UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS VISANDO OBTER INSUMOS BIOLÓGICOS DE INTERESSE PARA A AGRICULTURA Mestranda: Alexandra de Andrade Santos Orientadora: Dra. Márcia do Vale Barreto Figueiredo Co-orientadores: Dra. Maria Alice Gomes de Andrade Lima Dr. Mario de Andrade Lira Junior 1
INTRODUÇÃO Biopolímeros são polissacarídeos produzidos por microrganismos gomas ou exopolissacarídeos (EPSs), que tem a capacidade de formar géis e soluções viscosas em meio aquoso. (Moreira et al., 2003) No processo de produção de polissacarídeos deve-se considerar desde o microrganismo em estudo até a determinação dos parâmetros de fermentação, onde se destaca o meio de produção e sua influência na síntese, no rendimento e na composição dos exopolissacarídeos. (Faria, 2002) 2
INTRODUÇÃO Biopolímeros produzidos e utilizados comercialmente: dextrana, xantana, alginato bacteriano, gelana, celulose bacteriana. (Martins e Sá-Correia, 1993; Maugeri, 2001;Giavasis et al., 2003; Kalogiannis et al., 2003; Viet et al., 2008) Biopolímeros em estudo, porém, não são produzidos comercialmente: indicana, pululana, ciclossoforanas, succinoglucana, clairina, diutana. (Navarini et al., 1997; Maugeri, 2001; Navarrete & Shah, 2001; Chi & Zhao, 2003; Moreira et al., 2003). 3
INTRODUÇÃO Vantagens de sua obtenção em relação às outras gomas, tais como: produção independente de condições climáticas, possibilidade de utilização de matérias-primas regionais, maior rapidez na obtenção do produto acabado, necessidade de espaço relativamente pequeno, além de ser um produto biodegradável. (Souza e Garcia-Cruz, 2004; Sutherland, 2001) 4
INTRODUÇÃO Tabela 1: Produção total (g.l -1 ) de exopolissacarídeos (EPSs) sintetizados por rizóbios: Rhizobium tropici (SEMIA 4077 e SEMIA 4080); Ensifer fredii (BR 112), Ensifer melilote (SEMIA 135), Ensifer saheli (BR 526), Bradyrhizobium sp. (EI6 e NFB 700) e isolado ISOL14. Na coluna, as médias seguidas de mesma letra, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,01). Fonte: Xavier, 2009 5
INTRODUÇÃO Desenvolvimento de processos mais econômicos e aperfeiçoar a produção EPS, Obtenção de novas tecnologias para produção de insumos microbiológicos para utilização em sistemas agrícolas. 6
OBJETIVOS Objetivo geral Verificar o efeito da temperatura, tempo do cultivo e comportamento reológico (no mosto e no pó) dos polissacarídeos produzidos por microrganismos fixadores de N 2 assim como, avaliar a infectividade e eficiência simbiótica no caupi. 7
OBJETIVOS Objetivos específicos Determinar quais as melhores bactérias produtoras de polissacarídeos, em relação à quantidade; Estudar parâmetros na produção dos polissacarídeos extracelulares formado pelas estirpes de rizóbios, assim como avaliar seu comportamento reológico. Determinar a melhor temperatura na produção do biopolímero; Avaliar a infectividade e eficiência das estirpes de rizóbios utilizando biopolímeros sintetizados por rizóbios, goma xantana e polímero semi-sintético como veículo de inoculação. 8
HIPÓTESE Se o tempo de cultivo e a temperatura podem influenciar na biossíntese, composição química e propriedades reológicas dos biopolímeros, então o estudo dos diferentes parâmetros no processo fermentativo dos microrganismos diazotróficos poderá maximizar as condições operacionais na produção de EPSs, bem como se estas propriedades reológicas interfere na sobrevivência das células bacterianas nos EPSs sintetizados por estes microrganismos, induzindo uma maior nodulação e desenvolvimento do feijão. 9
Serão usados isolados do banco de germoplasma do laboratório de Biologia do solo do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), como: EI-6 (Bradyrhizobium sp.) ISOL-14 (Rhizobium) e, BR-3267 (estirpes recomendada oficialmente pela RELARE para a produção de inoculantes). 10
Primeiro Experimento: Efeito do tempo e da temperatura na síntese de EPS Produção de células: Realizada a partir de 2,5% do inóculo 200 rpm EI6 EI6 EI6 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 48h 96h 144h 48h 96h 144h ISOL14 ISOL14 ISOL14 Temperatura: 28, 38 e 48 C 11
Primeiro Experimento: Efeito do tempo e da temperatura na síntese de EPS Viscosimetria viscosímetro rotacional Brookfield, modelo LVDV II+P e banho termostático modelo TC 502. 12
Primeiro Experimento: Efeito do tempo e da temperatura na síntese de EPS Extração e purificação do EPS Banho termostatizado por Etanol P.A. 3 x Separação 20 min a 80 C 13
Primeiro Experimento: Efeito do tempo e da temperatura na síntese de EPS Massa seca do biopolímero 14
Primeiro Experimento: Efeito do tempo e da temperatura na síntese de EPS Determinação da composição química do EPS Os componentes monossacarídeos do biopolímero método de Sawardeker et al.(1965) por cromatografia líquido-gás (GLC); A dosagem do ácido urônico presente no biopolímero seguindo o método descrito por Blumenkrantz & Asboe- Hansen (1973) usando m-hidroxifenila como reagente cromogênico. 15
Segundo Experimento: Veículos alternativos para inoculação EPSs sintetizados pelas estirpes de rizóbios EI-6 ou ISOL- 14, Goma xantana, Polímero semi-sintético (carboximetilcelulase), Turfa (padrão). 16
Segundo Experimento: Veículos inoculação alternativos para Inoculação células bacterianas da estirpe padrão BR3267, recomendada pela RELARE para caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp.) Os inoculantes serão incubados por um período de 0, 15, 45, 90 e 120 dias, contagem dos microrganismos por plaqueamento em meio YEMA, pelo método da gota ( Drop-plate ), das diluições de 10 7 a 10 9. 17
Segundo Experimento: Veículos alternativos para inoculação Infecção em plantas (diluições) Delineamento experimental inteiramente casualizado, Arranjo fatorial 4 x 3, em cada tempo, Cinco repetições. 18
Terceiro Experimento: Avaliação da eficiência simbiótica em caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp). Vasos de Leonard, Areia + vermiculita na proporção 2:1, cultivar de caupi cv "IPA 205", inóculo será preparado com a estirpe padrão BR3267, recomendada pela RELARE (cultura com 10 8 células/ml), 19
Terceiro Experimento: Avaliação da eficiência simbiótica em caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp). Substrato para inoculante: o turfa, o goma xantana, o polímero semi-sintético (carboximetilcelulase) e o inoculante formulado a partir da produção do EPS. delineamento experimental blocos ao acaso, Três repetições A colheita será realizada aos 40 dias após plantio (DAP) 20
Terceiro Experimento: Avaliação da eficiência simbiótica em caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp). avaliados: o altura de plantas, o comprimento da raiz, o matéria seca da parte aérea (MSPA), da raiz (MSR) e dos nódulos (MSN), o relação MSPA/MSR, o número e tamanho de nódulos, o nitrogênio acumulado na MSPA pelo método de Kjeldahl segundo Bremner (1965), o teor de Leghemoglobina (LHb), mensurada em espctrofotômetro (540) de acordo com Wilsom & Reisenauer (1963) o e nodulação específica (Gulden & Vessey, 1998). 21
Análise Estatística: Os dados serão submetidos à análise de variância, utilizando o Guided Data Analysis Procedure do SAS (SAS Institute, 1999), com nivel de significância de 5% pelo teste F e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05). 22
RELEVÂNCIA DO PROJETO Geração de produtos agroindustriais com inovações tecnológicas utilizando matérias primas de baixo custo visando repercussão no impacto ambiental. Gerar pela via convencional agronômica e através da biotecnologia, novos insumos microbiológicos para utilização em sistemas agrícolas. 23
GRATA PELA ATENÇÃO andradex82@hotmail.com 24