76 Efeito do 6- benzilaminopurina (BAP) e do ácido indolacético (AIA) na propagação in vitro da caapeba [Pothomorphe peltata (L.) Miq.] SCHWERTNER, A.B.S. 1 *; NAGAO, E.O. 2 ; HIDALGO, A.F. 2 ; ZAFFARI, G.R. 3 1 Doutoranda do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Av. Gen. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 300, Mini-Campus, Aleixo-Manaus, AM, 69077-000. * aldecinei@yahoo.com.br. 2 Professor do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFAM, Av. Gen. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 300, Mini-Campus, Aleixo - Manaus, AM, 69077-000. E-mails: eonagao@ufam.edu.br, hidalgo@ufam.edu.br. 3 Professor do curso de Ciências Biológicas/Biotecnologia da Universidade do Vale do Itajaí UNIVALI/Epagri, Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, Rua Uruguai, 458, caixa postal 360. Itajaí, SC, 88302-202. E-mail: gzaffari@epagri.rct-sc.br. RESUMO: Caapeba ou pariparoba é um arbusto considerado medicinal pelas populações tradicionais da Região Amazônica e é utilizado no tratamento de inflamação, dor, infecções, úlceras, hepatite, leishmaniose e malária. Estudos comprovam que diferentes extratos de folhas de Pothomorphe peltata apresentam atividade antioxidante, antiinflamatória, antimalárica e inibitória contra HIV-I. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diversas concentrações do 6- benzilaminopurina (BAP) e do ácido indolacético (AIA), na regeneração in vitro de brotos a partir de folhas de P. peltata. Sementes foram desinfestadas com etanol e hipoclorito de sódio e germinadas in vitro em meio de cultura MS. Das plantas in vitro com 60 dias de idade, foram excisatas folhas e inoculadas em meio MS suplementado ou não com BAP e AIA. A resposta morfogenética de folhas usadas como explantes resultou na proliferação de brotos adventícios por organogênese direta em todos os meios de cultura MS, acrescidos ou não dos reguladores de crescimento. O melhor tratamento para a proliferação de brotos foi com meio de cultura MS adicionado de 0,5 mg L -1 de BAP. Os brotos separados, inoculados e mantidos por 30 dias em meio MS isento de reguladores de crescimento apresentaram 100% de enraizamento. Palavras-chave: Pothomorphe peltata, micropropagação, reguladores de crescimento, planta medicinal ABSTRACT: Effect of 6-benzylaminopurine (BAP) and indole-3-acetic acid (IAA) on in vitro propagation of caapeba [Pothomorphe peltata (L.) Miq.]. Caapeba or pariparoba is a small shrub used in traditional medicine for treating inflammation, pain, infections, ulcers, hepatitis, leishmaniasis and malaria in different locations in the Amazon region. Recent studies on leaf extracts revealed that this plant has a high antioxidant activity, antiinflammatory, antimalarial and inhibitory activity against HIV-I. The objective of this work was to evaluate the effect of different concentrations of the 6-benzylaminopurine (BAP) and indole-3-acetic acid (IAA) on in vitro regeneration of shoots from leaf explants. Seeds were disinfested and inoculated on a solid MS medium. After 60 days, this leaf explants were removed from seedlings, and inoculated on solid MS medium supplemented with various concentrations of growth regulators (BAP and IAA). The growth and development were evaluated 45 days after inoculation. Shoots were formed from leaves on all types of medium. The MS medium supplemented with 0.5 mg L -1 of BAP presented a higher shoot proliferation. Plantlets mainteined for 30 days on MS medium without growth regulators showed 100% rooting. Key words: Pothomorphe peltata, micropropagation, growth regulators, mediicinal plant Recebido para publicação em 27/11/2006 Aceito para publicação em 04/04/2007
77 INTRODUÇÃO As piperáceas têm sido alvo de muitas pesquisas devido às características importantes que incluem a utilização na área alimentar, de fármacos, de cosméticos e perfumaria (Lemos, 2003; Silva & Oliveira, 2000). Pothomorphe peltata (L.) Miq. (Piperaceae), é um arbusto popularmente conhecido como caapeba ou pariparoba utilizado tradicionalmente em vários locais da Região Amazônica no tratamento de inflamação (Di Stasi et al., 1994; Desmarchelier et al., 1996), dores hepáticas (Braga, 1976; Van Den Berg, 1993), infecções e úlceras (Desmarchelier et al., 1995; Desmarchelier et al., 1996), e malária (Adami et al., 1998). Estudos têm demonstrado que diferentes extratos de folhas P. peltata exercem significante atividade antioxidante (Desmarchelier et al., 1997a e b), antiinflamatória (Desmarchelier et al., 2000), antimalárica (Sala-Neto et al., 1992; Adami et al., 1998), inibitória contra HIV-I (Gustafson et al., 1992) e apresenta citotoxidade contra células tumorais em proliferação (Mongelli et al., 1999), inibindo também o crescimento celular dessas células (Pinto, 2002). Particularmente, em biotecnologia vegetal a utilização de técnicas de cultura de tecidos como a micropropagação possibilitou a multiplicação de muitas espécies medicinais, assim como algumas piperáceas já estabelecidas in vitro: Piper nigrum (Mathews & Rao, 1984; Philip et al.,1992); P. longum e P. betle (Bhat et al., 1995); Piper hispidinervium (Pescador et al., 2000) e Pothomorphe umbellata (Viana et al., 2000; Pereira et al., 2000). As mudas são produzidas em larga escala, com qualidade superior, sem destruir a planta-mãe. As plantas obtidas são fáceis de transportar para diversos países sem preocupações com introdução de novas doenças. Neste trabalho, estudaram-se os efeitos de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina e 3-ácido indolacético (AIA) na proliferação de brotos regenerados a partir de folhas de Pothomorphe peltata cultivadas in vitro. MATERIAL E MÉTODO Desinfestação de sementes de P. peltata As sementes foram obtidas a partir de espigas, coletadas no mês de setembro (época de seca), de plantas localizadas no Mini-campus Bloco V, da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA) e da UFAM em beira de mata, nas coordenadas geográficas 03 05' 59.5" S e 059 58' 36.3" W. As espigas foram lavadas em água corrente e detergente neutro. Foram retiradas sementes da parte mediana da espiga e tratadas com solução Benomil 0,1% durante dezesseis horas. Em câmara de fluxo laminar (CFL) as sementes foram lavadas em água destilada esterilizada e imersas em etanol 70% em três tempos (1, 3 e 5 minutos) e em dois tempos de imersão ao hipoclorito de sódio 0,9% (15 e 30 minutos), num fatorial 3x2. Em seguida, as sementes foram lavadas e secas em placas de Petri, contendo papel de filtro esterilizado, e inoculadas em meio de cultura Murashige & Skoog (1962) (MS) contido em placa de Petri. Cada tratamento foi constituído por 4 repetições sendo cada repetição composta de 4 placas de Petri contendo de 50 a 100 sementes. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2 0 C, em fotoperíodo de 16 horas com intensidade de luz cerca de 40 mmol cm -2 s -1. A cada trinta dias após a germinação as plântulas foram transferidas para novo meio de cultura MS para crescimento e desenvolvimento. Regeneração de brotos a partir de folhas de P. peltata Plântulas in vitro com 60 dias de idade, serviram como fontes de explantes. Folhas com 1 cm de tamanho (sem pecíolo) foram inoculadas em meio Murashige & Skoog (1962), adicionado de 3% de sacarose e 0,9% de ágar, e suplementado com diferentes concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,5; 3,0; 5,0 mg L -1 ) e AIA (0,0; 0,5; 1,5; 3,0 mg L -1 ). O delineamento experimental foi em blocos casualizados, num fatorial de 4x5, com quatro concentrações de AIA e cinco concentrações de BAP totalizando 20 tratamentos, com 4 repetições por tratamento. Aos 45 dias após a inoculação foram avaliados: número e tamanho dos brotos, número de folhas e de raízes. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de significância de 5% no sistema de análise estatística SANEST. RESULTADO E DISCUSSÃO Desinfestação de sementes de P. peltata O tratamento de desinfestação de sementes mais eficiente foi o de imersão em etanol 70% (5 min) e em hipoclorito de sódio 0,9% (30 min). Durante todo o ensaio a maior incidência de contaminação foi por fungos do gênero Fusarium, patógenos estes de comum incidência em outras piperáceas como Piper nigrum (Lemos, 2003). Regeneração de brotos a partir de folhas de P. peltata De acordo com o resumo da análise de variância os tratamentos com apenas BAP adicionado ao meio de cultura apresentaram diferenças
78 significativas para todos os itens analisados (Tabela 1). Os melhores resultados para o número médio de brotos e número médio de folhas foram obtidos com folhas inoculadas em meio MS adicionado de 0,5; 1,5 e 3,0 mg L -1 do regulador de crescimento BAP (Tabela 2 e Figura 1). No entanto, a regeneração de brotações adventícias a partir de folhas de P. peltata foi induzida por todas as combinações dos reguladores de crescimento BAP e AIA adicionadas ao meio de cultura MS, e ainda em menor grau em meio de cultura MS isento de reguladores de crescimento. A regeneração de brotações adventícias foi por organogênse direta e muito similar ao que foi descrito por Pereira et al. (2000) em segmentos de folhas de P. umbellata. Aos 45 dias da cultura foi observada a presença de pelo menos uma folha em cada broto (Figura 1). Verificou-se a regeneração de brotos adventícios a partir de folhas em meio MS isento de reguladores de crescimento, principalmente nas áreas correspondentes as nervuras próximas à inserção do pecíolo (Figura 1A), porém, o número médio de brotos formados foi dependente apenas da presença de BAP. Pereira et al. (2000) verificaram que a regeneração de brotos adventícios em P. umbellata foi dependente de 6-benziladenina e ácido naftalenoacético verificando também que em explantes foliares, com 1 cm 2 de tamanho, inoculados em meio de cultura com apenas um dos reguladores de crescimento não ocorreu a indução de organogênese. Estas diferentes respostas morfogenéticas podem estar relacionadas ao tipo de explante utilizado. Diferente de Pereira et al. (2000), neste trabalho foram usadas folhas sem pecíolo como explantes. Considerando o grande potencial de regeneração de explantes de pecíolo de Piper colubrinum (Kelkar & Krishnamurthy,1998) e da base de folha de Piper longum (Soniya & Das, 2002), foi constatado que a presença de tecidos que formam TABELA 1. Resumo da análise de variância dos tratamentos de proliferação com BAPxAIA referente ao número e tamanho de brotos, número de folhas e de raízes regenerados de folhas de Pothomorphe peltata cultivadas in vitro. UFAM, Manaus. 2005. Causas da variação G. L. Número de brotos Tamanho dos brotos Q. M. Número de folhas Número de raízes BAP 4 5,20 ** 0,02 ** 3,23 ** 14,13 ** AIA 3 0,27 NS 0,01 ** 0,36 NS 0,06 NS BAPxAIA 12 0,3 NS 0,00 ** 0,41 NS 0,11 NS Blocos 3 - - - - Resíduo 57 0,23 0,00 0,27 0,05 Média Geral 2,31 1,14 2,45 1,48 C.V 5,94% 2,99 % 21,13% 14,51% ** Significativo ao nível de 1% NS Não significativo TABELA 2. Efeito do BAP sobre o número médio de brotos, de folhas e de raízes regenerados a partir de folhas de Pothomorphe peltata cultivadas in vitro. UFAM, Manaus. 2005. Níveis de BAP (mg L -1 ) Número de brotos Número de folhas Número de raízes Médias originais Médias originais Médias originais 0 1,963 c 2,831 d 9,091 a 0,5 8,772 a 8,243 a 0,189 b 1,5 7,379 ab 6,376 ab 0,210 b 3,0 8,391 ab 5,431 bc 0,054 b 5,00 5,805 b 3,276 cd 0,100 b Médias com letras iguais: os tratamentos não diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
79 FIGURA 1. Regeneração de brotações adventícias de Pothomorphe peltata a partir de folhas inoculadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) com 3-ácido indolacético (AIA) Regeneração de brotações adventícias de Pothomorphe peltata a partir de folhas inoculadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) com 3ácido indolacético (AIA) ou 6-benzilaminopurina (BAP). UFAM, Manaus. 2005. Letras correspondentes a diferentes tratamentos. (A) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS. (B) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS com 0,5 mg L-1 de AIA. (C) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS com 1,5 mg L-1 de AIA. (D) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS com 3,0 mg L-1 de AIA. (E) Brotos formados em meio MS com 0,5 mg L-1 de BAP. (F) Brotos formados em meio MS com 1,5 mg L-1 de BAP. (G) Brotos formados em meio MS com 3,0 mg L-1 de BAP. (H) Brotos formados em meio MS com 5,0 mg L-1 de BAP. as nervuras próximas à área de inserção do pecíolo nos explantes utilizados, produziu um maior potencial morfogenético nas respostas aos meios de cultura, principalmente nos explantes inoculados em meio MS isento de reguladores de crescimento. Quanto ao número médio de raízes houve diferenças significativas entre os tratamentos. O melhor resultado foi observado em folhas inoculadas em meio com ausência de reguladores de crescimento (Figura 1A). Porém algumas folhas inoculadas em meio MS adicionado de AIA regeneraram raízes independentemente dos brotos, mas os brotos regenerados também emitiram raízes (Figura 1B-D). Pereira et al. (2000) também observaram a formação de raízes independentemente dos brotos em meio MS adicionado de diversas concentrações de ácido naftalenoacético e 6benziladenina. Para o tamanho médio dos brotos houve interação entre os diferentes tratamentos com ambos reguladores de crescimento, as médias comparadas constam na Tabela 3. Foi observado que nas folhas inoculadas em meio de cultura com ausência de reguladores de crescimento o tamanho médio dos brotos foi maior (0,6 cm), quando comparado aos outros tratamentos (Tabela 3). Entre os tratamentos com a presença de reguladores, os brotos regenerados em meio de cultura MS com 0,5 e 1,5 mg L-1 de AIA apresentaram o tamanho médio dos brotos significativamente maior quando comparados aos brotos regenerados em meio de cultura MS contendo BAP ou ambos os reguladores de crescimento. Entretanto, o tamanho médio desses brotos foi menor que 0,5 cm conforme o observado também por Pereira et al. (2000). CONCLUSÃO Os agentes desinfestantes etanol 70% e hipoclorito de sódio 0,9% foram eficientes na desinfestação superficial das sementes de Pothomorphe peltata. A presença de reguladores de crescimento promoveu o processo de morfogênese de brotações adventícias a partir de folhas de P. peltata obtida por meio da organogênese direta.
80 TABELA 3. Interação para os níveis de BAP x AIA referente ao tamanho médio dos brotos regenerados a partir de folhas de Pothomorphe peltata cultivadas in vitro. UFAM, Manaus. 2005. BAP (mg L -1 ) AIA (mg L -1 ) 0 0,5 1,5 3,0 Médias de BAP 0 0,611 A a 0,414 A b 0,442 A b 0,227 A c 0,424 a 0,5 0,302 B a 0,297 AB a 0,277 B a 0,225 A a 0,275 b 1,5 0,270 B a 0,317 AB a 0,314 AB a 0,210 A a 0,278 b 3 0,235 B a 0,264 AB a 0,252 B a 0,267 A a 0,255 b 5 0,240 B a 0,235 B a 0,230 B a 0,232 A a 0,234 b Médias de AIA 0,332 A 0,305 A 0,303 A 0,232 B Na vertical, colunas referentes ao AIA: para letras maiúsculas iguais, os tratamentos não diferem significativamente. Na horizontal, linhas referentes ao BAP: para letras minúsculas iguais, os tratamentos não diferem significativamente. Nível de significância de 5% pelo teste de Tukey. A adição de BAP ao meio MS induziu maior número médio de brotos adventícios em folhas de P. peltata. Entretanto, o BAP inibiu o crescimento e desenvolvimento dos brotos, os quais apresentaram menor tamanho se comparados aos brotos proliferados em meio MS isento de reguladores de crescimento ou adicionado de AIA. AGRADECIMENTO Aos professores da Universidade Federal do Amazonas e da Universidade do Vale do Itajaí pela orientação e colaboração no Mestrado. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas pelo apoio financeiro. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ADAMI, Y.L. et al. In vitro antimalarial activity of crude extracts of Pothomorphe peltata and P. umbellata (Piperaceae). Tropical Medicine, v.40, p.91-4, 1998. BRAGA, R. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. 3.ed. Mossoró: Coleção Mossoerense, 1976. 540p. BHAT, S.R.; CHANDEL, K.P.S.; MALIK, S.K. Plant regeneration from various explants of cultivated Piper species. Plant Cell Reports, v.14, n.6, p.398-402, 1995. DESMARCHELIER, C. et al. Etnobotanica y bioactividad de plantas medicinales utilizadas por un grupo indígena Takana de la Amazonía peruana. Acta Farmaceutica Bonaerense, v.14, p.195-208, 1995. DESMARCHELIER, C. et al. Ritual and medicinal plants of the Eseíejas of the Amazonian rainforest (Madre de Dios, Perÿ). Journal of Ethnopharmacology, v.52, p.45-51, 1996. DESMARCHELIER, C. et al. 4-Nerolidylcatechol from Pothomorphe spp. scavenges peroxyl radicals and inhibits Fe(II)-dependent DNA damage. Planta Medica, v.63, n.6, p.561-3, 1997a. DESMARCHELIER, C. et al. Inhibition of lipid peroxidation and iron (II)-dependent DNA damage by extracts of Pothomorphe peltata (L.) Miq. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, n.30, p.85-91, 1997b. DESMARCHELIER, C.; SLOWING, K.; CICCIA, G. Antiinflammatory activity of Pothomorphe peltata leaf methanol extract. Fitoterapia, v.71, n.5, p.556-8, 2000. DI STASI, L.C. et al. Medicinal plants popularly used in Brazilian Amazon. Fitoterapia, v.65, p.529-40, 1994. GUSTAFSON, K.R. et al. The peltatols, novel HIV-inhibitory catechol derivatives from Pothomorphe peltata. Journal of Organic Chemistry, v.57, p.2809-11, 1992. KELKAR, S.M.; KRISHNAMURTHY, K.V. Adventitious shoot regeneration from root, internode, petiole and leaf explants of Piper colubrinum Link. Plant Cell Reports, v.17, p.721-5, 1998. LEMOS, O.F. Mutagênese e tecnologia in vitro no melhoramento genético da pimenta-do-reino (Piper nigrum L.). 2003. 159 p. Tese (Génética e Melhoramento de Plantas)-Escola Superior de Agronomia Luiz de Queiroz - Universidade de São Paulo, Piracicaba. MATHEWS H.V.; RAO, P.S. In vitro responses of black pepper (Piper nigrum). Current Science, v.53, p.183-6, 1984. MONGELLI, E. et al. Cytotoxic 4-nerolidylcatechol from Pothomorphe peltata inhibits topoisomerase I activity. Planta Medica, v.65, n.4, p.376-8, 1999. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, v.15, p.473-97, 1962. PEREIRA, A.M.S. et al. Micropropagation of Pothomorphe umbellata via direct organogenesis from leaf explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.60, p.47-53, 2000. PESCADOR, R. et al. Biotecnologia da Piper hispidinervium - Pimenta Longa. Protocolos para obtenção de Safrol. Revista Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento, v.15, p.18-23, 2000. PHILIP, V.J. et al. Micropropagation of black pepper (Piper nigrum L.) through shoot tip cultures. Plant Cell Report, v.12, p.41-4, 1992.
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