Diversidade genética de acessos nativos de Macroptilium spp e seu simbionte bacteriano no semiárido Pernambucano

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1 Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE Departamento de Agronomia Programa de Pós-Graduação Melhoramento Genético de Plantas PPGMGP Disciplina: Seminários II Diversidade genética de acessos nativos de Macroptilium spp e seu simbionte bacteriano no semiárido Pernambucano Mestrando: Thiago Prates Orientador: Profº. Mario de A. Lira Junior, Ph.D. Recife Pernambuco Novembro, 2010

2 Introdução As plantas estão constantemente expostas a grande variedade de microrganismos; O solo é um reservatório de diversidade de espécies microbianas, que entram em contato com as plantas via raiz; A comunidade microbiana da rizosfera difere daquelas encontradas em outras regiões do solo; As interações mais estudadas e conhecidas são aquelas em que ocorrem alterações morfofisiológicas nos organismos envolvidos.

3 Introdução A interação entre leguminosas e as bactérias diazotróficas; 79% do N na atmosfera, que está na forma de N N (N2) deve ser transformado em uma forma assimilável; Os organismos que pertencem ao grupo dos eucariotos (plantas e animais) não conseguem utilizar este elemento diretamente; Os microrganismos diazotróficos; Fonte: Microscopia de transmissão: Frank Dazzo Figura 1: Rizóbio no solo envolto por uma cápsula de exopolissacarídeo, que protege a célula contra a dessecação. Também facilita a aderência à superfície da raiz.

4 Introdução Os microrganismos capazes de fixar o nitrogênio atmosférico são caracterizados em três: Diazotroficos de vida livre; Diazotróficos associativos; Diazotróficos simbiontes. As bactérias fixadoras de nitrogênio que nodulam as leguminosas, são conhecidas genericamente como rizóbios. Fonte: Artenisa Rodrigues Fonte: Artenisa Rodrigues

5 Introdução Diazotróficos Simbióticos Tradicionalmente, se tem dividido os rizóbios em grupos de acordo com a velocidade de crescimento; Crescimento rápido Crescimento lento Crescimento intermediário Rhizobium, Azorhizobium e Ensifer (Sinorhizobium) Bradyrhizobium Mesorhizobium

6 Introdução Uma importante peculiaridade destas interações é o elevado grau de especificidade; A nodulação é um processo de multi-passos que envolvem plantas específicas e expressão genética bacteriana compatível. Raiz de leguminosa Flavonóides Lipooligossacarídeos Rizóbio

7 Introdução 12 2 Figura 2: Células de Rhizobium trifolii aderidas à superfície da ponta da raiz de trevo. Fonte: Frank Dazzo (obtida de homepage) Figura 3: Rhizobium trifolii aderidos à superfície da raiz de trevo. Formação de uma rede de microfibrilas (celulose/exopolissacarídeos) Fonte: Frank Dazzo (obtida de homepage)

8 Introdução Fixação do Nitrogênio A simbiose leguminosas-bactérias fixadoras de N 2 atmosférico é amplamente aceita como alternativa à fertilização química; Processo de Haber-Bosch (Fixação Industrial); Uma demanda que implica grandes custos financeiros, energéticos e, sobretudo, ambientais; A fabricação do fertilizante químico usa energia derivada de petróleo o que encarece o produto final.

9 Introdução Haber-Bosch: Fixação Industrial

10 Introdução Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) Interações benéficas, os rizóbios são capazes de invadir as raízes das plantas e induzir a formação de um novo órgão, o nódulo; O bacteróide; [N ATP + 8e - + 8H + [2NH ADP + 16 Pi + H 2 ] N molecular Amônia Transferência de 6 elétrons, está associada à redução de 2 prótons para formar H 2. O complexo da enzima nitrogenase catalisa essa reação

11 Introdução Interações Essenciais A sinalização Processo de infecção Estab. da simbiose Envolvem genes específicos Desenvolvimento dos nódulos Planta hospedeira Simbionte Genes nodulinas (Nod) Genes da nodulação (nod)

12 Introdução Processo de Formação dos Nódulos Como se inicia o processo? 1. As raízes liberam substâncias indutoras da expressão do GENE nod nas bactérias; Flavonóides 2. Bactérias expressão o GENE nod, que promovem a síntese dos fatores nod; Lipo-Oligossacarídeos 3. As raízes apresentam alterações no fluxo iônico, ocorre a expressão as nodulinas, e é infectada.

13 Introdução Fonte: Artenisa Rodrigues

14 Introdução...ocorrendo também intensa divisão celular das células corticais que se exteriorizam, formando o NÓDULO;...as bactérias param de se dividir e começam a aumentar em tamanho e a se diferenciar em organelas endossimbióticas. Fonte: Sebastião Junior

15 Introdução Efeito de fatores de nodulação em raiz de siratro. Controle Rhizobium meliloti Rhizobium leguminosarum Rhizobium leguminosarum Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium japonicum Fonte: Artenisa Rodrigues

16 Introdução Nódulo em Leguminosa Córtex da raiz Tecido vascular (Xilema e floema) Endoderme Zona de senescência (baixa-zero habilidade de fixação de N 2 ) Zona madura (alta habilidade de fixação de N 2 ) Região recentemente infectada (baixa habilidade de fixação de N 2 ) Zona de divisão celular (não tem habilidade de fixação de N 2 )

17 Introdução Fonte; Fernando Luiz Fonte; Sebastião Junior Figura 4: Micrografias de nódulos que fixam N. Seção transversal de uma raiz do trevo branco, uma leguminosa, mostra pêlos radiculares e um nódulo. Figura 5: Seção transversal de uma raiz de Datisca glomerata e um nódulo.

18 Introdução Fonte: Artenisa Rodrigues Fonte: Artenisa Rodrigues Figura 6: Microscopia de varredura de uma célula infectada de Vicia faba, mostrando bacteróides alongados. Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão de células de Glycine max contendo bacteródies ativos.

19 Introdução Fonte: Fernando Luiz Fonte:Sebastião Junior Figura 10: Nódulos de Phaseolus vulgaris - Rhizobium Figura 10: Rizóbio dentro de um nódulo. Cada nódulo tem cerca de 10 9 células bacterianas - Microscopia de Varredura -

20 Introdução Fonte: Artenisa Rodrigues Figuras 12: Nódulos ativos. Coloração intensa - Leghemoglobina

21 Introdução Fonte: Carolina E. Santos Tipos de nódulos Mucunã (Dioclea grandiflora) Nódulos radiculares de leucena Nódulos de Phaseolus vulgaris Nódulos radiculares da Soja Nódulos de Jurema de Imbira Figura 13: Variabilidade no formato de nódulos. Amorosa (Mimosa paraibana)

22 Fonte: Artenisa Rodrigues Introdução Inoculado Não-inoculado Figura 14 :Siratro cultivado em condições estéreis

23 Introdução Fonte: Artenisa Rodrigues Figura 15: Siratro cultivado em condições estéreis

24 Objetivo Objetivo Geral Coletar e avaliar a diversidade genotípica de pares simbióticos ocorrentes em 11 microregiões do semiárido de Pernambuco.

25 Objetivo Objetivos Específicos Avaliar a diversidade genotípica de acessos de Macroptilium spp em 11 sites de coletas no estado de Pernambuco; Avaliar a diversidade genotípica de isolados rizobianos que nodulem Macroptilium spp obtidos nas mesmas áreas de coleta dos genótipos vegetais

26 Metas Metas Obter 100 acessos de Macroptilium spp, bem como avaliar a diversidade genotípica dos mesmos; Obter 300 isolados rizobianos utilizando Macroptilium atropurpureum como planta isca; Avaliar compatibilidade simbiótica destes isolados com os acessos vegetais; Avaliar diversidade fenotípica e genotípica dos isolados que nodulem efetivamente espécies nativas deste gênero.

27 Metodologia

28 Metodologia Quadro 1: Cidades de Pernambuco onde será feita a coleta de germoplasma. Cidades Santa Cruz (microregião de Araripina) Parnamirim (microregião de Salgueiro) Serra Talhada (Sertão do Pajeú) Sertânia (Sertão do Moxotó) Petrolina (microregião de Petrolina) Floresta (microregião de Itaparica) Tupanatinga (Vale do Ipanema) Jataúba (Vale do Ipojuca) Santa Cruz do Capibaribe (Alto Capibaribe) Bom Jardim (Médio Capibaribe) Caetés (microregião de Garanhuns)

29 Metodologia Figura 16 - Mapa de Pernambuco, com círculos amarelos representando os locais de coleta. Fonte: Lira Junior

30 Metodologia Coleta do germoplasma: Coletas serão em áreas de ocorrência de gramíneas e em áreas mais protegidas de pastejo; Coordenadas geográficas; Plantas serão coletadas inteiras, com solo e colocadas em saco plástico; Plantas do BAG serão coletadas com inflorescência para identificação botânica no herbário da UFRPE e do Instituto Agronômico de Pernambuco.

31 Metodologia Avaliação da diversidade genotípica da leguminosa: Folhas jovens dos acessos de Macroptilium spp. serão coletadas para estudos genéticos; Isolamento do DNA genômico; Genotipagem por marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat);

32 Metodologia A D C B E Figuras 17: Siratro (Macroptilium atropurpureum)

33 Metodologia Amplificação da região ITS (Espaçador Transcrito Interno) do rdna, primers ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990); As amplificações serão analisadas seguindo a metodologia descrita por (RASBAND, 2008); Sequenciamento Embrapa CENARGEN;

34 Metodologia Isolamento, autenticação e caracterização dos isolados: Siratro (Macroptilium atropurpureum) será utilizado como planta-isca; Plântulas de M. atropurpureum serão pré-germinadas em vermiculita; 60 dias após inoculação as plantas serão colhidas e os nódulos serão limpos e conservados em tubos com sílica-gel; O isolamento será conduzido em placas de Petri com meio 79, com azul de bromotimol.

35 Metodologia A caracterização morfológica Velocidade de aparecimento de colônias isoladas; Forma, cor, brilho; Superfície, borda e tamanho da colônia; Produção e consistência de muco; Absorção de corantes; Modificação do ph do meio de cultura.

36 Metodologia Figura 17: Isolados de rizóbio em meio YMA.

37 Metodologia Sementes coletadas no BAG de cada uma das espécies serão utilizadas para formar uma amostra composta representativa da espécie; Cada estirpe será colocada para crescer em vaso de penicilina com meio YMA; Após 45 dias da inoculação será realizada avaliação visual do sistema radicular.

38 Metodologia A caracterização fenotípica e a avaliação de compatibilidade simbiótica serão utilizadas conjuntamente para agrupamento dos isolados; Através de UPGMA. Figura 18:Estirpes de rizóbio isoladas de nódulos de caupi cultivado em amostras de solo do Nordeste do Brasil Fonte: Norma - EMBRAPA BR 2001 Bradyrhizobium japonicum Rhizobium; Sinorhizobium; Azorhizobium

39 Metodologia Fonte: Fabio Araújo Cada estirpe será submetida ao sequenciamento completo do 16S; PCR (TAURIAN et al., 2006; XU, 2006); Figura 19: Sequência de procedimentos para obtenção dos amplicons

40 Metodologia 95 C por 3 min; 30 ciclos (94 C por 1 min, 54 C por 45 s e 72 C, por 2 minutos); Alongamento final por 7 min a 72 C; Os amplicons serão analisados em gel de agarose.

41 Metodologia Condição de PCR Figura 20: Amplificação dos fragmentos de DNA

42 Metodologia Fonte: megasoftware.net Análise das sequências; Comparação GenBank; Alinhamento Mega4; Figura21: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Análise Molecular Genética Evolutiva Estirpes não identificadas a nível de espécies serão utilizadas em outras pesquisas com grupos de trabalho mais especializados em taxonomia rizobiana.

43 Cronograma Cronograma de execução:

44 Apoio Apoio institucional e financeiro:

45 Fim... Thiago Prates Engº. Agrônomo Programa de Pós-Graduação Melhoramento Genético de Plantas - PPGMGP Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE pratesthiago@yahoo.com.br