Ao meu orientador, Ieso de Miranda Castro, pela oportunidade de trabalho, investimento e todo auxílio prestado. Ao meu co-orientador e chefinho do coração, Evanguedes Kalapothakis, com quem trabalho desde o 5º período da graduação, há mais de cinco anos, e com quem aprendi tudo o que sei praticamente de trabalho de bancada, cotações, preparação de artigos científicos, projetos, cursos e - principalmente - como me comportar profissionalmente perante jornalistas e fotógrafos do EM! Muito obrigada por tudo, chefe! Ao pessoal do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos da UFOP, Ana Maria, André, Liz, Luciano, Michele, Totola e Zézé, por toda a ajuda, ânimo, bom humor e hospitalidade. Ao pessoal do Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do ICB-UFMG: - Alessandra, Ana Carolina Campi, Fabíola, Ju, Marluce e Valéria, pelo companheirismo, pelas brincadeiras, pelas dicas e quebra-galhos. - Às minhas amigonas, Carolina Campolina, Flávia, Simone e Thaís, por tantos anos de boa convivência, por tudo o que passamos juntas, por serem do jeito que são e terem me ensinado, cada uma de sua maneira, coisas tão especiais. Vão ficar saudades, meninas! - Ao Lorde do nosso laboratório: Gabriel. Sempre prestativo, gentil e com questionamentos muito inteligentes... O único companheiro da ala masculina do nosso chefe por um bom tempo. - E também à nova geração do lab, Ana Luíza, Arthur, Flavinha, Kika e, em especial, ao Higgor, que têm me ajudado muito nesta etapa final da tese. Boa sorte para vocês! Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFOP e, em especial, aos Professores Rogélio Lopes Brandão e Elio Hideo Babá. Ao Professor Carlos Chavéz-Olórtegui e todos os seus alunos. Ao CNPq pelo apoio financeiro. E por fim, aos casais: Natasha e Cláudio e Cláudia e Rodrigo, que sempre me receberam com os braços abertos em suas casas em Porto Alegre, me emprestaram o computador umas mil vezes para eu escrever e imprimir a tese e que, sem dúvida, farão às vezes da minha família nesta minha nova cidade. Muito obrigada!
"Só sei que nada sei". SÓCRATES
Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível, modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional. Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade, trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola. Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de uma biblioteca de cdna das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes quantidades. Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional e internacional é aquele que utiliza no combate a diversas pragas agrícolas. O sistema supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o dos inseticidas químicos. Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema de expressão - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1 (previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus selvagens. Acreditamos que os recombinantes aqui gerados poderão permitir a expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
In order to get an overview of all Loxosceles intermedia venom gland transcripts, we performed a clustering analysis of 268 cdna sequences available in our laboratory. The 136 singlets and 33 consensus sequences generated after alignment, allowed the identification by database searches of several distinct genes/proteins in the gland. We analyzed these sequences, classified them in functional categories (biological function) and, whenever possible, predicted their 3D structure by homology. Moreover, aiming the production of highly efficient bioinsecticides, our group has worked with insecticidal toxins. Recently, we located and characterized, by chromatography of L. intermedia crude venom and screening of its venom gland cdna library, lethal toxins to Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): a plague which attacks the Brazilian corn culture since harvesting to storage. Due to practical limitations to get from the crude venom a high rate of previously identified neurotoxins, the use of expression systems to study heterologous genes becomes necessary. Baculovirus is one of the most studied heterologous systems used worldwide as a resource for combating pests. They are powerful, versatile and provide advantages concerning finance, ecology and human health. In this manner, we subcloned genes of the insecticidal toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1 (previously identified from L. intermedia venom gland) in baculovirus expression vectors. The construction s success of the recombinant virus was verified after insects cells infection and also by PCR. The expression of LiTx1, LiTx2 and LiD1 toxins was verified by RT-PCR, SDS- PAGE and Western Blotting. Bioassays with the recombinant virus LiTx1 and LiTx2 in S. frugiperda larvae showed their insecticidal efficacy, with life-time reduction of this plague when compared to the wild virus. We believe recombinant baculovirus herein generated will allow a large scale expression of L. intermedia toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1. This will conduce to characterization studies of the action mechanisms of these toxins and also will permit their use as tools to basic researches in ionic channels and physiologic processes.
PÁGINA 1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Análises bioinformáticas 1 1.2 Inseticidas químicos x Bioinseticidas 3 1.3 As aranhas 7 1.3.1 Comentários gerais 7 1.3.2 Composição geral do veneno 8 1.3.3 Toxinas inseticidas 10 1.4 Aranhas do gênero Loxosceles 12 1.4.1 Comentários gerais 12 1.4.2 Composição geral do veneno 16 1.4.3 Toxinas inseticidas 19 1.5 Os 20 1.6 Expressão de toxinas em sistema 23 2. OBJETIVOS 26 2.1. Geral 26 2.2. Específicos 26 3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA 28 4. MATERIAIS 29 4.1. Equipamentos 29 4.2. Programas 30 4.3. Reagentes 30 4.3.1 Antibióticos 30 4.3.2 Meios de cultura 31 4.3.3 Soluções 32 4.3.4 Tampões 34 4.3.5 Outros 35
PÁGINA 4.4. Linhagens celulares 36 4.5. Genótipo das linhagens bacterianas hospedeiras 36 5. MÉTODOS 37 5.1 Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de Loxosceles intermedia 5.1.1 Obtenção das seqüências 38 5.1.2 Tratamento das seqüências 39 5.1.3 Agrupamento das seqüências 39 5.1.4 Anotação dos uniques 40 5.1.5 Classificação manual dos uniques em categorias funcionais 42 5.1.6 Análises biológicas dos uniques classificados em categorias funcionais 5.1.7 Modelagem molecular dos uniques 44 5.2 Veneno bruto de L. intermedia 44 5.3 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia 45 5.4 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L. intermedia 5.5 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no vetor de transferência psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 5.5.1 PCR para amplificação do DNA da região madura de LiTx1 e LiTx2 5.5.2 Purificação do produto de PCR 50 5.5.3 Clonagem do produto de PCR de LiTx1 e LiTx2 no vetor de clonagem pcr 2.1-TOPO 51 5.5.4 Transformação de bactérias por eletroporação 53 5.5.5 PCR de colônias 54 5.5.6 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) 55 5.5.7 Digestão do vetor pcr 2.1-TOPO contendo a região madura de LiTx1 ou LiTx2 com EcoR I 5.5.8 Seqüenciamento automático capilar 56 38 44 45 46 46 56
PÁGINA 5.5.9 Purificação dos fragmentos da região madura de LiTx1 e LiTx2 57 obtidos pela digestão do vetor pcr 2.1-TOPO com EcoR I 5.5.10 Digestão do vetor psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 57 com EcoR I 5.5.11 Ligação do fragmento da região madura de LiTx1 ou LiTx2 no 59 vetor psynxiv VI + X3 5.5.12 Precipitação do produto de ligação 60 5.5.13 Transformação de bactérias por eletroporação 60 5.5.14 PCR de colônias 60 5.5.15 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) 61 5.5.16 Seqüenciamento automático capilar 62 5.6 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema 63 5.6.1 Co-transfecção 63 5.6.2 Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes 64 vsynlitx1 e vsynlitx2 em culturas celulares 5.6.3 Verificação por RT-PCR da presença de RNAs mensageiros dos 67 vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx2 em culturas celulares 5.6.4 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por 69 SDS-PAGE 5.6.5 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por 70 Western Blotting 5.7 Bioensaio com os vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx2 71 5.8 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia 71 5.8.1 Ensaio hemolítico 72 5.8.2 SDS-PAGE 72 5.8.3 Western Blotting 73 5.8.4 Seqüenciamento de proteínas 73 5.9 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de 73 transferência pfastbac TM 1 do sistema de expressão Bacto-Bac 5.9.1 Atividade tóxica do veneno bruto de L. intermedia em linhagens 73 celulares de inseto
PÁGINA 5.9.2 PCR para amplificação do DNA da região madura de LiD1 74 5.9.3 Purificação do produto de PCR 76 5.9.4 Clonagem do produto de PCR de LiD1 no vetor de clonagem 76 pgem -T Easy 5.9.5 Precipitação do produto de ligação 78 5.9.6 Transformação química de bactérias 78 5.9.7 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) 78 5.9.8 Digestão do vetor pgem -T Easy contendo a região madura de 79 LiD1 com BamH I 5.9.9 Purificação do fragmento da região madura de LiD1 obtido pela 79 digestão do vetor pgem -T Easy com BamH I 5.9.10 Digestão do vetor pfastbac TM 1 do sistema de expressão 79 Baculovírus Bac-to-Bac com BamH I 5.9.11 Ligação do fragmento da região madura de LiD1 no vetor 81 pfastbac TM 1 5.9.12 Precipitação do produto de ligação 81 5.9.13 Transformação química de bactérias 81 5.9.14 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) 82 5.9.15 Digestão do vetor pfastbac TM 1 contendo a região madura de 82 LiD1 com BamH I 5.9.16 PCR para confirmação da correta orientação do inserto LiD1 no 82 vetor pfastbac TM 1 5.9.17 Seqüenciamento automático capilar 83 5.10 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema 84 5.10.1 Transposição 84 5.10.2 Isolamento do DNA do bacmídeo recombinante 85 5.10.3 Análise do DNA bacmídeo 86 5.10.4 Transfecção de células Sf9 com o DNA bacmídeo recombinante 88 5.10.5 Amplificação do estoque viral 88 5.10.6 Extração de DNA de vírus secretados e não secretados 89 5.10.7 Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes LiD1 89 no sistema 5.10.8 Infecção de células de inseto com partículas virais 89 recombinantes
PÁGINA 5.10.9 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por 90 SDS-PAGE e Western Blotting 6. RESULTADOS 91 6.1 Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de 91 Loxosceles intermedia 6.1.1 Obtenção das seqüências 91 6.1.2 Tratamento das seqüências 91 6.1.3 Agrupamento das seqüências 91 6.1.4 Anotação dos uniques 91 6.1.5 Classificação dos uniques 93 6.1.6 Análises biológicas dos uniques classificados em categorias 95 funcionais 6.1.7 Modelagem molecular dos uniques 101 6.2 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia 104 6.3 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L. 104 intermedia 6.4 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no 105 vetor de transferência psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 6.5 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema 111 6.6 Bioensaio com os vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx2 116 6.7 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia 117 6.8 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de 121 transferência pfastbac TM 1 do sistema de expressão Bacto-Bac 6.9 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema 126 7. DISCUSSÃO 131 7.1 Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de 131 Loxosceles intermedia
PÁGINA 7.2 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia 136 7.3 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L. 137 intermedia 7.4 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no 138 vetor de transferência psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 7.5 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema 139 7.6 Bioensaio com os vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx2 141 7.7 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia 142 7.8 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de 145 transferência pfastbac TM 1 do sistema de expressão Bacto-Bac 7.9 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema 146 7.10 Considerações finais 148 8. CONCLUSÕES 151 9. PERSPECTIVAS 153 10. ANEXOS 154 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 157