Fatores Físicos e Químicos que Influenciam a Fermentação Alcoólica Prof. Clóvis Parazzi
O que se deseja de um processo fermentativo? Elevado Rendimento Uniformidade na produção de metabólitos pela levedura Qualidade do produto final (cervejarias, bebidas fermentadas e destiladas )
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Produtos e Subprodutos ( Jackman, E.A, 1987) Etanol... 45-49 % CO 2... 43-47 % Glicerol... 02-05 % Ácido Succínico... 0,5-1,5 % Ácido Acético... 0-1,4 % Ácido málico... 0-0,3 % Biomassa... 0,7-1,7 % Óleo Fúsel... 0,2-0,6 % Butileno Glicol... 0,2-0,6 %
LEVEDURAS ALCOÓLICAS Saccharomyces cerevisae, S. elipsoideus, S. anmensis, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula ( Camhi,1979). Leveduras de panificação ou selecionadas em laboratório usadas na fermentação são inadequadas por desaparecerem logo no início da safra e são substituídas por outras oriundas da biodiversidade ambiental. (Basso et.al., 1993). Linhagens selvagens selecionadas pelo caráter de dominância e persistência na indústria.
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA PRINCIPAIS FATORES QUE AFETAM A FERMENTAÇÃO Substrato composição química do meio produtos: açúcar, álcool, ácidos, etc. nutrientes: N, K, P, Mg, Mn, etc. Microrganismo constituição e estágio dos microrganismo leveduras e contaminantes. Condições físicas e ambientais Temperatura ph (acidez) aerobiose/anaerobiose Sistemas de fermentação contínuo e descontínuo. Outros
FATORES QUE LIMITAM A PRODUTIVIDADE a) NUTRIENTES MINERAIS N, P, K, Mg, Zn, Mn b) AGENTES TÓXICOS ALUMÍNIO, SULFITO, EXCESSO K + e Ca ++ c) TEMPERATURA ELEVADA d) CONCENTRAÇÃO DE ETANOL e) ACIDEZ (ph) f) PRESSÃO OSMÓTICA AÇÚCARES E SAIS g) CONTAMINAÇÃO BACTÉRIA e LEVEDURAS Condições estressantes para a levedura
Como as Leveduras Respondem as Mudanças do Meio
LEVEDURA CONDIÇÕES ESTRESSANTES Nutrientes Temperatura Pressão Osmótica ph Álcool Oxidantes metais pesados
TEMPERATURA Efeito da temperatura a) Fatores externos Mudanças na temperatura da água, clima e mosto b) Fatores intrínsicos Calor liberado na fermentação Influência da temperatura na variação do tempo de geração e do coeficiente específico de crescimento para a linhagem da levedura Saccharomyces cerevisiae Temperatura Tempo de geração (h) Coef. espec. de cresc. g/l/h -1 20 5 0.15 24 3.5 0.21 27 3.0 0.30 30 2.2 0.31 36 2.1 0.29 38-0.19 40 4.0 -
TEMPERATURA Efeito interativo de temperatura e espécie de levedura
TAXA DE CRESCIMENTO X TEMPERATURA Fonte: LALUCE et.al., 1995.
TEMPERATURA DA FERMENTAÇÃO Influência direta sobre a fermentação Favorece multiplicação bacteriana Floculação Acima 35 o C afeta desempenho da levedura Redução da viabilidade de leveduras Diminui rendimento da fermentação Temperatura ótima Crescimento... 30 a 34 C Fermentação...32 a 36 C
TEMPERATURA X VIABILIDADE 95,0 VINHO VIABILIDADE 94,0 93,0 92,0 91,0 90,0 89,0 32,8 33,3 33,8 VINHO TEMP. MÁXIMA Y = 244,57798-4,54762 X (* r = -0,80498) Fonte: Fermentec, 2002
TEMPERATURA FERMENTAÇÃO X CONTAMINAÇÃO VINHO 194 VINHO BAST. x 10^6 144 94 44-6 -56 32,0 33,0 34,0 35,0 36,0 37,0 VINHO TEMP. MÁXIMA Y = -1721,24045 + 52,10960 X (** r = 0,78442) Fonte: Fermentec, 2002
ph Crescimento ph 3.0 a 8.0 Produção de Biomassa ph 4 a 6. Fermentação ph Inicial 4,2 a,5,1 Reduz a ph 3,9-4,1. Produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae em função do tempo de cultivo em melaço de soja (Ayube M. A Z., 2002).
EFEITO DO ph NA ATIVIDADE DA INVERTASE DE LEVEDURA --- invertase purificada célula intacta
ATIVIDADES DE INVERTASES H 2 O FRUTOSE O INVERTASE + GLICOSE SACAROSE
Condições Ambientais (Substrato x Produto) Efeitos da concentração de etanol e glicose sobre o metabolismo de S. cerevisiae. >16% <10%
VIAS DE DEGRADAÇÃO DE CARBOIDRATOS E A PRODUÇÃO DE ETANOL.
FATORES INTERFERENTES NO METABOLISMO DA LEVEDURA. (>16%) Efeito da condição ambiental sobre o comportamento metabólico em S. cerevisiae (<10%) Gráfico de velocidades de consumo de açúcar, produção de etanol e crescimento de leveduras numa fermentação alcoólica (HORAS)
a) Glicose > 15,0% (150 g/l) inibe enzimas fermentativas. de 0,3 a 10% inibição seletiva da respiração. 5% em meio aeróbico via fermentativa completa (mitocôndria é reprimida e citocromo não funcionais). glicose e oxigênio alto catabolismo oxidativo / respiração (não há fermentação) efeito Pasteur b) Oxigênio / Agitação aeração moderada auxilia na suspensão das células mais do que efeito direto do oxigênio (maior superfície de contato). É capaz de induzir a respiração na dependência de concentração de glicose do meio.
GLICOSE CRESCIMENTO 2% a 5% de açúcar no meio (biomassa). CONCENTRAÇÃO LIMITE 25 A 30% Produção de etanol passa a ser prejudicada Biomassa diminui.
c) Efeito da concentração de Etanol inibe a atividade metabólica e leva a morte (sem condição de sobrevivência); limite no vinho 12% de álcool variável (espécie e linhagem de leveduras e condições da fermentação). Influência do etanol na fermentação (Franz, 1961)
O Estresse da levedura TIPOS Térmico - temperaturas elevadas Oxidativo - produtos de oxidação Osmótico - presença de sais,alcoois, etc,
Principais fatores que podem induzir à levedura ao estresse * características operacionais SA-1 * composição química do mosto * presença de sais (excesso de potássio no meio) * concentração de álcoois superiores (isoamílico) * deficiência de nutrientes (N)
Choque Osmótico A levedura produz glicerol para se defender A resposta leva cerca de 1 minuto O glicerol tem a função de osmorregulador
ATIVIDADES DE INVERTASE Pode levar ao estresse osmótico H 2 O FRUTOSE O INVERTASE + GLICOSE SACAROSE (1 MOLÉCULA) (2 MOLÉCULAS) MAIOR PRESSÃO OSMÓTICA
Diferença Entre Linhagens Consumo de Açúcar (Alves, 2000)
ÁCIDO MÁLICO GLICEROL
LEVEDURAS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE INVERTASE. PODE SE OBTER MELHOR DESEMPENHO DAS LEVEDURAS EVITANDO O CHOQUE OSMÓTICO. LEVEDURAS - ALTA ATIVIDADE DE INVERTASE - DEVE-SE ALIMENTAR MAIS VAGAROSAMENTE. LEVEDURAS - BAIXA ATIVIDADE DE INVERTASE PODE SE ALIMENTAR EM MENOR TEMPO.
NUTRIENTES Esquema geral do metabolismo da levedura
BIOMASSA ÁCIDOS NUCLEICOS K + Mg ++ P NADP + NADPH + H + PENTOSES P (1) GLUCOSE P FRUTOSE P ATP ADP FRUTOSE P TREALOSE GLICOGÊNIO (RESERVA) - P NH 4 + Mg ++ K + PROTEÍNAS E ENZIMAS DIHIDROXIACETONA P NADH + H + NAD P GLICEROL K + Mn ++ AMINOÁCIDOS S SUCCINATO ALDEÍDOS ÁCIDOS GRAXOS N Pulmão ácidos (KREBS) ALCOOIS (2) GLICERALDEIDO Cu ++ PIRUVATO Fe +++ Mg ++ Zn ++ CO 2 ESTERES Zn ++ P ALDEIDO ACÉTICO NADH + H + NAD ETANOL CO 2 Mn ++
Nutrientes K Mg Ca Ti Mn Fe Cu Mo. Co, B Funções Ativador enzimático inclusive de reações da glicólise; estabilizador de membranas; necessário para a absorção do H2P04 aumenta a tolerância para iônios tóxicos, inclusive H, controlando o ph intracelular; participa da absorção, por troca, de catiônios bivalentes (Zn e Co). Ativador enzimático no processo glicolítico de transferases e carboxilases; estimula a absorção de H2P04 incrementando a fermentação; mantém a integridade e permeabilidade das membranas e regula o transporte de catiônios bivalentes. Sofre ação antagônica do Ca++. Parece não ser importante para fermentações e multiplicação. Mantém integridade da membrana plasmática em condições adversas. Ativa ATPase em concentração 1 mm, mas se mostra inibidor a 10 mm. Inibe absorção de aminoácidos em conc. de 1 mm e inibe o crescimento em conc. de 25 mm. Participa da glicólise e da síntese de vitaminas, sendo essencial ao crescimento e á fermentação. Não é substituído por nenhum outro íon em suas funções; é integrante de desidrogenases, aldolases e desulfidrases. A absorção é reduzida, em ph abaixo de 5 e é efetuada mediante troca com 2 íons K+. Estimula a síntese de proteínas e tiarnina; aumenta o teor de desidrogenase. Participa do sitio ativo de diversas enzimas (hemoenzimas). Requerido para multiplicação na concentração de 1 a 3 μm. Concentrações de 10 a 15 μm inibem crescimento e fermentação. Integrante de algumas enzimas; em concentrações de 1 a 1,5 μm estimula fermentação e crescimento, já em conc. de 10 μm inibe o crescimento Estimulam crescimento e fermentação em baixas concentrações (1μM). Inibição com concentrações acima de 5μM. Principais nutrientes e suas funções (fonte: Rodney e Greenfield (1984))
NUTRIENTES Condições de estresse para leveduras Trealose Mudanças morfológicas na células de leveduras podem ser entendidas como resposta ao desbalanço de nutrientes do caldo de cana-de-açúcar (Kuriyama Slaghter, 1995). &
Pseudo-hifas Linhagens de Saccharomyces cerevisiae sofrem transição dimórfica que envolve mudanças na forma das células e no padrão de divisão celular, resultando em crescimento filamentoso como resposta à deficiência de nitrogênio (Gimeno et al., 1992); Os produtos principais do catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada, os chamados álcoois superiores (óleo fúsel), são responsáveis pela transição dimórfica das células (Dickinson, 1996).
DEFICIÊNCIA DE NITROGÊNIO (Silva & Parazzi, 2002) Tabela 1. Crescimento em meio sólido com ausência de nitrogênio. Linhagens Crescimento Pseudohifas FL células agrupadas não presente SM4 formação de cachos não presente SL3 pouco agrupadas presente
Pseudo-hifas Crescimento Normal Crescimento com pseudo-hifas
Pseudo-hifas
LEVEDURAS DIMÓRFICAS Alterações na forma das células e no padrão de divisão celular. *Crescimento filamentoso (Pseudohifas). deficiência de nitrogênio produtos do catabolismo de aminoácido álcoois superiores, oleo fúsel - estresse metabólico mudanças genéticas (Kuryama & Slaghter, 1995; Dickinson, 1996) * Ocorrem principalmente: culturas em meio sólidos culturas contínuas.
COMPOSIÇÃO DO CALDO Concentração de Potássio no caldo Meio caldo extraído da cana-de-açúcar Concentração de K 2 O no caldo 1,44g/L - tratamento (T) 2,47g/L tratamento (P1) 3,35g/L tratamento (P2).
Tabela 2. Resultados obtidos após fermentação. Massa Seca* (g/100ml) ART vinho* (g/100ml) Ef.Fermentativa* (%) Lev/ Trat P1 P2 T P1 P2 T P1 P2 T FL 5,72 5,42 8,69 1,81 3,61 1,18 80,31 79,91 72,16 SL3 3,86 2,82 3,80 3,18 4,18 2,63 72,42 64,16 74,20 SM4 3,90 2,35 5,18 3,17 4,26 2,68 61,40 56,41 66,16 Média 4,49 3,53 5,89 2,72 4,02 2,16 71,38 66,82 70,84 * diferenças significativas a 5% de probabilidade entre tratamentos, levedura e interação leveduras x tratamentos.
100 80 60 40 20 FL SL3 SM 4 0 P1 P2 T Eficiência Média de três ciclos fermentativos (%).
LEVEDURAS COM ALTO DESEMPENHO FERMENTATIVO SUPORTAR OS ESTRESSES DA FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL COM RECICLO DE CÉLULAS. ALTAS TEMPERATURAS ELEVADOS TEORES ALCOÓLICOS TRATAMENTO ÁCIDO PARADAS (FALTA DE AÇÚCAR) SULFITO, ALUMÍNIO, ETC PRESSÃO OSMÓTICA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA SUSTENTAR ALTA VIABILIDADE CELULAR DURANTE RECICLOS E APRESENTAR BOA EFICIÊNCIA EM ETANOL.
Comentários Finais Um pouco de estresse é bom Leva à adaptação e tolerância pelas leveduras às mudanças do meio Células em proliferação são mais sensíveis Afetam o desempenho do processo industrial
CLÓVIS PARAZZI parazi@cca.ufscar.br