Reprodução Humana Assistida 2011/2012

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1 Reprodução Humana Assistida 2011/2012

2 HORMONAS SEXUAIS HIPOFIOTRÓFICAS HORMONAS PRODUZIDAS PELA HIPÓFISE ANTERIOR Reprodução Humana Assistida ( ) Acção das Hormonas Sexuais Fisiologia da Reprodução Humana A placenta é uma glândula endócrina temporária, importante na altura da gravidez, pois produz a hormona gonadotrofina coriónica humana, estimula o corpo amarelo / lúteo e a produção de progesterona. As gónadas estão continuamente a produzir hormonas sexuais: testosterona, estrogénios (estradiol) e progesterona. A prolactina não é uma gonadotrofina porque não induz a produção de outras hormonas (ela própria já é uma hormona final). Hormonas esteróides classe de lípidos derivados do colesterol. Hormonas cujos receptores são intracelulares, ou seja, dentro das membranas citoplasmáticas. Como são lipossolúveis, atravessam facilmente as membranas citoplasmáticas e percorrem o sangue ligados a proteínas. Hipófise Anterior / Adeno-Hipófise e as Hormonas Sexuais A hipófise, que possui origem epitelial, situa-se numa cavidade óssea abaixo do hipotálamo, e é controlada por neurohormonas produzidas pelas células neurohormonais do hipotálamo (sistema hipotálamo-hipofisário). Fisicamente, a hipófise e o hipotálamo estão ligados pelo infundibulum. A produção de hormonas sexuais, pela hipófise anterior, é feita sob controlo muito apertado, nomeadamente de hormonas libertadas pela hipófise (FSH e LH) que também controlam o processo reprodutivo (ovulação, espermatogénese e desenvolvimento folicular). Isto tudo controlado por neurohormonas do hipotálamo (factores libertadores das gonadotrofinas). Hormonas gonadotróficas / gonadótrofina as gonadotrofinas são controladas pela hormona libertadora das gonadotrofinas (GnRH), produzida pelo hipotálamo, que apesar de ser apenas de um tipo, vai estimular a libertação de dois tipos de gonadotrofinas diferentes: Hormona folículo-estimulante (FSH) estimula as gónadas, controlando a gametogénese; Hormona luteinizante (LH) estimula a produção de testosterona (homem), estradiol e progesterona (mulher). Prolactina responsável pelo desenvolvimento e crescimento dos alvéolos mamários durante a gravidez e pela produção de leite durante a amamentação. A prolactina é controlada pela hormona inibidora da prolactina / dopamina (DA) e pela hormona libertadora da prolactina (PRH), produzidas pelo hipotálamo. As hormonas do hipotálamo (neurohormonas) são neurónios, assim, são produzidas pelo corpo celular e chegam ao fim do axónio. O sistema capilar do hipotálamo agrega-se e depois ramifica de novo numa rede capilar na hipófise. Como existe uma saída neste ponto, a diluição das hormonas é impedida. Hormonas libertadoras - hormona libertadora das gonadotrofinas (GnRH) e hormona libertadora da prolactina (PRH). Hormonas inibidoras - hormona inibidora da prolactina (PIH) / dopamina (DA). 1

3 Em situações normais (homem, mulheres não grávidas e/ou que não amamentam) há uma maior produção da hormona inibidora da prolactina. Quando há défice nesta hormona, a prolactina vai aumentar o que pode levar a problemas de fertilidade. As hormonas são produzidas e percorrem todo o corpo, no entanto só reagem e surtem efeito quando chegam às células-alvo respectivas. Hormonas e Reprodução Humana A reprodução humana é controlada, principalmente, por hormonas: hormona + célula com receptores para hormonas, que levam à indução da mensagem na célula. Existem 3 tipos diferentes de hormonas: Proteicas (a maioria) o receptor para a hormona está na membrana celular. Derivadas da tirosina o receptor para a hormona está no interior da célula. Esteróides (grupo de lípidos) o núcleo base é o colesterol, pelo que atravessam facilmente as membranas celulares. Aparelho Reprodutor e Hormonas As gonadotrofinas induzem a produção de hormonas esteróides e de inibina (uma protéina e não uma hormona esteróide) que é importante no controlo das hormonas sexuais. HIPOTÁLAMO GnRh (Factor Libertador das Gonadotrofinas) HIPÓFISE ANTERIOR Gonadotrofinas (FSH ; LH) GÓNADAS Androgénios Estrogénios Progesterona Inibina Dopamina (Factor Inibidor da Prolactina) Factor Libertador da Prolactina Prolactina TROFOBLASTO / PLACENTA hcg (Gonadotrofina Coriónica Humana) SUPRARENAL Androgénios LOCAIS EXTRAGLANDULARES (tecido adiposo - exemplo) Conversão de Androgénios em Estrogénios Gonadotrofinas promovem o desenvolvimento de gâmetas e o estímulo de produção de hormonas pelas gónadas. Feminino Masculino FSH Actua no folículo em desenvolvimento (produção de estrogénios e estimula o Actua nas células de sertoli (suporte, manutenção, crescimento folicular) controlo da espermatogénese) LH Actua no corpo lúteo (produção de progesterona, reinicia a meiose e rompe o folículo) Actua nas células de Leidig (produção de testosterona) Gonadotrofina coriónica humana semelhante e com efeitos idênticos à LH. Produzida durante a gravidez. É utilizada na reprodução assistida por ser mais fácil de obter que a LH. Androgénios produzidos pela supra-renal não são testosterona. Na mulher, são responsáveis pelo aparecimento de pêlos púbicos. Estes têm a capacidade de ser convertidos em estrogénios (diferentes dos produzidos nos ovários) que vão inibir o hipotálamo. Podem ser responsáveis por problemas de fertilidade. 2

4 Factor libertador das gonadotrofinas não é produzido de forma contínua, mas por pulsos. Se for administrado continuamente leva à inibição do hipotálamo pois os receptores ficam todos ocupados. Hormonas Esteróides Dehidroepiandrosterona (DHEA) Colesterol Pregnenolona Progesterona Androstenediona Testosterona Estrona Estradiol Estriol Dehidrotestosterona (DHT) A LH é sempre necessária em valores basais pois é esta hormona que tem a capacidade de converter o colesterol em androstenediona, nas células da teca. Esta androstenediona, como se encontra em pequenas quantidades, não sai nem é lançada no sangue, pois difundese imediatamente para as células da granulosa, onde são convertidos em estradiol. Androgénios testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona e dihidrotestosterona. A dehidroepiandrosterona e a androstenediona são os androgénios produzidos pela supra-renal, e assim são as mais fracas. Estrogénios estradiol, estrona, estriol. O estradiol é semelhante à testosterona e é produzido pelos ovários. O estriol é um estrogénio produzido pela placenta, durante a gravidez. Testículo: Androgénios testosterona. Pequenas quantidades de estrogénios estradiol. Inibina proteína. Ovário: Estrogénios estradiol (folículo). Progesterona corpo amarelo. Pequenas quantidades de androgénios testosterona. Inibina proteína. Anatomia do Aparelho Reprodutor Feminino Gónadas ovários. Na realidade as gónadas não produzem um verdadeiro gâmeta (Profase I Oócito I Metafase II Oócito II (fecundação) Gâmeta). Estruturas acessórias trompa de Falópio, útero e vagina. Genitália externa clitóris, lábio maiores e lábios menores. Os ovários são os produtores de gâmetas e hormonas. 3

5 Oviduto / Trompa de Falópio tubo aberto em forma de funil, com projecções para o ovário mas que não está ligado a ele, no entanto constitui um sistema suficientemente eficiente para a captura do oócito, na maior parte dos casos. Serve para deter o oócito e como via de subida dos espermatozóides pois é o local de fecundação que, caso ocorra, ainda serve para conduzir a mórula até ao útero. Útero estrutura com forma de pêra, com uma zona terminal (colo) que se projecta para a vagina. Serve para implantar o blastocisto, caso haja fecundação. Vagina tubo fibro-muscular que é importante para a saída do bebé e entrada de espermatozóides. É, assim, a ligação com o exterior. Ovário Epitélio cúbico simples Albugínea tecido conjuntivo denso. Córtex estroma constituído por tecido conjuntivo frouxo com folículos. Medula estroma constituído por tecido conjuntivo frouxo com vasos e nervos. Ovário estrutura pequena (4 cm) com epitélio cúbico simples (epitélio germinativo) a rodear, seguido de uma camada de tecido conjuntivo denso, antes do córtex (mais exterior) e da medula (mais interior). Este epitélio germinativo não está relacionado com as células germinativas. Um folículo é formado pelo oócito e uma ou várias camadas de células estritamente associadas. O grau de desenvolvimento dos folículos é muito variado e depende de muitos factores (idade, ciclo, ). Folículos Primordiais Folículos Primários Folículos Secundários Folículos Antrais (Ovulação - expulsão do oócito rodeado pela zona pelúcita e corona radiata) Corpo Amarelo Corpo Albicans Folículos primordiais oócito parado em Profase I. Possui uma única camada de células pavimentosas achatadas a rodear o óocito. Estes folículos, ao 5º mês de gestação, já estão todos formados (mitoses e meioses respectivas já ocorreram) e rodeados por estroma. Folículo primário oócito continua parado em Profase I e está rodeado por uma camada de células cúbicas (a camada aumenta em espessura). Inicia-se a segregação de uma glicoproteína (zona pelúcida) que fica presa nas células da granulosa. Folículos secundários oócito continua parado em Profase I. A zona pelúcida aumenta de espessura e as células da granulosa multiplicam-se e passam a formar várias camadas. Começam a diferenciar-se células da teca, junto ao estroma, formando a teca interna (que produz androgénios) e a teca externa. Folículos antrais as células da granulosa começam a produzir líquido cheio de estrogénios que fica aprisionado no interior do folículo. Este forma espaços que se vão fundir e evoluir para uma única cavidade bem definida (antro). O oócito (que antes da ovulação vai completar a divisão I da meiose e parar em Metafase II) fica numa posição excêntrica (e não no centro) pois vai ser empurrado, cada vez mais, pelo líquido acumulado no antro. 4

6 Cumulus oophurus oócito rodeado por uma / duas camadas de células da granulosa e ligada por um pedúnculo das mesmas células, às camadas basais das paredes da granulosa. Coroa radiata células da granulosa que rodeiam o oócito no antro. É a estrutura que é expulsa, na ovulação, juntamente com o oócito. O espermatozóide, para fecundar (ou seja, conseguir chegar ao oócito), tem de perfurar estas duas camadas. Depois da ovulação, o folículo, no ovário, fica vazio que, por efeito da LH, vai modificar. Esta modificação consiste no aumento das células da granulosa e da teca, dando origem ao corpo amarelo, que produz hormonas e tem uma vida bem definida (12 14 dias), ao fim dos quais morre. É, posteriormente, invadido por fibroclastos que com a produção de colagénio forma o corpo albicans, o qual é reabsorvido pelo organismo, ao fim de algum tempo. Só no estado de folículo de Graff é que se completa a I divisão meiótica (poucas horas antes da ovulação). São, então, originadas 2 células com uma distribuição muito desigual de citoplasma (oócito II e glóbulo polar). A divisão meiótica continua e a II divisão não se completa (pára em metafase II). Se há fecundação, a divisão meiótica completa-se e origina-se o II glóbulo polar. O desenvolvimento de folículo primordial para folículo antral demora cerca de 1 ano. Desenvolvimento Folicular Recrutamento Recrutamento crescimento e desenvolvimento dos folículos desde o primordial ao secundário. Durante a fase da infância existem folículos primordiais que podem desenvolver para folículos primários e até chegar a folículos secundários, situação que não se sabe porque ocorre. No entanto, a determinada fase é necessária a presença de FSH e LH que, como não existem na infância, pára o processo e então essas células morrem, isto até à puberdade. Este fenómeno constitui o processo de atresia. Folículos Primordiais (50 μm) (Oócito em Profase I) Folículos Primários (60-80 μm) (Oócito em Profase I) Folículo Secundário ( μm) (Oócito em Profase I) A fase de recrutamento ocorre desde o 7º mês de gestação até à menopausa, e dura cerca de 90 a 270 dias. Do 7º mês de gestação até à puberdade atresia. Menopausa atresia. Só ocorre o desenvolvimento até à ovulação. Desenvolvimento Folicular Crescimento Folicular Basal O crescimento folicular basal, que constitui o desenvolvimento desde folículo secundário até folículo antral, ocorre desde a puberdade até à menopausa, e dura cerca de 70 dias. Folículo Secundário ( μm) (Oócito em Profase I) Folículos Antrais (180 μm - 20 mm) Folículo Antral com 2,5 mm (Oócito em Profase I) Selecção (3-11 folículos) FSH Folículo Antral com 5-8 mm (Oócito em Profase I) Dominância (1 folículo) Folículo Antral com 20 mm (Oócito II e Glóbulo Polar) LH (Retomar da Meiose até Metafase II) (36 horas antes da ovulação) Até à puberdade podem ser formados pequenos folículos antrais (inferiores a 2 mm), mas por falta de hormonas, eles param e morrem. Provavelmente, existe uma série de factores, produzidos pelas camadas da granulosa ou da teca, responsáveis por este desenvolvimento. 20 Dias 5

7 Neste processo não foram identificadas hormonas mas é plausível que existam algumas em valores vestigiais. Os folículos de 2,5 mm estão perfeitamente aptos para receberem hormonas, uma vez que já possuem os receptores suficientemente maduros para responderem à FSH (inicialmente) e ao LH (folículo mais maduro de todos). Por isso, dos folículos que entraram em crescimento folicular basal, os que atingem os 2,5 mm vão sofrer uma fase de selecção. Para o desenvolvimento continuar é necessário que ocorram as fases anteriores, de forma a que surja um folículo suficientemente maduro, e a presença de FSH. Um folículo não maduro (inferior a 2 mm), pode ter FSH e não desenvolver, devido à imaturidade dos seus receptores. Mas, também, se o folículo estiver suficientemente maduro, e não existir FSH, nada acontece / desenvolve. Dominância folículo que atinge os 8 mm antes dos restantes (folículo dominante). Até atingir os 8 mm é necessário a presença de FSH, no entanto após este ponto, é necessário LH (acção nas células da granulosa que adquirem receptores de LH), sendo que os folículos mais atrasados não vão responder a esta hormona. Normalmente, só 1 folículo atinge esta fase (se atingem 2 podem originar gémeos). Os outros folículos sofrem atresia devido à quebra de hormonas e ao facto de não terem receptores suficientes para continuarem o seu desenvolvimento. Se aparece um pico de LH, no folículo dominante, verifica-se a retoma da meiose e, pela ruptura do folículo (devido ao aumento do líquido no seu interior), a expulsão do oócito II, com a coroa radiata, para as trompas de Falópio. Do pico de LH até à ovulação decorrem 36 horas. Este pico de LH vai ser, ainda, responsável pela transformação das células da granulosa e da teca, em células de corpo lúteo (luteinização), que já antes da ovulação se inicia, com o aumento da progesterona. Esta fase dura 20 dias, num ciclo de 28 dias, uma vez que se inicia ainda um pouco antes da menstruação. Resumindo, é necessário um folículo suficientemente maduro, proveniente da fase de recrutamente, de FSH e, por último, de um pico de LH, para que se dê a ovulação. Oogénese Vida fetal: 9ª semana de gestação divisões mitóticas das oogónias. 4º mês de gestação início da divisão meiótica (oócito I). 5º mês de gestação paragem da meiose em Profase I. Puberdade até à menopausa: 36 horas antes da ovulação prosseguimento da meiose até à Metafase II (oócito II e 1º glóbulo polar). Se houver fecundação finalização da meiose II e formação do 2º glóbulo polar. Oogénese ocorre ao nível dos ovários. Este processo inicia-se com oogónias (células germinativas primordiais femininas, que durante o processo embrionário migram para os ovários em formação), localizadas nos ovários. Após a última fase da oogénese, ocorre a ovulação que consiste na libertação de um oócito II, bloqueado em Metafase II, dos ovários para o pavilhão das trompas de Falópio. A meiose só termina caso haja fecundação, onde a penetração de um espermatozóide estimula a finalização da meiose, originando um óvulo e o 2º glóbulo polar (que degenera). Aquando o nascimento da criança existem oócitos I parados em Profase I. Todos os meses, aquando a ovulação, o oócito I desenvolve-se até oócito II, que está parado em Metafase II. Só termina a segunda divisão meiótica e origina o gâmeta feminino, óvulo, se houver penetração de um espermatozóide. 6

8 Desenvolvimento Folicular Fecundação 7º mês de gestação (5 milhões de folículos primordiais com o oócito em profase I). Nascimento 1 2 milhões de folículos (oócito em profase I). Puberdade folículos (oócitos em profase I). Por cada ciclo ovárico (28 dias): Recrutamento (1000) e crescimento folicular basal de folículos primordiais ou primários. FSH Selecção de 3 a 11 folículos antrais (2,5 mm). Dominância de 1 folículo (5 8 mm). Crescimento final do folículo (20 mm). Prosseguimento da meiose (oócito em profase I oócito II em metafase II + LH glóbulo polar). Ovulação. Menopausa muitos poucos folículos (cerca de 1000). Recrutamento Crescimento folicular basal Atresia (Atresia) Oogónia Oócito I Desenvolvimento das células da granulosa Folículo primário Desenvolvimento das células da teca Folículo secundário Desenvolvimento do antro, em resposta ao FSH Folículo de Graff Primeira meiose completa e ovulação ocorre em resposta ao LH Regulação Hormonal Oócito secundário Corpo Lúteo Segunda divisão da meiose começa Corpo Albican Corpo lúteo (gravidez) Fertilização. segunda divisão meiótica completa e ocorre a fusão nuclear Zigoto Ciclo Ovárico Fase folicular (1º - 14º dia): Crescimento dos folículos seleccionados da fase anterior sob influência da FSH e do estradiol. Produção crescente de estradiol pelo folículo em crescimento (efeito da FSH e LH). Decrescimento da FSH na 2ª parte desta fase (feedback negativo provocado pela inibina e estradiol). Ovulação (14º dia): Pico de LH (e FSH) feedback positivo provocado pelos níveis elevados de estradiol produzido pelo folículo dominante. Reinício da meiose, ruptura do folículo e luteinização das células foliculares (efeito do pico de LH). Fase lútea (15º - 28º dia): Produção de progesterona (e estradiol) pelo corpo amarelo (efeito do LH). Decréscimo da LH (e FSH) feedback negativo da progesterona e inibina. Regressão do corpo amarelo (devido à falta de LH) e decréscimo da produção de progesterona (e estradiol). Ciclo Uterino Fase menstrual (primeiros 4 dias da fase folicular) efeito da queda de progesterona (e estradiol) devido à regressão do corpo amarelo. Fase proliferativa (restante fase folicular) efeito do estradiol. Fase secretora (fase lútea) efeito da progesterona (e estradiol). 7

9 O ciclo ovárico apenas corresponde à quase totalidade da fase de selecção até à ovulação. Sendo a fase folicular correspondente à última fase do desenvolvimento dos folículos. Fase menstrual ocorre devido à quebra de progesterona e estrogénios que induzem o aumento de prostaglandinas que fazem a contracção do músculo e, consequentemente, a quebra dos vasos sanguíneos. Os níveis de estradiol aumentam, à medida que a quantidade de folículos em desenvolvimento aumenta, pois quantos mais folículos possuírem as células da granulosa, a produção de estradiol (estrogénios) é maior. Quando ocorre o pico de LH, as concentrações hormonais começam a mudar. O pico de progesterona ocorre, aproximadamente, a meio do desenvolvimento do corpo amarelo. O pico de estradiol ocorre na segunda parte do desenvolvimento folicular, que é quando há mais células granulosas activas a produzir estrogénios. FSH concentração elevada logo no início da fase folicular, o que faz com que os folículos se desenvolvam. A partir da segunda fase do desenvolvimento folicular, estes valores baixam. Ocorre um grande controlo por feedback negativo no hipotálamo e hipófise, devido aos estrogénios, sendo inibida a FSH (a granulosa também produz inibina, que possui um efeito inibidor da FSH), pois os níveis de estradiol aumentam, fortemente (estrogénios). LH sempre com concentrações muito baixas, na primeira fase do desenvolvimento folicular. Na segunda parte desse mesmo desenvolvimento, a concentração começa a aumentar, atingindo um pico antes da ovulação. Este pico é a principal causa da mudança das células / hormonas. O decréscimo de FSH, na segunda parte da fase folicular, deve-se à produção de estrogénios, pelo folículo dominante, o que vai inibir o hipotálamo. Como o folículo tem receptores suficientes, consegue continuar o desenvolvimento, mesmo com a ligeira diminuição de FSH. Quando se atinge determinado nível elevado de estrogénios, vão ser induzidos os picos de LH e de FSH, que provocam a ovulação e a continuação do ciclo. Regulação Hormonal Produção de Estrogénios na Fase Folicular Estrogénios (estradiol) produzido por células foliculares e pela teca interna. A sua concentração aumenta progressivamente, à medida que os folículos ováricos crescem, e de um modo rápido, antes da ovulação, onde atingem um valor máximo. Após a ovulação, diminui devido à perda de células foliculares, e volta a aumentar na fase luteínica, devido à actividade do corpo amarelo. Bastam pequenas quantidades de LH para a conversão de colesterol em androgénios (androstenediona). 8

10 Os estrogénios são produzidos essencialmente na fase folicular (responsáveis pelo desenvolvimento dos folículos). A teca interna é estimulada, por valores basais de LH (logo existem receptores para esta hormonas, nessas células), a converter colesterol em androgénios (que não vão para a circulação, logo não seria bem correcto designar esta substância por hormona) que se difundem para as células em redor, as da camada da granulosa, e os convertem em estrogénios (estradiol). A conversão pressupõe um estímulo, por parte do FSH, às células da granulosa, em quantidades razoáveis. Assim, a hormona LH é necessária em níveis baixos, mas a FSH é necessária em níveis elevados. O estrogénio produzido, como hormona que é, vai entrar no sangue e atingir as zonas do corpo para a qual existem receptores (aparecimento de caracteres secundários), mas uma parte vai permanecer acumulada no antro formado no folículo, sendo esta uma das razões pela qual cada folículo cresce. Esta hormona vai actuar, também, nas células da granulosa, que se pensa aumentarem os receptores para o FSH nas suas células. Regulação Hormonal Fase Folicular FSH e estrogénios responsáveis pelo desenvolvimento folicular. FSH e LH responsáveis pela produção de estrogénios. Feedback negativo dos estrogénios e inibina sobre a produção de FSH. Esta descrição vai corresponder a toda a fase folicular, excepto o período imediatamente antes da ovulação. O hipotálamo produz a hormona libertadora das gonadotrofinas, que vai actuar na hipófise anterior, nas células que produzem FSH e nas células que produzem LH, que lançam estas hormonas na circulação. Estas hormonas vão actuar no folículo que está dentro do ovário. A LH aparece em valores basais, mas a FSH, dependendo do momento da fase folicular, pode ser mais, ou menos, elevada. Níveis baixos de estrogénios são designados por serem, quantitativamente, menores que os da ovulação (apesar de mesmo assim serem elevados) o que inibe o hipotálamo e a hipófise, logo a tendência é diminuir a hormona FSH e a hormona libertadora das gonadotrofinas (que diminui a hormona LH e a hormona FSH). Além disso, a inibina produzida pelo folículo em crescimento, inibe a hipófise, ao nível da FSH. Devido a este fenómeno vai-se assistir à diminuição da FSH, pensando-se que seja devido a este decréscimo, a razão pela qual apenas um único folículo chega ao fim. 9

11 Regulação Hormonal Ovulação Quando se atingem determinados níveis de estrogénio, ocorre uma estimulação (e não inibição como seria esperado), por feedback positivo, das células da hipófise, que produzem LH, e do hipotálamo, atingindo-se, então, um pico de LH e de FSH (o pico de LH é maior que o de FSH pois a LH sofre estimulação a 2 níveis e, também, a inibina continua a actuar nas células que produzem FSH, na hipófise). As células da granulosa adquirem, neste momento, receptores de LH (que até este ponto não tinham). O LH actua e reinicia-se a meiose, e, depois da ovulação, provoca a luteinização do folículo. As maiores dúvidas, em relação a este processo, encontram-se na via pela qual os estrogénios induzem o pico de LH e de FSH (mais baixo). Até ao momento presente, não se conhece nenhum fenómeno directo associado ao pico de FSH. Regulação Hormonal Fase Lútea Células da granulosa do folículo dominante com receptores de LH. Pico de LH induzido por níveis elevados de estrogénios (feedback positivo). Pico de LH responsável pelo reinício da meiose, ovulação e luteinização das células foliculares. A este momento, a FSH está, então, relativamente baixa (mas não tão baixa como na fase lútea) pelo que se vai observar a uma inversão dos níveis / perfis hormonais. LH responsável pela manutenção do corpo amarelo e pela produção de progesterona (e estrogénio). Feedback negativo da progesterona (mesmo que os níveis de estrogénios atinjam valores que originam o feedback positivo na ovulação) sobre a produção de LH. Após a ovulação, por efeito do pico de LH, verifica-se a produção de estrogénios e progesterona, formando o corpo amarelo de tempo bem definido. Mais uma vez, se verifica, que o hipotálamo produz a hormona libertadora das gonadotrofinas, que estimula a produção de LH. 10

12 Os níveis moderados de estrogénio dizem respeito a valores superiores aos da fase folicular, mas mesmo assim inferiores aos do pico provocado antes da ovulação. Sendo assim, teoricamente, estes níveis seriam capazes de actuar e provocar novamente picos de LH e de FSH, no entanto a progesterona é um poderoso inibidor do hipotálamo. O pico de progesterona aparece a meio da fase lútea, que é quando o corpo amarelo está na sua máxima potência. Regulação Hormonal Gravidez No caso de haver fecundação, 7 dias após a ovulação, é segregada pelo trofoblasto a Gonadotrofina coriónica humana (hcg) que tem uma acção semelhante à LH, logo é importante para a manutenção do corpo amarelo. Assim, mantém-se a produção de grande quantidade de estrogénios e progesterona, levando à ausência do período menstrual. Também, desta forma, ocorre inibição da produção de FSH e LH o que implica a ausência de maturação de novos folículos e de ovulação. Gonadotrofina coriónica hormona produzida após a fecundação do óvulo. É uma hormona, em tudo, idêntica à LH, que faz com que o corpo amarelo cresça e persista. Se o corpo amarelo persiste, há a produção contínua de progesterona e estradiol, que durante a gravidez vão permanecer sempre com níveis de concentração, correspondentes ao seu pico (na fase lútea), logo as prostagladinas não podem actuar e provocar a esquemia, pois estão fortemente inibidas e, consequentemente, nunca ocorre a passagem para um novo desenvolvimento folicular. A sua produção mantém-se com valores elevados durante os 3 primeiros meses de gravidez, após o qual o corpo amarelo degenera, mas a produção de estrogénios e progesterona é assegurada pela placenta que, inclusive vai aumentar os seus níveis. Desta forma, a hormona gonadotrofina coriónica, apenas é produzida durante os primeiros 3 meses após a fecundação e de seguida o corpo amarelo degenera e desaparece. Uma vez que já existe a placenta, esta torna-se a responsável pela produção de estrogénios e progesterona, que vão manter os seus níveis suficientemente altos, para que as prostaglandinas permaneçam inibidas, e a gravidez prossiga, normalmente. A fecundação dá-se imediatamente após a ovulação, ou até 24 horas após (capacidade de sobrevivência do oócito). Após 7 dias (meio da fase lútea), inicia-se a produção da hormona gonadotrofina coriónica humana que tem uma acção muito semelhante à da hormona LH. Vai estimular o corpo amarelo, que está no seu máximo desenvolvimento, e vai fazer a sua manutenção, ou seja, em vez de envelhecer, vai até crescer. Asseguram-se os níveis elevados de progesterona e estrogénios o que impede o novo início do ciclo (pois não se dá a quebra de hormonas), logo não há menstruação, nem gravidez dessincronizada. A hormona gonadotrofina coriónica humana vai ser utilizada em reprodução assistida para o efeito da LH. Esta é, também, a hormona que se detecta num teste de gravidez. Regulação Hormonal Amamentação / Hiperprolactinemia Níveis elevados de Prolactina Inibição da produção do factor libertador das gonadotrofinas (GnRh) - descida de FSH e LH Bloqueio da acção da FSH e LH no ovário Ausência de maturação de folículos Ausência de ovulação 11

13 A hipófise produz prolactina que tem um controlo duplo através do factor libertador da prolactina, que aparece na fase depois da gravidez, e pela dopamina, que normalmente é a hormona que está presente. A hiperprolactinemia é uma patologia na qual a prolactina está em valores elevados, por défice (patológico) da dopamina. Este défice pode provocar problemas de infertilidade devido à ausência da ovulação. A patologia pode ser provocada por um tumor. Este pode ser o factor (ausência de ovulação pela presença de níveis elevados de prolactina) explicador para o facto de as mulheres que amamentam não engravidarem e não terem menstruação, uma vez que apresentam valores elevados de prolactina devido à presença de valores elevados da hormona libertadora da prolactina (e não de défice de dopamina como acontecia em caso de patologia). Regulação Hormonal Menopausa A menopausa (último período menstrual) é um processo gradual. Após ser atingido este estado, pode continuar a persistir um desenvolvimento folicular, com oscilações na secreção de estrogénios, até que essa actividade acabe por desaparecer, com o esgotamento dos folículos, deixando de ocorrer a retroacção negativa das hormonas ováricas, sobre o complexo hipotálamo-hipófise, aumentando os valores de gonadoestimulinas. Na menopausa, a ausência de folículos é responsável pelos níveis quase nulos de estradiol e progesterona, o que origina um aumento significativo de FSH e de LH. Aparece porque os folículos esgotam. A LH e a FSH vão ser produzidas em grandes quantidades, pois não há estrogénios nem progesterona para fazerem inibição. Assim, ao serem medidos os níveis sanguíneos de FSH e LH, no sangue, de uma mulher em menopausa, estes estarão muito elevados comparativamente aos de uma mulher fora desse período. Trompa Local da fecundação ampola. Movimentação do oócito / zigoto em direcção ao útero 3/4 dias. Efeito dos estrogénios aumento do número de células ciliadas da mucosa. Efeito da progesterona aumento das secreções (células da mucosa) e relaxamento do músculo do istmo. Constituído por 4 zonas: infundíbulo, ampola, istmo e porção intramural. Todas as zonas possuem uma mucosa mais, ou menos, pregueada, uma camada de músculo e uma camada serosa. No epitélio há células ciliadas e secretoras. A ampola, a nível histológico, é muito diferente do istmo e da porção intramural. O infundíbulo e a ampola têm mucosas maiores, mas o istmo e a porção intramural possuem uma camada muscular maior. 12

14 O oócito tem de ser empurrado pelo sistema da trompa pois não possui flagelos para se mover. O batimento dos cílios do epitélio, com a ajuda das secreções, fazem com que o oócito seja arrastado. No período próximo da ovulação, as paredes das trompas, vão estar cheias de cílios, para que, caso haja fecundação (ou mesmo que não haja), consigam arrastar a estrutura. Isto juntamente com o aumento das secreções, provocado pelas hormonas produzidas. O músculo das trompas está contraído e só a progesterona vai provocar o seu relaxamento, logo só nesse momento, o tubo vai permitir a passagem do zigoto / oócito. Corpo do Útero O útero, numa mulher não grávida, tem 7 centímetros. Numa mulher grávida ocorre principalmente hipertrofia (aumento do tamanho através do aumento das células musculares) e mais raro a hiperplasia (aumento do número de células). Endométrio: Estrato funcional: o Estrato compacto. o Estrato esponjoso. Estrato basal. Miométrio. Perimétrio. O epitélio (estrato funcional), que rodeia a cavidade uterina, e o estrato basal constituem o endométrio. Conforme as hormonas que se encontrem em maior, ou menor, quantidade, o estrato basal permanece e o estrato funcional é o que sofre modificação e vai descamar, dando origem à menstruação. O crescimento posterior do estrato funcional deve-se à permanência de vasos sanguíneos e de células do estrato basal. Assim, nesta mucosa, é o estrato funcional o que sofre grandes alterações de tamanho (desde o desaparecimento até ao seu máximo tamanho). Ciclo Uterino crescimento em tamanho do endométrio (mucosa do corpo do útero) sob o efeito dos estrogénios: Fase Menstrual Fase proliferativa Fase Secretora Fase menstrual destruição parcial do endométrio, visto que as células deixam de receber os nutrientes necessários e morrem, é uma consequência da baixa concentração de hormonas ováricas. Fase proliferativa crescimento em espessura do endométrio, desenvolvimento de glândulas e de vasos sanguíneos, devido a um aumento da taxa de estrogénios, durante a fase folicular. Ou seja, é a formação da camada de células mais superficial, que descamou na fase anterior, ocorrendo, também, o crescimento do endométrio, em altura. Fase secretora aumento da espessura do endométrio, actividade secretora das glândulas devido à acção das hormonas ováricas produzidos durante a fase luteínica. Ou seja, é uma fase onde ocorre a secreção de várias substâncias. 13

15 Influência das hormonas ováricas no endométrio: Estrogénios regeneração do estrato funcional a partir do estrato basal (crescimento do estroma, glândulas e vasos sanguíneos). Progesterona estimulação da actividade secretora das glândulas. Queda de progesterona contracção das artérias do estrato funcional (isquemia) e necrose o que leva à descamação do estrato funcional. A progesterona é, então, responsável pelo aumento da actividade glandular (pois provoca a sua estimulação). Estas secreções são acumuladas no estroma do endométrio, que é onde o zigoto vai buscar a sua nutrição antes da formação da placenta. Na fase secretora também ocorre um aumento adicional do endométrio pois continuam a ser produzidos estrogénios. A queda da progesterona leva ao aumento de prostaglandinas que provoca uma grande contracção que faz corte na circulação e o tecido morre e sai. A implantação (7 dias após a fecundação) dá-se na fase secretora (coincidente com o nível máximo de progesterona). Influência das hormonas ováricas no miométrio: Estrogénios aumento das contracções uterinas. As contracções uterinas existentes, próximo do período ovulatório, auxiliam a propulsão dos espermatozóides em direcção às trompas. Progesterona diminuição das contracções uterinas. Implantação (7 dias após a fecundação) dá-se na fase em que as contracções uterinas e são inibidas (coincidente com o nível máximo de progesterona). O miométrio está absolutamente relaxado devido ao pico de progesterona o que permite o sucesso da implantação. Colo do Útero O colo do útero limita o canal cervical que liga a cavidade uterina à vagina. Este local é, histologicamente, diferente do corpo do útero e não está sujeito a descamação. Possui uma mucosa com epitélio cilíndrico (ou estratificado na zona que se projecta na vagina) e muitas células secretoras que são responsáveis pela produção do muco cervical. Influência das hormonas ováricas no colo do útero: Estrogénios produção de um muco cervical aquoso que permite a passagem dos espermatozóides em direcção à cavidade uterina. Progesterona produção de um muco cervical espesso que não permite a passagem de bactérias (e de espermatozóides) em direcção à cavidade uterina. Assim, a composição deste muco está relacionada com a produção de hormonas. Quando o muco produzido é muito espesso, muitos poucos espermatozóides conseguem passar para o útero (probabilidade de fecundação muito reduzida). Os estrogénios tornam esse muco mais aquoso, o que facilita a passagem de espermatozóides (probabilidade de fecundação aumenta). A progesterona torna o muco extremamente espesso formando uma barreira entre a vagina e o útero, o que é vantajoso pois impede a passagem de bactérias (e espermatozóides, mas o que não é relevante se a este nível já tiver ocorrido fecundação), basicamente isolando a cavidade uterina. Vagina Mucosa: Epitélio estratificado com células com glicogénio. Lâmina própria tecido conjuntivo com muitos vasos sanguíneos e fibras. elásticas. Muscular. Adventícia. O epitélio está potencialmente sujeito a abrasões mecânicas (relações sexuais, bactérias, ácido, ). 14

16 As células podem descamar e devido à presença de colagéneo as bactérias comensais vão usá-lo para o seu metabolismo, tornando o ph extremamente ácido, o que é favorável à inibição do crescimento de bactérias patogénicas. Metabolização do glicogénio por bactérias comensais ph ácido (ph = 3,5 / 4,0) Inibe o crescimento de bactérias patogénias Lubrificação da vagina a vagina, durante o acto sexual, tem de ser lubrificada: Muco cervical oriundo do colo do útero. Transudata da rede vascular da lâmina própria (vasodilatação das arteríolas induzidas pelo sistema nervoso parassimpático durante o acto sexual) a vasodilatação provoca a saída de líquido da rede sanguínea. Esta é a única excepção de vasodilatação provocada pelo sistema nervoso parassimpático, uma vez que todas as restantes vias são exclusivamente provocadas pelo sistema nervoso simpático. Secreção das glândulas dos lábios menores. Muco do líquido seminal. O músculo e as fibras elásticas intervêm na distensão da vagina durante o acto sexual e parto (esta distensão é provocada pela grande quantidade de fibras elásticas). No entanto, após o acto sexual, por contracção do músculo da vagina, levam à permanência do líquido seminal na região cervical. Assim, após a saída do pénis, o músculo da vagina está totalmente distendido e as fibras provocam uma contracção que favorece a permanência dos espermatozóides, dentro da vagina. Anatomia do aparelho Reprodutor Masculino Gónadas testículos (saem da cavidade abdominal juntamente com uma prega de pele, o escroto). Ductos epidídimo, canal deferente, ducto ejaculador e uretra. Glândulas anexas vesículas seminais, próstata e glândulas bulbouretrais. Órgão copulador pénis. A localização dos testículos, fora da cavidade abdominal, é importante para a formação dos espermatozóides. A espermatogénese, no máximo, dá-se a uma temperatura de 35 C, logo se tivesse no interior do organismo, esta não ocorria. A sua localização especial deve-se, então, exclusivamente a uma questão de temperatura. No epidídimo, os espermatozóides entram num processo de maturação, onde adquirem a sua capacidade para se moverem. 15

17 As glândulas bulbouretrais produzem muco, essencialmente. A frutose (produzida pelas vesículas seminais) é a fonte de energia para os espermatozóides. A proteína fibrinogénio (produzida pelas vesículas seminais) são importantes na coagulação do líquido seminal que prende os espermatozóides e os mantêm na vagina. As enzimas pró-coagulantes (produzido pela próstata) quebram o fibrinogéneo. As enzimas proteolíticas (produzidas pela próstata) permitem a dissolução do coágulo. As prostaglandinas (produzidas pelas vesículas seminais) induzem contracções do músculo uterino ajudando a propulsionar os espermatozóides em direcção às trompas. Testículo Túbulo seminífero: Células de Sertoli. Células germinativas espermatogónia, espermatócito, espermátides, espermatozóides. Tecido intersticial: Células de Leydig produzem testosterona. Vasos sanguíneos. Através do corte de um testículo, verifica-se que, no seu interior, existem inúmeros tubos cujas paredes têm uma constituição especial, nomeadamente a presença de células de Sertoli (muito importantes para a espermatogénese) e as células germinativas. Para além dos tubos, existe, também, tecido intersticial. Células germinativas as fases mais atrasadas estão na base do tubo, enquanto perto do lúmen encontram-se as células em fases mais evoluídas (espermatozóides). Tecido intersticial possui vasos sanguíneos e linfáticos e algumas (poucas) células nervosas. Espermatogénese Espermatogónia MITOSE tipo A Espermatogónia MITOSE tipo B Espermatócito primário 1ª MEIOSE Espermatócito secundário 2ª MEIOSE Espermátides Espermatozóide Túbulo seminífero: As células de Sertoli são células muito altas que asseguram a nutrição das células germinativas. No compartimento basal aparecem espermatogónias, não existindo adesão entre as células desta camada. Existem espermatogónias de tipo A e de tipo B que são fonte permanente de células germinativas. A Mitose A B Mitose Germinativa A B 16

18 As espermatogónias B, por mitoses, dão origem a espermatócitos I (2n), que migram para o compartimento adluminal, por abertura e fecho das células de Sertoli (que não possuem grande adesão). Por meiose I, origina-se o espermatócito II, e quando se conclui a meiose II formam-se espermátides. Estes fenómenos ocorrem ao longo da célula de Sertoli, logo quanto mais próximo está a célula germinativa do lúmen, mais avançada será a fase que apresenta. As espermátides através de uma diferenciação originam os espermatozóides. Estas células germinativas, provenientes das várias fases da espermatogénese, ficam agregadas, ou seja, praticamente não ocorre divisão total do citoplasma até ser atingida a fase final do processo (passagem de espermátides a espermatozóides). A espermatogénese (processo desde espermatogónias até espermatozóides) dura cerca de 70 dias. Espermiogénese Há, essencialmente, uma diferenciação a nível do núcleo, com o aparecimento do acrossoma (2/3 anteriores acima do núcleo) que tem uma série de proteínas e enzimas que são essenciais à penetração do espermatozóide no oócito. Ocorre, também, a formação da cauda (que na prática é um flagelo) e da peça intermédia (onde existem mitocôndrias fundamentais para o movimento dos espermatozóides). Após esta diferenciação, os espermatozóides são libertados no lúmen, mas estes ainda não têm qualquer capacidade para se moverem, pois necessitam de sofrer, ainda, outro processo (maturação). Mesmo depois disso continuam sem ser capazes de fecundar (só após a capacitação que ocorre nas vias femininas, nomeadamente na zona do muco do colo do útero segundo o que se pensa, é que passa a ser capaz de fecundar). In vitro é possível, sob determinadas condições, provocar a capacitação fora das vias femininas, no entanto, In vivo, tal só é possível dessa forma. Tecido Intersticial e Células de Leydig Testosterona Efeito da testosterona no aparelho reprodutor, antes do nascimento: Diferenciação dos ductos e glândulas anexas. Diferenciação da genitália externa (dihidrotestosterona). Descida dos testículos da cavidade abdominal. Efeito da testosterona no aparelho reprodutor, a partir da puberdade: Crescimento do testículo. Crescimento e secreção das glândulas anexas. Espermatogénese (mitoses e meioses das células germinativas). Síntese de testosterona nas células de Leydig Lúmen do túbulo seminífero (ligada à ABP acção nas células de Sertoli - espermatogénese) Vasos sanguíneos (acção nos restantes tecidos alvo) 17

19 As células de Leydig são, então, produtoras de testosterona, quando estimuladas por LH. A testosterona é uma hormona esteróide, logo difunde-se com toda a facilidade através das membranas citoplasmáticas. Parte desta testosterona entra no sangue e é transportada (ligada a uma proteína) até aos vários órgãos alvo. A restante, passa para as células de Sertoli onde fica aprisionada em grandes quantidades. Para além disso, o tubo seminífero produz ABP que ancora a testosterona às suas células. Células de Sertoli Barreira hemato-testicular devido à estrita adesão entre as células de Sertoli contíguas, o que faz com que muitas substâncias não passem dos vasos sanguíneos para o lúmen do túbulo seminífero, evitando a formação de anticorpos contra os espermatozóides, uma vez que estes se formam tardiamente na vida do homem. Nutrição dos espermatozóides. Fagocitose de citoplasma que é libertado na diferenciação dos espermatozóides. Secreção do fluído tubular permite a passagem dos espermatozóides, desde o túbulo seminífero até ao epidídimo, que entretanto é reabsorvida para permitir o armazenamento de espermatozóides nesse local. Estes espermatozóides só saem do epidídimo, devido a fortes contracções do músculo, aquando da ejaculação. Secreção de ABP proteína de ligação dos androgénios. Alvo da testosterona e FSH espermatogénese. Secreção da inibina controle da FSH. Efeitos da FSH na Reprodução Foliculoestimulina (FSH) estimula as células de Sertoli na produção da hormona Inibina que tem grande afinidade para a testosterona. A fixação de testosterona permite obter, nos túbulos seminíferos, uma certa concentração, estimulando a espermatogénese. Antes da puberdade proliferação das células de Sertoli. A partir da puberdade estimulação das células de Sertoli, que por sua vez estimulam a espermatogénese, a secreção de ABP (androgene binding protein) e a secreção de inibina. A FSH actua nas células de Sertoli, sendo responsável também pela espermatogénese (provavelmente aumentam os seus receptores para a testosterona). A sua ausência pode provocar a falta ou diminuição do número das células de Sertoli, pois provocam a sua proliferação, antes da puberdade. A testosterona, produzida pelas células de Leydig, dá o sinal para que ocorram mitoses e meioses, iniciando, desta forma, a espermatogénese. Para além da testosterona, existe a hormona FSH que é essencial para estimular as células de Sertoli. Pensa-se que a FSH tenha um efeito limitador da testosterona, pois se só existir testosterona, não ocorre nada. Assim, são necessárias ambas as hormonas para que ocorra espermatogénese. Assim, a hormona FSH actua sobre as células de Sertoli estimulando a produção de espermatozóides. Por sua vez, estas células produzem uma hormona, a Inibina, capaz de diminuir, por um mecanismo de retroacção negativa, a produção de FSH. Logo, o aumento de concentração da FSH estimula as células de Sertoli à produção de Inibina, cujo aumento leva à diminuição da produção de FSH. 18

20 Controlo Hormonal A testosterona, em grandes quantidades, inibe a sua própria produção. Desta forma, os indivíduos que tomam testosterona podem ficar inférteis, não por falta a hormona, mas pela falta de FSH, que o seu excesso provoca. Epidídimo Reabsorção do fluído tubular. Contracções rítmicas do músculo liso condução dos espermatozóides até ao canal deferente. Armazenamento de espermatozóides capacidade limitada. Maturação de espermatozóides: Aquisição de movimentos direccionais. Distribuição das proteínas de membranas importantes para o processo de capacitação. A espessura da camada de músculo liso aumenta da zona inicial para a terminal do epidídimo. Este músculo possui contracções rítmicas, logo vai ser o responsável por empurrar os espermatozóides até ao canal deferente. É no epidídimo onde ocorre a maturação dos espermatozóides, ou seja, é o local onde eles adquirem certas características que permitem o seu movimento. Canal Deferente Armazenamento de espermatozóides só saem deste compartimento se o músculo se contrair, durante a ejaculação, empurrando os espermatozóides para a uretra. Contracções peristálticas do músculo liso, por acção do sistema nervoso simpático condução dos espermatozóides até à uretra durante a ejaculação. Este tubo possui uma grande camada de músculo liso, que está fortemente enervado pelo sistema nervoso simpático. Assim, só com descargas do sistema nervoso simpático é que há contracção do músculo liso e ejaculação. Glândulas Anexas Secreção de fluidos que são adicionados aos espermatozóides e líquido tubular provenientes do canal deferente durante a ejaculação. O conjunto das várias secreções destas glândulas vai constituir o líquido seminal que possui um volume em cerca de 2,0 6,0 ml, com um ph entre 7,2 e 7,8. Possui, também, uma concentração de espermatozóides que vai desde os 20 milhões até aos 150 milhões por ml. Como resultado, quando há ejaculação, todos os conteúdos se juntam e formam o líquido seminal. No entanto, estes fluidos apenas se juntam aquando da ejaculação, de modo a evitar coagulações nas vias do tracto masculino. Em casos de infertilidade, a coisa mais óbvia a ser verificada é a presença de espermatozóides, no líquido seminal. 19

21 Glândulas Anexas Vesículas Seminais O fluído proveniente das vesículas seminais é lançado no ducto ejaculador, apenas durante a ejaculação. Fora destes momentos, as substâncias estão armazenadas na respectiva glândula. Líquido viscoso e alcalino (60% do líquido seminal) permite que, juntamente com o ph ácido da vagina, resulte num ph óptimo para a movimentação dos espermatozóides. Frutose fonte de energia para os espermatozóides. Prostaglandinas contracção do músculo liso no tracto feminino e masculino. Ou seja, auxiliam a contracção na ejaculação, mas essencialmente auxiliam na contracção do aparelho feminino, o que permite o sucesso da mobilidade até às trompas, pois por mobilidade própria, dificilmente chegariam tão longe. Fibrinogénio coagulação. É a substância essencial para a formação do coágulo. Glândulas Anexas Próstata O fluído proveniente da próstata é lançado na uretra prostática, aquando da ejaculação. Este fluído possui características anti-bacterianas e enzimas proteolíticas. Líquido aquoso e ligeiramente ácido (25% do líquido seminal). Ácido cítrico. Enzimas proteolíticas: Vesiculase coagulação do líquido seminal. Actua na fibrina e forma o coágulo. Enzimas semelhantes à quimiotripsina PSA (liquefacção do líquido seminal). Vai desfazer, lentamente, o coágulo permitindo que os espermatozóides saiam e continuem a percorrer o seu caminho. Glândulas Anexas Glândulas Bulbouretrais O líquido proveniente das glândulas bulbouretrais é lançado na uretra peniana. Muco lubrificação da uretra. Pénis O pénis é o órgão copulador, constituído por 2 tipos de corpos erécteis, que são espaços vasculares, nomeadamente o corpo cavernoso e o corpo esponjoso. A erecção ocorre, quando estes espaços vasculares ficam cheios de sangue, ou seja, estão sob controlo das arteríolas que enchem esses espaços. Maioritariamente, deve-se ao corpo cavernoso, e em menor interesse / amplitude pelo corpo esponjoso. Erecção Trata-se de um reflexo medular parassimpático (único, uma vez que a maioria dos reflexos é controlado pelo sistema nervoso simpático). 20

22 A maioria das arteríolas é controlada pelo sistema nervoso parassimpático (e pelo simpático em menor amplitude e muito menos importante). A descarga do parassimpático é conseguida através da estimulação de receptores presentes na glande do pénis. Pode haver estimulação por via medular ou somático, mas a maioria é medular. Ocorre uma inibição da estimulação simpática, mas que é muito pouco importante. Este mecanismo de erecção é importante para a entrada do pénis na vagina. Ejaculação Fase de emissão reflexo medular simpático, que consiste no despejar das substâncias, que se encontram armazenadas, na uretra. Esta é conseguida por contracção do músculo liso dos tubos: Estimulação dos receptores na glande do pénis Impulsos simpáticos para o músculo liso da próstata, epidídimo, canal deferente, ducto ejaculador e vesículas seminais Contracção do músculo e esvaziamento do conteúdo (líquido seminal) na uretra Fase de expulsão reflexo somático, que consiste na saída do fluído seminal da uretra para o exterior. Esta é conseguida pela contracção do músculo-esquelético que se encontra na base do pénis: Enchimento da uretra Impulsos através de nervos motores para o músculo esquelético da base do pénis Contracção do músculo e expulsão do líquido seminal para o exterior Percurso dos Espermatozóides da Vagina até à Trompa (Ampola) Deposição dos espermatozóides na vagina: Coagulação do líquido seminal que impede a saída dos espermatozóides da vagina após a retirada do pénis devido à presença do fibrinogénio (vesículas seminais) e da vesiculase (próstata). Liquefacção do líquido seminal o que permite a libertação dos espermatozóides na parte superior da vagina devido à presença das enzimas da próstata (PSA). Aquisição de movimento devido à presença de um ph óptimo para a mobilidade dos espermatozóides de cerca de 6,0 6,5 (junção do ph da vagina de cerca de 3,5 4,0 com o ph do líquido seminal de cerca de 7,2 7,8) e de frutose (vesículas seminais) que funcionam como fonte de energia. A rede tridimensional do coágulo aprisiona os espermatozóides. A libertação é permitida pela dissolução do coágulo. 21

23 A junção dos ph vai originar o ph óptimo para o movimento dos espermatozóides. O percurso até ao canal cervical é feito apenas pelo movimento próprio dos espermatozóides, logo necessitam de muita energia. Movimentação dos espermatozóides através do canal cervical o muco cervical é passível de ser atravessado (aquoso) no período ovulatório (estrogénios altos e progesterona baixa). Se o muco cervical for muito espesso, a probabilidade de espermatozóides passarem é muito reduzida, logo essa probabilidade apenas aumenta se o muco for aquoso. Transporte dos espermatozóides até ao local da fecundação, a trompa (ampola): Por contracções da musculatura uterina e da trompa máxima no período periovulatório (estrogénios altos e progesterona baixa) e pela presença de prostaglandinas (vesículas seminais) do líquido seminal. Quimiotaxia sobre espermatozóides capacitados devido à presença da alurina libertada pelo oócito e de factores do fluído folicular. A percentagem de espermatozóides que chega ao oócito é reduzidíssima. Pensa-se que, na medida de aumentar o número de espermatozóides a chegar ao oócito, existam fenómenos de quimiotaxia sob os espermatozóides capacitados (não comprovado), que atraem os mesmos até ao oócito, permitindo uma maior facilidade no seu encontro. Capacitação dos espermatozóides no aparelho reprodutor feminino aquisição da capacidade de fecundação pelo espermatozóide que permite a reacção acrossómica e a hiperactivação da motilidade: Modificação e exposição das proteínas de membrana (receptores) do espermatozóide nas vias femininas, nomeadamente por remoção de colesterol da membrana, ao atravessar o muco cervical. Este processo, que dura cerca de 2 horas a 4 horas, constitui uma fase transitória dos espermatozóides. A capacitação é, então, a capacidade de fertilização adquirida pelos espermatozóides. Devida, principalmente, à cabeça do espermatozóide. Este processo só ocorre nas vias femininas pois só aí é que ficam expostos aos factores necessários que os permitem fecundar um oócito. Penetração do Espermatozóide nas Camadas que Rodeiam o Oócito 22

24 Hiperactivação da motilidade movimentos violentos da cauda do espermatozóide que permitem o movimento através das camadas que rodeiam o oócito. Este fenómeno é induzido pela hormona P, que é a hormona presente no fluído folicular, libertado na ovulação e na matriz da coroa radiata. Reacção acrossómica exocitose do acrossoma por fusão da membrana citoplasmática com a membrana externa do acrossoma (com a libertação de enzimas do acrossoma, a hialuronidase e acrosina). Este fenómeno é induzido pela hormona P e pela ligação do espermatozóide à proteína ZP3 da zona pelúcida. Hialuronidase digere/quebra a ligação entre as células da coroa radiata. Acrosina (presente no acrossoma) digere a zona pelúcida. A hiperactivação consiste em movimentos violentos que fazem o espermatozóide perfurar as camadas que rodeiam o oócito. O espermatozóide necessita de possuir receptores para a hormona P senão não pode ser induzido. Este fenómeno faz com que as células da coroa radiata sejam perfuradas pelos espermatozóides, sendo para isso apenas a hormona P. Será formado, então, um túnel para a passagem do espermatozóide. O oócito ainda está em metafase II, pois só no fim deste processo é que o espermatozóide entra realmente em contacto com o oócito. Capacitação (exposição de proteínas da membrana) Encontram a hormona P e a ZP3 na zona pelúcida Hiperactivação da motilidade Exocitose de enzimas (Reacção acrossómica) Fecundação Fusão das membranas do oócito e espermatozóide Aumento do cálcio no citoplasma do oócito Inibição da polispermia Activação do zigoto Fusão das membranas do oócito e espermatozóide: Contacto da membrana do espermatozóide (proteína fertilina) com a do oócito (integrinas). Fusão das duas membranas. Entrada da cabeça, que tem o núcleo, (e talvez da peça intermediária e cauda) no citoplasma do oócito. O aumento do cálcio apenas ocorre quando as duas membranas entram em contacto. Inibição do polisperma (fertilização de um oócito por muitos espermatozóides): Desgranulação cortical na zona mais externa de um oócito existem grânulos com enzimas que se desfazem. Libertação de enzimas (inactivação de, por exemplo, ZP3). Impossibilidade de ligação e penetração de outros espermatozóides. O oócito possui grânulos que se dissolvem, libertando as substâncias que estão acumuladas. Algumas destas enzimas vão inactivar a proteína ZP3 que é responsável pela penetração na zona pelúcida, logo os espermatozóides que andam ao redor não serão capazes de formar um túnel, devido à ausência da reacção que os estimula, inibindo assim a penetração de outros espermatozóides. O cálcio surge logo após a penetração do primeiro espermatozóide, impedindo desde o início qualquer penetração posterior. 23

25 Activação do zigoto: Finalização da meiose II (parada em metafase II) formação do pronúcleo feminino e do segundo glóbulo polar. Formação do pronúcleo masculino descondensação do núcleo do espermatozóide e formação de uma nova membrana nuclear (de origem materna). Contacto e fusão dos dois pronúcleos, com formação do primeiro fuso mitótico fuso acromático puxa os dois pronúcleos para o centro. Apenas neste momento se origina um núcleo n. O espermatozóide permanece no espaço vitelino. Estes fenómenos dão-se pela fusão das membranas que desencadeiam o aumento do cálcio. O fuso vai arrastar os dois pronúcleos para o centro da célula permitindo a sua fusão após a qual se dá o início da primeira divisão mitótica. 1ª Semana de Desenvolvimento Idade (dias) Estado Número de células (blastómeros) Local Fenómenos que ocorrem 1 2 Trompa 2 4 Trompa 3 8 Trompa Útero Compactação Mórula 5 60 Útero Eclosão Blastocisto 6 80 Útero Blastocisto Útero Implantação (início) Blastocisto 24

26 Mórula (esfera maciça idêntica a uma amora envolvida pela zona pelúcida) Blastómeros achatam-se, aumentam a superfície de contacto com as células vizinhas e reduz-se o espaço intercelular difícil isolamento das células Formação de 2 tipos de células diferentes - trofoblastos e massa de células interna Acumulação de líquido no interior provocando a formação de uma cavidade Blastocisto (esfera oca com uma cavidade cheia de líquido e com uma massa de células interna, num dos pólos) Saída do blastocisto para fora da zona pelúcida Compactação (início na fase de 8 células) - polarização dos blastómeros e aparecimento de junções intercelulares Cavitação - acção de NA/K ATPase (acumulação de sódio e água na cavidade) Eclosão - devido a enzimas produzidas pelo trofoblasto e à pressão do líquido acumulado A cada uma das células formadas dá-se o nome de blastómeros. Até ao dia 3, a camada de glicoproteína (zona pelúcida) continua presente e o percurso é feito nas trompas, da ampola até à porção intramural. No dia 4, já há um aglomerado de células, envolvidas ainda pela camada pelúcida. A zona pelúcida não aumenta, logo as células vão-se dividindo em células, cada vez, mais pequenas. Começa-se a acumular líquido dentro da mórula e num dos pólos acumulamse células (blastocisto). A presença desta camada permite a adesão das células e impede que o zigoto, nesta fase, se implante pois não é suposto ser feito nas trompas nem muito cedo no útero. A eclosão é o desaparecimento da zona pelúcida. O trofoblasto dá origem aos anexos embrionários enquanto o embrioblasto dá origem ao feto. Já nesta fase as células têm funções / composições diferentes. Compactação a partir deste momento torna-se praticamente impossível retirar uma célula da mórula. Qualquer diagnóstico de avaliação da condição das células tem de ser feito antes desta fase. Cavitação formação da cavidade. O sódio e o potássio é transportado para determinadas zonas específicas. Implantação (7º - 10º Dia) 1. Aposição direccionamento do blastocisto para uma área da cavidade uterina (pólo embrionário parede posterior do útero). 2. Adesão ao endométrio. 3. Invasão do endométrio enzimas do trofoblasto destroem a matriz extracelular do endométrio, ocorrendo a migração do blastocisto no estroma. Há o direccionamento das células para junto da parede do útero. O pólo embrionário adere ao útero e libertam-se enzimas produzidas pelo trofoblasto que digerem células da parede do útero. Toda a massa de células fica embebida no útero, ou seja, toda a estrutura está no interior da parede do útero que possui um endométrio com elevadas concentrações das secreções reservadas / acumuladas, pois é a fase do pico de progesterona, estando também inibidas as contracções do útero. 25

27 Anomalias do Sistema Reprodutor e Infertilidade Infertilidade Infertilidade ausência de concepção após 12 meses de relações sexuais regulares e desprotegidas. Pode ser causado por factores patológicos ou fisiológicos (não patológicos). Factores não patológicos idade (a idade do homem não constitui um factor limitativo da fertilidade, logo, não é importante): Para a mulher, o pico da fertilidade é atingido aos 25 anos. A partir dos 35 anos ocorre um declínio muito rápido (a nível estritamente biológico existe um grande risco de concepção a partir desta idade). A cerca de 10 anos antes da menopausa verifica-se o final da fertilidade. Influenciado pelo envelhecimento e diminuição do número de oócitos. Reserva ovárica parâmetro que avalia o número e a qualidade dos oócitos. Com o tempo a reserva ovárica diminui. Existem duas formas deste parâmetro ser avaliado: Dosear FSH ao 2º ou 3º dia do ciclo (e posteriormente comparar a uma concentração padrão) quando é mais elevado que o padrão, a reserva ovárica é baixa. Contagem dos folículos antrais (valor normal entre 5 a 8) que são grandes e fáceis de distinguir através de uma endoscopia endovaginal. Um número baixo de folículos sugere uma reserva ovárica baixa. Factores não patológicos frequências das relações sexuais: Duração do oócito 24 horas. Duração do espermatozóide 48 horas. Período fértil 3 dias antes até 2 dias depois da data provável da ovulação. Este período está um pouco alargado (na realidade seria desde 48 horas antes até 24 horas depois) de modo a aumentar a probabilidade de concepção, quando existem relações regulares nesse mesmo período. Frequência recomendada de relações sexuais relações regulares 2 vezes por semana ou relações regulares de 2 vezes por mês no período fértil. 15 a 20% dos casais são inférteis: 40% devido a causas masculinas. 50% devido a causas femininas. 10% devido a causas idiopáticas (não se sabe a causa). Infertilidade masculina método de avaliação principal é o espermograma: Disfunção testicular / anomalias na espermatogénese (40%) problemas nos testículos. Há outras causas que provocam o mesmo efeito. Disfunções hipotálamo-hipofisárias (2%) hormonas estimulantes não estão presentes. Alterações no transporte dos espermatozóides (20%) impossibilidade dos espermatozóides chegarem ao exterior ou serem depositados, ou seja, são impossibilitados de chegarem à vagina. Infertilidade feminina cujos métodos de avaliação são através de calendário menstrual (do ponto de vista de regularidade, duração, ), perfil hormonal (FSH, LH, Prolactina, o doseamento de estrogénios não é feito directamente, mas antes pelo teste de privação da progesterona, que consiste na administração da hormona até determinado momento no qual se pára, se a partir daí houver menstruação é porque existiam estrogénios) e técnicas de visualização (ecografia, histerosonosalpingografia, laparoscopia, ): Disfunções ovulatórias (30 40%) não há ovulação (devido quer a problemas nos folículos quer no hipotálamo). Patologia das trompas (30 40%) obstrução / bloqueio nas trompas. Endometriose aparece endométrio em sítios onde não é suposto. Na prática é uma causa das disfunções ovulatórias. Patologia do útero raramente é causa da infertilidade. 26

28 O resultado final de cada patologia é praticamente idêntico, mas as causas é que podem ser diferentes. Infertilidade Masculina Disfunção Testicular / Anomalias na Espermatogénese Alterações no testículo (linhagem germinativa, células de Sertoli ou de Leydig) que levam a uma diminuição ou ausência de produção de espermatozóides ou formação de espermatozóides deficientes. Causas primárias: Alterações genéticas (por exemplo, microdelecções no cromossoma Y). Criptorquidia descida incompleta dos testículos (temperatura superior a 35 C). Infecções (por exemplo papeira necrose do epitélio germinativo). Radiações, drogas, Causas idiopáticas. Alterações no hipotálamo ou hipófise Infertilidade Masculina Disfunções Hipotálamo-Hipofisárias Hiperprolactinemia Produção deficiente de GnRh / LH / FSH Inibição da produção de GnRh Espermatogénese comprometida Diminuição ou ausência da produção de espermatozóides ou formação de espermatozóides deficientes Substâncias agonísticas da dopamina são administradas ao homem com hiperprolactinemia e à partida são o suficiente para a prolactina baixar, no entanto se o problema está nas células de ligação da hipófise com o hipotálamo, isso não adianta. Causas primárias: Tumores podem não ser tumores nas células produtoras, mas no caminho para o hipotálamo / hipófise. Hemacromatose doença ligada ao ferro. Causas genéticas. Infertilidade Masculina Alterações no Transporte dos Espermatozóides Impossibilidade de deposição de espermatozóides na vagina, devido a: Obstrução (ou ausência congénita) do epidídimo ou ducto deferente devido a infecções genitais (sífilis, gonorreia que podem levar ao crescimento de tecido e consequentemente ao entupimento dos canais) ou cirurgias várias. Ejaculação retrógrada refluxo do líquido seminal em direcção à bexiga. Devido a problemas no esfíncter ou nas pressões geradas pelo mesmo. Ausência de erecção ou ejaculação devido a lesões vertebro-medulares, vasculares (diabetes, doenças cardio-vasculares), doenças psíquicas ou medicamentos (anti-depressivos, anti-hipertensores, ). Infertilidade Feminina Disfunção Ovulatórias Ausência de ovulação: Ausência de folículos ou ausência de resposta dos folículos às hormonas. Insuficiências hormonais que impedem o desenvolvimento final e ovulação. 27

29 Causas primárias da insuficiência ovárica / falência ovárica: Ausência de células germinativas disgenesia do ovário, ou seja, o ovário forma-se mas não gera folículos (por exemplo, por causas congénitas). Falência ovárica prematura ou menopausa precoce (poucos folículos por atresia acelerada devido a anticorpos ováricos). Síndrome da resistência ovárica desenvolvimento folicular só até estados pré-antrais, possivelmente devido à incapacidade do ovário em responder à FSH. Os folículos estão em número correcto apenas não se desenvolvem mais. Consequências: reserva ovárica baixa, logo os níveis de FSH e LH estão altos. Infertilidade Feminina Disfunção Ovulatórias (Outras Causas) Disfunção hipotálamo/hipofisária baixa capacidade de produção de GnRh / FSH / LH devido a tumores, causas genéticas e lesões causadas por várias doenças (ausência do amadurecimento de folículos e de ovulação). Níveis baixos de FSH e LH e estrogénios. Hiperprolactinemia excesso de produção de prolactina devido a tumor, ou bloqueio na produção ou no envio de dopamina (factor inibidor da prolactina). Leva à inibição da produção de GnRh e ao bloqueio da acção da FSH no ovário. Ausência do amadurecimento de folículos e de ovulação, com níveis altos de prolactina. Síndrome do ovário poliquístico ovários aumentados, com estroma denso e mais de 10 folículos periféricos com tamanho inferior a 10 mm, frequentemente associados a hirsutismo (distribuição de pêlo do tipo masculino devido ao excesso de androgénios), resistência à insulina (hiperinsulinemia) ou obesidade. Distúrbios hormonais que levam à ausência do amadurecimento dos folículos e da ovulação. Grande número de folículos que aumenta a ocupação de espaço no ovário e consequentemente o desenvolvimento folicular é dificultado. Origina níveis altos de estrogénios, níveis normais ou baixos de FSH, níveis altos de LH, e LH/FSH alto. Alteração essencialmente a nível ovárico que não leva necessariamente à infertilidade. Os folículos não evoluem para além dos 10 mm, logo nunca continuam o seu desenvolvimento. Pensa-se que o despoletar desta síndrome estará numa anormalidade nas células da teca (ou do estroma) que, por alguma razão, produzem androgénios excessivamente. Se houver hiperinsolinemia verifica-se que a insulina induz a produção de androgénios pelas células da teca / do estroma, que aumentam ainda mais os androgénios. Para além disso, a obesidade, quando provocada pela resistência à insulina, pode levar à hiperinsolinemia. Assim, a quantidade total de androgénios é muito superior à que seria normal encontrar, provocando o hirsutismo. Os androgénios ao passarem no tecido adiposo, são convertidos em estrona. A obesidade faz com que haja mais tecido adiposo, logo aumenta o estrona (que não é igual ao estradiol, mas actua como se fosse, ao nível do hipotálamo). 28

30 Provoca então o bloqueio da produção de FSH e um aumento de LH. A relação LH / FSH é sempre alta pois o LH é sempre superior ao esperado. Com a FSH baixa, o folículo não amadurece. Com o LH elevado, atingem-se os picos antes do folículo estar suficientemente maduro, provocando luteinizações prematuras sucessivas (alteração do perfil bioquímico das células), sem nunca haver ovulação, o que provoca situações de infertilidade. Como o LH está sempre alto, as células da teca produzem sempre mais androgénios, o que aumenta ainda mais a amplitude do síndrome. Obesidade habitualmente associado a resistência à insulina (hiperinsolinemia) e ao hiperandrogenismo. Não significa que leve sempre a situações de infertilidade, mas podem surgir situações que façam isso. Hiperinsolinemia Níveis altos de androgénios Níveis altos de estrogénios (por conversão de androgénios no tecido adiposo) FSH diminui Deficiente maturação do folículo Níveis de estrogénios elevados levam à inibição da FSH, logo não há amadurecimento de folículos. Pode ser resolvida pela administração de antagonistas de estrogénios. Exercício físico exagerado / Anorexia leva a distúrbios hormonais: Diminuição da libertação de GnRh pelo hipotálamo FSH baixa Níveis baixos de estrogénios e deficiente maturação do folículo A anorexia leva à diminuição de GnRh uma vez que são necessárias quantidades mínimas de tecido adiposo (que estas mulheres não possuem) para que seja produzida uma substância permissiva da libertação do hipotálamo. Teoricamente, bastaria a administração de GnRh para esta mulher engravidar, mas a nível clínico as implicações seriam outras. Infertilidade Feminina Patologia das Trompas Não está relacionado com a ovulação, pois a partida ela ocorre. O calendário menstrual, neste caso, está normal. Causas primárias: Obstrução das trompas causada por infecções do tracto genital, endometriose ou doença pélvica inflamatória. A consequência é o impedimento da chegada do espermatozóide ao oócito. Detectada por histerosalpingografia, histerosonosalpingografia, laparoscopia. Aderências que distorçam a posição relativa da trompa / ovário. A consequência é o impedimento da captura do oócito pela trompa. Infertilidade Feminina Endometriose Presença de endométrio (glândulas e estroma) fora da cavidade uterina (trompas, ovário, cavidade abdominal) responde às hormonas da mesma forma que o endométrio uterino e origina dor, inflamação e formação de tecido cicatricial. Consequências: Aderências que limitam a mobilidade ou modificam a posição da trompa. Tecido a envolver o ovário impedindo a entrada do oócito na trompa. Obstrução das trompas. Compostos tóxicos que impedem o normal desenvolvimento do oócito. Detectado por laparoscopia. Esta patologia depende do grau e da quantidade de tecido que exista. O tratamento clínico pode passar pela remoção do tecido (mas com tal por vezes volta a aparecer), desde a (mais frequente) indução de uma pseudo-gravidez a uma pseudo-menopausa (de modo a parar as alterações hormonais). Pode ser resolvido, sob o ponto de vista do tratamento de infertilidade. 29

31 Infertilidade Feminina Patologia Uterina Relação controversa com a infertilidade, habitualmente associada ao aborto: Alterações anatómicas (por exemplo, útero rudimentar). Fibromiomas (tumores do miométrio), pólipos (tumores pediculados do endométrio). Consequências: dificuldades de implantação e ocupação de espaço. Detectado por histeroscopia, ecografia, histerosalpingografia. Pode influenciar alterações no calendário menstrual. Técnicas de Visualização Usadas na Avaliação e Tratamento da Infertilidade Feminina e em Reprodução Assistida Ecografia pélvica endovaginal visualização de ovário, útero e trompas. Utilizado para a avaliação dos folículos e recolha de oócitos, diagnóstico de ovário poliquístico, ). Histerosalpingografia radiografia, com introdução de uma solução de contraste na cavidade uterina / trompa. Histerosonosalpingografia ecografia, com introdução de uma solução de contraste na cavidade uterina /trompa para a visualização do útero e das trompas. Utilizado no diagnóstico de obstrução das trompas,. Histeroscopia endoscopia da cavidade uterina, para visualização da mesma. Utilizada para a visualização e remoção de pólipos e fibromas. Laparoscopia endoscopia da cavidade pélvica, para visualização da mesma. Utilizada no diagnóstico da endometriose, ovário poliquístico e obstrução das trompas. Também, para a remoção de aderências, destruição de quistos no ovário e remoção de tecido na endometriose, É necessário a administração de uma anestesia. Indução da Ovulação Ovulação de 1 ou 2 oócitos monitorizar para evitar o risco de gravidez múltipla. Citrato de clomifeno (antagonista de estrogénios) síndrome de ovário poliquístico. Bromocriptina (agonista da dopamina) hiperprolactinemia. HMG / FSH + HCG 24 horas após o folículo atingir 16 mm a ovulação dá-se 36 horas após a administração de HCG. Indução de Poliovulação Recolha de vários oócitos (8 a 10 para fertilização in vitro) monitorizar para evitar o risco de síndrome de hiperestimulação ovárica. Tratamento: Agonista da GnRh (para evitar luteinização prematura), juntamente com HMG / FSH (em doses mais elevadas que na indução da ovulação), HCG 24 horas após o folículo atingir 16 mm (a ovulação dá-se 36 horas após a administração de HCG) e a aspiração dos folículos após 36 horas. Assim, a indução da poliovulação depende da quantidade de FSH que é administrada, no entanto tal não pode ser em demasia devido à síndrome de hiperestimulação ovárica. Este síndrome ocorre quando o amadurecimento de folículos em demasia faz com que os estrogénios aumentem brutalmente, o que aumentam a permeabilidade dos capilares, saindo uma grande quantidade de líquidos do sistema circulatório. Isto diminui o fluxo renal e aumenta a hemoconcentração (que aumenta a probabilidade de coagulação e formação de trombos nos vasos sanguíneos), pondo em risco a vida da mulher. O tratamento deveria ser feito com um antagonista, mas a utilização de um agonista é mais eficiente, uma vez que uma administração contínua dessa substância leva à inibição do hipotálamo (pois este só funciona por pulsos da substância). A aspiração não pode ser cedo demais, pois o oócito não está desenvolvido na totalidade, nem muito tarde, pois se há ovulação não se encontra mais o oócito nas trompas. Logo é necessário ser 36 horas, depois da injecção, sem qualquer margem para hesitações. 30

32 Casal Infértil Avaliação do Casal Infértil Infertilidade (segundo a organização mundial de saúde) ausência de concepção após 12 meses de relações sexuais regulares e desprotegidas. Primária casal nunca conseguiu uma concepção. Secundária pelo menos um dos elementos do casal já obteve uma concepção. Avaliação do casal infértil após tentativa do casal, durante 1 ano, sem conseguir uma gravidez. As causas mais complicadas de se resolver serão as de esterilidade. Muitas vezes quando não há mais nenhuma possibilidade de obter gâmetas destes indivíduos, procede-se a dadores de gâmetas. Esterilidade existência de uma causa masculina e/ou feminina que impeça em absoluto a fecundação. Fecundabilidade capacidade para conseguir uma gravidez comprovada, durante o ciclo menstrual (cerca de 20% dos casais jovens). Após terem decidido tentar a concepção, em situações onde não há nenhum problema. A infertilidade atinge entre 15% a 20% dos casais dos países ocidentais (cerca de de habitantes em Portugal), os quais são relativamente elevados. Factores de Infertilidade Não patológicos idade e frequência do acto sexual. Patológicos factor masculino, disfunção ovulatória e alterações anatómicas (factor cervical, factor tubo-peritoneal, factor uterino). Factores de Infertilidade Factores Não Patológicos Idade feminina pico da fertilidade aos 25 anos, com declínio a partir dos 30 e com um agravamento nítido a partir dos 35 anos (a probabilidade de não disjunções aumenta a partir desta idade). Oócito taxas aumentadas de abortamento espontâneo (causa genética predominante), consequência da diminuição da fertilidade. Idade masculina diminuição da fertilidade a partir dos 40 anos. Começa a observar-se com frequência, em homens mais velhos, espermatozóides com quebras de DNA. Frequência das relações sexuais: Capacidade fertilizante do espermatozóide no aparelho genital feminino 48 horas. Capacidade fertilizante do oócito 24 horas. Período fértil 3 a 4 dias anteriores à data provável da ovulação e os 2 dias seguintes à mesma. Periodicidade adequada de relações sexuais 2 vezes/semana com intervalos regulares ou 2 vezes/mês desde que no período fértil. 31

33 Factores de Infertilidade Factores Patológicos Masculinos Constitui cerca de 50% das situações de infertilidade. Causas: Antecedentes de lesão testicular. Antecedentes cirúrgicos. o Quando se faz uma vasectomia, os espermatozóides chegam ao corte e degeneram, sendo posteriormente absorvidos, mas às vezes originam alguma reacção imunológica. Alterações da temperatura testicular. Reacções alérgicas sistémicas. Exposição a radiações. Uso de drogas. Exposição a compostos tóxicos (industriais e agrícolas). Doença endócrina. Varicocelo artérias da zona testicular estão aumentadas (como nas varizes). São como varizes ligadas às veias dos testículos, que provocam diminuição do fluxo sanguíneo e aumento da temperatura testicular. Ejaculação retrógrada os espermatozóides são direccionados para a bexiga (é um problema pois a urina é hipotónica e tem muitos tóxicos). Existem 2 tipos de soluções para se obter os gâmetas destes indivíduos: o Masturbar-se ou ter relações e a seguir urinar a amostra vai para o laboratório onde é eliminada a urina e são colocados num meio de cultura adequado. o Retirar polpa testicular do indivíduo (através de uma biopsia). Agenesia dos canais deferentes indivíduo pode ejacular ou não, mas tem sempre equilíbrio hormonal. Solução para se obter gâmetas destes indivíduos: realização de uma biopsia testicular ou de uma microinjecção. Causa genética. Factores de Infertilidade Factores Patológicos Feminino (Disfunção Ovulatória) Disfunção ovulatória 30 a 40% das situações de infertilidade feminina. Síndrome do ovário poliquístico. Falência ovárica prematura menopausa precoce. Hiperprolactinemia. Amenorreia hipotalâmica. Patologia da tiróide. Patologia da supra-renal. Defeitos da fase luteal. Averiguação doseamento da FSH (2º ou 3º dia do ciclo) para a determinação da reserva ovárica: FSH elevada falência ovárica. FSH normal com LH elevada (2º a 5º dia) síndrome de ovário poliquístico. Factores de Infertilidade Factores Patológicos Feminino (Factor Tubo-Peritoneal) Factor tubo-peritoneal 30 a 40% das situações de infertilidade feminina. História de doença inflamatória pélvica, peritonite, aborto séptico, cirurgia pélvica, doenças de transmissão sexual, endometriose. Averiguação estudo da permeabilidade tubular: Histerosalpingografia. Histerossonasalpingografia utilizado um líquido com concentração salina elevada e através da ecografia estuda-se a anatomia. Laparoscopia. 32

34 Factores de Infertilidade Factores Patológicos Feminino (Factor Cervical e Uterino) Factor cervical cerca de 5% das situações de infertilidade feminina. As secreções e características do muco são hormonodependentes. O muco cervical é importante na medida em que apenas deixa entrar espermatozóides no útero, pois o líquido seminal é extremamente agressivo para esta estrutura. Averiguação teste pós-coital: 1 a 2 dias antes da ovulação e até 2 a 6 horas após o acto sexual. Para avaliar a interacção espermatozóide/muco cervical (qualidade do muco, número e motilidade dos espermatozóides, interacções espermatozóide/muco). Factor uterino anomalias uterinas associadas a abortamento recorrente. A existência de um mioma poderá obstruir a passagem dos espermatozóides, bem como provocar alterações na implantação (mesmo com FIV é uma condição difícil de ultrapassar). Abordagem do Casal Infértil Casal Presente História e exame físico de ambos Aconselhar relações sexuais 2 a 3 vezes/semana MULHER Referenciar precocemente se: - Idade > 35 anos. - Amenorreia / oligoamenorreia. - Cirurgia pélvica abdominal / pélvica prévia. - Doença pélvica inflamatória. - DTS. - Exame ginecológico anormal. - Confirmar ovulação com doseamento de progesterona no meio da fase lútea - Se ciclos regulares, não avaliar a finção tiroideia e a prolactina. Analisar Resultados com o casal Se história ou estudo anormal referenciar para o centro de infertilidade Desaconselhar o álcoól e o tabagismo HOMEM Referenciar precocemente se: - Patologia genital prévia. - Cirurgia urogenital prévia. - DTS. - Varicocelo. - Doença sistémica. - Exame genital anormal. Requisitar 2 espermogramas no laboratório para onde irá ser enviado o paciente Analisar resultados com o casal Adiar referenciação do paciente se exames normais e infertilidade inferior a 18 meses Avaliar: - Serologia rubéola. - Ácido fólico. - Se IMC > 30 aconselhar a perda de peso. - História de drogas. - História ocupacional. - Citologia do colo. Normalmente, a queixa surge do membro feminino do casal, através de uma ida à ginecologista. Kit LH (determinação de LH na hora) é muito falível. Indivíduos com varicocelo, normalmente, não sabem que têm esta patologia, pois como sempre viveram com isso, acham uma situação perfeitamente normal. O número e a qualidade dos espermatozóides varia imenso com vários factores / períodos, como por exemplo, com as estações do ano (na Primavera a qualidade é muito inferior variações drásticas de volume). Para além do espermograma existem outros tipos de avaliação primária. Normalmente, a queixa surge do membro feminino do casal, através de uma ida à ginecologista. Kit LH (determinação de LH na hora) é muito falível. Técnicas de Fertilização Inseminação artificial espermatozóides são seleccionados e introduzidos directamente no útero. Microinjecção intracitoplasmática (ICSI) espermatozóide injectado no oócito. Fertilização in vitro (FIV) espermatozóides em suspensão, entram em oócitos (em meio, na estufa). 33

35 Estudos dos Parâmetros Espermáticos Estudo Citomorfobioquímico do Esperma - Espermograma O primeiro 1/3 da ejaculação é constituído por líquido prostático e 70% a 80% dos espermatozóides armazenados nos canais deferentes. Os 2/3 finais são constituídos pelas secreções das vesículas seminais e contêm um baixo número de espermatozóides. Assim, a primeira parte de esperma é a que possui todos os espermatozóides com alta capacidade de fecundação, fenómeno que é fundamental ao sucesso da fertilização. É necessária abstinência sexual dias antes de fazer um espermograma (ejaculação anterior 2 a 5 dias): < 2 dias diminuição do volume e concentração de espermatozóides (mas os mais recentes e eficazes permanecem lá). > 5 dias aumento da concentração da percentagem de espermatozóides imóveis e morfologicamente anormais. Estudo citomorfobioquímico do esperma: Volume. Cor se muito amarelo indica a presença de muitos fungos e/ou bactérias. Se vermelha indica a presença de sangue. Se acastanhada indica a presença de uma hemorragia interna. Cheiro. Viscosidade. Liquefacção (10 a 30 minutos). ph. Número quando muito elevado reduz a fertilidade, mas é fácil de resolver. Vitalidade uso de um corante vital o qual faz com que os espermatozóides mortos, como não são selectivos à entrada do corante, apareçam a vermelho. Motilidade. Aglutinação verifica-se a presença de complexos de espermatozóides aglutinados entre si. Ocorre quando há algum problema com as células de Sertoli, já que estas são a barreira hematotesticular e de anticorpos. Hipoosmolaridade os espermatozóides são colocados a uma osmolaridade menor da que estão habituados. Apenas os espermatozóides vivos deixam entrar água. Logo, os reactivos aparecem com a cauda enrolada. Morfologia não deve possuir restos citoplasmáticos (maturação incompleta): o Espermatozóide normal cabeça oval 4-5 μm de comprimento e 2,5-3,5 μm de largura, peça intermediária com cerca de 3 μm de comprimento, cauda com μm de comprimento. Corantes vitais (iorosina) testam a vitalidade (se o espermatozóide está vivo ou morto). Se estiver vivo, o corante não penetra na membrana citoplasmática que é selectiva. Se está morto, não existe a mesma selectividade e o corante penetra no interior da célula, aparecendo o espermatozóide com cor vermelha. Quanto à motilidade, os espermatozóides podem ser divididos em 4 tipos: Imovéis espermatozóides que podem estar ou não mortos. Movimento In situ espermatozóides que mexem a cauda, mas permanecem no mesmo sítio, logo estão parados. Movimento lento espermatozóides que progridem lentamente. Movimento rápido espermatozóides que progridem continuamente e a uma velocidade razoável. Quando se coloca o líquido seminal numa solução hiposmótica (para se averiguar sobre a hipoosmolaridade), se houver um enrolamento da ponta da cauda do espermatozóide, então este está reactivo (situação normal devido à entrada de água na célula). 34

36 Estudo Citomorfobioquímico do Esperma Valores de Referência Volume 2 6 ml Morfologia (% formas normais) 4 % Cor Amarelo grisalho / branco grisalho Vitalidade 60% Cheiro Sui generis Espermatogónias, espermatócitos I e II, espermátides / 100 espermatozóides < 3 Viscosidade Normal Leucócitos/ml < Liquefacção Completa aos 60 minutos Aglutinação Ausente ph 7,2 8,0 Teste de hipoosmolaridade 60 % Concentração (espermatozóides/ml) 20 < Frutose 8 28 mmol/l Motilidade progressiva rápida 25 % Ácido cítrico mmol/l Os espermatozóides também são sensíveis à pressão. Segundo a OMS para um homem ser considerado normal, a nível de fertilidade, necessita de possuir mais de 4% de espermatozóides morfologicamente normais. Os valores de referência já sofreram alterações pois antes a percentagem seria 14%. Despistagem de Factores Masculinos Exame bacteriológico verificar a presença de leucócitos que fazem aumentar os radicais livres de oxigénio no fluído seminal. Estudo imunológico não só do homem, mas também por parte da mulher, pois a presença de anticorpos na zona cervical pode impedir a passagem dos espermatozóides, neste caso, estas células aparecem em aglomerados ou colapsados. Cariótipo, cariótipo de meioses, estudos dos complexos sinaptonémicos estudos genéticos para averiguar anomalias em termos cromossómicos. Exame anatomopatológico de biópsia testicular pode detectar problemas a nível da parede do testículo e verificar se há, ou não, meiose e maturação correcta das células germinativas. Para solucionar os problemas de maturação, recolhem-se espermatogónias e colocamse em meio de cultura (meios ricos) até atingirem a fase final do seu desenvolvimento (taxa de insucesso enorme). Uma biópsia a nível feminino não tem muito lógica pois podem não ser encontrados os estados pretendidos, na amostra de tecido retirada, devido à forma como ocorre o desenvolvimento folicular. Desenvolvimento Pré-zigoto (entre as 12h e as 19h, após fecundação). Só se considera zigoto quando os pró-núcleos se fundem. Um embrião com uma divisão síncrona tem uma maior probabilidade de implantar no útero feminino, que um embrião com divisão não síncrona. Durante a divisão do zigoto é mau se durante as mitoses sucessivas existir, em alguma fase do desenvolvimento, um número de células ímpares, uma vez que tal acontecimento indica que a divisão está atrasada em algumas células. Até ao estado de mórula pode ocorrer a formação de gémeos verdadeiros. A infertilidade, normalmente, ocorre devido ao não encontro dos gâmetas ou a problemas anatómicos que impedem a migração / implantação do embrião. 35

37 Inseminação Artificial Tipos de Inseminação Artificial IA de 2 tipos, que diferem na presença de gâmetas viáveis pelos membros do casal: Inseminação artificial homóloga utiliza-se gâmetas do casal. Ou seja, existem gâmetas viáveis de ambos os membros do casal, podendo originar-se 1 descendente. Inseminação artificial dador / heteróloga utiliza-se gâmetas de outro indivíduo. Ou seja, não se obtêm gâmetas viáveis de algum dos membros do casal (ou de ambos). Quando o homem é dado como estéril, a única hipótese é recorrer a um dador. Processamento dos Gâmetas Masculinos Separação dos espermatozóides do plasma / líquido seminal que contém factores descapacitantes, os quais não permitem a capacitação espermática (série de processos ainda não definidos, essenciais aos espermatozóides na aquisição da competência para a penetração ovocitária), bem como de outros tipos de células e espermatozóides imóveis, aumentando a concentração, motilidade e proporção de espermatozóides morfologicamente normais. Espermatozóides normais, teratospermias, astenospermias e oligospermias moderadas. Quanto mais tempo os espermatozóides tiverem em contacto com o plasma, depois da liquefacção, pior é: Centrifugação com gradientes de concentração fraccionada para a obtenção do depósito os melhores espermatozóides estão na parte inferior. Lavagem com meio de cultura e colocação em meio próprio feita com meios ricos em aminoácidos, a ph entre 7,2 7,7 os quais são adquiridos através de entidades credenciadas e não feitos no próprio laboratório (como já foram). Swim-up não se utiliza todos os espermatozóides, mas só aqueles que formam uma nuvem leitosa para cima do depósito (pois são os que têm maior motilidade). Assim, os espermatozóides nadam para o topo. Quanto mais baço o líquido, mais espermatozóides dispersos possuiu. Astenospermias e oligospermias graves lavagem com meio de cultura: Em situações graves não se realiza centrifugação fraccionada, e aproveita-se tudo o que vem no plasma seminal (células epiteliais, espermátides, espermatozóides anormais, etc). A centrifugação não se faz, sob o risco de perda dos poucos espermatozóides que existem (casos muito graves de número e qualidade de espermatozóides). Biopsia testicular: Obtenção de fragmentos de diferentes zonas do testículo. Dissecção dos fragmentos testiculares não se corta, mas esfia-se o tecido, para desagregar as células do túbulo seminífero. Lavagem com meio de cultura. Aspiração de túbulos do epidídimo lavagem da suspensão com meio de cultura. Biopsia aspirativa para estudo mas não para fertilização pois a pressão negativa que é exercida, pode modificar as células germinativas: De exploração pouco invasivo e indicador do estado do epitélio germinativo. Para obtenção de espermatozóides a fresco. Espermátides população celular mais representativa. Células de Sertoli representa aproximadamente 1/3 da linha espermatogénica. 36

38 Este tipo de biopsia é um método muito menos evasivo. A agulha penetra no testículo (por pressão negativa) e aspira a polpa testicular que terá presente espermatozóides. Não é útil para a obtenção de espermatozóides a fresco, uma vez que a pressão negativa exercida é tão forte, que pode destruir estruturas (como por exemplo o núcleo, o que pode ser muito grave). Assim, para diagnosticar é um bom método, mas não para a obtenção de espermatozóides para a fertilização (demasiado arriscado). Comparação Qualitativa e Quantitativa em Indivíduos Inférteis Existem diversas situações que podem ser detectadas através de uma biopsia testicular e que estão relacionadas com a patologia que o indivíduo possui. Síndrome de só células de Sertoli ausência completa de células da linha germinativa; azoospermia; volume testicular diminuído; FSH elevada e inibina B diminuída. Em termos de células masculinas nada se pode fazer (a única solução seria a adopção ou a recorrência a espermatozóides dadores). Hipoespermatogénese grande número de células de Sertoli, proporção elevada de células imaturas da linha germinativa e redução do número de espermátides e espermatozóides. FSH elevada; inibina B diminuída; pequeno volume testicular. Oligozoospermia e azoospermia (secretora esterilidade completa do homem, pois não há produção de células germinativas). Pode ser devido à falta de factores de maturação de espermatozóides. Pode-se resolver recorrendo a uma maturação in vitro. Paragem da maturação em espermatogónia ou espermatócitos elevada proporção dessas células. Se a maturação for completa, está associada a azoospermia. FSH elevada; inibina B diminuída; volume testicular normal. Paragem da maturação em espermátide aumento significativo de espermátides redondas e alongadas. Ausência ou redução drástica de espermatozóides. FSH, inibina B e volume testicular normais. Linha germinativa normal proporções das diferentes linhas celulares com valores normais. No caso de azoospérmicos, por obstrução dos canais deferentes, o quadro está associado a um aumento da percentagem de células maduras. Estas soluções contrariam o factor selecção, uma vez que, através da microinjecção (por exemplo) permite-se a transmissão das características para a descendência. Obtenção de Células Germinativas em Azoospermia Microsurgical epididimal sperm aspiration (MESA) técnica posta de lado devido à ocorrência de fragmentação do DNA. Os espermatozóides têm melhor qualidade nos testículos, que no epidídimo, pois com o tempo o DNA fragmenta. É necessário o epidídimo estar visível, e com agulha aspira-se apenas de 1 dos túbulos do epidídimo. Percutaneous epididimal sperm aspiration (PESA) picada na zona do epidídimo aspirando o seu conteúdo. É um método um pouco bruto uma vez que se fura às cegas a estrutura, pois ao penetrar num lado pode ocorrer a ruptura de vários tubos, piorando a patologia. Agulha e aspiração de espermatozóides aleatória, do epidídimo (não utilizada já). Testicular sperm extraction (TESE) é a melhor técnica e faz-se através de biopsias a porções do testículo. Extraem-se pequenos fragmentos testiculares. Testicular sperm aspiration (TESA) / Percutaneous fine needle aspiration (FNA) aspira-se a polpa testicular. A pressão negativa não pode ser muito elevada para não ocorrer destruição dos vasos. Processamento de Gâmetas Femininos Punção com monitorização ultrassonográfica o útero é uma cavidade histual, porque na realidade ele concentra-se quase sem espaço entre as paredes. O eixo da punção dos pronúcleos deve estar perpendicular (ortogonal) ou no seguimento os glóbulos polares. Há punção do oócito, zona pelúcida, coroa radiata e do cumulus oophurus. 37

39 Fertilização In Vitro e Microinjecção Intracitoplasmática Fertilização In Vitro (FIV) Utilizada principalmente no caso de infertilidade feminina (principalmente obstrução). Inseminação com a espermatozóides/ml (motilidade rápida). Incubação em meio de cultura a 37 C, 6% de CO 2, 5% de O 2 e saturação de humidade (para não ocorrer evaporação dos meios de cultura). Desnudação (retirar o pré-zigoto, ou seja, separar o oócito das camadas celulares que o rodeiam) e avaliação da fertilização 12 a 18 horas após inseminação. Incubação em meio de cultura renovado diariamente. Transferência. A inseminação é feita com os espermatozóides que fizeram o melhor swim-up. Microinjecção Intracitoplasmática de Espermatozóides (ICSI) Remoção do cumulus oophuros por digestão enzimática (com hialuronidase). DESNUDAÇÃO Lavagem em meio de cultura. Remoção da corona radiata por aspiração com pipeta de vidro. Microinjecção (1 a 2h depois da desnudação): o Microscópio invertido com platina termostatizada. o Micromanipuladores hidráulicos. o Micropipetas (fixação e injecção). o Ovócitos em microgota sob óleo mineral (não permite contacto do oócito com o meio ambiente e isola termicamente). o Espermatozóides em PVP (diminui a velocidade, sendo mais fácil apanhar espermatozóides com a melhor aparência) ou meio de cultura sob óleo mineral. o Esmagamento do flagelo eliminar a motilidade (que pode interferir com o citoesqueleto do oócito), há uma ruptura da membrana citoplasmática do espermatozóide, aumentando a probabilidade de sucesso da fertilização. Avaliação da fertilização 12 a 18 horas após a microinjecção. Incubação em meio de cultura renovado diariamente. Transferência depende de cada caso e do número de embriões que se possam obter de uma possível fecundação (no estado de células, ou já no de mórula). No próprio dia da recolha, os oócitos têm de ser desnudados. O oócito e o embrião são muito mais sensíveis à temperatura (que os espermatozóides), logo necessitam de estar a 37, com um desvio padrão muito baixo (2 3 décimas). O óleo mineral é utilizado para a temperatura se manter mais estável, e para o oócito não entrar em contacto com nenhuma partícula do ar. O PVP é um plástico que aumenta a viscosidade do líquido seminal de modo a se conseguir escolher o melhor espermatozóide (a nível morfológico). O esmagamento do flagelo é feito para provocar uma activação do espermatozóide, na medida de forçar o núcleo a sair (o núcleo tem de estar íntegro, mas o resto não importa). Inicialmente, aspira-se um pouco de citoplasma, e de seguida injecta-se para o espermatozóide estar envolvido em citoplasma ovocitário. Há quem defenda que esta rejeição e reintrodução provoca a activação da meiose no oócito (não provado). A injecção deve ser feita longe do glóbulo polar, pois poderia interferir com a Meiose II que está ainda por ocorrer. Em alguns casos pode ocorrer a entrada de 2 espermatozóides dando origem a ovos triplóides que provavelmente originam abortamentos espontâneos. 38

40 Assim, a existência de 3 pro-núcleos: FIV provável entrada de 2 espermatozóides (2 ). ICSI provável meiose II não concluída (2 ) ou entrada de 2 espermatozóides (2 ). São, assim, seres 3n com grandes anomalias. Apesar disso dividem-se bastante sincronizadamente, mas são descartados. Mesmo se fosse transferido, provavelmente não chegariam ao fim, uma vez que estão documentados diversos abortos naturais de embriões triplóides e até se chegassem a nascer possuiriam duração de algumas horas apenas. As células com mais que 1 núcleo ou com erros, normalmente originam a placenta (células anormais desviadas para constituir a placenta, naturalmente). Nos primeiros 3 dias os meios de cultura devem ser parecidos com o ambiente da trompa. Em blastocisto os meios de cultura têm de ser parecidos com o útero. Até à fase de mórula, o genoma materno é o único com actividade. Após a mórula existe conexão entre os blastómeros e o embrião começa a comportar-se como uma unidade. Eclosão do embrião o embrião sai da zona pelúcida. É a fase ideal para a implantação do embrião in vivo. In vitro implanta-se o embrião no útero da mulher numa fase anterior a esta. ICSI Transferência Cateteres de diferentes tipos. Remoção do muco cervical com uma compressa molhada em soro fisiológico. Utilização do controlo ecográfico (abdominal). Ausência de sangue no cateter (traumatismo transcervical). Depósito do(s) embrião(ões) a cerca de 1 cm do fundo uterino (sem lhe tocar com a extremidade do cateter). Um traumatismo transcervical não é muito grave (pequena quantidade de sangue fruto da passagem pelo canal cervical, muito irregular e frágil). No entanto, se trouxer células de endométrio é grave pois significa que destruiu as mesmas, podendo levar ao insucesso da nidação. Também não se deve tocar no fundo do útero pois quando esta estrutura é incomodada parece ocorrer uma resposta pulsativa da sua parte. ICSI Imobilização do espermatozóide induz a permeabilização da membrana do espermatozóide e aumenta a descondensação nuclear, incrementando a probabilidade de fertilização. Aspiração do citoplasma auxilia a activação do ovócito. Maturação e activação do ovócito são reguladas pelo aumento dos níveis intracelulares de iões de cálcio. Expulsão do 2º glóbulo polar 2 a 3 horas após a ICSI. Pro-núcleo masculino em posição central. Pro-núcleo feminino próximo do 2º glóbulo polar. Pro-núcleo masculino de maiores dimensões e com maior número de nucléolos. Microinjecção de Espermatídeos Os espermatídeos são células imaturas, não ideais, mas à falta de melhor, pode-se tentar uma fecundação com as mesmas. Ocorre devido à paragem da maturação ou à síndrome de apenas células de Sertoli. Ejaculado lavagem com meio de cultura. Biopsia testicular fragmentação e compressão dos túbulos seminíferos com lâminas de bisturi. Recolha do fluído seminífero. Lavagem com meio de cultura. Diluição do pellet em meio de cultura e extensão em placa de cultura sob óleo mineral. Espermatídeos redondos selecção com micropipeta de injecção. Deformação na entrada da micropipeta sem aderirem à sua extremidade interna. Espermatídeos com cauda esmagamento do flagelo com a micropipeta de injecção. 39

41 Técnicas de Manipulação Embrionária Micromanipulação Micromanipulação dissecção parcial da zona pelúcida. Muito importante em casos onde a capacidade ovocitária está muito diminuída, devido à existência de uma zona pelúcida muito espessa. Antigamente, uma pipeta perfurava o ovócito, antes da fecundação, para facilitar a mesma (técnica que deu origem à ICSI). Micromanipulação Partial Zone Dissection (PZD) Fecundação facilitada eclosão facilitada. Pipetas de contenção e dissecção. Zona drilling (ZD) com tampão ácido de Tyrode completamente abandonada. O ácido fazia com que a zona pelúcida ficasse destruída, facilitando a eclosão ou de forma a retirar blastómeros da mórula para serem avaliados. Foi assim, abandonada pois o ph, mesmo sendo muito baixo, podia provocar desconforto ao embrião. Micromanipulação Subzonal Sperm Insemination (SUZI) Fecundação facilitada. Transferência de diversos espermatozóides para o espaço perivitelino. Consiste em deixar alguns espermatozóides entre a zona pelúcida e a membrana citoplasmática. Micromanipulação Eclosão Assistida Procedimento in vitro no qual a zona pelúcida de um embrião é fragilizada ou perfurada por métodos químicos, mecânicos ou laser, para ajudar à saída do blastocisto do interior da zona pelúcida. Micromanipulação Remoção de Fragmentos Utilizada para melhorar os embriões. Os fragmentos podem ser poucos, dispersos ou até 50% do embrião, os quais são um mau presságio para a implantação. Com uma pipeta pode-se retirar os fragmentos, na tentativa de melhorar as condições. Tal fenómeno significa que as divisões ocorrem com erros, e não é por se remover esses fragmentos (provenientes dos erros) que o problema é eliminado. Não há qualquer vantagem e actualmente não é feito. Micromanipulação Transferência de Citoplasma Diminuição da qualidade dos ovócitos, com a idade feminina (mitocôndrias). Transferência de 5 a 15% de citoplasma da dadora durante a ICSI. Aplicação só após maior quantidade de estudos. Interferência do DNA mitocondrial com a regulação génica. Esta técnica é ilegal em Portugal. Utiliza-se de forma a refrescar o citoplasma de uma mulher, com oócitos envelhecidos, com o citoplasma de oócitos de mulheres mais jovens, de modo a tentar melhorar o problema de fecundação, de formação do embrião e de nidação. O problema é que passa a existir 3 progenitores: Núcleo do espermatozóide. Núcleo do oócito e mitocôndrias da mulher que recebe o citoplasma. Mitocôndrias da mulher dadora do citoplasma. Aponta para uma ligeira melhoria em alguns casos mas não em todos. É uma técnica que está posta de lado. 40

42 Micromanipulação Transferência Nuclear Ainda em fase de investigação. Transferência em estado de VG (MII). Infertilidade relacionada com a idade, falência ovárica prematura (causas genéticas). Transferência de núcleo de células diplóides para um ovócito enucleado de uma dadora capacidade de haploidização do ovócito. Oócitos ainda se encontram em profase I. Pode dar origem a uma clonagem. Existem 3 progenitores também. Manipulação muito artificial, com muitos erros e complicações, sob o risco de introduzir mais erros genéticos, para além dos existentes. Sendo assim é uma técnica proibida. Meios de Cultura de Embriões Humanos Requisitos nutricionais. Fisiologia celular durante as primeiras divisões dos blastómeros comportam-se, em termos fisiológicos, como organismos unicelulares. Após compactação, a mórula comporta-se como uma unidade. Estes meios de cultura são fundamentais para o desenvolvimento embrionário. No passado, o meio de cultura era sempre o mesmo, durante o desenvolvimento embrionário. Actualmente, existe uma série de meios ideais para as diversas fases do desenvolvimento embrionário, de modo a imitar fidedignamente as condições fisiológicas do desenvolvimento no útero. Diferenças na Fisiologia Embrionária Antes e Após Compactação Antes: Depois: Baixa actividade biossintética. Elevada actividade biossintética. Baixo quociente respiratório. Elevado quociente respiratório. Necessidade de piruvato e Necessidade de glucose. lactato. Aminoácidos essenciais e não Aminoácidos não essenciais. essenciais. Genoma materno. Genoma embrionário. Diferenças entre as condições do oviduto e do útero: Oviducto Útero Glucose (mmol/l) 0,5 3,15 Piruvato (mmol/l) 0,32 0,10 Lactato (mmol/l) 10,5 5,2 Oxigénio (%) 8,0 1,5 CO 2 (%) ph 7,5 7,1 Glicina (mmol/l) 2,77 19,33 Alanina (mmol/l) 0,5 1,24 Serina (mmol/l) 0,32 0,80 No útero o embrião necessita de muito menos oxigénio, pois como está em contacto com os vasos sanguíneos da mãe, recebendo-o por difusão 41

43 Selecção Embrionária A selecção embrionária classifica os embriões como bons e permite seleccionar o melhor embrião para a implantação. Métodos: Metabolismo actualmente não se realiza a técnica. Utilização de métodos quantitativos que permitem calcular o maior ou menor metabolismo do embrião, comparando com a composição inicial do meio de cultura. Produtos de secreção actualmente não se realiza a técnica Está relacionado com o maior ou menor metabolismo, nomeadamente a excreção de ureia como produto do metabolismo. Genética diagnóstico através da hibridização in situ ou em PCR. Morfologia dos nucléolos, através da observação do seu desenvolvimento: o Organização dos nucléolos nos pro-núcleos ideal é a existência de muitos nucléolos na zona de fusão dos pro-núcleos. o Multinucleação dos blastómeros uma célula possui mais que 1 núcleo (mau presságio pelo menos para essa célula). o Fragmentação do embrião. o Velocidade de divisão nem muito rápida nem lenta, deve ser óptima. Atenção, também, há formação de cristais de gelo. As células com anomalias genéticas, normalmente, têm preferência para originar a placenta. Antes da observação de qualquer tipo de morfologia tem de se assegurar a existência de um bom oócito (importante não ser muito viscoso) e de um bom espermatozóide (não é fundamental que a morfologia seja ideal, apenas terá de ser o melhor dos melhores). Nos mamíferos, numa pós-maturação, em alguns casos, aparecem 2 células mais pequenas, em vez de 1 glóbulo polar, provenientes da sua divisão ou fragmentadas. Este fenómeno pode inferir que a injecção de FSH foi um pouco tardia ou que se esperou muito tempo para se fazer a punção (oócito não ideal para ser injectado). O ideal morfológico é que os núcleos estejam alinhados com a posição do 2º glóbulo polar ou ortogonais à mesma. Os corpos propulsores dos nucléolos (que darão origem ao nucléolo propriamente dito) devem estar dispersos no interior do núcleo (idealmente, deve existir um número de corpos mais ou menos semelhante nos pro-núcleos masculino e feminino. Segundo estudos de Lod Score, quando esses corpos propulsores estão próximos e organizados em número 3 ou 7, favorecem a fertilização. A divisão precoce é outro parâmetro que actualmente não se avalia. A observação do zigoto é feita para marcar a hora da primeira divisão mitótica (cerca de 26 horas após a fertilização, idealmente) mas um embrião, também, não é melhor se for mais rápido que o normal (nem mais lento). 42

44 Criobiologia na Reprodução Humana Criopreservação A criopreservação de espermatozóides e embriões é excelente, no entanto a criopreservação de oócitos encontra-se no início, pois grande quantidade de citoplasma pode levar à produção de cristais. Quanto menos cristais de gelo se formarem, melhor. Lento / Rápido baseia-se na alternância de fases de congelação lenta com fases de congelação rápida. É um método utilizado actualmente. Ultra-rápido muito rápido. Velocidade do abaixamento de temperatura é cerca de 1500 /minuto. Esta técnica foi substituída pela técnica de vitrificação. Vitrificação células num suporte à temperatura ambiente e mergulha-se a estrutura em azoto líquido. O abaixamento de temperatura é brutal, quase não existindo formação de cristais de gelo, pois a temperatura baixa muito rapidamente. Método: Exposição preliminar a crioprotectores (meios de cultura com grande quantidade de glicerol e glucose (meio hipertónico) que provoca a saída da água das células do embrião ou blastocisto e do meio. Redução da temperatura de um modo progressivo até -196 C. Armazenamento. Descongelação (num meio bastante hipotónico) espermatozóides são mais fáceis de descongelar. Diluição dos crioprotectores até ao restabelecimento fisiológico entrada de água sucessiva, para não ser brusca. Cultura. Espermatozóides e espermátideos células mais fáceis de criopreservar, já acontecendo há vários anos: Meio hipertónico retirar água para não permitir a formação de cristais de gelo. Exposição a vapor de azoto líquido (10 minutos). Armazenamento em azoto na fase gasosa (-196 C). Descongelação efectuada a temperatura ambiente coloca-se num meio próximo da isotonicidade e de seguida num isotónico, para lentamente reiniciar a mobilidade (boa taxa de recuperação). Preservação da fertilidade em indivíduos submetidos a radio e quimioterapia (perda da produção de espermatozóides e/ou mutações) a radioterapia aumenta a probabilidade da formação de danos genéticos na cromatina dos espermatozóides uma vez que as radiações gama são muito fortes. TESE; TESA; PESA; MESA. Os espermatozóides podem ficar várias décadas preservados o espermatozóide com mais idade que fecundou, até a actualidade, possuía 20 anos. Embriões 2 pro-núcleos, 2 a 4 células, blastocisto (diferentes fases / dias do desenvolvimento embrionário): Utilização hipertónica de meios de cultura. Método de congelação lenta / descongelação rápida. Armazenamento em azoto na fase gasosa (-196 C). Criopreservação: Descongelação com série inversa com meios de cultura atingir a isotonicidade inversamente. Taxa de sobrevivência entre 60 e 70%. Transferência 24 a 48 horas após descongelação. 43

45 Quando os embriões possuem 1 célula desligada está descrito que podem ser utilizados e originar um embrião normal. No entanto, o ideal será a existência de todas as células íntegras. Criopreservação de Ovócitos Ainda se encontra numa fase muito experimental (resultados em termos líquidos não são muito satisfatórios): Idealmente em Profase I (diplóteno) para isso seria necessário retirar tecido ovárico e congelar, no entanto quanto maior a estrutura a congelar, mais dificuldade existe em realizar a técnica. Metafase II microtúbulos. Vitrificação soluções crioprotectoras altamente concentradas. Taxa de abaixamento da temperatura: C/min. Quanto mais rápido o abaixamento de temperatura melhor. Sobrevivência moderada. ICSI nestes casos, por questão de segurança, deve ser feita uma ICSI, uma vez que, por razões não explicadas, pode haver alteração da zona pelúcida e não ser permitida a ligação ao espermatozóide. Manutenção da fertilidade feminina idade, radioterapia / quimioterapia. Novas tentativas de gravidez sem estimulação ovárica. Método alternativo à criopreservação de embriões. A congelação faz com que os microtúbulos possam ser afectados, podendo influenciar a correcta migração dos cromossomas, após a descongelação. Criopreservação de Tecido Ovárico Preservação da função ovárica e fertilidade de pacientes (em idade infantil, jovem ou adulta) submetidos a quimio ou radioterapia. Reimplantação após tratamento contudo se o tumor for no ovário, pode estar a reimplantar as células tumorais logo é necessário especial atenção a este factor. Folículos I no córtex ovárico são menos sensíveis ao dano da criopreservação do que ovócitos em metafase II. Tecido Ovárico O que fazer ao tecido ovárico quando este se encontra preservado. Autoimplante restituição de tecido ovárico na própria paciente (possibilidade de restituição do equilíbrio hormonal): No mesmo local de origem (pedículo ovárico) possibilidade de gravidez natural. Noutros locais (superfície anterior do útero, músculo deltóide, cápsula renal, zona subcutênea do antebraço) recurso a FIV, sendo fisiologicamente possível. Xenotransplante transplantação de tecido ovárico criopreservado para um animal hospedeiro (ratinho transgénico, imunodeficiência) e subsequente maturação e colheita de ovócitos (outros animais a ovular os óvulos da mulher). Provavelmente não existe nenhum caso de criança nascida desta forma. Eliminação da possibilidade de transmissão de células cancerígenas por autoimplante. 44

46 Maturação In Vitro de Gâmetas Maturação In Vitro de Espermatozóides Surge devido a uma qualquer causa genética, que não permite a maturação dos espermatozóides. Paragem da maturação em espermatócito ou espermátide. Útil apenas em fases posteriores a paquíteno. FSH e testosterona no meio de cultura (em quantidades ideias) permite a formação de espermatozóides suficientemente maduros para a fecundação. Paragem da maturação pós-meiótica menos grave de todos: Paragem em estado de espermátide redonda. Paragem em estado de espermátide em alongamento e alongada (quase que se garante a obtenção de espermatozóides maduros). Paragem da maturação meiótica: Paragem em espermatócito I (pós-paquíteno). Paragem em espermatócito II. Hipooespermatogénese com apoptose maciça espermatozóides mortos ou em número muito reduzido, normalmente com morfologia muito má Faz-se então a suspensão celular e coloca-se em meio de cultura, observando-se posteriormente, podendo (se não houver maturação suficiente) a microinjecção com espermátides redondas (sucesso muito reduzido, 1 / 2 casos relatados a nível mundial, logo a taxa de sucesso é quase nula). Maturação In Vitro de Folículos e Ovócitos Ovócitos imaturos humanos atingem as fases finais de maturação (de profase I a metafase II) espontaneamente in vitro com intervalos semelhantes aos de outros mamíferos ( mecanismo programado ), perdendo, no entanto, a competência para futuro desenvolvimento. Portanto: maturação meiótica e maturação citoplasmática. Meio de cultura para maturação: aminoácidos, vitaminas, proteínas, gonadotrofinas e estrogénios. Ainda em fase de investigação (mecanismos moleculares da maturação ovocitária). Quase em mecanismo programado pensa-se que existe a nível de proteínas meióticas, que induzem a meiose, nos mamíferos. 45

47 Genética da Reprodução Humana Factores Genéticos da Infertilidade Feminina Anomalias Cromossómicas Numéricas Síndrome de Turner (45, X) existência de 1 único cromossoma sexual (X0). A diferença a nível físico, destas mulheres, já pode ser ultrapassada, mas a sua situação de infertilidade, não. 1/2000 nados-vivos. Por vezes há presença de células germinativas, na fase embrionária, mas que estão ausentes no estado adulto. Delecção, duplicação, inversão, translocação e anel (pode fazer com que um dos cromossomas X esteja inactivo). Mosaicismo descritas com percentagens de células no indivíduo que pode ser variada. Linhagem com 46 XX e outras com 45X. A falta de um cromossoma X torna inviável o desenvolvimento de um embrião. Por vezes aparece menarca e função ovárica satisfatória. Gravidez excepcional. Disgenesia gonádica em fêmeas XY mulheres com um cromossoma X e outro Y, mas com a perda de uma determinada região do cromossoma Y (SRY) que se encarrega do desenvolvimento testicular, desenvolvendo-se uma mulher. Consequência de mutações em genes que controlam o desenvolvimento ovárico. Delecção SRY (sex determining region of Y chromossome). Amenorreia primária (situações onde nunca houve menstruação) e risco elevado de desenvolvimento tumoral na gónada primitiva. Factores Genéticos da Infertilidade Feminina Anomalias Cromossómicas de Estrutura Este tipo de anomalias cromossómicas podem dar origem a condições de infertilidade e, na maior parte dos casos, esterilidade não ultrapassável. Tendo, assim, de se recorrer à doação de gâmetas, mas se possuírem um útero bem formado podem implantar o embrião, através de complementos hormonais (parente não biológico). Estudos apontam para a tentativa de gestação do embrião em tecido conjuntivo (para mulheres sem útero capaz de desenvolver o embrião) em tecido conjuntivo entre a epiderme e a cavidade abdominal, que tem capacidade de vascularizar e alojar um embrião, provavelmente (ainda longe de se conseguir). 46, X del (Xp)(p11) mais comum. Amenorreia primária e disgenesia gonádica ( 50% casos), desenvolvimento de glândulas mamárias e ciclos menstruais irregulares ( 50% casos). 46, X del (Xp21 e 22.1) infertilidade e amenorreia secundária (quando já tiveram menstruação, mas por alguma razão deixaram de ter). Isocromossoma X amenorreia primária e disgenesia gonádica, estatura muito diminuída e fenótipo semelhante a 45, X. Delecção de Xq13 amenorreia primária, disfunção ovárica sem desenvolvimento de glândulas mamárias. Através do tratamento com suplementos hormonais é possível levar ao desenvolvimento de caracteres secundários, de modo a torná-las mulheres normais que se insiram na sociedade, apesar de a nível de fertilidade ser mais difícil. Síndrome X-frágil expansão da repetição do tripleto CGG no início da região não transcrita dos genes FMR1 (Xq27.3), fruto de anomalias na replicação celular. População normal 6 a 54 repetições. Pré-mutação 60 a 200 repetições (já é uma mutação obviamente). Pode ter algumas repercussões fenotípicas. Também pode ocorrer devido a um crossing-over desigual na zona das repetições, passando a existir mais repetições, e na geração seguinte, ao emparelhar com 1 cromossoma normal, já vai estar aumentado o número de repetições. Mutação completa mais de 200 repetições (resulta na hipermetilação dos trinucleotídeos CGG na direcção a montante do gene, levando à inactivação da transcrição). A presença de alelos com pré-mutação está relacionada com a falência ovárica prematura (16% das mulheres com menopausa antes dos 40). 46

48 Factores Genéticos da Infertilidade Feminina Devido a translocações robertsoneanas e inversões (para e pericêntricas). Estes factores não são identificados, logo passam despercebidos, entrando na percentagem de causas idiopáticas. Não se faz esta despistagem por ser pouco viável, uma vez que são um pouco caras e existe uma enorme variabilidade que poderia ser feita. Assim, as causas idiopáticas, normalmente são devidas a causas genéticas deste tipo (ou outros), mas que devido a vários factores, os estudos genéticos não andam para a frente e assume-se a esterilidade. Pode explicar uma não formação / diminuição de células gaméticas. Normalmente, origina sub-fertilidades ou infertilidades graves, o que diminui bastante a capacidade / probabilidade de formar um embrião biológico. Quando tal se consegue, realiza-se uma ICSI, mas mesmo assim será necessário controlar o embrião por diagnóstico pré-implantação. Factores Genéticos da Infertilidade Feminina Loci Autossómicos Disgenesia gonádica XX hereditariedade do tipo autossómico recessivo. Diversos síndromes relacionados com disgenesia gonádica sempre sob o risco de a gónada primitiva desenvolver para carcinoma. Síndrome de agonadismo XX órgãos genitais externos mal desenvolvidos. Anomalias genéticas no eixo hipotálamo-hipófise-ovário deficiência na produção de GnRH (X recessivo): Hipogonadismo hipogonadotrófico (mais frequente no sexo masculino) redução das gónadas (descrita em mulheres mas mais frequente em homens). Síndrome de Kallmann (também com malformação do bolbo olfactivo). FSH e LH são heterodímeros com cadeias α e β. A subunidade α é idêntica em ambas. A cadeia β define, portanto, a especificidade de acção. O gene responsável pela formação da cadeia β, da FSH, está localizada no cromossoma 11, sendo constituído por 3 exões. Delecção do exão 3 quebra na sequência dos codões 61-86, introduzindo um codão stop (impossibilidade de ligação à subunidade α e formação de FSH activa. Se em homozigotia amenorreia primária e infertilidade. Se em heterozigotia ciclos menstruais irregulares e infertilidade. O gene responsável pela formação da cadeia α da LH está localizado no cromossoma 6, enquanto o da cadeia β está localizado no cromossoma 19. Mutação no gene da cadeia β substituição de glutamina por arginina na posição 54. Perda da capacidade de ligação aos receptores das células alvo. Conduz a disfunção na formação de esteróides. Mutação no codão 1502 do exão 3 da subunidade β da LH substituição de serina por glicina na posição 102. Ciclos menstruais normais, infertilidade, níveis de LH normais ou elevados no soro e baixo estradiol no início da fase folicular. Factores Genéticos da Infertilidade Masculina Cromossoma Y O cromossoma Y possui uma importância fulcral para o desenvolvimento embrionário de um indivíduo do sexo masculino. É um cromossoma pequeno e muito heterogéneo, logo a informação que possui é mesmo muito reduzida. Este cromossoma é responsável pela regulação de: Determinação testicular. Diferenciação testicular. Espermatogénese. Função orgânica especificamente masculina. 47

49 Pelo menos 33 genes estão localizados no cromossoma Y, subdivididos em 3 grupos: Grupo 1 regiões pseudoautossómicas (emparelhamento com X) (PAR1 e PAR2). Localizados junto dos telómeros dos braços curto e longo. Grupo 2 região não recombinante do cromossoma Y (NRY), com genes semelhantes no cromossoma X. Grupos 3 genes específicos do cromossoma Y. SRY (determinação testicular no início da embriogénese). A maior parte dos genes têm um número elevado e variável de cópias que se expressam unicamente no testículo. Cromossoma Y e determinação testicular localização de SRY imediatamente adjacente a PAR1. Se recombinação meiótica anormal: translocação para cromossoma X. XX região SRY tem de aparecer algures em algum dos cromossomas X. XY não está presente no cromossoma Y a região SRY, pois provavelmente foi perdida durante a meiose. Cromossoma Y e diferenciação testicular: Região AZF (factor de azoospermia): AZFa, AZFb, AZFc, AZFd. Delecções de grande tamanho normalmente resultam em SCO ou paragem da espermatogénese. No entanto, pequenas delecções intersticiais podem conduzir a resultados idênticos. Região AZF delecções, de maior ou menor tamanho, das várias combinações destas regiões levam a uma grande diminuição ou até à ausência de gâmetas, de maior ou menor gravidade. Os genes Dffry e dby desempenham um papel importante no início da espermatogénese pode existir a delecção de uma ou de ambas as zonas, com diferentes consequências: 100% de portadores da delecção de ambos: SCO. Se apenas um deles é delectado: oligospermia grave. Delecções envolvendo a região AZFa resultam normalmente em azoospermia. Oligozoospermia é o fenótipo mais frequente associado a delecções de outras regiões AZF. AZFa: Se delecção apenas na metade proximal contendo o gene Dffry (metade distal, contendo o gene dby intacto), presença de células germinativas com paragem da espermatogénese (completa ou parcial). Se ambas as regiões (proximal e distal) estão delectadas, não se verifica a presença de células germinativas. Estudo das microdelecções do cromossoma Y quando existe um quadro clínico com a diminuição de espermatozóides ou com a mobilidade reduzida, mas com as células de Sertoli normais (falta de maturação) é quase obrigatório o estudo do cromossoma Y (verificando-se o que está ou não presente). É importante para explicar a infertilidade, quando um indivíduo assim nasce de um progenitor normal, o que significa que de uma geração para a outra ocorreu uma mutação, normalmente proveniente de um crossing-over desigual. 48

50 Diagnóstico Genético Pré-Implantação Diagnóstico Genético Pré-Implantação É uma excelente alternativa ao diagnóstico pré-natal (análise de um feto já em desenvolvimento), que permite ultrapassar quase todos os traumas relacionados com o mesmo. Alternativa ao diagnóstico pré-natal quando há risco de surgir descendência com alguma doença genética, seja por: Membro da família afectado / portador. Descendente afectado. Abortamento recorrente. Realizado quando: Doenças causadas por um gene: autossómico dominante ou recessivo, heterossómico dominante ou recessivo. Doenças ligadas ao cromossoma X desconhecimento do gene específico, considerável heterogeneidade genética (selecção do sexo). Anomalias cromossómicas. Doenças relacionadas com a repetição de tripletos (exemplo, paramiloidose). 3 ou mais insucessos em ciclos de fertilização in vitro normalmente, em qualquer mulher não se faz este estudo de diagnóstico, a não ser que à partida, haja um risco significativo da descendência possuir uma doença genética. Mulheres com idade superior a 35 anos tem justificação pois aumenta muito a probabilidade e o número de ocorrerem não disjunções meióticas, no entanto, em termos de sucesso de gravidez, não se mostrou relevante. Assim, é aplicado quando existe o risco de aparecer uma criança com uma doença genética. A maior parte dos abortos consecutivos têm uma causa genética. Processo de Fertilização In Vitro Exames preliminares nas mulheres e homens. Estimulação de mais de 9 ovócitos para estudar / manipular as células à vontade. ICSI não contaminação (espermatozóides e células da granulosa). Na FIV utiliza-se também uma microinjecção pois o oócito tem células da granulosa e espermatozóides a rodeá-lo e com a ICSI evita-se a contaminação, assegurando assim o sucesso da fertilização. Biópsia Existem 3 tipos diferentes de fonte de material genético para se realizar uma biopsia: 1º e 2º glóbulos polares espelho da condição interna das células que formam o embrião, mas apenas da parte materna. Tem lógica quando a transmissão de alguma doença seja materna. 1 a 2 blastómeros (embriões com 8 a 12 células), ao 3º dia técnica mais usada. Células da trofoectoderme de blastocistos ao 5º dia. 49

51 Abertura da Zona Pelúcida É necessária a abertura da zona pelúcida, de modo a que a pipeta consiga entrar, para serem recolhidas 1 ou 2 células. Existem 3 modos / abordagens diferentes de fazer a abertura: Solução ácida de Tyrod (ph 2.2) foi uma técnica afastada, pois por muito pouco ácido que fosse utilizado, o embrião era perturbado desnecessariamente. Laser técnica bastante rápida, utilizada actualmente, que substituiu as restantes. Consiste na incidência de raios laser numa zona pretendida do aglomerado de células, que é o embrião por esta altura, de modo a se conseguir um buraco para a pipeta entrar. Dissecção parcial existem poucos laboratórios a nível mundial que ainda realizam esta técnica. Consiste na remoção de células, com uma precisão microcirúrgica. Exige imenso trabalho técnico. Todos estes métodos utilizam meios (especiais) sem cálcio / magnésio sem estes iões, os blastómeros (que estão ligados uns aos outros), ficam mais fluidos e consegue-se retirar uma célula de cada vez. Diagnóstico Unicelular Constitui um problema, pois apenas se consegue o diagnóstico daquela célula e não do colectivo de blastómeros. Este diagnóstico é feito através de 2 grandes grupos que se usam que se usam para problemas específicos e diferentes, cada um deles: PCR doenças causadas por um gene. FISH anomalias cromossómicas (número, translocações recíprocas, inserções e robertsoneanas, XX e XY). A determinação do sexo (através de FISH) apenas faz-se, em alguns países, a pedido dos pais (em Portugal é completamente proibido). Turismo reprodutivo pessoas migram para países onde as leis são menos rígidas, a este nível, para incorporarem os tratamentos e/ou fazer estes diagnósticos, onde nos seus países é proibido. Diagnóstico Unicelular PCR Lise celular / extracção do DNA. Amplificação com primers específicos. Problemas: Contaminação com DNA estranho é um problema, mas que em laboratórios de reprodução in vitro a probabilidade de ocorrência é muito baixa, logo não se torna relevante / importante. Amplificação preferencial (allele drop-out) pode ocorrer por exemplo num indivíduo heterozigótico que possui 1 alelo normal e 1 alelo anormal. Durante o PCR, pode haver uma amplificação preferencial de um alelo em relação ao outro (exemplo o normal em relação ao anormal). Como só existe uma célula, pode não se conseguir identificar a doença (falso positivo). Allele drop-out um dos alelos, comparativamente ao outro, é amplificado com maior facilidade, sendo, a partir daí, um processo exponencial, o que ao fim de n ciclos, se obtêm muito mais cópias desse alelo (tanto para muitas como para poucas células), provocando erros de diagnóstico. Assim, um diagnóstico pode ser feito apenas com 1 célula, no entanto é preferível trabalhar com 2 células independentes (pode ser pior para o sucesso de implantação do embrião, mas é preferível ao risco de diagnósticos errados). 50

52 Tipos de técnicas: Nested PCR. PCR com fluorescência. PCR em tempo real cada vez mais utilizado. PCR multiplex. Hibridização genómica comparativa consiste na tentativa de hibridização de um padrão de DNA normal, com um padrão de DNA alterado e este marcado com fluorescência. Se ocorrer hibridização, o indivíduo tem a doença. Encontra-se em crescente desenvolvimento. Chips de DNA (microarrays) kits que permitem analisar as anomalias mais ocorrentes em mulheres, por exemplo. Correspondem a chips kits com DNA já pronto a hibridizar com a sequência específica. Diagnóstico Unicelular FISH Técnica que se utiliza nos cromossomas onde as principais e mais graves patologias da espécie humana, estão presentes. Controlo do cromossoma 13, 16, 18, 21, X e Y. Permite fazer um diagnóstico quanto ao sexo. Apenas se faz selecção de sexo quando há indivíduos de doenças associadas ao X ou Y. Sondas: Sequências repetitivas ou sondas α-satélite. Sondas loci específicas. Pintura cromossómica o núcleo do blastómero recolhido está em Interfase (identificação por diferentes cores). Como o núcleo não está em metafase, o diagnóstico torna-se mais complicado. Diagnóstico Genético Pré-Implantação Transferência de embriões 4º ou 5º dia após punção folicular. Taxa de gravidez clínica em DGPI 22,4 %. Motivos para a realização de DGPI: Risco genético e prévia interrupção da gravidez 21,1%. Risco genético e objecção à interrupção da gravidez 36,2 %. Risco genético e sub-fertilidade ou infertilidade 25,6%. Risco genético e esterilização 1,0 %. Aneuploidias relacionadas com a idade 14,2 %. Outros 6,4%. DGPI em abortamentos de repetição: PGD-AS (aneuploidy screening) usam-se principalmente chips ou hibridização com sondas fluorescentes. Translocações (recíprocas, inserções e robertsoneanas) ocorrem abortamentos muitíssimo precoces. 51

53 Chromosome Abnormalities Complete Karyotyping by CGH (hibridização genómica comparativa) cariótipo molecular através de hibridização genómica comparativa, onde o genoma normal hibridiza com o genoma pretendido, se tal não ocorrer é porque existem erros. Doenças Monogénicas Doenças monogénicas ausência de um dos alelos, quer seja recessivo quer seja dominante. 52