Avaliação da capacidade de redução microbiana da instrumentação manual associada com a terapia fotodinâmica em lesões endodônticas

Avaliação da capacidade de redução microbiana da instrumentação manual associada com a terapia fotodinâmica em lesões endodônticas de dentes decíduos Josianne Neres da Silva Faculdade de Odontologia Centro de Ciências da Vida josianne.ns@puccamp.edu.br Sérgio Luiz Pinheiro Dentística Minimamente Invasiva Centro de Ciências da Vida slpinho@puc-campinas.edu.br Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de redução microbiana da instrumentação manual associada com a terapia fotodinâmica (TFD) em lesões endodônticas de dentes decíduos. Foram selecionados 10 molares decíduos e a odontometria foi feita pelo método visual. Os dentes foram autoclavados e contaminados com cepa padrão de Enterococus faecalis (escala 0,5 de McFarland). Foi feita a instrumentação manual com limas tipo kerr. A cada troca de lima foi realizada irrigação com 1 ml de hipoclorito de sódio 1%. A TFD foi realizada com três combinações luz/fotossensibilizante: azul de toluidina/laser, fucsina/ luz halógena e fucsina/led. Antes e após a instrumentação e a TFD foram feitas coletas das bactérias do sistema de canais radiculares utilizando cone de papel estéril. As amostras foram incubadas por 5 dias em anaerobiose a 37 C. Os resultados em unidades formadoras de colônias foram transformados em log 10 e submetidos à análise descritiva e ao teste de Wilcoxon. Pode-se observar que a instrumentação manual e a terapia fotodinâmica utilizando azul de toluidina associado ao laser, fucsina associada à luz halógena e fucsina associada ao led proporcionaram redução significante de Enterococcus faecalis dos canais radiculares dos dentes decíduos. Pode-se observar que a TFD pode ser utilizada como tratamento coadjuvante na redução microbiana das lesões endodônticas de molares decíduos. Palavras-chave: Terapia Fotodinâmica, Fotossensibilizantes, Dentes Decíduos. Área do Conhecimento: Ciências da Saúde - Odontologia PIBIC/CNPQ. 1. INTRODUÇÃO Os dentes decíduos possuem papel importante no que se refere à mastigação, fonação e estética na criança [1]. Além disso, manter os dentes decíduos no arco dental até a esfoliação fisiológica auxilia na erupção correta da dentição permanente e favorece no crescimento maxilo-mandibular. No atendimento odontopediátrico, a necessidade do tratamento endodôntico existe quando acontece exposição pulpar por trauma ou lesão de cárie [2]. A técnica mais utilizada para o tratamento endodôntico em dentes decíduos é realizada com limas manuais de aço carbono. Essa técnica é amplamente utilizada por causa do baixo custo [3]. Apesar do uso de instrumentos endodônticos e soluções irrigadoras desinfectantes, a quantidade de bactérias residuais nos canais radiculares após a instrumentação químico-mecânica é significativa e pode levar a uma nova infecção do canal [4]. A microbiota resistente ao tratamento endodôntico é, em sua maioria, composta por bactérias anaeróbias como as gram-positivas Streptococcus e Enterococcus faecalis [5]. A Terapia Fotodinâmica (PDT) parte do princípio de que uma luz de comprimento de onda específico incide sobre uma solução fotossensibilizante e ocorre a transferência de energia entre luz/fotossensibilizante e substrato, originando fótons de energia que liberam oxigênio singleto e radicais livres. Essas substâncias liberadas atuam na parede bacteriana modificando seu metabolismo através da alteração de lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos, levando a morte bacteriana. Além disso, esta é uma técnica de fácil aplicação, indolor, não promove resistência microbiana e não causa efeitos sistêmicos [6]. As lâmpadas emissoras de luz podem ser do tipo halógena, emissoras de diodo (led) e laser de baixa intensidade [7]. As lâmpadas halógenas produzem luz azul, liberam calor quando ativadas e atuam em comprimento de onda aproximado de 670 nm. São encontradas nos consultórios dentários e são utilizadas principalmente para fotopolimerização da resina composta [7]. As lâmpadas emissoras de diodo possuem um conjunto de várias minilâmpadas emitindo luz monocromática com pouca elevação de temperatura atuando no comprimento de onda que

varia entre 450-490 [8]. Os dois tipos de luz podem incidir em corantes vermelhos derivados dos xantenos, como eritrosina, rosa de bengala e eosina que apresentam absorção de luz compatível com seu comprimento de onda [9]. A utilização do laser de baixa intensidade também aplica-se para a TFD. Nesse caso, a faixa de comprimento de onda é aproximadamente 638 nm e os fotossensibilizantes utilizados são derivados das fenotiazinas como azul de metileno, de toluidina e azuleno [6]. A correta combinação de luz/fotossensibilizante pode auxiliar no tratamento endodôntico promovendo maior descontaminação do sistema de canais radiculares. O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de redução microbiana da instrumentação manual associada com a terapia fotodinâmica em lesões endodônticas de dentes decíduos. 2. MATERIAIS E MÉTODOS O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUC- Campinas (Protocolo 783/09). 2.1. Seleção da amostra Foram selecionados 10 molares decíduos na Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia da PUC- Campinas. 2.2. Critérios de inclusão: - Os molares decíduos deveriam possuir, no mínimo, 2/3 de raiz; - Ausência de reabsorção radicular patológica externa e/ou interna; - Ausência de perfuração interna e/ou externa na região de furca; - Angulação moderada da raiz (raios de curvatura entre 10 a 20 mm e ângulos entre 25º e 39º [10]. 2.3. Critérios de exclusão: - Os molares decíduos com menos de 2/3 de raiz; - Dentes com reabsorção radicular patológica interna e/ou externa; - Presença de perfuração interna e/ou externa na região de furca; - Dentes que não apresentavam raios de curvatura entre 10 a 20 mm e ângulos entre 25º e 39º [10]. 2.4. Procedimentos metodológicos Para a padronização do comprimento dos dentes foi realizado corte transversal na região cervical com disco de carboril dupla face (KG Sorensen, Agerskov, Denmark) e as coroas foram desprezadas [11]. O comprimento do canal radicular foi estabelecido através da inserção de um instrumento manual 10 tipo K-file (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Suíça) dentro do canal até a ponta ativa ser vista no forame apical (método visual). O instrumento foi retirado e o comprimento de trabalho determinado subtraindo 1 mm do comprimento do canal [12]. Os dentes foram esterilizados em autoclave com calor úmido a 121ºC por 15 minutos. A contaminação dos canais radiculares foi feita com cepa padrão de Enterococcus faecalis ACTT 19433 (LabCenter, Campinas, SP, Brasil) padronizada na escala 0,5 de McFarland. Cada canal radicular foi irrigado com 1 ml de cepa padrão de Enterococcus faecalis no fluxo laminar. As amostras foram incubadas em jarras de anaerobiose (Oxoid Ltda., Basingstoke, Hampshire, England) a 37 C durante 24 horas em atmosfera de 85% de N 2, 10% de CO 2 e 5% de H 2 obtida pelo uso de envelopes geradores de anaerobiose e indicadores de anaerobiose (AnaerogenTM, Oxoid Ltd.,Basingstoke, Hampshire, England). Após lavagem com soro fisiológico, um cone de papel estéril de diâmetro anatômico compatível com o canal foi introduzido em cada canal durante 30 segundos, obtendo-se a primeira amostra da contaminação bacteriana que foi imediatamente transferida para tubo de ensaio com 4.5 ml do meio BHI (Brain Heart Infusion- estéril, Acumedia Manufacturers, Michigan, EUA). A instrumentação manual foi realizada pela técnica coroa-ápice utilizando limas do tipo Kerr (Les Fils D Auguste Maillefer, Switzerland, Suíça). Para os canais mesiais, foram utilizadas as limas tipo Kerr 30 e 25 para preparo do terço cervical e 20 e 15 para preparo do terço médio e apical. No canal distal, foram utilizadas as limas tipo Kerr 45 e 40 no terço cervical e no terço médio e apical as limas 30 e 25 [13]. Todas as limas foram utilizadas no comprimento de trabalho e a cada troca de lima foi realizada irrigação com 1 ml de hipoclorito de sódio 1%. A segunda amostra foi coletada um cone de papel estéril de diâmetro anatômico compatível com o canal durante 30 segundos e inserida em tubo de ensaio contendo 4,5 ml de BHI estéril (Acumedia Manufacturers, Michigan, EUA). Para a realização da terapia fotodinâmica foi feito um sorteio dos canais radiculares para os três tipos diferentes de tratamento, sendo um para cada canal seguindo a ordem do sorteio. Os tratamentos foram os seguintes: - Tratamento 1: Fotossensibilizante azul de toluidina e laser de baixa intensidade. Foram utilizados o fotossensibilizante azul de toluidina 0.005% (Fórmula & Ação Laboratório Farmacêutico Ltda., São Paulo, Brasil), tempo de pré-irradiação de 3 minutos e irradiação com laser de baixa intensidade (Flash LaserIII, DMC, São Carlos, Brasil) com 4 J/cm 2 de

energia por 60 segundos, comprimento de onda de 660 nm e potência de 100 mw; - Tratamento 2: Fotossensibilizante fucsina e a luz halógena. Foram utilizados o fotossensibilizante fucsina 0.005% mg/500ml (Fórmula & Ação Laboratório Farmacêutico Ltda., São Paulo,Brasil), tempo de pré-irradiação de 3 minutos, o aparelho emissor de luz halógena XL 3000 (3M UNITEK EUA) com intensidade de 638 mw/cm² por 60 segundos; - Tratamento 3: Fotossensibilizante fucsina e led. Foram utilizados o fotossensibilizante fucsina 0.005% mg/500ml (Fórmula & Ação Laboratório Farmacêutico Ltda., São Paulo, Brasil), tempo de pré-irradiação de 3 minutos e o aparelho led por 60 segundos (Biolux, Bio Art Ltda., São Carlos, São Paulo) com comprimento de onda de 470 nm. Nos três diferentes tipos de tratamentos, o corante foi aplicado com auxílio de pinça clínica e cone de papel estéril compatível com o canal radicular. Para a aplicação da luz correspondente para cada canal e corante, foi necessário aproximar ao máximo a ponteira do aparelho da entrada dos canais radiculares para obter a maior área sensibilizada possível. A aplicação de cada um dos tipos de luz foi feita da mesma maneira: aplicação de luz por 1 minuto. Após essa aplicação, foi feita a terceira coleta microbiológica através da inserção de um cone de papel estéril compatível com o canal que foi deixado em contato com as paredes do canal por 30 segundos. 2.5. Análise Estatística Os resultados em unidades formadoras de colônias foram transformados em log 10 e submetidos à análise descritiva e ao teste de Wilcoxon. 3. RESULTADOS Houve redução significante de Enterococcus faecalis após a instrumentação manual dos canais radiculares dos dentes decíduos (p=0.0007) (Tabela 1). Tabela 1. Médias aritméticas, desvios padrão e teste de Wilcoxon da variação de Enterococcus faecalis dos canais radiculares de dentes decíduos antes e após a instrumentação rotatória (log 10) Antes da instrumentação manual Após a instrumentação manual Redução Valor de p 3.22 (1.46) a 0.53 (1.27) b 83.54% 0.0007 Letras diferentes: p<0.0001 A terapia fotodinâmica utilizando azul de toluidina associado ao laser, fucsina associada à luz halógena e fucsina associada ao LED acarretou em redução significante de Enterococcus faecalis dos canais radiculares dos dentes decíduos após a instrumentação manual (p<0.01) (Tabela 2). Tabela 2. Médias aritméticas, desvios padrão e teste de Wilcoxon da variação de Enterococcus faecalis dos canais radiculares de dentes decíduos antes e após a terapia fotodinâmica instrumentação manual (log 10) Azul de toluidina e laser Fucsina e luz halógena Fucsina e LED Antes da TFD Após a TFD Redução Valor de p 4.71 0.92 80.46% 0.0117 (0.83) a (1.71) b 4.53 0.51 88.74% 0.0180 (1.10) a (1.35) b 4.30 0.00 100% 0.0077 (1.16) a (0.00) b Letras diferentes: p<0.05 4. DISCUSSÃO A manutenção dos dentes decíduos até a esfoliação fisiológica contribui para mastigação, fonação, estética e previne hábitos deletérios na criança [1]. Dessa maneira, preservar os dentes decíduos na cavidade oral até a esfoliação fisiológica é importante e norteia a indicação do tratamento endodôntico pediátrico. O sucesso do tratamento endodôntico em dentes decíduos depende da redução microbiana significativa após a instrumentação químico-mecânica. Entretanto, a quantidade de bactérias residuais nos canais radiculares após a instrumentação químico-mecânico é significativa e pode levar a uma nova infecção do canal [14]. O preparo químico-mecânico para desinfecção dos canais radiculares dos dentes decíduos pode ser realizado com técnica manual ou com sistema rotatório através das limas de níquel-titânio [15]. A instrumentação manual é amplamente utilizada em dentes decíduos, porém apresenta limitações no que se refere à qualidade da limpeza dos canais radiculares [4]. A literatura mostra trabalhos em que compara o potencial de limpeza dos canais radiculares utilizando a técnica manual e a rotatória. O que pode ser observado através desses trabalhos é que terço cervical e médio não apresentam diferença significante, já no terço apical, os instrumentos manuais apresentaram melhor desempenho [16]. A instrumentação manual acarreta redução de 82,59% do total de baterias viáveis após [5]. Ng et al. (2011) [17]

observaram redução do total de bactérias viáveis das espécies microbianas após a instrumentação manual e 3 dentes apresentaram total eliminação de bactérias após a instrumentação manual. Os resultados desse trabalho mostraram redução de 83,54% do número de bactérias viáveis após instrumentação manual concordando com a literatura [5, 16-17]. Apesar de a técnica manual mostrar alto potencial de redução microbiana, o número de bactérias viáveis após a instrumentação é significativo. Nesse trabalho, foi observado 16,46% de contaminação dos canais radiculares após a instrumentação. A microbiota responsável pela necrose pulpar em dentes decíduos é, em sua maioria, de microrganismos anaeróbicos [5]. As bactérias gram-positivas Streptococcus e Enterococcus faecalis são as principais responsáveis por falhas no tratamento endodôntico. Alguns autores observaram que uma semana após o tratamento endodôntico, 40% da microbiota bacteriana original recolonizou os canais radiculares e foi necessário o retratamento endodôntico associado à terapia fotodinâmica para eliminar os microrganismos residuais [18]. A TFD baseia-se na interação de luz e fotossensibilizador com liberação de oxigênio singleto. Os fotossensibilizantes não devem ser tóxicos, devem apresentar alta absorção e produção de substâncias nocivas aos microrganismos ou tecidos alvo (células tumorais, bactérias, fungo e vírus) [5]. Além disso, a TFD é uma técnica de fácil aplicação, indolor, não promove resistência microbiana e não causa efeitos sistêmicos [6]. Portanto, ela é uma aliada ao tratamento convencional no controle de infecções endodônticas, não desconsiderando a importância do preparo químico-mecânico dos canais. O azul de metileno 50 mcg/ml com luz led com comprimento de onda de 665 nm durante 5 minutos em diferentes irradiâncias (10, 20 e 40 mw/cm²) foi utilizado e os efeitos não foram nocivos em osteoblastos após 24 horas e não houve apoptose celular nas células animais presentes. Isso comprova a janela terapêutica que a terapia fotodinâmica possui e sua indicação para microrganismos patogênicos sem que haja dano celular [19]. O azul de toluidina (TBO) é um fotossensibilizante que apresenta interação e capacidade de penetrar na membrana celular das bactérias acarretando maior susceptibilidade a absorção da luz [20-21]. O TBO é um fotossensibilizante derivado das fenotiazinas. Ele possui afinidade com a membrana externa das bactérias gram-positivas e com o lipossacarídeo das gram-negativas. A irradiação do TBO com laser acarreta reações químicas que reduzem significativamente o número de bactérias viáveis por meio da liberação de oxigênio singleto e radicais livres tóxicos para as bactérias anaeróbias do canal. Com a variação da intensidade ou do tempo de exposição, bem como a concentração do corante e o tempo de pré-irradiação utilizado pode-se constatar maior ou menor redução microbiana. O azul de metileno 0,01% foi utilizado com laser de diodo com comprimento de onda de 660 nm em canais radiculares de dentes permanentes. A irradiação foi realizada com ou sem a utilização de fibra óptica intracanal, a potência utilizada foi de 90 mw com dois tempos de exposição (1 minuto e 30 segundos e três minutos). Houve maior redução do número de unidades formadoras de colônias no grupo que recebeu a TFD em comparação ao grupo controle [22]. Outro trabalho utilizou para avaliação da eficácia da TFD raspas de dentina do canal radicular contaminadas com Enterococcus faecalis por 2 semanas. Primeiramente, as amostras foram imersas em NaOCL 6% para desinfecção e a TFD foi realizada com corante TBO e laser. O grupo que recebeu NaOCl / TBO / luz obteve taxa de sobrevivência bacteriana menor 0,01%, o grupo que recebeu apenas NaOCl a taxa de sobrevivência foi de 0,66% e o grupo que recebeu TBO / luz a taxa de sobrevivência foi de 2,9% [23]. Os resultados desse trabalho concordam com a literatura [20-23] uma vez que, utilizando azul de toluidina 0.005% e irradiação com laser de baixa intensidade foi possível observar redução de 80,46% de Enterococcus faecalis dos canais radiculares de dentes decíduos. Entretanto, Souza et al. (2010) [24] não observaram redução microbiana significante da TFD com azul de metileno, verde de malaquita ou azul de toluidina (15 mg / ml) irradiados com densidade de energia de 15,8 J /cm ², 26,3 J /cm² e 39,5 J /cm² sobre cultura de Candida albicans. Os xantenos são compostos aniônicos cíclicos com três anéis aromáticos em arranjo linear com um átomo de oxigênio no anel central. Dentro do grupo dos xantenos encontram-se: fluorosceína, eosina, eritrosina, rosa bengala. São fotossensibilizantes que apresentam fácil conversão fotocatalítica de oxigênio tripleto em oxigênio singleto [9]. O oxigênio singleto causa danos aos ácidos graxos presentes nas membranas lipídicas que sofrem reações de peroxidação de enzimas por reações específicas com os aminoácidos metionina, triptofano, tirosina e ácidos nucléicos resultando em morte bacteriana [25]. A fucsina é um corante vermelho muito utilizado na odontologia para evidenciar lesões de cárie e placa bacteriana. A fucsina também pode ser classificada no grupo dos xantenos e ao incidir luz visível com comprimento de

onda variando entre 500 e 570 nm ocorre liberação de radicais livres e de oxigênio singleto. Nesse trabalho, a fucsina também foi utilizada como fotossensibilizante em associação com dois tipos de emissores de luzes azuis: halógena e luz emissora de diodo. A luz halógena e o led estão presentes atualmente na maioria dos consultórios odontológicos, sendo assim, de fácil acesso e baixo custo para utilização na TFD. O uso do led apresenta como vantagem o fato de não ter o mesmo risco de dano ocular acidental que os lasers de baixa intensidade e a possibilidade de combinar comprimentos de ondas diferentes [26]. Rolim et al. (2012) [27] avaliaram os fotossensibilizantes rosa de bengala, eritrosina e eosina (irradiados com luz azul-570 nm) e azul de metileno, toluidina e verde de malaquita (irradiados com LED-636 nm). A eosina não acarretou em redução microbiana e o TBO e o MB reduziram a contagem de bactérias em relação aos seus respectivos grupos controle (não tratados). O TBO e o MB também obtiveram maior liberação de oxigênio singleto se comparados aos corantes vermelhos, discordando dos resultados desse trabalho que demostraram 88,74% de redução do total de bactérias viáveis dos canais radiculares utilizando fucsina com luz halógena e de 100% utilizando fucsina e led. Costa et al. (2010) [28] avaliaram o led (455-475 nm) utilizado por 180 segundos associado à eritrosina e rosa de bengala. Houve redução significativa da microbiota viável após a utilização de fotossensibilizantes vermelhos e led concordando com os resultados desse trabalho. Junqueira et al. (2009) [29] estudaram o led com comprimento de onda de 460 nm associado com rosa de bengala e eritrosina para sensibilizar Escherichia coli e observaram redução microbiana após a TFD. Este resultado concorda com os resultados desse trabalho em que a utilização da fucsina e o led provocaram redução de 100% no número de bactérias residuais presentes no canal radicular após a instrumentação endodôntica. Os fotossensibilizantes vermelhos apresentam eficiência para inviabilizar a sobrevivência bacteriana se combinados com fontes de luz em comprimento de onda e potência específica para sua absorção de luz. 5. CONCLUSÃO A TFD pode ser utilizada como tratamento coadjuvante na redução microbiana das lesões endodônticas de molares decíduos. AGRADECIMENTOS Ao CNPQ (Processo: 800271/2011-4) e a PUC- Campinas pela bolsa de Iniciação Científica e pelas condições de infra-estrutura para realização desse trabalho. REFERÊNCIAS [1] Bodur H, Odabas M, Tulunoglu Ö, Tinaz AC (2008), Accuracy of two different apex locators in primary teeth with and without root resorption. Clin Oral Invest, vol. 12, n.2, p.137-41. [2] Leonardo MR, Silva LAB, Nelson-Filho P, Silva RAB, Raffaini MSGG (2008), Ex vivo evaluation of the accuracy of two electronic apex locators during root canal length determination in primary teeth. International Endodontic Journal, vol. 41, n.4, p.317 21. [3] da Silva LA, Nelson-Filho P, Faria G, Souza- Gugelmin MCM, Yto IY (2006), Bacterial profile in primary teeth with necrotic pulp and periapical lesions. Brazilian Dental Journal, vol.17, n.2, p.144 8. [4] Barr ES, Kleir DJ, Barr NV (2000), Use of nickeltitanium rotary files for root canal preparation in primary teeth. Pediatr Dent, vol.22, n.1, p.77-8. [5] Pinheiro SL, Schenka AA, Alves Neto A, Souza CP, Rodriguez HMH, Ribeiro MC (2009), Photodynamic therapy in endodontic treatment of deciduous teeth. Lasers Med Sci, vol. 24, n. 4, p.521-526. [6] Soukos NS, Chen PSY, Morris JT, Ruggiero K, Abernethy AD, Som S, Foschi F (2006), Photodynamic therapy for endodontic disinfection. J Endod, vol. 32, n.10, p. 979-84. [7] Wood S, Metcalf D, Devine D, Robinson C (2006), Erythosine is a potential photosensitizer for the photodynamic therapy of oral plaque biofilms. J Antimicrob Chemother, vol.57, n.4, p.680-684. [8] Mills RW, Uhl A, Jandt KD (2002), Optical powers outputs, spectra and dental composite depths of cure, obtained with blue light emitting diode (LED) and halogen light curing units (LCUs). Br Dent J, vol.193, n.8, p.459-63 [9] Diwu Z, Lown WL (1994), Phototherapeutic potential of alternative photosensitizers to porphyrins. Pharmacological Therapy, vol. 63, n.1, p.1-35. [10] Schneider SW (1971), A comparison of canal preparations in straight and curved root canals. Oral Surg, vol.32, n.2, p.271-275. [11] Teixeira CS, Alfredo E, Thomé LH, Gariba-Silva R, Silva-Sousa YT, Sousa-Neto MD (2009), Adhesion of an endodontic sealer to dentin and

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