MORFOLOGIA DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE CURIMATÃ EM MÁQUINA DE CONGELAÇÃO Pinheiro, J. P. S. (1) ; Melo-Maciel, M. A. P. (1) ; Almeida, P.S. (1) ; Pinheiro, R.R.R. (1) ; Torres, T.M. (1) ; Leite, L.V.(1); Linhares, F.R.A. (1) ; Salmito-Vanderley, C.S.B. (1) joaopaulospinheiro@yahoo.com.br (1) Universidade Estadual do Ceará UFCE, Fortaleza CE, Brasil. RESUMO O curimatã comum é um peixe de valor ecológico e econômico, entretanto, a pesca predatória e a construção de barragens em rios impedem sua reprodução. Por isso, a criopreservação do sêmen pode auxiliar na reprodução artificial. Para avaliar a qualidade do sêmen descongelado, um dos parâmetros analisados é a morfologia espermática. Portanto, o objetivo do trabalho foi avaliar a morfologia espermática do sêmen de Prochilodus brevis criopreservado em máquina de congelação programada (MCP) com diferentes diluidores. Utilizaram-se doze machos induzidos hormonalmente. As amostras seminais constituíram quatro pools, aliquotadas para morfologia e criopreservação com Glicose ou Beltsville Thawing Solution (BTS) acrescido Dimetilsulfóxido (DMSO) ou Metilglicol (MG). Após 10 dias, o sêmen foi descongelado e fixado para morfologia, sendo assim comparado com o in natura. Os dados foram submetidos à análise de variância e Teste de Tukey (P<0,05). Na análise do sêmen in natura observou-se maior porcentagem de espermatozoides normais em relação ao sêmen pós-descongelação (P<0,05). Entretanto, não houve diferença (P>0,05) entre a porcentagem de normais e
entre as patologias encontradas nos diferentes tratamentos. Logo, o sêmen de P.brevis apresenta elevadas porcentagens de espermatozoides normais quando criopreservado nas soluções diluidoras: Glicose ou BTS associados a DMSO ou a MG em MCP. Palavras-chave: Prochilodus brevis, Peixes, Criopreservação. INTRODUÇÃO A espécie Prochilodus brevis Steindachner, 1875 (=Prochilodus cearensis), conhecida regionalmente por curimatã comum, é um peixe pertencente à ordem dos Characiformes e nativo da região semiárida (Nordeste) do Brasil (CE, PI, RN) sendo introduzido em alguns estados da região sudeste (DOURADO, 1981). O curimatã comum possui grande valor biológico e econômico, que de acordo com Fontenele (1982) ocupa lugar de destaque pela precocidade, prolificidade, regime alimentar e grande aceitação pelos habitantes do Nordeste. Contudo, a construção de barragens em rios impedindo a realização da migração para a reprodução e a pesca predatória no período que antecede a desova, afeta a sobrevivência dessa espécie (NASCIMENTO et al., 2012). 2
Devido a isso, surge nos pesquisadores o interesse sobre o estudo da reprodução dessa espécie, e uma das áreas em ascensão para reprodução artificial é a criopreservação do sêmen tanto para a produção em aquicultura como para preservação de material genético em programas de conservação (CAROLSFELD et al., 2003). No entanto, para se obter o sucesso de tal técnica é necessária a utilização e interação de diversos fatores, tais como: bom diluidor; taxa de resfriamento, condições de congelação, temperatura e tempo de descongelação apropriados, dentre outros (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Dessa forma, há a necessidade da padronização de protocolos de criopreservação, principalmente da técnica empregada, que pode ser obtida com a utilização da máquina de congelação programada, que irá permitir a queda homogênea e gradual da temperatura. Quando a interação entre esses fatores supracitados não acontece, podem ocorrer danos celulares, dessa maneira, havendo a necessidade de que se analisem alguns parâmetros do sêmen pós-descongelação que influenciam negativamente a taxa de fertilização, dentre eles a morfologia espermática (RURANGWA et al., 2004). 3
Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a morfologia espermática do sêmen de Prochilodus brevis criopreservado em máquina de congelação programada com diferentes soluções diluidoras. MATERIAL E MÉTODOS Os reprodutores foram provenientes do plantel do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP) (-3.793218, - 38.558250) do Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) da Universidade Estadual do Ceará (UECE). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética (CEUA) com o seguinte número de processo: 12776936-6. Para o estudo foram utilizados doze machos de curimatã comum (P.brevis) induzidos hormonalmente com única dose de extrato hipofisário de carpa comum (EHC: 2mg/Kg de peso vivo) na base da nadadeira peitoral, via intracelomática. Após 18 horas da indução foi realizada a coleta seminal, para isso, os animais foram capturados individualmente e sedados em solução à base de óleo de cravo (Eugenol; União Vegetal Suplementos Nutricionais Ltda) (1ml de óleo de cravo : 10ml de álcool absoluto : 10000ml de água do tanque) até que se observasse a perda do equilíbrio do animal (ventre voltado para cima). Em seguida, a papila urogenital enxuta com papel toalha e realizada uma massagem abdominal no sentido crânio-caudal com o 4
cuidado do sêmen não ser contaminado com água, sangue, fezes ou urina. O sêmen foi coletado em tubos graduados de polietileno, identificados e mantidos em caixa térmica de poliestireno (~ 10 ºC). As alíquotas contaminadas e que apresentaram motilidade espermática subjetiva inferior a 80%, quando ativadas com água do tanque, não foram utilizadas. As amostras selecionadas formaram quatro pools de sêmen (três machos por pool), em que uma alíquota de 5 µl do sêmen in natura foi fixada em 50µL de formol citrato para análise da morfologia espermática e a restante foi destinada a criopreservação. No processo de criopreservação utilizaram-se os diluentes: Beltsville Thawing Solution - BTS (Minitub, 318 mosm) e Glicose comercial (Fresenius Kabi Brasil Ltda, 252 mosm); e os crioprotetores: Dimetilsulfóxido DMSO e Metilglicol MG. Dessa forma, constituídos os seguintes tratamentos: T1) Glicose + DMSO; T2) Glicose + MG; T3) BTS + DMSO; e T4) BTS + MG. O sêmen de cada pool (n = 4) foi diluído 1:6 (sêmen:diluidor) em todos os tratamentos, sendo essa solução envasada em palhetas de 250µL, identificadas, seladas nas extremidades com álcool polivinilico e 5
colocadas em freezer (~10 ºC) por 10 minutos. Após esse período, transferidas para máquina de congelação programada (Dominium K, BIOCOM, Brasil), em que as amostras foram resfriadas a temperatura inicial de 10 ºC, e submetidas a duas rampas de congelação durante o processo (rampa 1: -12 ºC/min.; rampa 2: -3 ºC/min) até atingir temperatura final de -60 ºC, e finalmente as palhetas transferidas para o botijão de nitrogênio líquido. Após 10 dias, o sêmen foi descongelado em banho-maria a 25 o C por 30s, sendo essas amostras fixadas com a mesma metodologia para o sêmen in natura. Em seguida, misturou-se 20µL da solução fixada com 10 µl de corante Rosa Bengala. Dessa mistura, retirou-se 4µL e feito o esfregaço em lâmina de vidro, realizando essa operação duas vezes (duas lâminas) e feita a análise de 100 espermatozoides em cada lâmina com auxílio de microscópio óptico a 400x, totalizando 200 espermatozoides por tratamento. As patologias foram observadas e classificadas de acordo com Galo et al. (2011). Todos os dados obtidos foram comparados entre amostras frescas e pósdescongeladas. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados por meio de análise de variância seguida pelo Teste de Tukey ao nível de 6
5% de significância, utilizando o programa estatístico ASSISTAT versão 7.6 beta (2013). RESULTADOS E DISCUSSÃO Na análise morfológica do sêmen in natura observou-se grande porcentagem de espermatozoides normais (96,88±5,60%) sendo superior ao encontrado no sêmen pós-descongelação (P<0,05). Entretanto, verificou-se que não houve diferença significativa (P>0,05) entre a porcentagem de espermatozoides normais entre os diferentes tratamentos (tabela 1). Além disso, não se verificou diferença significativa (P>0,05) entre os diferentes tratamentos (tabela 1) quanto às patologias encontradas (cauda: dobrada, enrolada, quebrada e corrugada) (Figura 1), porém dessas patologias, a única que foi encontrada no sêmen in natura foi a patologia cauda dobrada, já no sêmen pós-descongelação observou-se todas as patologias mencionadas. Dentre as patologias observadas no sêmen criopreservado, a patologia cauda dobrada apresentou uma maior porcentagem em relação às outras patologias. Tal fato pode ser observado também em outros estudos, como com a espécie Piaractus mesopotamicus (Streit Jr. et al., 2006) e Prochilodus lineatus (Streit Jr. et al., 2003). 7
De acordo com Streit Jr. et al. (2006), a presença de espermatozoides com essas patologias pode ser em virtude da exposição destes à solução crioprotetora e à congelação dos espermatozoides. Tabela 1. Morfologia do sêmen criopreservado em diferentes tratamentos na máquina de congelação programada (Dominium K, BIOCOM, Brasil). T1: Glicose + DMSO; T2: Glicose + MG; T3: BTS + DMSO; T4: BTS + MG. As médias seguidas pela mesma letra entre as linhas não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Normal (%) Cauda dobrada (%) Cauda enrolada (%) Cauda quebrada (%) Cauda corrugada (%) in natura 96,88±5,60 a 3,12 ± 5,60 a - - - T1 78,75±8,82 b 18,00±8,68 b 0,37 ± 0,48 1,63 ± 0,48 1,25 ± 0,65 T2 79,25±6,81 b 16,00±6,54 b 0,87 ± 0,85 2,75 ± 0,87 1,13 ± 0,48 T3 73,50±6,36 b 21,88±6,43 b 0,37 ± 0,48 1,50 ± 0,91 2,75 ± 1,04 T4 79,00±6,18 b 17,63±6,76 b 0,87 ± 1,11 1,63 ± 0,63 0,88 ± 0,25 Segundo Galo et al. (2011) o decréscimo na motilidade após o processo de criopreservação pode ser correlacionado com a deformação estrutural durante o processo de congelação/descongelação do espermatozoide. Com isso, a presença dessas anormalidades espermáticas poderá influenciar negativamente no processo de fertilização (LAHNESTEINER et al., 1996; LAHNSTEINER et al., 1998; COSSON et al.,1999). 8
Figura 1. Morfologia do sêmen criopreservado de curimatã comum (P. brevis). Letras correspondem: a cauda normal; b cauda enrolada; c cauda corrugada; d cauda quebrada; e cauda dobrada. Setas indicam o espermatozoide que foi classificado. O padrão normal de morfoanomalias dos espermatozoides é preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 1998), sendo de 30% para mamíferos, bovinos e equinos, e de 20% para ovinos e suínos, no entanto, em peixes, as referências ainda não foram estabelecidas. Dessa maneira, os resultados encontrados nesse estudo são superiores ao padrão estabelecido para outras espécies, ressaltando assim a eficiência do protocolo empregado. 9
CONCLUSÃO Nas condições em que foram realizadas este experimento, o sêmen de curimatã comum (P.brevis) apresenta elevadas porcentagens de espermatozoides normais quando criopreservado nas soluções diluidoras: Glicose ou BTS associados a DMSO ou MG em máquina de congelação programada Dominium K. REFERÊNCIAS CAROLSFELD J, HARVEY B, GODINHO HP, ZANIBONI-FILHO E. Cryopreservation of sperm in Brazilian migratory fish conservation. Journal of Fish Biology, v.63, p.472-481, 2003. COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal, 2ª Ed., Belo Horizonte, 1998. COSSON, J.; BILLARD, R.; CIBERT, C.; DRÉANNO, C.; SUQUET, M. Ionic factors regulating the motility of fish sperm. In: GAGNON, C. The male gamete: from basic science to clinical applications. Viena: Cache River Press, p.162-186, 1999. DOURADO, O.F. Principais peixes e crustáceos dos açudes controlados pelo DNOCS, SUDENE/DNOCS, Fortaleza, Ceará, Brasil, 40 p., 1981. FONTENELE, O. Contribuição para o conhecimento da biologia da Curimatã pacu, Prochilodus argenteus Spix in Spix & Agassiz (Pisces: Characidae, Prochilodontinae). Coletânea de Trabalhos Técnicos. Pesca e Piscicultura. Ministério do Interior. DNOCS. p. 215-231, 1982. GALO, J.M.; STREIT JR., D.P.; SIROL, R.N.; RIBEIRO, R.P.; DIGMAYER, M.; ANDRADE, V.X.L.; EBERT, A.R. Spermatic abnormalities of piracanjuba Brycon orbignyanus (Valenciennes, 1849) after cryopreservation. Braz J Biol, v.71, p.693-699, 2011. 10
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