Luísa Nogueira Domingues

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1 Luísa Nogueira Domingues Práticas de controle e perfil de suscetibilidade de Haematobia irritans irritans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) à cipermetrina e clorpirifós na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, 2010 Tese apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária, como pré-requisito para conclusão do curso de doutorado em Ciência Animal. Área de Concentração: Medicina Veterinária Preventiva. Orientador: Prof. Romário Cerqueira Leite Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG 2011

2 D671p Domingues, Luísa Nogueira, Práticas de controle e perfil de suscetibilidade de Haematobia irritans irritans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) à cipermetrina e clorpirifós na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, 2010 / Luísa Nogueira Domingues p. :il. Orientador: Romário Cerqueira Leite Tese (doutorado) Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária 1. Bovino Parasito Teses. 2. Carrapato de bovino Controle - Teses. 3. Carrapato Resistência aos inseticidas Teses. 4. Mosca-do- Chifre Teses. I. Leite, Romário Cerqueira. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. III. Título. CDD

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5 À minha mãe Edna Martha, meus irmãos Felipe e Martha e meu namorado Cleiton Abílio pelo apoio e cumplicidade. Aos meus amigos Ana Bello, Arildo Cunha e Ricardo Dalla Rosa por toda ajuda. A realização deste trabalho não seria possível sem a cooperação de vocês. 5

6 AGRADECIMENTOS A Deus por me guiar e abençoar com mais esta conquista. Aos meus orientadores Dr. Romário Cerqueira Leite, Dr. Antonio Thadeu Medeiros de Barros e Dr. Paulo Roberto Oliveira por me apoiarem nesta pesquisa e pela dedicação e contribuição à minha formação. Aos membros das bancas de qualificação, pré-defesa e defesa pelas sugestões e correções que enriqueceram este trabalho. Aos professores e funcionários da Escola de Veterinária, em especial ao professor Dr. Rômulo Cerqueira Leite, pela ajuda na confecção das redes entomológicas e preparo das placas de Petri. À minha mãe Edna Martha N. Domingues, meus irmãos, Felipe N. Domingues e Martha N. Domingues, tios e primos pela compreensão nos momentos de ausência e apoio nos momentos de angústia. À Tia Marlúcia L. Nogueira e sua família pela recepção dos carrapatos. À Tia Rita Knop pela correção ortográfica e gramatical. Aos meus colegas do Laboratório de Doenças Parasitárias da EV/UFMG, pela ajuda durante todo o desenvolvimento deste trabalho e introdução às expressões e realidades do mundo veterinário, especialmente à Ana Cristina P. P. Bello, Arildo P. da Cunha e Ricardo C. Dalla Rosa, companheiros essenciais para o desenvolvimento deste estudo. À Patrícia V. B. Leite e Daniel S. Rodrigues por tornarem possível a realização dos testes pilotos. Luiza B. Leite e Talita P. Resende pela ajuda na realização dos bioensaios. À Dr. Márcia C. Mendes pelos ensinamentos relacionados à realização dos bioensaios com o carrapato-do-boi e pela doação da cepa Porto Alegre. Ao Dr. João Ricardo de S. Martins pela doação da cepa Mozo. Ao Dr. Felix Guerrero pela doação da cepa San Felipe. À Dr. Lygia Maria F. Passos, Dr. Kurt Pfister, Dr. Cornelia Silaghi e todos os funcionários do Instituto de Parasitologia e Medicina Tropical Comparada da Ludwig-Maximilians-Universität por me receberem, ensinar e possibilitar a realização de experimentos nessa instituição. Ao Sr. Robert Pohl, Sra. Marianne Pohl e sua família por me receberem e me hospedarem na Alemanha, tornando a minha estadia nesse país ainda mais fascinante. À Associação Brasileira dos Criadores de Girolando pela ajuda na organização das visitas. Ao IFTM Instituto Federal do Triângulo Mineiro e todos os proprietários e funcionários que participaram deste trabalho, por nos receberem com educação e gentileza e permitirem a coleta de informações e a realização dos bioensaios. Às empresas AllVet e Ouro Fino pela doação dos princípios ativos utilizados nos bioensaios. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro ao projeto de pesquisa e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelas bolsas de doutorado e de doutorado-sanduíche a mim concedidas. 6

7 SUMÁRIO RESUMO... 9 ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Haematobia irritans irritans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) Resistência a inseticidas/acaricidas OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Período de realização dos experimentos e localização das propriedades Caracterização das práticas de controle Bioensaios com H. irritans Preparação dos papéis de filtro impregnados com cipermetrina e clorpirifós Realização dos bioensaios Bioensaios com larvas de R. (B.) microplus Preparação dos papéis de filtro impregnados com cipermetrina e clorpirifós Realização do Teste do Pacote com Larvas Avaliação da ocorrência do mecanismo de resistência a piretróides - insensibilidade do sítio de ação Extração de DNA Realização do PCR alelo específico Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização das práticas de controle Bioensaios com H. irritans Bioensaios com larvas de R. (B.) microplus Avaliação da ocorrência do mecanismo de resistência a piretróides - insensibilidade do sítio de ação CONCLUSÕES CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS Anexo I Anexo II Anexo III Anexo IV

8 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Ocorrência de Haematobia irritans e Rhipicephalus (B.) microplus na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Tabela 2: Número de tratamentos anuais realizados para o combate de Rhipicephalus (B.) microplus na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Tabela 3. Composição dos produtos utilizados para o controle de Haematobia irritans e Rhipicephalus (B.) microplus em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Tabela 4. Suscetibilidade de populações de Haematobia irritans a inseticidas, avaliada em bioensaios com papel de filtro impregnado, na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais, em abril/ Tabela 5. Suscetibilidade de populações de Rhipicephalus (B.) microplus à cipermetrina e clorpirifós, avaliada pelo Teste do Pacote com Larvas, na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais, em abril/ LISTA DE FIGURAS Figura 1: Bioensaio com Haematobia irritans. A: diluição do princípio ativo. B e C: impregnação dos papéis de filtro (laboratório de Doenças Parasitárias DMVP EV/UFMG, abril/2010). D a G: realização do bioensaios (propriedades da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Parnaíba, MG, abril/2010). H: aspirador manual (confeccionado de acordo com A. T. M. Barros) Figura 2. Bioensaio com larvas de Rhipicephalus (B.) microplus (laboratório de Doenças Parasitárias DMVP EV/UFMG). A: diluição dos princípios ativos. B: impregnação dos papéis de filtro (abril/2010). C: transferência dos ovos para recipientes de vidro. D, E, F: exposição das larvas aos princípios ativos. G: leitura da mortalidade (abril a junho/2010) Figura 3: Tamanho dos rebanhos de propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Figura 4: Tipo do rebanho de propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Figura 5: Uso de equipamentos de aspersão para controle parasitário em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Figura 6: Local de realização dos banhos de aspersão para controle parasitário em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Figura 7: Critérios utilizados para escolha de produtos inseticidas/carrapaticidas em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Figura 8: Fontes de informação sobre o controle de Haematobia irritans e Rhipicephalus (B.) microplus em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/ Figura 9: PCR alelo específico com larvas de R. (B.) microplus de propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais e da população suscetível de referência, abril/2010. Reação utilizando primer FG-227 e FG- 221 (S) ou FG-227 e FG-222 (R). Controle positivo = Cepa San Felipe e controle negativo contém água ao invés de DNA na reação. Foto Representativa

9 RESUMO Este estudo teve como objetivos caracterizar práticas adotadas para o controle da mosca-doschifres, Haematobia irritans, e do carrapato-do-boi, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG; avaliar a suscetibilidade destes parasitos ao piretróide cipermetrina e ao organofosforado clorpirifós; e verificar a ocorrência do mecanismo de resistência à piretróides, insensibilidade do sítio de ação, mediado pela substituição T2134A, no segmento S6 do domínio III, do canal de sódio, nas populações de R. (B.) microplus. Em abril/2010, 23 propriedades foram visitadas e foram realizadas entrevistas semiestruturadas, para caracterização das práticas de controle dos ectoparasitos. A suscetibilidade das populações de mosca-dos-chifres foi avaliada por bioensaios com papéis de filtro impregnados com cipermetrina ou clorpirifós, em nove e duas propriedades, respectivamente. A suscetibilidade das populações de carrapato-do-boi aos referidos princípios ativos foi analisada pelo Teste do Pacote com Larvas, com populações provenientes de sete propriedades. A ocorrência da mutação T2134A foi averiguada por PCR alelo específico, em larvas de R. (B.) microplus, de 10 propriedades. A maioria dos entrevistados conhecia características relativas à epidemiologia dos parasitos, mas realizava o controle sem critérios técnicos. Apesar do reconhecimento da importância de H. irritans, o controle, da mesma, não era uma prática rotineira em 82,61% das propriedades. Todas as populações de mosca-dos-chifres avaliadas foram resistentes à cipermetrina (47,3 < FR < 400,6) e suscetíveis ao clorpirifós (FR < 0,01), enquanto todas as populações de R. (B.) microplus foram resistentes à cipermetrina (16,0 < FR < 25,0) e 85,71% ao clorpirifós (2,2 < FR < 15,6). Todas as larvas do carrapato-do-boi foram homozigotas suscetíveis para a mutação pesquisada. Palavras-chave: mosca-dos-chifres, carrapato-do-boi, resistência, bioensaios, PCR alelo específico, insensibilidade do sítio de ação ABSTRACT This study aimed to characterize control practices adopted for controlling the horn fly, Haematobia irritans, and the cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, in cattle ranches in the regions of Triângulo Mineiro and Alto Paranaíba, Minas Gerais state, as well as to evaluate the susceptibility of these parasites to the pyrethroid cypermethrin and the organophosphate chlorpyrifos, and verify the occurrence of the mechanism of resistance to pyrethroids - target site insensitivity mediated by the T2134A substitution in the segment S6 domain III of the sodium channel, in R. (B.) microplus populations. Twenty-three ranches were visited on April/2010 and structured interviews were conducted to characterize parasite control practices. Insecticide susceptibility of horn flies to cypermethrin and chlorpyrifos was assessed in nine and two ranches, respectively, by the impregnated filter paper bioassay. Susceptibility of cattle tick populations to both active ingredients was evaluated by the Larval Packet Test, in individuals from seven ranches. Mutation occurrence was evaluated by an allele specific PCR in larvae of R. (B.) microplus from 10 ranches. Most of the interviewees were aware of characteristics regarding the epidemiology of parasites, but control of parasites was made without technical criteria. Despite recognizing the importance of H. irritans, its control was not a routine practice in 82.61% ranches. All horn fly populations were resistant to cypermethrin (47.3 < RF < 400.6) and susceptible to chlorpyrifos (RF < 0.01), while all R. (B.) microplus populations were resistant to cypermethrin (16.0 < RF < 25.0) and 85.71% to chlorpyrifos (2.2 < RF < 15.6). All cattle tick larvae were homozygous susceptible to the studied mutation. Keywords: horn fly, cattle tick, resistance, bioassays, allele specific PCR, target site insensitivity 9

10 1. INTRODUÇÃO As parasitoses dos animais determinam um significativo entrave para a pecuária nacional, pois causam redução na produtividade, mortalidade de animais, aumento dos custos de produção, além de gastos com as tentativas de controle. Considerando as vendas realizadas pela indústria de medicamentos veterinários no Brasil, pode-se estimar o impacto das parasitoses nos sistemas de produção. Para um faturamento da indústria de medicamentos veterinários de quase três bilhões de reais no ano de 2009, 34,02% (R$ ,00) foram de produtos antiparasitários, valores estes que apresentaram tendência crescente nos últimos cinco anos (Mercado, 2011). A mosca-dos-chifres, Haematobia irritans irritans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) e o carrapato-do-boi, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) são considerados importantes ectoparasitos da pecuária bovina brasileira, causando prejuízos estimados em U$865 milhões e U$2 bilhões anuais, respectivamente (Grisi et al., 2002; Bianchin et al., 2006). Tais prejuízos estão relacionados ao hábito alimentar destas espécies - a hematofagia, que gera uma intensa irritação aos animais, no caso da mosca-dos-chifres e espoliação sanguínea, no caso de R. (B.) microplus. Este quadro provoca redução na produção (carne e leite) e fertilidade, aumento na mortalidade e consumo de produtos para controle destes parasitos, além de danos ao couro. A mosca-dos-chifres atua, ainda, como vetor do nematódeo Stephanofilaria spp. (Filarioidea: Filariidae) (Dies e Pritchard, 1985; Miyakawa et al., 2009) e de ovos de Dermatobia hominis (Diptera: Cuterebridae) (Rodríguez et al., 1998). O carrapato é vetor dos hemoparasitos Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale, agentes causadores da Tristeza Parasitária Bovina, um importante complexo parasitário dos rebanhos brasileiros (Gonzáles, 1995). O controle destes ectoparasitos baseia-se primordialmente na aplicação de ectoparasiticidas comerciais, sendo empregados produtos compostos por piretróides, organofosforados, formamidinas, reguladores de crescimento de insetos, fenilpirazol e lactonas macrocíclicas. O uso rotineiro de tais produtos, juntamente com as práticas inadequadas utilizadas para o combate dos parasitos e a falta de especificidade dos ectoparasiticidas, tem colaborado para a rápida seleção de populações resistentes. Devido ao alto custo e às dificuldades técnicas associadas ao desenvolvimento e produção de novas classes de inseticidas é fundamental a implantação de estratégias eficazes de controle de parasitos, que utilizem os antiparasitários de maneira racional, retardando o desenvolvimento de resistência e prevenindo a presença de resíduos destes produtos no ambiente e em alimentos de origem animal. A falta de cuidados, neste sentido, pode resultar em limitações na comercialização dos produtos derivados do leite e da carne, em âmbito nacional e internacional. Os bovinos costumam estar parasitados por diferentes endo e ectoparasitos simultaneamente no campo. Propostas de controle envolvendo o combate, de mais de um parasito, concomitantemente, são mais viáveis econômica e operacionalmente e podem ter maior aceitação pelos produtores rurais. O conhecimento das características culturais e socioeconômicas das propriedades e das práticas adotadas para o controle dos parasitos, bem como do perfil de suscetibilidade dos parasitos frente aos produtos disponíveis para seu combate, são essenciais para o sucesso no desenvolvimento e implantação dos programas de controle no campo. Sendo assim, este estudo procurou caracterizar as práticas adotadas para o controle dos ectoparasitos H. irritans e R. (B.) microplus em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto 10

11 Paranaíba, MG, averiguar os níveis de suscetibilidade destes parasitos aos ectoparasiticidas cipermetrina e clorpirifós e verificar a ocorrência do mecanismo de resistência à piretróides, insensibilidade do sítio de ação, nas populações do carrapatodo-boi estudadas, por intermédio do uso combinado de técnicas de estudos sociais, testes biológicos e moleculares, cotejando os resultados encontrados nas duas espécies parasitárias. 2. REVISÃO DA LITERATURA Haematobia irritans irritans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) Haematobia irritans irritans, popularmente conhecida como mosca-dos-chifres, apresenta uma ampla distribuição geográfica, ocorrendo na Europa, norte da África, Ásia e América. A introdução deste parasito no continente americano ocorreu no final do século XIX com bovinos trazidos da Europa (Riley, 1889). No Brasil, foi primeiramente registrado na região Norte, no final da década de 70, descrita em 1983 (Valério e Guimarães, 1983) e atualmente, encontra-se distribuída em todas as regiões do país (Collares, 1990; Saueressig, 1993; Oliveira e Freitas, 1997; Barros, 2001; Martins et al., 2002; Souza et al., 2005; Bianchin et al., 2006). Sua adaptação às condições climáticas do Brasil pode ser evidenciada por sua ocorrência em todo o país e pelo aumento gradativo das infestações em algumas regiões, como demonstrado por Oliveira e Freitas (1997) e Barros et al. (2008) nos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, respectivamente. Segundo Barros et al. (2008), infestações médias durante os picos populacionais da mosca-dos-chifres no Pantanal, não ultrapassavam 85 moscas por animal pouco após a introdução da mosca na região ( ), entretanto, foram superiores a 240 moscas por animal pouco mais de uma década depois ( ). Machos e fêmeas adultos são parasitos hematófagos obrigatórios e permanecem dia e noite sobre seus hospedeiros. Parasitam especialmente bovinos, mas podem atacar bubalinos, equinos e até o homem (Honer et al., 1991). Têm maior atração por animais adultos, machos, de pelagem escura, taurinos e seus cruzamentos (Schreiber e Campbell, 1986; Honer et al., 1991; Bianchin et al., 2006). Localizam-se na parte dorsal do corpo dos hospedeiros, principalmente em regiões de maior dificuldade de acesso pelo hospedeiro, entretanto, nos horários mais quentes do dia são comumente encontradas na região ventral dos animais (McLintock e Depner, 1954; Bruce, 1964; Schreiber e Campbell, 1986; Kumarochi, 2000). As fêmeas só deixam o hospedeiro para ovipor nas fezes recém-defecadas e logo retornam ao parasitismo. A oviposição ocorre de forma parcelada (11 a 24 ovos), totalizando 100 a 200 ovos/fêmea. Em menos de 24 horas as larvas eclodem e iniciam seu desenvolvimento nas fezes até atingirem a fase de pupa, a qual ocorre na própria massa fecal ou no solo, logo abaixo destas (McLintock e Depner, 1954; Bruce, 1964; Mendes e Linhares, 1999; Kumarochi, 2000). O período de desenvolvimento de ovo a adulto depende primariamente da temperatura e há uma clara correlação negativa entre estas variáveis (Lysyk, 1992). No Brasil, Barros (2002) demonstrou que o período mínimo de desenvolvimento variou de menos de 10 dias no verão e início do outono e de 17 dias durante o inverno, o que sugere a ocorrência de 22 gerações anuais. Esta espécie apresenta diapausa na fase de pupa, mecanismo que permite a sobrevivência das moscas em regiões com baixas temperaturas durante os meses de inverno, contribuindo para manutenção da espécie mesmo em condições desfavoráveis para seu desenvolvimento (Mendes e Linhares, 1999). Estudos realizados em diferentes estados do Brasil demonstraram que a dinâmica populacional da mosca-dos-chifres segue um padrão geral, no qual temperaturas elevadas e moderada pluviosidade são favoráveis ao seu desenvolvimento. Ocorre um aumento populacional no final da 11

12 primavera, seguindo o aumento da temperatura e pluviosidade após uma estação seca e fria (inverno) e outro no outono, após a redução das chuvas mais intensas do verão (Collares, 1990; Saueressig, 1993; Oliveira e Freitas, 1997; Barros, 2001; Bianchin et al., 2006). Nos estados da região sul do país as infestações são nulas ou próximas a zero durante os meses de inverno (Martins et al., 2002; Souza et al., 2005). No início da década de 90, Honer et al. (1990) publicaram o Programa de controle da mosca-dos-chifres. I. Brasil Central. Este programa baseava-se na literatura norteamericana e australiana e preconizava o uso racional de inseticidas em todo o rebanho, no início (setembro/outubro) e final (maio) da época chuvosa, além da liberação do predador natural da mosca-dos-chifres, Digitonthophagus gazela (Coleoptera: Scarabaeidae), nas propriedades, como medida auxiliar ao controle químico. Barros et al. (1992), a partir de observações da dinâmica populacional da mosca-dos-chifres no Mato Grosso do Sul, reiterou as recomendações de Honer et al. (1990) e acrescentou a necessidade da observação do comportamento do rebanho, grau de inquietação dos animais, como medida essencial para decisão sobre a necessidade de novos tratamentos ( tratamentos táticos ) no decorrer do ano. Leite (2000), Domingues et al. (2008) e Leite et al. (2010) também recomendaram dois tratamentos ao ano na região Sudeste do país, sendo um no início da estação chuvosa e outro no fim desta estação. Contudo, para estes autores, o segundo tratamento deve ser realizado somente se observado um elevado grau de infestação e consequente inquietação do rebanho. Os referidos autores ressaltaram ainda a necessidade de infraestrutura adequada para aplicação dos produtos inseticidas, bem como a possibilidade de tratamento concomitante em propriedades vizinhas para evitar a rápida reinfestação do rebanho com moscas de propriedades próximas. Na região Sul do país, onde os picos de infestação foram registrados no mês de março (Martins et al., 2002), estes autores indicaram tratamentos no respectivo mês, a fim de minimizar os prejuízos econômicos ao produtor e diminuir o crescimento exponencial da população de mosca-doschifres. Antes da descoberta dos inseticidas sintéticos, os primeiros a serem utilizados foram os pós de piretro e de tabaco, seguidos pelo spray de piretro. Após a segunda guerra mundial, o DDT (diclorodifenil-tricloroetano) tornou-se disponível para uso contra diversas pragas, inclusive a mosca-dos-chifres. Na década de 50 surgiram os organofosforados, seguidos dos carbamatos, na década de 60. A partir dos anos 70 foram lançados no mercado os piretróides sintéticos e os reguladores de crescimento de insetos (IGRs). Posteriormente, foram introduzidas as lactonas macrocíclicas (década de 80), os fenilpirazóis (década de 90) e, mais recentemente, as spinosinas (Barros, 2003). Em detrimento do conhecimento técnico científico sobre a dinâmica populacional da mosca-dos-chifres no país, dos programas de controle existentes e das diferentes classes de produtos inseticidas disponíveis para o combate desta espécie, o controle é rotineiramente realizado de maneira incorreta (Saueressig e Barros, 2003; Rodrigues et al., 2004; Oliveira et al., 2006; Barros et al., 2007). Os produtos mais utilizados são aqueles pertencentes à classe dos piretróides, com frequência de tratamentos acima do necessário e uso sequencial ou rotação aleatória dos produtos, sem preocupação com alteração das bases químicas (Saueressig e Barros, 2003; Rodrigues et al., 2004; Oliveira et al., 2006; Barros et al., 2007) Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) O carrapato R. (B.) microplus está presente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, entre os paralelos 32 N E 32 S, sendo encontrado na América do Sul e Central, México, ilhas do Caribe, Austrália, África do Sul e alguns países da Ásia 12

13 (Gonzáles, 1995). De acordo com Nuñes et al. (1982), este parasito chegou à América do Sul por meio dos colonizadores ibéricos entre os séculos XVI e XVIII e foi introduzido no Brasil devido à importação do gado zebu da Ásia. Seu principal hospedeiro é o gado bovino, com maiores infestações nas raças taurinas do que nas zebuínas (Gomes et al., 1989; Oliveira e Alencar, 1990; Veríssimo et al., 2002). O carrapato-do-boi é um parasito monoxeno, realizando suas duas mudas em um único hospedeiro. Seu ciclo biológico pode ser dividido em duas fases, uma de vida livre, seguida de outra parasitária. A fase de vida livre inicia-se quando a teleógina se desprende do corpo do hospedeiro, cai no solo e faz a ovipostura. No ovo desenvolve-se a larva e posteriormente, no ambiente, esta se torna ativa e com capacidade infestante. Este processo demora cerca de três dias para pré-postura, duas a três semanas para a postura, que pode resultar em aproximadamente ovos por fêmea, 22 a 30 dias para a eclosão das larvas e dois a três dias para o fortalecimento de suas cutículas, transformando-as em larvas infestantes. A fase de vida parasitária iniciase com a chegada da larva infestante no hospedeiro, onde se alimenta e se transforma em metalarva. Deste ínstar origina-se a ninfa e, posteriormente, há o desenvolvimento dos adultos, machos ou fêmeas. Na fase parasitária são necessários, em média, 18 a 26 dias para a fixação, alimentação, troca de cutícula, fase adulta e acasalamento, assim como para alimentação, ingurgitamento e queda das fêmeas (Furlong, 1993; Gonzáles, 1995). As condições médias de temperatura e umidade do Brasil Central permitem a ocorrência de quatro gerações de carrapatos que se desenvolvem ao longo de todo o ano, tendo o ciclo mais curto e maiores infestações na estação quente e chuvosa, entre setembro e março (Oliveira et al., 1974; Costa, 1982; Magalhães, 1989; Guaragna et al., 1992; Lima et al., 2000; Pereira et al., 2008). Na região Sul, o frio do inverno elimina a maioria dos ovos e as larvas das pastagens, bem como retarda a postura, diminuindo as infestações sobre os bovinos, resultando em apenas três gerações anuais (Souza et al., 1988; Gonzáles, 1995; Pereira et al., 2008). A partir do conhecimento sobre os aspectos biológicos, ecológicos e de dinâmica populacional de R. (B.) microplus em diversos estados do Brasil, alguns autores desenvolveram propostas de controle deste parasito, com destaque para Magalhães e Lima (1991), Oliveira (1993), Furlong et al. (2003), Domingues et al. (2008), Pereira et al. (2008), Leite et al. (2010) e Cunha (2011), na região Sudeste do país. Magalhães e Lima (1991) propuseram o controle de R. (B.) microplus com banhos de imersão a cada 21 dias, durante quatro meses, com início no mês de novembro, época em que as formas de vida livre apresentam períodos mais curtos de desenvolvimento (Magalhães, 1989). Oliveira (1993) propôs uma estratégia de seis tratamentos carrapaticidas, entre os meses de outubro e março, com intervalos máximos de 28 dias, considerando um período modal de 22 dias de vida parasitária e um período médio de seis dias de atividade residual do produto carrapaticida. Estratégia similar a de Pereira et al. (2008). Segundo Furlong et al. (2003), o controle do carrapato-do-boi na região central do Brasil (Sudeste e Centro-Oeste) deve ser iniciado na primavera, com uma série de cinco ou seis tratamentos com banhos de aspersão em intervalos de 21 dias, ou três a quatro aplicações de carrapaticidas pour-on a cada 30 dias. Novas aplicações devem ser realizadas somente nos animais mais parasitados, caso se perceba, nestes animais, 25 ou mais fêmeas ingurgitadas em um lado do corpo. Domingues et al. (2008), Leite et al. (2010) e Cunha (2011) preconizaram tratamentos durante um período de 120 dias, com início no mês de abril, com banhos de aspersão em todo o rebanho sempre que forem observadas partenóginas (fêmeas semiingurgitadas 3 mm), em pelo menos um animal. Após este período, serão tratados 13

14 somente os animais mais parasitados ou aqueles adquiridos de outros rebanhos. Apesar da existência de diversas publicações relacionadas à epidemiologia e ao controle do carrapato-do-boi, estudos em vários estados brasileiros têm demonstrado que o controle desta espécie é rotineiramente realizado sem considerar os conhecimentos técnicos disponíveis na literatura: a rotação de produtos é feita de maneira indiscriminada, sem considerar os princípios ativos dos mesmos; ocorre um número excessivo de aplicações; o volume de solução por animal costuma ser menor que o recomendado pelo fabricante; e formulações caseiras ou produtos de uso agrícola são utilizados para o controle do carrapato-do-boi (Leite, 1988; Santos Junior et al., 2000; Rocha et al., 2006; Mendes et al., 2008; Koller et al., 2009; Santos et al., 2009; Mendes et al., 2011) Resistência a inseticidas/acaricidas Resistência a pesticidas é definida como a habilidade de uma população de parasitos de tolerar doses de tóxicos que seriam letais para a maioria dos indivíduos de uma população, de uma mesma espécie (Stone, 1972). Segundo a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO, sigla em inglês) (Guidelines, 2004) a resistência pode ser descrita como a redução da suscetibilidade de um parasito aos pesticidas, quando estas drogas são usadas na concentração recomendada e de acordo com todas as recomendações de uso. Resistência é uma característica hereditária que se desenvolve na população devido à seleção de genes resistentes, inicialmente presentes em baixas frequências nas populações (Rousch e McKenzie, 1987). A velocidade de desenvolvimento de resistência depende de fatores genéticos, biológicos e operacionais (Stone, 1972; Georghiou e Taylor, 1977; Jonsson et al., 2000; Bianchi et al., 2003; Rodriguez-Vivaz et al., 2006). Os fatores genéticos dizem respeito à frequência inicial do gene de resistência, ao grau de dominância do gene, à seleção prévia por outros inseticidas e ao grau de adaptação do genótipo (Stone, 1972, Georghiou e Taylor, 1977). Os fatores biológicos referem-se ao potencial biótico da espécie, como número de gerações ao ano e tamanho da prole, e ao comportamento do parasito (Georghiou e Taylor, 1977). Os fatores ligados ao controle são a natureza do pesticida, a relação com produtos anteriormente utilizados, a persistência do produto, o uso frequente de um mesmo produto, o número de tratamentos realizados por ano, o método de aplicação e o modo de ação do produto (Georghiou e Taylor, 1977; Jonsson et al., 2000; Bianchi et al., 2003; Rodriguez-Vivaz et al., 2006). O primeiro relato de resistência da moscados-chifres a inseticidas ocorreu na década de 60, nos Estados Unidos, a partir da constatação da ineficiência do controle com DDT e toxapheno (McDuffie, 1960). Resistência ao organofosforado fenclorfós foi comprovada em 1962, após três anos de uso intenso (Burns e Wilson, 1963). Na década de 80, pouco tempo após a introdução de brincos impregnados com piretróides no mercado americano, estudos relataram a resistência de H. irritans a esta classe, quadro que pode ter sido acelerado pela resistência cruzada entre piretróides e DDT (Quisenberry et al., 1984; Byford et al., 1985). A ocorrência de resistência cruzada entre inseticidas organofosforados foi observada por Barros et al. (2001). Embora populações de H. irritans resistentes a piretróides e organofosforados tenham sido encontradas no México (Kunz et al., 1995; García et al., 2004), a ocorrência de resistência no Uruguai, Argentina, Brasil e Chile ainda encontra-se restrita aos piretróides (Marques et al., 1997; Guglielmone et al., 2001; Barros et al., 2002; Oyarzún et al., 2011). No Brasil, a primeira descrição de resistência em populações de H. irritans ocorreu no ano de 2001, em estudo realizado no sul do país e Argentina por Guglielmone et al. (2001). Populações de mosca-dos-chifres, colhidas de 95 propriedades dos dois países, sendo três do Brasil, foram avaliadas quanto à suscetibilidade ao piretróide cipermetrina e 14

15 ao organofosforado diazinon, tendo sido encontrada resistência ao primeiro. Desde então, resistência a cipermetrina foi constatada em outros estados brasileiros como Piauí, Maranhão, Roraima, Goiás, Tocantins, Distrito Federal, Alagoas, Bahia, Sergipe, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais (Girão et al., 2002; Braga e Barros, 2003; Saueressig e Barros, 2003; Oliveira et al., 2006; Barros et al., 2007; Sabatini et al., 2009). Populações de R. (B.) microplus resistentes aos diversos princípios ativos disponíveis estão presentes em quase todos os países onde este parasito ocorre (Alonso-Díaz et al., 2006). No Brasil, na década de 50, houve o primeiro relato de resistência aos organoclorados no Rio Grande do Sul (Freire, 1953, 1956). Também neste estado, na década de 70, surgiram comprovações de resistência aos organofosforados (Arteche, 1972; Arregui et al., 1974; Souza et al., 1984). Posteriormente, detectou-se resistência aos piretróides (Laranja et al., 1989; Vargas et al., 2003; Farias et al., 2008; Camillo et al., 2009) e às lactonas macrocíclicas (Martins e Furlong, 2001). Na região Sudeste, os relatos de resistência aos organofosforados ocorreram ainda nas décadas de 70 e 80 por Patarroyo e Costa (1980) e Oliveira et al. (1986), em Minas Gerais e Rio de Janeiro, respectivamente. Também na década de 80, houve a primeira descrição de resistência aos piretróides (Leite, 1988). Desde então, houve registros de resistência à formamidina e associações entre piretróides e organofosforados (Arantes et al., 1995; Furlong e Martins, 2000). No estado de São Paulo, há comprovações de resistência às lactonas macrocíclicas e ao fenilpirazol (fipronil) além das classes anteriormente citadas (Pereira, 2006; Klafke et al., 2006; Mendes et al., 2007; Castro-Janer et al., 2010; Mendes et al., 2011). Na microrregião leiteira de Goiânia/GO, populações de R. (B.) microplus apresentaram resistência a piretróides e organofosforados, segundo estudos de Sobrinho Reinaldo et al. (1997) e Silva et al. (1997, 2000). No estado do Mato Grosso do Sul, foi encontrada resistência a estas duas classes e à formamidina (Koller et al., 2009). Segundo estudo realizado no estado de Sergipe por Oliveira e Azevedo (2002) somente uma associação de organofosforados foi eficiente no controle de R. (B.) microplus, enquanto piretróides, associações entre piretróide e organofosforado, e formamidina não obtiveram eficácia média de 95%. Quadro similar ao relatado por Campos Junior e Oliveira (2005) em propriedades do município de Ilhéus/BA. Alguns autores têm ressaltado a possível correlação entre resistência em R. (B.) microplus e o controle da mosca-doschifres. Jonsson et al. (2000), em estudo realizado na Austrália, encontraram correlação entre resistência à piretróides em populações do carrapato-do-boi e o tratamento frequente com piretróides contra a mosca-dos-chifres. Segundo documento da FAO (Guidelines, 2004), o controle de mosca-dos-chifres com produtos em concentrações inferiores às necessárias para o controle do carrapato-do-boi, contribuiu para um aumento na taxa de evolução de resistência aos acaricidas na América Latina, quadro igualmente observado por Faria et al. (2008) no Rio Grande do Sul. No mesmo documento, é ressaltado que o controle do carrapato também pode manter pressão de seleção indireta nas populações da mosca-doschifres, contribuindo assim para o aumento ou manutenção da resistência nesta espécie, situação discutida por Kunz et al. (1995) e García et al. (2004) no México. Genes resistentes surgem em decorrência de mutações naturais, que incluem amplificação gênica, alterações na regulação gênica e alterações em genes estruturais (Devonshire e Field, 1991; Scott, 1995; Soderlund e Kniple, 2003). As mutações resultam em alterações estruturais ou metabólicas que diminuem o efeito do fármaco no parasito. Estas alterações incluem: menor penetração da droga no tegumento do parasita, devido à modificação do exoesqueleto (Stone, 1972); resistência metabólica ou detoxificação, a 15

16 qual consiste na inativação da droga por enzimas detoxificativas como monooxigenases dependentes do citocromo P450, glutationa-s-transferases (GSTs) e esterases (Stone, 1972; Cilek et al., 1995; Sheppard, 1995); insensibilidade do sítio de ação (denominada knockdown resistancekdr e super-kdr no caso de resistência a piretróides), na qual ocorre uma alteração na estrutura de receptores celulares que afetam a ligação do fármaco com seu sítio de ação e consequentemente reduzem seu efeito farmacológico (Stone, 1972; Williamson et al., 1996; Pittendrigh et al., 1997; Soderlund e Kniple, 2003). Os inseticidas piretróides exercem seu efeito inseticida/acaricida ao alterar a função dos canais de sódio voltagem-dependentes nas membranas nervosas (Soderlund e Kniple, 2003; Dong, 2007). Os piretróides se ligam a estes canais, que são proteínas transmembrânicas responsáveis pela condução do sinal elétrico nos neurônios, e prolongam sua abertura, inibindo assim a desativação do canal e estabilizando a configuração aberta dos mesmos. Desta forma, há continuidade na condução dos impulsos nervosos e o parasito morre por paralisia (Soderlund e Kniple, 2003; Dong, 2007). Mutações pontuais nos canais de sódio podem ocasionar alterações estruturais nestes canais e assim diminuir a interação entre os piretróides e seu sítio alvo, reduzindo a sensibilidade dos parasitos aos acaricidas desta classe (Wang et al., 2001; Soderlund e Kniple, 2003; Tan et al., 2005; Dong, 2007). Insensibilidade do sítio de ação (kdr ou super kdr) é um dos principais mecanismos de resistência a piretróides nos artrópodes, tendo sido descrito em populações de Drosophila melanogaster (Pittendrigh et al., 1997), Musca domestica (Williamson et al., 1996) e H. irritans (Guerrero et al., 1997). He et al. (1999) identificaram uma mutação pontual no segmento S6, do domínio III, do canal de sódio de cepas mexicanas de R. (B.) microplus sabidamente resistentes a permetrina, resultante da mudança do aminoácido fenilalanina por isoleucina. Esta mutação foi pesquisada na cepa brasileira Santa Luiza, resistente a permetrina, não tendo sido encontrada (Li et al., 2008). Entretanto, a referida mutação foi encontrada, em baixas frequências, em populações de campo de R. (B.) microplus do estado de São Paulo (Mendes et al., 2010). Outras mutações relacionadas à insensibilidade do sítio de ação e resistência a piretróides foram descritas no segmento S4-5, do domínio II, do canal de sódio, em cepas do carrapato-do-boi australianas. Morgan et al. (2009) encontraram a substituição do nucleotídeo citosina por adenina na posição 190, que resulta em mudança do aminoácido leucina no indivíduo suscetível para isoleucina no indivíduo resistente, enquanto Jonsson et al. (2010) descreveram a mutação G214T (substituição do nucleotídeo guanina por uma timina) segmento S4-5 do domínio II do canal de sódio, que gera uma alteração do aminoácido glicina para valina nos indivíduos suscetíveis e resistentes, respectivamente Objetivo geral 3. OBJETIVOS Averiguar a ocorrência de resistência a pesticidas em populações de Haematobia irritans irritans e Rhipicephalus (Boophilus) microplus, da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais Objetivos específicos: Caracterizar o controle de moscas-doschifres e carrapatos-dos-bovinos, em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais; Avaliar a suscetibilidade de populações destes ectoparasitos ao piretróide cipermetrina e ao organofosforado clorpirifós, em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais; Verificar a ocorrência da mutação T2134A no segmento transmembrânico S6, do domínio III, do canal de sódio, em 16

17 populações de R. (B.) microplus, de propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Período de realização dos experimentos e localização das propriedades No mês de novembro de 2009, foram visitadas 25 propriedades da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, no estado de Minas Gerais, região com o maior rebanho e produção de leite do estado (Pesquisa, 2009). Escolheu-se esta mesorregião porque seus rebanhos constituem-se, principalmente, por animais mestiços do cruzamento Bos taurus x Bos indicus, nas diferentes proporções genéticas, o que propiciaria a presença simultânea de H. irritas e R. (B.) microplus nos animais. Em cinco propriedades foram realizadas entrevistas-piloto, compostas por perguntas semiabertas e fechadas, baseadas em um questionário, previamente utilizado em pesquisas realizadas em diversos estados do país por A. T. M. Barros e colaboradores. Estas foram entrevistaspiloto que foram realizadas com o intuito de adequar o conteúdo e a aplicação para a realidade da região em questão. As visitas às propriedades foram articuladas com o apoio da Associação Brasileira dos Criadores de Girolando, com sede em Uberaba-MG; sendo que, 21 propriedades eram cadastradas no Serviço de Controle Leiteiro desta associação. Este programa prevê o acompanhamento das fêmeas através da pesagem periódica do leite, com o objetivo de aumentar o retorno econômico ao produtor, a partir da seleção dos animais mais produtivos e a comercialização de seus embriões. Com o intuito de selecionar as concentrações de clorpirifós que seriam utilizadas nos bioensaios com a mosca-doschifres, em fevereiro e abril/2010, foram realizados testes pilotos com este princípio ativo em populações de mosca-dos-chifres de duas propriedades do estado de Minas Gerais, localizadas nos municípios de Sete Lagoas e Teófilo Otoni. Na segunda quinzena de abril/2010, uma segunda visita foi realizada em 23 propriedades, não tendo sido permitido o acesso da equipe de pesquisa às demais. As propriedades localizam-se nos municípios de Uberlândia (n = 8), Uberaba (n = 4), Ituiutaba (n = 5), Campo Florido (n = 2), Conquista (n = 1), Água Comprida (n = 1), Monte Alegre (n = 1) e Araxá (n = 1). Neste momento, realizarem-se entrevistas semiestruturadas em todas as propriedades (Anexo I), em 12 foram realizados bioensaios com as populações de moscados-chifres e em 10 foram coletadas teleóginas de R. (B.) microplus Caracterização das práticas de controle A entrevista semiestruturada tinha como objetivo caracterizar a propriedade (localização, tipo e tamanho do rebanho) e as práticas adotadas para o controle da mosca-dos-chifres e do carrapato-do-boi, tais como: principais produtos utilizados, histórico de uso de pesticidas (inseticidas, acaricidas e endectocidas), percepção de controle e/ou resistência pelos produtores, freqüência de tratamento do rebanho, intervalo, critérios de substituição e modo de aplicação dos produtos e número de animais tratados por aplicação, entre outros aspectos. A realização das entrevistas, bem como o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo II), foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais em 03 de dezembro de 2008 (Processo n ETIC 592/08) (Anexo III) Bioensaios com H. irritans Com o intuito de verificar a suscetibilidade das populações de H. irritans ao piretróide cipermetrina e ao organofosforado clorpirifós, foram conduzidos bioensaios com moscas-dos-chifres em 12 propriedades. Estes princípios ativos foram 17

18 escolhidos porque estão presentes em grande parte dos produtos inseticidas/carrapaticidas, disponíveis no mercado brasileiro, para o combate da mosca-dos-chifres e do carrapato-do-boi, inclusive em associações (Compêndio, 2011). Nos bioensaios foi utilizada a metodologia do papel de filtro impregnado descrita por Sheppard e Hinkle (1987) Preparação dos papéis de filtro impregnados com cipermetrina e clorpirifós Kits inseticidas, constituídos por papéis de filtro impregnados com distintas concentrações dos inseticidas cipermetrina (AllVet, 93,59% de pureza) e clorpirifós (Ouro Fino, 97,43% de pureza), foram confeccionados no Laboratório de Doenças Parasitárias do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, da Escola de Veterinária, da Universidade Federal de Minas Gerais (DMVP EV/UFMG), em abril/2010, para uso nos bioensaios com mosca-dos-chifres. Inicialmente, calculou-se qual a quantidade necessária de cada um dos princípios ativos para a confecção dos kits. Estes cálculos consideraram a pureza dos princípios ativos, o volume necessário de cada solução/concentração, a maior concentração de cada princípio ativo a ser utilizada e a área do papel de filtro. Após a pesagem da cipermetrina e do clorpirifós, em balança analítica digital, os referidos princípios ativos foram diluídos em acetona P. A. 1 (Merck) resultando em onze concentrações do piretróide (819,2; 409,6; 204,8; 102,4; 51,2; 25,6; 12,8; 6,4; 3,2; 1,6 e 0,8 µg/cm 2 ) e 14 concentrações do organofosforado (6,4; 3,2; 1,6; 0,8; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25; 0,20; 0,15; 0,1; 0,05 e 0,025 µg/cm 2 ) (Figura 1 A). A faixa de concentrações, utilizada neste estudo, foi estabelecida com base na literatura, consulta a especialista (A. T. M. Barros) e aos testes-piloto, de modo a possibilitar a avaliação da suscetibilidade em populações de campo, com distintos históricos de exposição a produtos inseticidas e, consequentemente, diferentes níveis de suscetibilidade. Papéis de filtro (Whatmann nº 1 com 9 cm de diâmetro) foram previamente distribuídos sobre uma bancada forrada com papelalumínio e, logo após a diluição, 1 ml de cada solução/concentração, foi aplicado aos papéis de filtro, em ordem crescente de concentrações (Figura 1 B, C). Foram utilizados três papéis de filtro por concentração (triplicatas). Os papéis permaneceram por duas horas à temperatura ambiente para secagem, sendo cada concentração (três papéis) embalada, individualmente, em papel-alumínio e armazenada em refrigerador (Brastemp BRA34A), até próximo à viagem, para realização dos bioensaios. Além dos papéis impregnados com inseticidas, cada kit continha um grupo controle, constituído por três papéis impregnados exclusivamente com acetona P. A. Durante a elaboração dos kits inseticidas, utilizados nos bioensaios a campo, foram produzidos kits com concentrações menores de cipermetrina (1,0; 0,8; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25; 0,2; 0,15; 0,1 e 0,05 µg/cm 2 ) e de clorpirifós (0,8; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25; 0,2; 0,15; 0,1; 0,05 e 0,025 µg/cm 2 ) para envio ao Knipling-Bushland US Livestock Insects Research Laboratory, USDA-ARS, Kerrville, Texas, EUA, onde foram realizados bioensaios com uma cepa suscetível de referência. Os resultados obtidos, com a população de referência, permitiram avaliar o nível de suscetibilidade/resistência das populações testadas a campo. 1 P. A. = Pronta para Análise 18

19 A B C D E F G H Figura 1: Bioensaio com Haematobia irritans. A: diluição do princípio ativo. B e C: impregnação dos papéis de filtro (laboratório de Doenças Parasitárias DMVP EV/UFMG, abril/2010). D a G: realização do bioensaios (propriedades da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Parnaíba, MG, abril/2010). H: aspirador manual (confeccionado de acordo com A. T. M. Barros). 19

20 Realização dos bioensaios No dia anterior à realização dos bioensaios no campo, os papéis de filtro foram acondicionados em placas de Petri descartáveis (plásticas, lisas, 90 x 15 mm), ficando os kits prontos para os bioensaios. As placas de Petri foram previamente furadas no centro de sua parte inferior e foram utilizadas de modo invertido, sendo o papel de filtro depositado na tampa. O orifício tinha aproximadamente 1 cm de diâmetro, de modo a permitir a colocação das moscas no interior das placas. Todos os bioensaios foram realizados no período da manhã, quando as temperaturas eram mais amenas, evitando assim maior mortalidade das moscas, devido às elevadas temperaturas do período vespertino. Os bovinos foram presos em bretes de contenção e as moscas foram coletadas, de, no mínimo, dez animais, com o auxílio de redes entomológicas. Após a coleta, aproximadamente moscas foram transferidas para cada placa de Petri, com a ajuda de um aspirador manual (A. T. M. Barros, Figura 1 H), sendo o orifício das placas tampado com etiqueta adesiva (Figura 1 D, E, F, G). Após duas horas de exposição foi realizada a leitura da mortalidade em cada placa, sendo consideradas mortas, as moscas incapazes de se locomover. Posteriormente, foi contado o número total de moscas por placa, para cálculo do percentual de mortalidade em cada concentração. Em cada propriedade, optou-se por realizar primeiramente o bioensaio com cipermetrina e havendo número suficiente de moscas, realizou-se o teste com clorpirifós Bioensaios com larvas de R. (B.) microplus Foram coletadas teleóginas (fêmeas ingurgitadas) de, no mínimo, 10 animais, de 10 propriedades. As teleóginas foram acondicionadas em recipientes plásticos com tampas perfuradas, os quais foram identificados por propriedade e enviados, via Sedex, para o Laboratório de Doenças Parasitárias (DMVP EV/UFMG), onde se realizou o Teste do Pacote com Larvas (Stone e Haydock, 1962), recomendado pela FAO (Guidelines, 2004), para avaliação da suscetibilidade das populações de R. (B.) microplus à cipermetrina e ao clorpirifós Preparação dos papéis de filtro impregnados com cipermetrina e clorpirifós Inicialmente, calculou-se a quantidade necessária de cada princípio ativo para a impregnação dos papéis de filtro. Estes cálculos consideraram a pureza dos princípios ativos, o volume total da solução e a maior concentração de cada princípio ativo a ser utilizada. Após a pesagem da cipermetrina e do clorpirifós em balança analítica digital, os princípios ativos foram diluídos em uma solução de Tricloroetileno P. A. (Synth) e Óleo de oliva (Sigma-Aldrich) na proporção de 2:1 (volume: volume), resultando em 10 concentrações de cipermetrina (5%; 4%; 2,4%; 2,04%; 1,632%; 0,9792%; 0,58752%; 0,352512%; 0, %; 0,126943%) e 10 concentrações de clorpirifós (0,128%; 0,064%; 0,032%; 0,016%; 0,008%; 0,004%; 0,002%; 0,001%; 0,0005%; 0,00025%) (Figura 2 A). A faixa de concentrações utilizada neste estudo foi estabelecida com base na literatura e consultas a especialistas (M. C. Mendes). Dois papéis de filtro Whatmann nº 1 (8,5 x 7,5 cm) foram impregnados com 0,67 ml de cada solução/concentração, além do controle (somente a solução de tricloroetileno com óleo de oliva) (Figura 2 B). Após a impregnação, os papéis permaneceram à temperatura ambiente por 24 horas para secagem, foram embalados em papel-alumínio e armazenados em refrigerador (Brastemp BRA34A), onde permaneceram até o dia da realização dos bioensaios.. 20

21 A B C D E F G Figura 2. Bioensaio com larvas de Rhipicephalus (B.) microplus (laboratório de Doenças Parasitárias DMVP EV/UFMG). A: diluição dos princípios ativos. B: impregnação dos papéis de filtro (abril/2010). C: transferência dos ovos para recipientes de vidro. D, E, F: exposição das larvas aos princípios ativos. G: leitura da mortalidade (abril a junho/2010). 21

22 Realização do Teste do Pacote com Larvas No laboratório, as teleóginas de cada propriedade foram divididas em grupos de 30 e acondicionadas em placas de Petri de vidro, as quais foram identificadas com o nome das propriedades e o dia de chegada das teleóginas ao laboratório. As placas de Petri foram mantidas por 14 dias, em câmaras incubadoras B.O.D. 2 (Fanem, 347CD), a 28ºC ± 2ºC e 85% de umidade relativa (UR) para oviposição. Ao final deste período, os ovos foram recolhidos com auxílio de uma espátula e transferidos para recipientes de vidro (Figura 2 C), que foram fechados com algodão hidrofóbico, identificados e novamente mantidos em câmaras incubadoras B.O.D., sob as mesmas condições citadas para as teleóginas. Os ovos foram misturados para assegurar que larvas de várias teleóginas fossem usadas nos bioensaios. Quatro semanas após a transferência dos ovos para os recipientes de vidro, 100 larvas com idade entre 14 a 21 dias foram retiradas destes recipientes com o auxílio de um pincel e colocadas nos papéis de filtro impregnados com os princípios ativos, que foram dobrados ao meio (Figura 2 D, E), fechados com clipes, tipo bulldog, nas laterais e extremidade superior (Figura 2 F), dispostos em bandejas plásticas, sendo mantidos em câmaras incubadoras B.O.D., por 24 horas, sob as condições anteriormente descritas. Após este período, foi realizada a contagem do número de larvas vivas e mortas em cada um dos papéis, com auxílio de uma bomba de vácuo (Primar, 141/2VC) e um microscópio estereoscópico (Micronal, Brasesit 11/37) (Figura 2 F). Larvas incapazes de se locomover foram consideradas mortas. O mesmo procedimento foi realizado com a cepa suscetível Porto Alegre, cujas larvas foram expostas a papéis de filtro contendo 0,1%; 0,06%; 0,0216%; 0,013%; 0,0078%; 2 Demanda Bioquímica de Oxigênio (B.O. D sigla em inglês) 0,0047%; 0,0028%; 0,0017% de cipermetrina e 0,128%; 0,064%; 0,032%; 0,016%; 0,008%; 0,004%; 0,002%; 0,001%; 0,0005%; 0,00025% de clorpirifós. Os resultados obtidos com a população de referência permitiram avaliar o nível de suscetibilidade/ resistência das populações testadas a campo. Esta cepa vem sendo mantida no Instituto Biológico de São Paulo sem contato com acaricidas há várias gerações Avaliação da ocorrência do mecanismo de resistência a piretróides - insensibilidade do sítio de ação Larvas, que não foram utilizadas no Teste do Pacote com Larvas, foram armazenadas em microtubos plásticos (tipo eppendorf), contendo etanol 99% e congeladas a -20ºC (Metalfrio, DA400), por sete meses. Em novembro/2010, foram levadas para o Instituto de Parasitologia e Medicina Tropical Comparada da Ludwig-Maximilians- Universität München em Munique, Alemanha, onde foram realizadas as análises moleculares Extração de DNA 3 O DNA foi extraído, individualmente, de 30 larvas de cada propriedade e da cepa suscetível Porto Alegre, com kit DNA Purification from Blood or Body Fluids (Spin Protocol) (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante, com algumas modificações: as larvas foram transferidas, com o auxílio de uma pinça, para uma placa de Petri contendo água destilada, cortadas ao meio, com uma lâmina de bisturi e transferidas para microtubos plásticos (tipo eppendorf) de 1,5 ml contendo 20 µl de proteinase K e 100 µl de Buffer AL. Os tubos contendo os pedaços das larvas e os reagentes foram centrifugados (Eppendorf 5417R) (10 s, rpm) e incubados durante a noite, a 56 C. Na manhã seguinte, realizou-se uma nova centrifugação (10 s, rpm) e adicionou-se 200 µl de Buffer AL a cada 3 Ácido Desoxirribonucleico (DNA, sigla em inglês) 22

23 tubo. Outra centrifugação foi realizada e as amostras foram incubadas por 10 min, a 70 C. Após este período, adicionou-se 200 µl de etanol a cada amostra e a solução foi transferida para uma coluna (spin-column). Esta coluna foi então centrifugada (1 min, rpm) e transferida para um novo tubo, sendo adicionados 500µl de Buffer AW1. Após outra centrifugação (1 min, rpm), a coluna foi transferida para um novo tubo e adicionou-se 500 µl de Buffer AW2. Centrifugou-se novamente (3 min, rpm), descartou-se o líquido e outra centrifugação foi realizada (1 min, rpm). As colunas foram, então, transferidas para tubos de 1,5 ml, identificados com o número e a origem de cada amostra, adicionou-se 100 µl de Buffer AE e incubouse por 5 min, à temperatura ambiente. Após esta etapa, realizou-se uma nova centrifugação (1 min, rpm) e adicionou-se mais 100 µl de Buffer AE. Outra centrifugação foi realizada (1 min, rpm) e a coluna foi descartada, restando no tubo plástico somente a solução contendo DNA. A leitura de absorbância do DNA de cada amostra foi realizada no aparelho NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) Realização do PCR 4 alelo específico O PCR alelo específico para detecção da substituição T2134A, no segmento transmembrânico S6, do domínio III, do canal de sódio, descrita por He et al. (1999), foi realizado de acordo com Guerrero et al. (2001). Cada reação continha no total 50 µl, sendo 5 µl Buffer 10x (Qiagen), 1 µl dntps (10 mm) (Qiagen), 0,25 µl HotStar Taq Plus (5 U/µl) (Qiagen), 2 µl MgCl 2 (2,5 µm) (Qiagen) e 5 µl do DNA de cada uma das larvas. Para determinação do alelo suscetível foi utilizado 0,5 µl do primer FG221 (100 µm) (5 - TTATCTTCGGCTCCTTCT - 3 ) (Eurofins MWG/Operon) e do primer FG227 (100 µm) (5 - TTGTTCATTGAAATTGTCGA - 3 ) 4 Reação em cadeia de polimerase (PCR, sigla em inglês) (Eurofins MWG/Operon); para o alelo resistente foi utilizado 0,5 µl do primer FG222 (100 µm) (5 - TTATCTTCGGCTCCTTCA - 3 ) (Eurofins MWG/Operon) e do primer FG227 (100 µm) (5 - TTGTTCATTGAAATTGTCGA - 3 ) (Eurofins MWG/Operon). As amplificações foram realizadas no termociclador ABVeriti (Applied Biosystems) nas seguintes condições: 95 C por 5 min, 37 ciclos de 94 C por 1 min, 60 C por 1 min, 72 C por 1 min e um passo final de 72 C por 7 min. Os produtos da reação (amplicons) foram separados em gel de agarose 2% com GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium) e Ladder 50 pares de base (pb) e visualizados em luz ultravioleta (UV). Os amplicons tinham 68 pb e larvas exibindo amplificação somente em uma das reações foram consideradas homozigotas suscetíveis (SS) ou homozigotas resistentes (RR), enquanto as larvas com amplificação nas duas reações foram consideradas heterozigotas (SR). A cepa resistente San Felipe, mantida sob pressão de seleção com o piretróide permetrina, por várias gerações no USDA- ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory (CFTRL) em Mission, Texas/EUA, foi utilizada como controle positivo Análise estatística As respostas, das perguntas semiabertas dos formulários, foram categorizadas e agrupadas de acordo com seus significados e cada pergunta tornou-se uma variável. Os dados foram transformados em frequência relativa e analisados com estatística descritiva, no software Sphinx Léxica V5. A mortalidade dos bioensaios com a moscados-chifres e com o carrapato-do-boi foi analisada no programa POLO-PC (Leora Software, 1987), que calculou, por análise probit, a concentração letal à metade da população testada (CL 50 ) e seus respectivos intervalos de confiança a 95% (IC 95%). As diferenças entre as CL 50 da população de campo e da população suscetível (Kerrville, para bioensaios com mosca-dos-chifres, ou Porto Alegre, para bioensaios com 23

24 carrapato-do-boi) foram consideradas significativas, quando não houve sobreposição dos IC 95%. O nível de suscetibilidade das populações de campo foi expresso pelo fator de resistência, que foi calculado a partir da divisão da CL 50 dessa população, pela CL 50 da população suscetível de referência. A mortalidade observada nas concentrações foi corrigida com base no grupo controle (Abbott, 1925) e bioensaios, com mortalidade superior a 10% no grupo controle, foram excluídos das análises. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização das práticas de controle Dezoito propriedades (78,25%) possuíam mais de 100 animais (Figura 3), destacandose a bovinocultura leiteira como a principal atividade pecuária desenvolvida entre as propriedades visitadas (Figura 4). A maior frequência de propriedades leiteiras resultou da articulação das visitas por meio da Associação Brasileira dos Criadores de Girolando, sendo a maioria (n = 21) das propriedades cadastrada nesta associação. Dentre os entrevistados, 7 (30,43%) eram proprietários e 16 (69,57%) eram funcionários. Não foi possível restringir as entrevistas somente aos funcionários ou aos proprietários, pois muitas das propriedades eram familiares, nas quais a única mão-deobra eram os proprietários ou, em algumas situações, os proprietários não estavam presentes e a entrevista foi realizada com os funcionários disponíveis. Segundo 22 entrevistados (95,65%), ambos os parasitos ocorriam nas propriedades, o que justifica a escolha da região do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba para a realização do estudo. No início da década de 90, época em que a mosca-dos-chifres alcançou os estados da região Sudeste do país (Honer et al., 1991), os pecuaristas da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba reclamaram da presença e dos prejuízos causados por este parasito aos rebanhos bovinos, quando, então, foi realizado um dos primeiros programas de controle desta espécie no município de Canápolis (Leite R. C., comunicação pessoal). 24

25 Vinte e dois entrevistados (95,65%) afirmaram que havia diferença de infestação por ambos os parasitos entre os animais. Dentre estes, 18 entrevistados (81,81%) disseram que os animais de maior grau de sangue taurino eram preferencialmente acometidos pelos parasitos, enquanto os demais não souberam especificar quais eram os animais mais parasitados. A predileção da mosca-dos-chifres e do carrapato-do-boi por animais de sangue taurino tem sido demonstrada em diversos estudos (Schreiber e Campbell, 1986; Gomes et al., 1989; Oliveira e Alencar, 1990; Honer et al., 1991; Lima et al., 2000; Veríssimo et al., 2002; Bianchin et al., 2006). No presente estudo, 16 entrevistados (69,57%) afirmaram que ambos os parasitos ocorrem em maior número no período quente e chuvoso (Tabela 1), tendo um afirmado, inclusive, haver dois aumentos expressivos na população de mosca-doschifres durante o ano. Tabela 1: Ocorrência de Haematobia irritans e Rhipicephalus (B.) microplus na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Época/mês Mosca-dos-chifres Carrapato-do-boi FA (FR) (n = 23) FA (FR) (n = 23) Todo o ano 0 (0,00%) 1 (4,35%) Fevereiro e Março 1 (4,35%) 1 (4,35%) Abril 1 (4,35%) 1 (4,35%) Abril a Junho 2 (8,69%) 2 (8,69%) Setembro 1 (4,35%) 1 (4,35%) Quente e chuvoso 16 (69,57%) 16 (69,57%) Seca 2 (8,69%) 1 (4,35%) FA (FR) Frequência Absoluta (Frequência Relativa) Segundo estudos realizados no Distrito Federal (Saueressig, 1993), São Paulo (Oliveira e Freitas, 1997) e Mato Grosso do Sul (Barros, 2001) a ocorrência da moscados-chifres está relacionada ao período quente e chuvoso do ano, com as maiores infestações acontecendo no início das chuvas da primavera e após a redução das chuvas do verão (outono). Oliveira et al. (1974) e Magalhães (1989), em estudos realizados no Rio de Janeiro e Minas Gerais, respectivamente, demonstraram que o desenvolvimento da fase não parasitária do carrapato R. (B.) microplus ocorreu de forma mais rápida no período quente e chuvoso do ano. Lima et al. (2000) ao estudarem a variação sazonal do carrapato-do-boi na região metalúrgica do estado de Minas Gerais, a partir da contagem de fêmeas ingurgitadas sobre os bovinos, observaram a presença de adultos durante todo o ano, com redução do número de parasitos por animal na estação seca (maio a setembro). O fato dos entrevistados reconhecerem as diferenças de infestação entre os animais do rebanho, bem como o período do ano em que há maiores infestações, contribui para a implantação de programas de controle nas propriedades visitadas, pois, de acordo com Bello (2010), o conhecimento do trabalhador rural a respeito da epidemiologia dos parasitos é um fator crucial para a eficácia dos programas de controle. Segundo Barros et al. (2007), em propriedades do Mato Grosso do Sul, o controle da mosca-dos-chifres é considerado uma importante operação na criação bovina e é rotineiramente realizado. Situação relativamente divergente do encontrado no presente estudo, no qual, 22 entrevistados (95,65%) reconheceram a importância desta espécie, entretanto 25

26 somente 4 (17,39%) realizavam controle específico deste parasito. Este controle era realizado quando se observava uma alta carga parasitária dos animais e o número de tratamentos realizados durante o ano era superior a seis, nas quatro propriedades. É sabido que, devido a diferenças de manejo, a mosca-dos-chifres tende a ter maior importância em gado de corte que em rebanhos leiteiros, o que pode explicar o menor número de propriedades nas quais era realizado o controle deste parasito no presente estudo. As recomendações para o controle da mosca-dos-chifres na região do Brasil Central (Sudeste e Centro-Oeste) incluem dois tratamentos ao ano, em todo o rebanho, sendo um no início e outro no final da estação chuvosa (Honer et al., 1991; Barros, 1992; Leite, 2000; Domingues et al., 2008; Leite et al., 2010). Tratamentos auxiliares devem ser realizados somente quando a infestação for muito alta e causar incômodo excessivo aos animais que então podem apresentar movimentos intensos de cauda e cabeça (Barros, 1992; Domingues et al., 2008; Leite et al., 2010). A infestação em equídeos e bezerros também são indícios de uma alta infestação nos bovinos adultos (Leite, 2000). Portanto, as práticas realizadas nas propriedades da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba não estão de acordo com o preconizado para o controle da mosca-dos-chifres no país e, a elevada frequência de tratamentos relatada em algumas propriedades pode, inclusive, contribuir para acelerar o desenvolvimento de resistência nas populações de moscados-chifres destes locais (Georghiou e Taylor, 1977). O controle do carrapato-do-boi era uma prática rotineira em 22 propriedades (95,65%). Entre estas, 2 entrevistados (9,09%) afirmaram utilizar tratamento homeopático e 3 (13,64%) empregavam produto composto por diflubenzuron, diariamente misturado ao sal. Em 12 propriedades (54,54%) realizava-se o controle mediante o grau de infestação do rebanho, em 4 (18,18%) seguia-se um calendário anual e em 1 (4,54%) o controle era feito de acordo com o tamanho do carrapato. Nas quatro propriedades que seguiam um calendário sanitário anual, o controle era realizado quinzenalmente, mensalmente, a cada 21 dias ou nos meses de março, maio e dezembro. Quanto ao número de tratamentos realizados por ano, a maioria dos entrevistados (72,22%) afirmou realizar mais de seis (Tabela 2). Na única propriedade onde o controle do carrapato-do-boi não era realizado, o rebanho era composto somente por fêmeas, de elevado grau de sangue zebu, receptoras de embriões. Embora este fosse um dos maiores rebanhos, dentre as propriedades visitadas, não havia preocupação com o controle de endo e ecto parasitos. Tabela 2: Número de tratamentos anuais realizados para o combate de Rhipicephalus (B.) microplus na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Número de citações Frequência relativa das respostas (n = 18 * ) Nenhum 1 5,55% 1 a 6 tratamentos 3 16,67% Mais de 6 tratamentos 13 72,22% Não sabe 1 5,55% * Não considera as propriedades que utilizavam tratamento homeopático ou diflubenzuron diariamente. 26

27 O tratamento dos animais, mediante a observação das formas adultas do carrapato sobre os bovinos e a realização de mais de seis tratamentos durante o ano, são práticas comuns em diversos estados brasileiros. Leite (1988) relatou que o intervalo entre banhos carrapaticidas em propriedades do Rio de Janeiro variou de 20 a 30 dias, dependendo da época do ano. Santos Júnior et al. (2000) observaram em três propriedades do Rio de Janeiro, que os tratamentos para o combate do carrapatodo-boi eram realizados após a visualização do parasito no hospedeiro, sendo que, em uma das propriedades, eram realizados 15 tratamentos por ano e nas demais, os tratamentos eram feitos 21 vezes por ano. Em estudo realizado por Farias et al. (2008) no Rio Grande do Sul, o controle do carrapato-do-boi era realizado exclusivamente com a aplicação de acaricidas, após a observação de elevadas infestações nos bovinos, com frequência superior a seis aplicações durante o ano. Rocha et al. (2006), ao estudarem a percepção dos produtores de leite do município de Passo, MG, sobre o carrapato dos bovinos, observaram que em 64% das propriedades os produtos carrapaticidas eram aplicados de acordo com a infestação dos animais e o número de aplicações variou de oito a 24, com média de 12 por ano. Na região do Vale do Paraíba, SP, em 95% das propriedades visitadas, as aplicações eram feitas apenas quando os animais se apresentavam altamente infestados (Mendes et al., 2011). De acordo com os trabalhos de Magalhães e Lima (1991), Oliveira (1993), Furlong et al. (2003), Domingues et al. (2008), Pereira et al. (2008), Leite et al. (2010) e Cunha (2011), o controle do carrapato-do-boi deve ser realizado considerando-se os aspectos bioecológicos e de dinâmica populacional da espécie, de modo a concentrar as ações de combate em somente um período do ano, reduzir o número de tratamentos realizados por ano, os gastos com mão-deobra e produtos carrapaticidas e os resíduos de antiparasitários nos produtos de origem animal. Para Magalhães e Lima (1991), Oliveira (1993), Furlong et al. (2003) e Pereira et al. (2008), na região Sudeste do Brasil, o controle do carrapato-do-boi deve ser iniciado no período quente e chuvoso do ano (primavera), com intervalos de 21 dias ou de acordo com a duração do ciclo não parasitário e o período residual do produto carrapaticida, e deve perdurar por, no mínimo, quatro meses. De acordo com Domingues et al. (2008), Leite et al. (2010) e Cunha (2011), o tratamento deve ser iniciado no mês de abril e mantido por 120 dias, com aplicações dos produtos em todo o rebanho sempre que se observar partenógina em pelo menos um animal do rebanho. Tratamentos além destes devem ser realizados somente nos animais comumente mais parasitados ou animais adquiridos de outro rebanho (Furlong et al., 2003; Domingues et al., 2008; Pereira et al., 2008; Leite et al., 2010; Cunha, 2011). Percebe-se que a prática adotada para o controle de R. (B.) microplus nas propriedades visitadas neste estudo e em outros estados brasileiros não está de acordo com as informações disponíveis na literatura e ainda contribui para o desenvolvimento de resistência nas populações do parasito, pois, como demonstrado por Jonsson et al. (2000), Bianchi et al. (2003) e Rodrigues-Vivaz et al. (2006), a realização de mais de seis tratamentos durante o ano é um fator de risco para o desenvolvimento de resistência à piretróides no carrapato-do-boi. É interessante ressaltar que mesmo em propriedades que utilizavam tratamento homeopático ou diflubenzuron diariamente, fazia-se uso de outros produtos quando a infestação alcançava níveis considerados inaceitáveis pelo produtor (Propriedades 1, 5, 10, 20, 21; Tabela 3), o que evidencia que estes produtos não mantinham as infestações em níveis baixos durante todo o ano. Situação semelhante foi encontrada por Bello (2010), no estado do Rio de Janeiro, sendo considerado que os produtores mantinham o uso dos produtos homeopáticos devido ao acompanhamento mensal feito pelos representantes da 27

28 empresa fornecedora e à praticidade de seu uso, que exige apenas que o produto (em pó) seja espalhado no cocho. Com relação ao uso de produtos para o controle da mosca-dos-chifres (Tabela 3), de modo geral, os produtos inseticidas utilizados na região estudada coincidem com o observado em outros estados, onde os piretróides e suas associações com os organofosforados são os produtos mais utilizados (Saueressig e Barros, 2003; Rodrigues et al., 2004; Oliveira et al., 2006; Barros et al., 2007). Segundo dados do Compêndio de Produtos Veterinários (2011), existem 95 produtos registrados para o controle da mosca-dos-chifres no Brasil, sendo 29 compostos por piretróides e 25 por associações entre piretróides e organofosforados. Portanto, a realidade encontrada nas propriedades reflete o mercado nacional de produtos parasitários e demonstra a dificuldade que o produtor tem de mudar de classe inseticida, uma vez que as opções, dentro de uma faixa de preços mais acessível, são restritas. Para o combate do carrapato-do-boi eram utilizados produtos de quase todas as classes disponíveis no mercado, sendo empregados com maior frequência os piretróides e suas associações com organofosforados (Tabela 3), o que coincide com o observado para o controle da moscados-chifres e com a situação encontrada por Mendes et al. (2011) no estado de São Paulo. No Rio Grande do Sul, os piretróides eram mais utilizados entre 1997 e 2000, quando, então, foram gradativamente substituídos pelas formamidinas (2000 a 2006), devido ao desenvolvimento de resistência a piretróides nas populações de R. (B.) microplus em decorrência de seu uso com maior frequência e em menores concentrações para o controle da moscados-chifres (Farias et al., 2008). Enquanto na região Sul do país, o método de aplicação por imersão ainda é o mais empregado para o combate ao carrapatodo-boi (Farias et al., 2008; Santos et al., 2009), nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste predomina o uso de aspersão com bombas costais para ambos os parasitos (Leite, 1988; Santos Junior et al., 2000; Saueressig e Barros, 2003; Rocha et al., 2006; Oliveira et al., 2006; Barros et al., 2007; Mendes et al., 2011). A realidade encontrada neste estudo não foi diferente: entre as 17 propriedades, nas quais se utilizava produtos alopáticos, em 11 (64,71%) a aspersão era o principal método de aplicação dos produtos e, dentre estas, sete faziam uso da bomba costal (Figura 5). O uso de bomba costal contribui para aplicação de volumes muito aquém do recomendado, devido ao grande esforço necessário para sua utilização (Rocha et al., 2006). A aspersão foi, inclusive, considerada um fator de risco para resistência a piretróides em populações do carrapato-do-boi da Austrália e Nova Caledônia (Jonsson et al., 2000; Bianchi et al., 2003). 28

29 Tabela 3. Composição dos produtos utilizados para o controle da mosca-dos-chifres e do carrapato-do-boi em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Propriedades Município Composição dos produtos Mosca-dos-chifres 1 Ituiutaba - 2 Ituiutaba - 3 Ituiutaba 4 Ituiutaba Cipermetrina + clorpirifós + citronelal Cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + butóxido de piperonila. 5 Ituiutaba - 6 Monte Alegre Cipermetrina + ethion Fluazuron 7 Uberlândia - 8 Uberlândia - 9 Uberlândia - Carrapato-do-boi Diflubenzuron; cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + citronelal; clorpirifós + diclorvós; fluazuron. Cipermetrina + ethion; clorpirifós + diclorvós; amitraz; ivermectina. Clorpirifós + diclorvós; amitraz. Cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + butóxido de piperonila. Homeopatia; cipermetrina + clorpirifós + citronelal. Cipermetrina; clorfenvinfós + diclorvós; amitraz. Flumetrina; cipermetrina + diclorvós; cipermetrina + clorpirifós + citronelal. Cipermetrina + clorpirifós; cipermetrina + clorpirifós + citronelal; ivermectina. 10 Uberlândia Uberlândia - Diflubenzuron; cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + butóxido de piperonila; cipermetrina + clorpirifós + citronelal; fipronil. 12 Uberlândia - Diclorvós + clorpirifós; fipronil. 13 Uberlândia - 14 Uberlândia - 15 Uberaba - 16 Uberaba - 17 Conquista Cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + citronelal; fluazuron. 18 Uberaba - Cipermetrina + clorpirifós + citronelal; amitraz; fluazuron. Cipermetrina; deltametrina; fluazuron; ivermectina. Cipermetrina + clorpirifós + citronelal; fipronil. Cipermetrina; diclorvós + clorfenvinfós; fluazuron. Ivermectina Cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + butóxido de piperonila + citronelal; cipermetrina + clorpirifós + citronelal; fluazuron. continua 29

30 continuação Propriedades Município Composição dos produtos Mosca-dos-chifres 19 Uberaba Água Comprida Campo Florido Campo Florido 23 Araxá Carrapato-do-boi Cipermetrina + fenitrotion; abamectina. Diflubenzuron; cipermetrina; fluazuron. Homeopatia; alfacipermetrina; cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + citronelal. Flumetrina; cipermetrina + clorpirifós + citronelal; fluazuron; ivermectina. Cipermetrina; cipermetrina + clorpirifós + citronelal. Dentre os entrevistados que utilizavam o método de aspersão (n = 11), 6 (54,54%) afirmaram diluir os produtos na concentração recomendada pelo fabricante. Em 8 (72,72%) propriedades os animais eram banhados com menos de cinco litros de calda e em 45,45% das propriedades as aplicações dos ectoparasiticidas eram realizadas com os animais soltos no curral (Figura 6). Figura 5: Uso de equipamentos de aspersão para controle parasitário em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Figura 6: Local de realização dos banhos de aspersão para controle parasitário em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Em propriedades de Tocantins, Distrito Federal, Goiás (Saueressig e Barros, 2003), Alagoas, Sergipe e Piauí (Oliveira et al., 2006) e Mato Grosso do Sul (Rodrigues et al., 2004; Barros et al., 2007) foi igualmente observado o uso mais frequente de aspersão por bombas costais para o controle da mosca-dos-chifres, bem como a aplicação de um volume menor de inseticida do que o recomendado. Rocha et al. (2006) relataram que, em propriedades do município de Passos, MG, 32% dos produtores utilizavam três litros de calda carrapaticida por animal para controlar o carrapato-do-boi, 24% utilizavam menos de um litro e 16% disseram não saber qual o volume utilizado. 30

31 De acordo com Pereira et al. (2008), o uso de quatro a cinco litros de calda inseticida/carrapaticida por animal adulto (um litro por 100 kg de peso vivo), bem como a contenção dos animais são práticas obrigatórias para a eficácia do banho. Segundo estes autores, assim como Furlong et al. (2003), Domingues et al. (2008), Leite et al. (2010) e Cunha (2011), a infraestrutura adequada para os tratamentos carrapaticidas, como os bretes de aspersão, é outro fator crucial para que o controle seja alcançado. Embora os produtos pour-on sejam mais fáceis de serem aplicados e apesar de, em algum momento, terem sido utilizados em todas as propriedades que faziam o controle da mosca-dos-chifres e do carrapato-do-boi com produtos alopáticos (n = 17), este método era empregado rotineiramente em 6 (35,29%) propriedades, sendo utilizado em parte do rebanho nas demais. Esta situação também foi encontrada por Oliveira et al. (2006) e Barros et al. (2007) ao estudarem o controle da mosca-dos-chifres em propriedades de Alagoas, Bahia, Sergipe e Mato Grosso do Sul e por Rocha et al. (2006) ao pesquisarem as práticas de controle do carrapato-do-boi em propriedades do sul do estado de Minas Gerais. Em São Paulo, Mendes et al. (2011) relataram que 65,4% das propriedades usavam apenas aspersão, 30,8% medicamentos injetáveis e 3,8% pour-on. Quando questionados sobre o número de animais tratados em um mesmo dia (aplicações de banhos por aspersão e/ou produtos pour-on), a maioria (54,55%) dos entrevistados afirmou que as aplicações eram realizadas de acordo com a categoria animal (animais jovens, lactantes ou solteiros), 27,27% afirmaram tratar todos os animais da propriedade e 18,18% relataram tratar somente os animais mais infestados. Rocha et al. (2006) encontraram situação diferente nas propriedades de Passos, MG. Em seu estudo, 80% dos entrevistados disseram banhar todos os animais no mesmo dia, 12% o faziam de acordo com os lotes e 8% banhavam somente os mais infestados. Há que se considerar que os rebanhos das propriedades de Passos tinham em média 122 animais, enquanto no presente estudo 47,82% das propriedades tinham mais de 200 animais (Figura 1). A falta de infraestrutura adequada para aplicação dos produtos nas propriedades visitadas é outro fator que pode ter contribuído para o tratamento de somente parte do rebanho em um mesmo dia. A alternância de produtos era realizada em quase todas as propriedades (n = 18) e as justificativas utilizadas foram: perda da eficácia (55,56%), preço do produto (16,67%), disponibilidade nas lojas (5,55%) e período de carência exigido (5,55%). Alguns entrevistados (16,67%) afirmaram não saber o porquê de trocar de produto. O motivo mais citado para a perda de eficácia (n = 10) foi a percepção de surgimento de resistência no carrapato ou na mosca (n = 8), seguido de problemas na fabricação de produtos (n = 1) e um entrevistado não soube responder. Rodrigues et al. (2004) observaram, em propriedades do Mato Grosso do Sul, que a troca de produtos para o controle da moscados-chifres era realizada de forma aleatória, sem nenhum critério técnico para escolha do próximo produto a ser utilizado, devido principalmente à observação de perda de eficácia. Esta mesma situação foi observada por Barros et al. (2007) em outras propriedades do Mato Grosso do Sul. Rocha et al. (2006) relataram que 64% dos produtores alternavam o produto devido a perda de eficácia, 28% devido ao preço e 24% por consideram uma ação importante. É interessante observar que nenhum entrevistado citou como causa, para perda de eficácia, a má utilização dos produtos; o que demonstra a falta de percepção desses indivíduos de que a grande frequência de tratamentos por ano, a falta de infraestrutura adequada e segura aos aplicadores e o tratamento de um número de animais maior do que o recomendado por carga/bomba sejam práticas incorretas, que contribuem para uma menor eficácia dos produtos. Há que se considerar que, como as informações foram obtidas através de entrevistas, existe a possibilidade de o entrevistado não ter citado a má utilização 31

32 como um dos motivos para perda de eficácia do produto, por não querer admitir o seu erro. Entretanto, a má aplicação dos produtos foi apresentada como motivo para o surgimento de resistência aos carrapaticidas, em 24% das propriedades em que Rocha et al. (2006) realizaram entrevistas. O uso de misturas ou formulações domésticas para o controle da mosca-doschifres ou do carrapato-do-boi não foi comum entre os entrevistados (n = 2), contudo esta foi uma opção para o combate de miíases causadas por Cochliomyia hominivorax (Diptera: Caliphoridae) em todas as propriedades visitadas (Anexo IV). Em propriedades do Distrito Federal, Goiás, Tocantins e Mato Grosso do Sul foram relatados o uso de medicamentos misturados com álcool e/ou óleo de soja na forma de pour-on e a aplicação de produtos indicados para agricultura no controle da mosca-dos-chifres e do carrapato-do-boi (Saueressig e Barros, 2003; Koller et al., 2009). A Lei n de 22 de dezembro de 1977 da Consolidação das Leis do trabalho, relativa à Segurança e Medicina do Trabalho, regulamenta o uso do Equipamento de Proteção Individual (EPI) (Brasil, 1977). De acordo seu artigo 166 a empresa é obrigada a fornecer aos empregados, gratuitamente, equipamento de proteção individual adequado ao risco e em perfeito estado de conservação e funcionamento, sempre que as medidas de ordem geral não ofereçam completa proteção contra os riscos de acidentes e danos à saúde dos empregados (Brasil, 1977). Segundo sua norma regulamentadora 6 (NR 6) EPI é todo dispositivo ou produto, de uso individual utilizado pelo trabalhador, destinado à proteção de riscos suscetíveis de ameaçar a segurança e a saúde no trabalho (Brasil, 1977). No presente estudo o uso de EPI era adotado somente em 7 propriedades (31,82%) e em apenas três todo o equipamento (roupa, boné, luvas, máscaras e botas) era utilizado. Entre as sete propriedades, em quatro os produtos eram aplicadas por aspersão com bomba costal, em duas por aspersão com bomba elétrica e em uma, eram utilizados produtos pour-on. Em várias propriedades havia o equipamento, porém o trabalhador preferia não utilizá-lo. A falta de hábito do uso de EPI demonstra a pouca preocupação com a possibilidade de intoxicação dos trabalhadores rurais, o que foi igualmente observado por Rocha et al. (2006) em propriedades do sul do estado de Minas Gerais e Bello (2010) em propriedades do Rio de Janeiro. Segundo Bello (2010) os trabalhadores justificavam o não uso do EPI por calor, falta de hábito ou falta de praticidade dentro da rotina de trabalho, queixas que também foram apresentadas pelos entrevistados do presente estudo. Esta autora ressalta a necessidade de um programa de educação continuada dos trabalhadores rurais, visando sua conscientização sobre a importância do uso de equipamentos de proteção, com esforços concretos para redução dos problemas de saúde nas áreas rurais. Os três critérios mais citados para a escolha dos produtos ectoparasiticidas foram: escolha pelo dono, indicação do veterinário e preço (Figura 7). A escolha pelo dono pode ser influenciada pela indicação do balconista, do veterinário ou até mesmo pelo preço, entretanto os entrevistados não diferenciaram estas situações. Somente um entrevistado citou como critério de escolha, o período de carência do produto. Talvez isto tenha ocorrido porque os produtos de aspersão, que eram os mais utilizados nas propriedades, possuem um pequeno período de carência ou pela falta de comprometimento ou conhecimento dos produtores rurais em relação às exigências do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento quanto aos resíduos de antiparasitários nos produtos de origem animal (Brasil, 1999; Brasil, 2002). Santos Júnior et al. (2000) relataram que nas três propriedades do estado do Rio de Janeiro, participantes de seu estudo, a escolha dos produtos era feita mediante 32

33 propaganda do fabricante. Bello (2010) observou que nas propriedades do Rio de Janeiro o produto era escolhido de acordo com o preço, o conselho de vizinhos ou a indicação do balconista. Nas propriedades de São Paulo, os critérios eram indicação do balconista (25%), de vizinhos (21,4%), de veterinários (21,4%), propaganda (18%), resultado do teste de imersão de teleóginas (3,4%) e 10,8% não tinham critério (Mendes et al., 2011). A maioria dos entrevistados (95,65%) afirmou que havia assistência técnica de médicos veterinários nas propriedades. Entretanto, estes profissionais eram consultados somente em casos de emergência em 52,71% das propriedades e eram fonte de informação sobre os métodos de controle dos parasitos, em apenas 7 (31,82%) (Figura 8). Na maioria das propriedades visitadas havia uma grande preocupação com a produtividade animal, entretanto os fatores sanitários do rebanho não recebiam tanta atenção por parte dos proprietários. Segundo Santos Junior et al. (2000) e Bello (2010) a assistência técnica veterinária não era comum em propriedades do estado do Rio de Janeiro. Rocha et al. (2006) relataram que estes profissionais eram as fontes de informação em 64% das propriedades do estado de Minas Gerais, que participaram de seu estudo, enquanto as revistas foram citadas em 28% e os vizinhos ou amigos em 20%. Figura 7: Critérios utilizados para escolha de produtos inseticidas/carrapaticidas em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Era permitida mais de uma resposta. 33

34 Figura 8: Fontes de informação sobre o controle de Haematobia irritans e Rhipicephalus (B.) microplus em propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, MG, segundo entrevistas realizadas em abril/2010. Ressalta-se a necessidade de uma maior participação dos médicos veterinários, instituições de pesquisa, cooperativas e associações ligadas ao setor, na divulgação dos programas de controle existentes e na capacitação dos trabalhadores rurais, para que se alcance sucesso na implantação de programas sanitários nas propriedades pecuárias estudadas, conforme sugerido por Arteche (1972), Leite (1988), Santos Júnior et al. (2000) e Bello (2010) Bioensaios com H. irritans Devido às infestações relativamente baixas na maioria das propriedades visitadas, os testes de suscetibilidade da mosca-doschifres com os princípios ativos cipermetrina e clorpirifós foram realizados em 12 e nove propriedades, respectivamente. Excluindose os ensaios que apresentaram mais de 10% de mortalidade no grupo controle e aqueles que não permitiram a obtenção da CL 50 ou de seu intervalo de confiança, 11 bioensaios foram analisados, sendo nove com cipermetrina e dois com clorpirifós (Tabela 4). As populações de campo avaliadas nos bioensaios com cipermetrina apresentaram CL 50 marcadamente superiores à CL 50 da população suscetível de referência e consequentemente, altos fatores de resistência para este princípio ativo (Tabela 4). Estes valores indicam que todas as populações de H. irritans avaliadas eram resistentes à cipermetrina. Segundo Guglielmone et al. (1998), tratamentos com cipermetrina pour-on não controlaram populações de mosca-dos-chifres com fatores de resistência para cipermetrina entre 16,8 e 36,5, menores do que aqueles encontrados no presente estudo. Sendo assim, pode-se esperar uma baixa eficácia de produtos piretróides nas propriedades onde foram realizados estes bioensaios, confirmando as observações dos entrevistados sobre a perda de eficácia de alguns produtos. 34

35 Tabela 4. Suscetibilidade de populações de Haematobia irritans a inseticidas, avaliada em bioensaios com papel de filtro impregnado, na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais, em abril/2010. Propriedade Município Cipermetrina Clorpirifós n Slope (EP) χ 2 (gl) CL 50 (IC 95%) FR n Slope (EP) χ 2 (gl) CL 50 (IC 95%) FR 3 Ituiutaba 479 1,40 (0,17) 1,55 (3) 52,08 (40,71-66,10) 400,6 ** 4 Ituiutaba 901 1,46 (0,12) 4,67 (6) 50,95 (39,98-63,02) 391, ,82 (0,20) *** 6 Monte Alegre 394 3,20 (0,46) 0,44 (1) 33,23 (26,88 38,66) 255, ,64 (3,92) *** 9 Uberlândia 399 3,07 (0,39) 0,49 (1) 23,16 (20,23 27,77) 178,1-10 Uberlândia 490 1,55 (0,16) *** - 13 Uberlândia 524 2,53 (0,23) 3,70 (3) 6,15 (4,43 8,05) 47, ,96 (1,89) *** 14 Uberlândia 604 2,48 (0,19) *** 445 9,45 (1,10) 1,42 (2) 0,22 (0,21 0,23) 0, Uberaba 648 2,23 (0,16) 5,81 (4) 6,41 (4,95 8,03) 49, ,35 (0,34) *** 18 Uberaba 642 1,72 (0,14) 5,57 (4) 12,06 (8,30 16,48) 92,8-19 Uberaba 514 2,45 (0,23) 7,38 (3) 9,24 (5,89 14,26) 71, ,07 (0,29) *** Campo Florido Campo Florido 637 1,59 (0,14) *** 348 8,65 (1,12) 0,04 (1) 0,16 (0,15 0,17) 0, ,30 (0,14) 9,26 (4) 11,79 (4,13 20,92) 90,7 ** Kerrville* Texas/EUA 575 3,12 (0,28) 2,49 (5) 0,13 (0,12 0,15) ,39 (0,28) 1,70 (5) 27,88 (13,48 133,31) - n = número de moscas utilizado para o cálculo da CL 50 χ 2 (gl) = Qui-quadrado (grau de liberdade) CL 50 (IC95%) = Concentração letal à 50% da população, expressa em µg/cm 2 de ingrediente ativo (Intervalo de Confiança a 95%) FR (Fator de Resistência) = CL 50 da população de campo/ CL 50 da população de referência de Kerrville, Texas, EUA * População suscetível de referência, mantida em laboratório em Kerrville,Texas, EUA; ** Mortalidade maior que 10% no grupo controle; *** Resultados dos bioensaios não permitiram a obtenção da CL 50, IC 95% e FR 35

36 Resistência à cipermetrina foi previamente registrada nos estados do Rio Grande do Sul (Guglielmone et al., 2001), Piauí e Maranhão (Girão et al. 2002), Goiás e Distrito Federal (Saueressig e Barros, 2003), Roraima (Braga e Barros, 2003), Alagoas e Sergipe (Oliveira et al., 2006) e Mato Grosso do Sul (Barros et al., 2007) e em países vizinhos como Uruguai (Marques et al., 1997), Argentina (Guglielmone et al., 1998; Guglielmone et al., 2001) e Chile (Oyarzún et al., 2011). A CL 50 da população suscetível de referência (Kerrville) (0,13 µg/cm 2 ) e seu intervalo de confiança a 95% (0,12-0,15 µg/cm 2 ) do presente estudo foram menores do que a CL 50 desta mesma população exposta a outro kit de cipermetrina nos anos de 2001 (CL 50 = 0,43 µg/cm 2, IC 95% = 0,29-0,70 µg/cm 2 ) e 2002 (CL 50 = 0,94 µg/cm 2, IC 95% = 0,64-2,11 µg/cm 2 ). Os últimos valores de CL 50 foram utilizados para a comparação dos resultados de bioensaios realizados a campo por Girão et al. (2002), Braga e Barros (2003), Saueressig e Barros (2003), Oliveira et al. (2006) e Barros et al. (2007). Essa diferença pode ser explicada por diferença nos kits utilizados (Sheppard e Joyce, 1992), na idade e gênero das moscas (Pruett et al., 2000) e/ou na contagem da mortalidade realizada por diferentes observadores. Em contrapartida, as CL 50 dos bioensaios com cipermetrina das populações de campo do presente estudo (Tabela 4) foram similares à CL 50 de populações de H. irritans dos estados do Piauí e Maranhão (16,87 a 27,96 µg/cm 2 ) (Girão et al. 2002), Distrito Federal e Goiás (8,75 a 60,99 µg/cm 2 ) (Saueressig e Barros, 2003), Roraima (0,71 a 45,77 µg/cm 2 ) (Braga e Barros, 2003), Mato Grosso do Sul (15,84 a 39,27 µg/cm 2 ) (Barros et al., 2007) e inferiores aquelas observadas em Alagoas e Sergipe (19,94 a 1928,30 µg/cm 2 ) (Oliveira et al., 2006). Em estudo realizado por Sabatini et al. (2009), populações de mosca-dos-chifres de todas as regiões do Brasil apresentaram o alelo kdr, responsável pelo mecanismo de resistência a piretróides caracterizado pela insensibilidade do sítio de ação (Guerrero et al., 1997), com exceção de populações da região Nordeste. Este trabalho utilizou inclusive espécimes dos estados de Alagoas e Sergipe. Portanto, a diferença entre as CL 50 das populações de campo do presente estudo e das populações dos estados de Alagoas e Sergipe talvez possa ser explicada por diferentes mecanismos de resistência presentes nestas populações, como demonstrado por Sabatini et al. (2009). A resistência encontrada à cipermetrina nas populações estudadas resulta do uso rotineiro e quase exclusivo de produtos piretróides, em sua maioria contendo este princípio ativo (Tabela 3) e ao número exagerado de tratamentos realizados ao ano. A utilização de somente uma classe de produto inseticida e a alta frequência de tratamentos durante o ano são práticas equivocadas, que contribuem para o desenvolvimento de resistência nas populações tratadas (Georghiou e Taylor, 1977; Byford et al., 1999). É interessante observar que em seis, das nove propriedades em que os bioensaios com cipermetrina foram realizados, os entrevistados afirmaram não fazer controle específico para a mosca-dos-chifres, isto é, a preocupação principal era combater o carrapato-do-boi, sendo a aplicação de ectoparasiticidas direcionada primordialmente a este parasito. Entretanto, nas outras três propriedades (Propriedades 3, 4 e 6; Tabela 4), o controle específico da mosca-dos-chifres era realizado; não coincidentemente, as populações da mosca nestas propriedades apresentaram fatores de resistência marcadamente superiores em relação às demais (Tabela 4). Uma vez que a maioria dos produtos carrapaticidas possui amplo espectro, não sendo específicos para o carrapato, é provável que a resistência à cipermetrina, detectada mesmo nas populações da mosca-dos-chifres não submetidas a um controle químico específico, tenha sido resultante da pressão de seleção causada pelo controle do carrapato. Nas três propriedades com os maiores fatores de resistência, é provável que o controle químico de ambos os parasitos tenha 36

37 aumentado a pressão de seleção sobre as populações da mosca-dos-chifres, contribuindo para a ocorrência dos elevados níveis de resistência detectados nos bioensaios. Segundo Kunz et al. (1995) o uso sequencial de piretróides contra o carrapato-do-boi contribuiu para o desenvolvimento de resistência nas populações de mosca-dos-chifres do México. Percebe-se a necessidade de se adotar práticas de controle que considerem as características epidemiológicas dos parasitos e envolvam o controle integrado das diferentes espécies presentes nos animais de forma a reduzir a pressão de seleção aleatória em diferentes parasitos de um mesmo hospedeiro e aumentar a sustentabilidade e eficiência das estratégias de controle parasitário. Em relação aos bioensaios realizados com clorpirifós, observa-se que as CL 50 das duas populações foram substancialmente menores que a CL 50 da população de referência Kerrville (Tabela 4), demonstrando o alto nível de suscetibilidade destas populações ao referido organofosforado. Até o momento, resistência da mosca-dos-chifres a organofosforados foi encontrada apenas nos EUA (Burns e Wilson, 1963; Barros et al., 2001) e México (Kunz et al., 1995; García et al., 2004). No Brasil, os estudos realizados em Mato Grosso do Sul (Barros et al., 2002, 2007), Tocantins, Goiás e Distrito Federal (Saueressig e Barros, 2003), Alagoas, Bahia e Sergipe (Oliveira et al., 2006) demonstraram elevada suscetibilidade das populações da mosca-dos-chifres ao organofosforado diazinon. Estes autores salientaram que a ausência de resistência ao organofosforado resultou do maior uso de produtos piretróides nas propriedades onde os bioensaios foram realizados, o que também foi observado nas propriedades deste estudo (Tabela 3). O presente trabalho foi o primeiro no Brasil realizado com o organofosforado clorpirifós e, apesar do número limitado de amostras, fornece informações importantes sobre as CL 50 de populações suscetíveis, as quais poderão ser utilizadas em comparações futuras. A CL 50 da população suscetível de referência (Kerrville) e seu respectivo intervalo de confiança a 95% foram muito altos (Tabela 4). Esta cepa apresentou 18,67% de mortalidade na concentração de 6,4 µg/cm 2, após duas horas de exposição, a qual é quatro e 10 vezes maior do que aquela que matou 100% dos indivíduos nas populações das propriedades nove e 10, respectivamente. Uma explicação para este fato pode ser uma baixa atividade das enzimas oxidases de função mista na população suscetível de Kerrville. Sabe-se que alguns organofosforados, como o diazinon e o clorpirifós, em sua forma inativa possuem pouca afinidade pela enzima acetilcolinesterase, seu sítio de ação (Fukuto, 1990). Estes inseticidas precisam ser ativados metabolicamente por enzimas, como as oxidases de função mista, para aumentar sua afinidade pelo seu sítio de ação e, consequentemente, sua toxicidade (Fukuto, 1990). Se a população de Kerrville possuir uma baixa atividade destas enzimas, pode ser que o clorpirifós não tenha sido ativado para a sua forma ativa e assim apresentou baixa toxicidade para a referida população. Um aumento do metabolismo oxidativo (e consequentemente da ativação do organofosforado) pode ter contribuído para a alta suscetibilidade detectada ao clorpirifós nos bioensaios, apesar dos organofosforados também serem utilizados para o combate da mosca-dos-chifres na região estudada, principalmente em associações com piretróides (Tabela 3). Segundo Cilek et al. (1995), populações de H. irritans resistentes a piretróides e com uma maior atividade das oxidases de função mista apresentaram alta sensibilidade ao organofosforado diazinon. Neste estudo demonstrou-se que as oxidases metabolizaram o diazinon para diazoxon, sua forma ativa/tóxica, aumentando a suscetibilidade das populações de moscados-chifres ao organofosforado, mecanismo conhecido como resistência cruzada negativa. O mesmo mecanismo foi relatado por Hatano et al. (1992) em relação ao clorpirifós em populações de Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) com alta atividade de oxidase e resistentes ao 37

38 organoclorado dicofol. De acordo com Barros (2004), a detoxificação por oxidases de função mista é o principal mecanismo de resistência a piretróides das populações brasileiras de mosca-dos-chifres, o que fundamenta a hipótese de que a elevada suscetibilidade observada ao clorpirifós nas populações estudadas seja resultante de uma resistência cruzada negativa. Em princípio, produtos organofosforados podem ser considerados uma alternativa viável para o controle da mosca-dos-chifres na região, uma vez que as populações estudadas foram suscetíveis ao clorpirifós. Entretanto, este controle deve ser realizado com cautela e de acordo com programas que considerem as características epidemiológicas do parasito, os princípios ativos, o número de aplicações por ano e o método de aplicação dos produtos (Georghiou e Taylor, 1977). Li et al. (2009) observaram em populações de H. irritans resistentes à permetrina que a substituição do uso de produto pour-on composto por ciflutrina (1%) por brincos impregnados com diazinon (40%), diminuiu as infestações e os fatores de resistência das populações à permetrina, contudo não reduziu a frequência dos alelos (kdr e superkdr) responsáveis pela resistência a piretróides na população estudada. O uso de piretróide associado ao sinergista butóxido de piperonila reduziu significativamente o desenvolvimento de resistência em populações de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) quando a resistência devia-se à detoxificação via oxidases de função mista (Kumar et al., 2002). Entretanto, quando baseada exclusivamente na alternância entre duas classes inseticidas, esta estratégia não se mostrou eficiente no controle de populações resistentes aos piretróides (Barros et al., 1999). Estes autores demonstraram que a rotação anual, durante sete anos, entre brincos impregnados com o piretróide λ- cialotrina + butóxido de piperonila (inibidor de oxidases) e brincos impregnados com o organofosforado metil-pirimifós não aumentou a eficácia do primeiro e não preveniu o desenvolvimento de resistência ao organofosforado em populações de H. irritans dos EUA resistentes a piretróides. Contudo, não foram estudados os mecanismos de resistência presentes nas populações Bioensaios com larvas de R. (B.) microplus Foram coletadas teleóginas em 10 propriedades, contudo, em três destas não foi possível obter a CL 50 ou seu intervalo de confiança. Desta forma, foram considerados os resultados dos bioensaios de sete propriedades para cada princípio ativo (Tabela 5). Segundo Bianchi et al. (2003), populações de R. (B.) microplus com fatores de resistência menores que três, entre três e cinco, entre cinco e cinquenta e maiores do que 50 são suscetíveis, tolerantes, resistentes e super-resistentes à permetrina, respectivamente. A partir da classificação de Bianchi et al. (2003), Mendes et al. (2007) propuseram a seguinte classificação: amostras com fatores de resistência menores ou iguais a 2,4 são suscetíveis, entre 2,5 e 5,4 são resistentes nível I, entre 5,5 e 50 são resistentes nível II e maiores que 50 são resistentes nível III, à deltametrina ou cipermetrina. Como os fatores de resistência das populações do carrapato-do-boi da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba à cipermetrina, variaram entre 16,0 e 25,0 (Tabela 5), todas as populações testadas podem ser consideradas resistentes nível II a este piretróide, segundo a classificação proposta por Mendes et al. (2007). 38

39 Tabela 5. Suscetibilidade de populações de Rhipicephalus (B.) microplus à cipermetrina e clorpirifós, avaliada pelo Teste do Pacote com Larvas, na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais, em abril/2010. Propriedades Município Cipermetrina Clorpirifós n Slope (EP) χ 2 (gl) CL 50 (IC 95%) FR n Slope (EP) χ 2 (gl) CL 50 (IC 95%) FR 2 Ituiutaba ,14 (0,13) ** ,42 (0,52) ** 7 Uberlândia ,24 (0,27) 6,56 (4) 0,48 (0,43 0,53) 16, ,05 (0,11) 6,41 (5) 0,04 (0,03 0,05) 4,4 9 Uberlândia 862 3,02 (0,24) 11,31 (6) 0,56 (0,45 0,67) 18, ,96 (0,17) 11,39 (6) 0,04 (0,03 0,05) 4,4 10 Uberlândia ,39 (0,12) 13,25 (10) 0,56 (0,51 0,62) 18, ,45 (0,07) 10,65 (10) 0,05 (0,04 0,05) 5,5 11 Uberlândia ,37 (0,15) 15,63 (10) 0,69 (0,63 0,75) 23, ,87 (0,10) 9,03 (7) 0,06 (0,05 0,07) 6,7 12 Uberlândia ,55 (0,21) 11,86 (6) 0,75 (0,58 0,88) 25, ,85 (0,30) 9,51 (4) 0,14 (0,09 0,32) 15,6 14 Uberlândia ,70 (0,17) 15,34 (8) 0,53 (0,44 0,63) 17, ,87 (0,17) 9,14 (4) 0,02 (0,01 0,03) * 2,2 15 Uberaba ,15 (0,17) ** 901 1,63 (0,13) 7,08 (3) 0,05 (0,04 0,09) 5,5 16 Uberaba ,32 (0,17) 11,75 (8) 0,73 (0,57 0,86) 24, ,74 (0,21) ** 21 Campo Florido *** ,47 (0,35) ** Cepa Porto São Paulo ,98 (0,16) 10,41 (6) 0,03 (0,02 0,03) ,00 (0,29) 13,25 (8) 0,009 (0,008 0,01) - Alegre n = número de larvas de R. (B.) microplus utilizado para o cálculo da CL 50 χ 2 (gl) = Qui-quadrado (grau de liberdade) CL 50 = Concentração letal para 50% da população, expressa em % de ingrediente ativo; IC95% = Intervalo de Confiança a 95% FR (Fator de Resistência) = CL 50 da população de campo/ CL 50 da cepa suscetível Porto Alegre *IC95% coincide com o IC95% da cepa suscetível ** Resultados dos bioensaios não permitiram a obtenção da CL 50, IC95% e FR ***Mortalidade maior que 10% no grupo controle 39

40 Nolan et al. (1989) ao estudarem populações de campo do carrapato-do-boi australianas, descreveram três diferentes perfis de resistência, de acordo com os resultados do Teste do Pacote com Larvas: cepa Marmor que apresentou moderada resistência a cipermetrina (fator de resistência igual a 6) e cialotrina (fator de resistência igual a 9,5); cepa Lamington com elevada resistência flumetrina (fator de resistência igual a 29), porém com alta suscetibilidade a cipermetrina, cialotrina e deltametrina; cepa Parkhurst com altos níveis de resistência aos piretróides cipermetrina, cialotrina, deltametrina e flumetrina, com fatores de resistência iguais a 114, 130, 152 e 446, respectivamente. Estes autores realizaram ainda testes de estábulo com gado infestado com as referidas cepas e aplicações de produtos comerciais, de acordo com as recomendações dos fabricantes. Em relação aos resultados destes testes, um produto composto por cialotrina (0,007%) atingiu 90,2% de eficácia contra a cepa Marmor e 33,4% para a cepa Parkhurst. Considerando estes resultados, pode se esperar que os produtos compostos por piretróides não tenham eficácia adequada frente às populações do carrapato-do-boi do presente estudo, pois estas populações apresentaram fatores de resistência para cipermetrina aproximadamente duas vezes maiores do que o fator de resistência da cepa Marmor (Tabela 5). O fator de resistência da cepa Marmor foi calculado de acordo com a CL 50 da cepa suscetível Yeerongpilly que foi de 0,0037% para cipermetrina, valor similar ao CL 50 da cepa Porto Alegre no presente estudo (Tabela 5). Segundo Jonsson et al. (2000) 54% das propriedades de Queensland, Austrália, apresentavam o perfil Parkhurst de resistência a piretróides, pelo Teste do Pacote com Larvas, quando seu estudo foi realizado. Rodrigues-Vivaz et al. (2006) ao estudarem populações do carrapato-do-boi mexicanas, demonstraram 66,32% de prevalência do perfil Parkhurst. Cabrera- Jimenez et al. (2008) ao pesquisarem a resistência a cipermetrina em populações de campo de R. (B.) microplus também mexicanas, pelo Teste do Pacote com Larvas, encontraram resistência em 31,25% das populações pesquisadas e fatores de resistência variando entre 5,15 e 2297,8. Segundo estes autores, as três populações com os maiores fatores de resistência haviam sido pressionadas com deltametrina nos últimos três anos, por mais de 12 vezes ao ano, o que poderia explicar os elevados fatores de resistência encontrados para cipermetrina. No Brasil, os primeiros relatos de resistência do carrapato-do-boi a piretróides datam do final da década de 80 (Leite, 1988; Laranja et al., 1989). Leite (1988), ao estudar uma amostra de carrapatos da Estação Experimental de Itaguaí PESAGRO RIO, pela técnica de Shaw (1966), demonstrou que esta população era resistente aos piretróides flumetrina, fenvarelato, alfametrina e deltametrina, confirmando as suspeitas levantadas com os testes in vivo e o Teste de Imersão de Adultas (Drummond et al., 1973) realizados pelo autor. Não foi encontrada resistência em amostras de carrapato-do-boi de propriedades vizinhas à PESAGRO, pelo teste de Shaw (1966), a nenhum dos piretróides testados. Estudos realizados em diversos estados brasileiros, utilizando a Teste de Imersão de Adultas, relataram resistência a piretróides (Arantes et al., 1995; Sobrinho Reinaldo et al., 1997; Silva et al., 1997; Furlong e Martins, 2000; Silva et al., 2000; Oliveira e Azevedo, 2002; Vargas et al., 2003; Campos Junior e Oliveira, 2005; Pereira, 2006; Farias et al., 2008; Camillo et al., 2009; Koller et al., 2009). O Teste de Imersão de Adultas consiste na avaliação da eclodibilidade e viabilidade da postura de teleóginas expostas a concentrações comerciais dos produtos carrapaticidas diluídos em água, conforme as recomendações dos fabricantes. A partir da comparação entre os resultados da eclodibilidade de ovos oriundos de teleóginas expostas aos produtos ou à água (grupo controle) tem-se a porcentagem de eficácia dos produtos testados. Entretanto, 40

41 este teste não fornece informações a respeito da CL 50 e, consequentemente, dos fatores de resistência das populações. Portanto, devido a diferença de metodologia utilizada, não é possível fazer uma comparação direta entre os resultados do presente estudo e aqueles encontrados nos estudos que utilizaram o Teste de Imersão de Adultas. Exatamente para padronizar e possibilitar a comparação entre testes realizados em diversos países, a FAO (Guidelines, 2004) elegeu o Teste do Pacote com Larvas como padrão para os estudos de suscetibilidade de R. (B.) microplus. Por esse motivo o referido teste foi escolhido para caracterização da suscetibilidade das populações do carrapato-do-boi da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba no presente estudo. No presente estudo, a CL 50 (0,03%) e seu respectivo intervalo de confiança a 95% (IC95%) (0,02% 0,03%) da cepa suscetível Porto Alegre à cipermetrina (Tabela 5) estão próximos a CL 50 (0,03291%) e IC95%, (0,02863% - 0,03782%) da cepa Mozo utilizada nos estudos de Vieira-Bressan et al. (1999). Porém foi aproximadamente duas vezes maior do que os valores relatados por Mendes et al. (2007) e Mendes et al. (2011),para a cepa Mozo, que foram, 0,0123% (0,0059% - 0,0193%) e 0,0147% (014% - 0,0155%), respectivamente. Considerando as diferenças entre as CL 50 da cepa Porto Alegre do presente estudo e da cepa Mozo nos estudos de Mendes et al. (2007) e Mendes et al. (2011), pode-se dizer que os fatores de resistência dos bioensaios com cipermetrina encontrados no presente estudo são maiores do que aqueles descritos por Mendes et al. (2007) e similares aos observados por Mendes et al. (2011). Esta divergência pode ter ocorrido devido a diferença entre os produtos utilizados nos últimos anos nas propriedades. Mendes et al. (2007) relataram que na maioria das propriedades onde foram coletadas as teleóginas de seu estudo, utilizava-se amitraz nos últimos cinco anos, enquanto nas propriedades pesquisadas por Mendes et al. (2011) os produtos utilizados nos últimos 3 anos foram associação entre piretróides e organofosforados (30,2%), piretróides (21,4%), lactonas macrocíclicas (19,3%) e amitraz (16%), situação semelhante à encontrada nas propriedades do presente estudo (Tabela 3). Em relação aos bioensaios realizados com o clorpirifós, com exceção da propriedade cujo IC95% apresentou sobreposição com o IC95% da cepa Porto Alegre, duas propriedades eram resistentes nível I e quatro eram resistentes nível II ao organofosforado (Tabela 5), segundo critérios de Mendes et al. (2007). De acordo com estes autores, populações com fatores de resistência menores ou iguais a 1,4 são suscetíveis ao clorpirifós, entre 1,5 e 4,4 são resistentes nível I, entre 4,5 e 50 são resistentes nível II e maior que 50 são resistentes nível III a este organofosforado. Patarroyo e Costa (1980), ao estudarem amostras do carrapato-do-boi do sul de Minas Gerais, observaram fatores de resistência para clorpirifós entre 1,42 e 132,90. Segundo estes autores, fatores de resistência maiores que seis para este organofosforado, inviabilizaria seu uso a campo. Oliveira et al. (1986) encontraram fatores de resistência para clorpirifós entre 8,94 e 46,71 em populações do carrapatodo-boi do Rio de Janeiro. Contudo, estes autores utilizaram a metodologia de Grillo e Gutierrez (1969), a qual consiste em expor as larvas a diferentes concentrações dos produtos comerciais diluídos em solução de Tween 80 a 1% em água desclorada. Devido a diferença entre as metodologias destes trabalhos e a metodologia utilizada no presente estudo não é adequada a comparação entre os fatores de resistência encontrados. A mesma dificuldade ocorre em relação aos estudos realizados por Arteche (1972) Arantes et al. (1995), Sobrinho et al. (1997), Silva et al. (1997), Furlong e Martins (2000), Silva et al. (2000), Oliveira e Azevedo (2002), Vargas et al. (2003), Campos Junior e Oliveira (2005), Pereira (2006), Farias et al. (2008), Camillo et al. (2009), Koller et al. 41

42 (2009) que detectaram resistência a organofosforados em diversos estados do país pelo Teste de Imersão de Adultas (Drummond et al., 1973), conforme anteriormente explicado. Mendes et al. (2007) e Mendes et al. (2011) utilizaram o Teste do Pacote com Larvas, mesma utilizada no presente trabalho, em seus estudos com populações de carrapatodo-boi do estado de São Paulo. Entretanto, estes autores utilizaram a cepa Mozo para as comparações com as CL 50 das populações de campo obtidas com bioensaios com o clorpirifós. A CL 50 da cepa Mozo foi 0,0141% (IC95% = 0,0015% 0,0022%) e 0,0179% (IC95% = 0,0169% - 0,0190%) nos trabalhos de Mendes et al. (2007) e Mendes et al. (2011), respectivamente. Estas CL 50 são aproximadamente duas vezes maiores do que as encontradas para a cepa Porto Alegre nos bioensaios com clorpirifós do presente estudo (Tabela 5). Considerando as diferenças entre as CL 50, os fatores de resistência encontrados ao clorpirifós no presente trabalho são um pouco maiores do que aqueles encontrados por Mendes et al. (2007) e menores do que aqueles relatados por Mendes et al. (2011). Novamente, ressalta-se a diferença de uso de produtos nos três estudos. Nas propriedades do presente estudo, bem como nas propriedades visitadas por Mendes et al. (2011) utilizava-se, principalmente, associações entre piretróides e organofosforados, seguido pelos piretróides, enquanto nas propriedades, participantes do trabalho de Mendes et al. (2007), utilizava-se, principalmente, amitraz. Analisando-se os fatores de resistência ao clorpirifós nas sete propriedades, percebese que foram relativamente próximos em seis. Entretanto, em uma das propriedades (Propriedade 12; Tabela 5), o fator de resistência encontrado foi, aproximadamente, duas vezes superior ao maior fator de resistência encontrado nas demais. A propriedade 12 possuía mais de 400 animais e realizava tratamento carrapaticida a cada 15 dias, com câmara atomizadora, utilizando produto composto por associação entre dois organofosforados há um ano (Tabela 3), tendo sido a única propriedade na qual o entrevistado afirmou que a mosca-dos-chifres não ocorria. Esta propriedade possuía assistência técnica de médico veterinário rotineiramente e era este quem indicava o produto a ser utilizado para o combate do carrapato-do-boi. O número excessivo de tratamentos e o uso de um produto composto exclusivamente por organofosforados, explica o maior fator de resistência encontrado nesta propriedade, pois, segundo Georghiou e Taylor (1977), estas práticas podem contribuir para o desenvolvimento de resistência. Em relação à propriedade com a população de carrapato-do-boi, considerada suscetível ao clorpirifós (Propriedade 14, Tabela 5), ela possuía mais de 400 animais e fazia uso de bomba elétrica, com um volume de calda carrapaticida por animal menor que o recomendado. O tratamento era realizado com os animais soltos no curral e alternavase, constantemente, os produtos utilizados, principalmente devido ao preço. Contudo, dentre os produtos citados pelo entrevistado, nenhum continha organofosforado em sua formulação, sendo utilizados produtos compostos por piretróides, lactonas macrocíclicas e regulador de crescimento de insetos (Tabela 3), o que explica o fato desta população não ser resistente ao clorpirifós. Os resultados encontrados nos testes de suscetibilidade evidenciam as práticas adotadas para o controle do carrapato-doboi nas propriedades da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, haja vista que o número excessivo de banhos, o uso de aspersão, principalmente com bomba costal, a aplicação de um volume de calda carrapaticida menor do que o recomendado e a realização de banhos com as animais soltos, são fatores relacionados ao desenvolvimento de resistência (Stone, 1972; Georghiou e Taylor, 1977; Jonsson et al., 2000; Bianchi et al., 2003; Rodriguez- Vivaz et al., 2006). 42

43 5.4 Avaliação da ocorrência do mecanismo de resistência a piretróides - insensibilidade do sítio de ação Todas as 30 larvas de cada uma das 10 populações de campo e da cepa suscetível Porto Alegre foram homozigotas, suscetíveis para a substituição T2134A, no segmento transmembrânico S6, do domínio III, do canal de sódio (Figura 9). Portanto, o mecanismo de resistência, referente à insensibilidade do sítio de ação, o qual é mediado pela referida mutação, não está relacionado com a resistência à cipermetrina encontrada nas larvas do carrapato-do-boi pelos bioensaios (Tabela 5). Larva 6 Larva 16 Larva 20 Controle Controle Ladder Positivo Negativo 50pb S R S R S R S R S R 100 bp 50 bp Figura 9: PCR alelo específico com larvas de R. (B.) microplus de propriedades pecuárias da mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba, Minas Gerais e da população suscetível de referência, abril/2010. Reação utilizando primer FG-227 e FG-221 (S) ou FG-227 e FG-222 (R). Controle positivo = Cepa San Felipe e controle negativo contém água ao invés de DNA na reação. Foto Representativa. Detoxificação metabólica e insensibilidade do sítio de ação são os principais mecanismos de resistência de R. (B.) microplus a acaricidas piretróides (Guerrero et al., 2001; Pruett, 2002; Li, 2004). Insensibilidade do sítio de ação é o nome dado ao mecanismo de resistência oriundo de mutações nos sítios alvos dos pesticidas que, no caso dos piretróides, é o canal de sódio. Três mutações neste canal foram associadas à resistência a piretróides em populações do carrapato dos bovinos (He et al., 1999; Morgan et al., 2009; Jonsson et al., 2010). A mutação descrita por He et al. (1999), pesquisada no presente estudo, envolve a substituição do nucleotídeo timina por adenina (T2134A), resultando na troca do aminoácido fenilalanina por isoleucina no segmento transmembrânico S6, no domínio III, do canal de sódio. Wang et al. (2001), ao introduzirem esta mutação em um canal de sódio de mamíferos demonstraram que ela reduziu a sensibilidade do canal a piretróides em 10 vezes. Tan et al. (2005) relataram que ela bloqueou a ligação do piretróide ao canal de sódio. 43