30 ºC e agitação de 110 rpm. O final da fermentação correspondeu ao tempo da completa dissociação dos grumos de células e esporos de Bacillus thuringiensis formados durante o processo, comportamento característico da bactéria. Este fenômeno foi monitorado por observações periódicas de lâminas a fresco de amostras do cultivo, em microscópico óptico. Métodos Analíticos A concentração celular durante a fermentação foi determinada de duas maneiras distintas, de acordo com o estágio do processo. Nas primeiras horas, durante a fase vegetativa de crescimento, a biomassa foi quantificada por turbidimetria. A partir do momento em que se iniciou a formação de grumos, a determinação foi feita diretamente por medida da massa seca de células (Berbert-Molina et al., 2008). A concentração de glicerol das amostras de fermentação e dos resíduos tratados foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando Cromatógrafo Waters, com coluna HPX-87H e detector de índice de refração. Bioensaios Para avaliar a toxicidade do meio fermentado foram realizados bioensaios com larvas de Aedes aegypti no quarto instar de desenvolvimento. As amostras do final de fermentação foram congeladas e descongeladas, posteriormente, para que ocorresse a lise celular e a liberação dos esporos. As larvas foram expostas ao meio fermentado puro, em séries de cinco replicatas, cada uma contendo uma larva. RESULTADOS E DISCUSSÃO Tratamento da glicerina bruta Os resultados dos tratamentos empregados, com relação a concentração de glicerol, estão mostrados na Tabela 1. O tratamento que demonstrou maior purificação do glicerol foi a acidificação com ácido fosfórico a ph 6. Nos demais tratamentos com acidificação, também houve purificação, o que não ocorreu no tratamento com carvão ativo. Tabela 1 Concentração de glicerol da glicerina bruta e submetida ao tratamentos. Resíduo Concentração (g/l) Glicerina Bruta 705,1 Tratado com H 2 SO 4 ph 1 964,7 Tratado com H 2 SO 4 ph 2 995,7 Tratado com H 3 PO 4 ph 4 945,1 Tratado com H 3 PO 4 ph 5 984,1 Tratado com H 3 PO 4 ph 6 1033,9 Tratado com carvão ativo 711,4 Ensaios fermentativos No ensaio fermentativo realizado com o resíduo tratado com carvão ativo, não houve

crescimento celular, indicando que este tratamento não é adequado para o cultivo de Bacillus thuringiensis var. israelensis. Em todos os demais ensaios, houve crescimento celular, apresentando todas as fases características da bactéria formação de grumos, esporulação e dissociação dos grumos ao final da fermentação. A Figura 4 mostra a curva de concentração celular e de substrato para o ensaio controle (com glicerol sintético). Nestas fermentações, observa-se um comportamento semelhante àquela com glicerol sintético. A máxima concentração celular foi atingida em torno de 47 horas, momento em que o substrato foi completamente consumido. O tempo de fermentação, para estes casos, foi de aproximadamente 55 horas. A Figura 6 mostra os gráficos para os ensaios com os resíduos tratados com H 3 PO 4. Figura 4 Curva de crescimento celular e de consumo de substrato para o ensaio com glicerol sintético. Observa-se que todo o substrato foi consumido e que a concentração celular máxima foi atingida em torno de 48 horas de fermentação, coincidindo com a exaustão do glicerol. A Figura 5 mostra as curvas para os ensaios com os resíduos tratados com H 2 SO 4. Figura 6 Curvas de crescimento celular e de consumo de substrato para os ensaios com os resíduos tratados com ácido fosfórico. Figura 5 Curvas de crescimento celular e de consumo de substrato para os ensaios com os resíduos tratados com ácido sulfúrico. Observa-se nestes ensaios uma fase de adaptação da bactéria ao meio e, somente por volta de 8 horas de cultivo, a bactéria começou a se multiplicar. Tal fase de adaptação pode estar relacionada com a alta concentração de íons fosfato, o de inibidores não removidos com a acidificação com ácido fosfórico. Com isto, o fim da fermentação se deu apenas em torno de 60 horas. Em todas as fermentações, nota-se que o substrato é consumido completamente, o que indica que o resíduo empregado é promissor para o cultivo da bactéria, bem como para a produção de bioinseticida.

Atividade larvicida Os bioensaios indicaram uma maior atividade larvicida no meio fermentado com resíduo tratado com H 3 PO 4 a ph 6, que matou 40% das larvas em menos de 24 horas. O mesmo resultado apresentou o meio fermentado com glicerol sintético. Já com resíduo tratado com H 2 SO 4 a ph 2, 60% das larvas morreram, porém isso só foi observado após 54 horas de contato. Os demais meios fermentados não apresentaram atividade larvicida. CONCLUSÕES A glicerina bruta proveniente da produção de biodiesel a partir de óleo de algodão pode ser empregada para a produção de bioinseticia por Bacillus thuringiensis var. israelensis, desde que seja empregado um tratamento adequado para sua purificação e remoção de compostos inibidores de crescimento e de produção de toxinas. O tratamento mais adequado para este processo é a acidificação com ácido fosfórico até ph 6 e posterior decantação por 24 horas. Outros tratamentos baseados na acidificação também podem ser empregados quando se deseja purificar a glicerina. Mesmo com o tratamento mencionado, é preciso um estudo mais detalhado de outras variáveis do processo, como composição do meio de cultivo e transferência de oxigênio, para que se possa obter um meio com alta atividade larvicida para a produção de bioinseticida a partir deste resíduo industrial. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARONSON, A.I.; SHAI, Y., 2001. Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action, Microbiology Letters, 195, 1-8. BERBERT-MOLINA, M.A.; PRATA, A.M.R.; PESSANHA, L.G.; SILVEIRA, M.M., 2008. Kinetics of Bacillus thuringiensis var. israelensis growth on high glucose concentrations, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnlogy. 35, 1397-1404. BERNHARD, K.; UTZ, R., 1993. Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses. In: ENTWISTLE, P.F.; CORY, J.S.; BAILEY, M.J.; HIGGS, S. Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice. John Wiley and Sons Ltda. 255-267. CRICKMORE, N.; ZEIGLER, D.R.; FEITELSON, J.; SCHNEPF, E.; LAMBERT, B.; LERECLUS, D.; BAUM, J.; DEAN, D.H., 1998. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins, Microbiology and Molecular Biology Review, 62, 807-813. GLAZER, A.N.; NIKAIDO, H., 1995. Microbial Biotechnology. In: Fundamentals of Applied Microbiology, Ed. W.H. Freeman & Co., New York, 3 rd edition, 45-56. KNOTHE, G.; GERPEN, J.V., 2006. Produção de Biodiesel. In: KNOTHE, G.; GERPEN, J.V.; KRAHL, J.; RAMOS, L.P., Manuel do Biodiesel. Editora Blucher, p. 29-54. KNOWLES, B.H., 1994. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal δ-endotoxins, Advances in Insect Physiology, 24, 308-310. MALDONADO-BLANCO, M.G.; SOLIS-ROMERO, G.; GALAN-WONG, L.J., 2003. The effect of oxygen tension on the production of Bacillus thuringiensis subsp israelensis toxin active against Aedes aegypti larvae, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 55, 671-674. PARAMATHA, R.B., 2000. Hyper-production of inseticidal crystal protein (δ-endotoxin) by B. thuringiensis var. israelensis is not related to sporulation-specific biochemical functions, Currency in Microbiology, 41, 187-191. REHMAN, A.; WIJESEKARA, R.G.; NOMURA, N.; SATO, S.; MATSUMURA, M., 2008. Pretreatment and utilization of raw glycerol from sunflower oil biodiesel for growth and 1,3- propanediol production by Clostridium butyricym, Journal of Chemical Technology and Biotechnology. STAHLY, P.; ANDREWS, R.E.; YOUSTEN, A.A., 1990. The genus Bacillus Insect Pathogens. In: The Prokaryotes, 2 nd edition. THOMPSON, J.C.; HE,B. 2006. Characterization of crude glycerol from biodiesel production from multiple feedstock, Applied Engineering in Agriculture, 22, 261-265. XIAOYAN, L.; YI, L.; PENG, L.; JUNCHENG, Z.; LIN, L.; SONGSHENG, Q.; ZINIU, Y., 2005. Microcalorimetric study of Bacillus thuringiensis growth with different plasmid numbers and various promoters, Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 79, 649-652. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC) da Universidade de São Paulo, pela bolsa concedida e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro ao grupo de pesquisa.