DANILO FONSECA BALBI

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1 FACULDADE DE VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) DANILO FONSECA BALBI DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Anaplasma marginale EM BOVINOS LEITEIROS NOS MUNICÍPIOS DE CARAMBEÍ, ESTADO DO PARANÁ, E MACUCO, ESTADO DO RIO DE JANEIRO, POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

2 1 NITERÓI 2013 DANILO FONSECA BALBI DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Anaplasma marginale EM BOVINOS LEITEIROS NOS MUNICÍPIOS DE CARAMBEÍ, ESTADO DO PARANÁ, E MACUCO, ESTADO DO RIO DE JANEIRO, POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientadora: Profª Drª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY

3 2 NITERÓI 2013 DANILO FONSECA BALBI DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Anaplasma marginale EM BOVINOS LEITEIROS NOS MUNICÍPIOS DE CARAMBEÍ, ESTADO DO PARANÁ, E MACUCO, ESTADO DO RIO DE JANEIRO, POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal. BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Nádia Regina Pereira Almosny Orientadora - UFF Profa. Dra. Namir Santos Moreira - UNIPLI Prof. Dr. Huarrisson Azevedo Santos - UFRRJ

4 3 Prof. Dr. Carlos Luiz Massard - UFRRJ NITERÓI 2013

5 4 Dedico este trabalho aos meus pais, Dilma e Geraldo, pela minha formação como pessoa, pelo amor, confiança e abnegação em me auxiliar a chegar até aqui. AGRADECIMENTOS A minha família; minha mãe Dilma, meu pai Geraldo, meu irmão Eduardo, meus avós Wilma, Ignácio, Orsina (in memorian) e Francisco (in memorian), tios e primos, por me proporcionarem absolutamente tudo o que precisei para chegar até aqui. A Tamyres Souza Freitas, pela compreensão e incentivo determinantes na elaboração deste trabalho. A Profa. Dra. Nádia Regina Pereira Almosny, pela orientação, apoio e confiança em mim depositados. Ao MV Paulo Sérgio Oliveira Daflon, pela inestimável colaboração com a coleta das amostras em Macuco. Sem a sua participação este trabalho não teria sido realizado. As MVs Luana Freitas e Camila Machado, por terem se disponibilizado a me ajudar com a coleta e processamento das amostras em Macuco. A Policlínica Veterinária Pioneiros e aos MVs Flávio Lima e Márcio Veras pela pronta colaboração com a coleta das amostras de Carambeí. Aos MVs e amigos Felipe Pitanga e Felipe Camacho, pela parceria e auxílio na coleta das amostras em Carambeí. A MV Lídia Enes de Toledo Piza, por me ajudar na coleta e processamento das amostras em Carambeí. A Profa. Dra. Namir Moreira de Souza, pelo imprescindível auxílio na realização dos testes de imunofluorescência. Ao Prof. Dr. Huarrisson Azevedo Santos, pela colaboração em ceder as amostras de controle positivo.

6 5 Aos Profs. Drs. Rosângela Zacarias e Célio Machado, pela disponibilização das lâminas para imunofluorescência. Aos amigos da pós-graduação; Ariel Director, Gabriela Lobato, Lucas Figueira, Renan Lima, Mário Balaro, Kathryn Diaz, Carolina Olivares, Carolina Cochito, Isabela Poubel, Lívia Munay, Paula Guttmann, Bianca Limberti, Michelle Salotto, Camila Vargas, Tábata Maués, Ana Paula Loureiro e Barbara Batista, pela companhia e amizade. A Camila Giesteira e aos plantonistas, monitores e estagiários do Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Universitário de Medicina Veterinária Prof. Firmino Mársico Filho UFF, pela cooperação em tudo. Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação em Medicina Veterinária UFF (Clínica e Reprodução Animal) Júlia Gleich, Sidney Cordeiro e Paula Neves, pela imensurável compreensão e disponibilidade sempre que foi necessário. A Universidade Federal Fluminense, instituição na qual me graduei e permaneci na pós-graduação. A Faculdade de Veterinária da Universidade Castelo Branco, aos funcionários, professores e alunos por me permitirem desempenhar o papel de professor.

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8 7 "Um homem precisa viajar. Por sua conta, não por meio de histórias, imagens, livros ou TV. Precisa viajar por si, com seus olhos e pés, para entender o que é seu. Para um dia plantar as suas árvores e dar-lhes valor. Conhecer o frio para desfrutar o calor. E o oposto. Sentir a distância e o desabrigo para estar bem sob o próprio teto. Um homem precisa viajar para lugares que não conhece para quebrar essa arrogância que nos faz ver o mundo como o imaginamos, e não simplesmente como é ou pode ser; que nos faz professores e doutores do que não vimos, quando deveríamos ser alunos, e simplesmente ir ver." Amyr Klink SUMÁRIO LISTA DE QUADROS...08 LISTA DE TABELAS...09 LISTA DE FIGURAS...10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...11 RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA HISTÓRICO Anaplasma marginale Epidemiologia Transmissão Patogenia Sinais Clínicos Diagnóstico MATERIAL E

9 8 MÉTODOS ÁREAS DE ESTUDO ANIMAIS COLETA DAS AMOSTRAS IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS E DISCUSSÃO AVALIAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Presença de animais positivos no município de Macuco Classificação dos animais positivos quanto à idade Classificação dos animais positivos quanto ao sexo Presença de animais positivos no município de Carambeí CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...36 ANEXOS LISTA DE QUADROS

10 9 Quadro Título Página Quadro 01. Classificação da família Anaplasmataceae a partir de Quadro 02. Frequência da infecção causada por Anaplasma marginale 21 em soros bovinos nas diferentes regiões do Brasil. LISTA DE TABELAS

11 10 Tabela Título Págin Tabela 1. Tabela 2. Tabela 3. Tabela 4. Resultado da pesquisa de anticorpos da classe IgG para A. marginale em IFI de bovinos do município de Macuco RJ. Comparação das faixas etárias dos bovinos positivos em IFI no município de Macuco RJ. Comparação do sexo dos bovinos positivos em IFI no município de Macuco RJ. Resultado da pesquisa de anticorpos da classe IgG para A. marginale em IFI de bovinos do município de Carambeí PR

12 11 LISTA DE FIGURAS Figura Título Págin Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Regiões fisiográficas do Estado do Rio de Janeiro. O município de Macuco, onde foram coletadas as amostras, está localizado na região serrana, marcada com a cor laranja. Regiões fisiográficas do Estado do Paraná. O município de Carambeí, onde foram coletadas as amostras, está localizado nos Campos Gerais e marcado com a cor vermelha Sala de ordenha em propriedade de exploração leiteira no município de Macuco, RJ, Sala de ordenha em propriedade de exploração leiteira no município de Carambeí, PR, Coleta à vácuo de sangue bovino através de venopunção da veia coccígea média

13 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS IFI IgG PCR PR RJ UFF Imunofluorescência Indireta Imunoglobulina G Reação em Cadeia da Polimerase Paraná Rio de Janeiro Universidade Federal Fluminense

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15 14 RESUMO Anaplasma marginale é um hemoparasito pertencente à ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae, sendo o principal agente etiológico da anaplasmose bovina. Esta enfermidade é transmitida principalmente por carrapatos ixodídeos e acomete os bovinos em todo o mundo, principalmente em regiões tropicais e subtropicais, sendo responsável por grandes prejuízos econômicos como mortalidade no rebanho, queda na produção de leite, diminuição do ganho de peso, além de gastos com controle e profilaxia. Com objetivo de avaliar a ocorrência deste hemoparasita, foram coletadas 400 amostras de sangue bovino de dois municípios com climas distintos: o município tropical de Macuco, no Estado do Rio de Janeiro e o município subtropical de Carambeí, localizado no Estado do Paraná. Além do clima, existem diferenças circunstanciais entre o tipo de exploração pecuária realizado entre ambos. As duzentas amostras de sangue bovino obtidas em cada município foram enviadas ao Laboratório de Pesquisa Clínica e Molecular Marcílio Dias do Nascimento da Faculdade de Veterinária-UFF, para avaliação sorológica por meio da técnica de imunofluorescência indireta, buscando evidenciar anticorpos que indiquem exposição ao agente etiológico. Foram encontradas 178 (89%) amostras positivas no município de Macuco, no Estado do Rio de Janeiro e 76 (38%) em

16 15 Carambeí, no Estado do Paraná. Tais resultados permitiram concluir que A. marginale está presente em ambas as regiões estudadas, porém com índices de soropositividade distintos. O município paranaense encontra-se sob instabilidade enzoótica, devido ao fato de haver grande parte dos animais susceptíveis à infecção, enquanto o município fluminense é de estabilidade enzoótica, pois a absoluta maioria dos animais já foi exposta ao agente infeccioso. PALAVRAS-CHAVE: Diagnóstico; Hemoparasitas; IFI; Anaplasmataceae, Anaplasma, bovinos. ABSTRACT Anaplasma marginale is a hemoparasite belonging to the order Rickettsiales, family Anaplasmataceae, being the main etiological agent of bovine anaplasmosis. This disease is primarily transmitted by ticks and ticks affects cattle worldwide, mainly in tropical and subtropical regions and is responsible for major economic losses to the herd mortality, decreased milk production, decreased weight gain, and spending with control and prophylaxis. In order to evaluate the occurrence of this hemoparasite, 400 bovine blood samples from two cities with different climates were collected: the tropical city of Macuco, State of Rio de Janeiro and the sub-tropical city of Carambeí, located in the State of Paraná. Besides the climate, there is circumstantial differences between the type of livestock held between them. The two hundred samples of bovine blood obtained in each municipality were sent to the Laboratory of Clinical Research and Molecular Marcílio Day of Birth, School of Veterinary-UFF, for serological evaluation by indirect immunofluorescence in order to enhance antibodies indicating exposure to the causative agent. 178 (89%) positive samples were found in the municipality of Macuco, State of Rio de Janeiro and 76 (38%) in Carambeí in the state of Paraná. These results showed that A. marginale is present in both regions studied, but with different rates of seropositivity. The Paraná municipality is under enzootic instability due to the fact that there most animals susceptible to

17 16 infection, while the municipality of Rio de Janeiro is enzootic stability, because the absolute majority of the animals were already exposed to the infectious agent. KEYWORDS: Diagnosis; anaplasma marginale; ifi; bovine; anaplasmataceae; tick-born disease. 1. INTRODUÇÃO Anaplasma marginale THEILER, 1910 é um hemoparasito pertencente à ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae (DUMLER, 2001), sendo o principal agente etiológico da anaplasmose bovina. Esta enfermidade é transmitida principalmente por carrapatos ixodídeos e acomete os bovinos em todo o mundo, principalmente em regiões tropicais e subtropicais (RISTIC, 1981), sendo responsável por grandes prejuízos econômicos como mortalidade no rebanho, queda na produção de leite, diminuição do ganho de peso, além de gastos com controle e profilaxia (PALMER, 1989; GONÇALVES, 2000; GRISI et al., 2002; BARROS et al., 2005). A anaplasmose bovina é caracterizada clinicamente por febre, anemia hemolítica, icterícia, perda de peso, diminuição na produção de leite e abortamento (OLIVEIRA et al., 2003; RAMOS et al., 2007; MARANA et al., 2009). A transmissão de Anaplasma marginale ocorre por meio de diversas espécies de carrapatos da família Ixodidae, podendo também ocorrer por meio de insetos hematófagos, fômites ou instrumentos cirúrgicos contaminados com sangue de animais infectados (RISTIC, 1981; GUGLIELMONE, 1994; KOCAN, 1995).

18 17 A distribuição epidemiológica da anaplasmose pode ser classificada em três áreas: área livre, onde as condições climáticas são desfavoráveis à multiplicação dos vetores, como no extremo sul do Brasil; área de instabilidade enzoótica, onde as condições climáticas são favoráveis à proliferação dos vetores apenas em determinadas épocas do ano (meses quentes), permitindo infestação em população de risco, como na região sul do país; e área de estabilidade enzoótica, onde ocorre multiplicação de vetores ao longo de todo o ano, como na maioria do território brasileiro, fazendo com que a população bovina tenha exposição permanente aos parasitos (VIDOTTO e MARANA, 2001). O diagnóstico da anaplasmose bovina pode ser realizado por meio de exame físico, pela observação dos sinais clínicos inerentes à enfermidade. No entanto, para a confirmação da infecção são utilizados diversos métodos laboratoriais como visualização dos parasitos em hemácias mediante observação de esfregaços de sangue periférico em microscopia de imersão, técnicas sorológicas visando à identificação de anticorpos, tais como ELISA e Imunofluorescência indireta, ou ainda métodos moleculares como a PCR (RIET-CORREA et al., 2007). Vários estudos de diagnóstico sorológico têm sido realizados buscando detectar a presença de anticorpos anti-anaplasma marginale em diferentes regiões do mundo. No Brasil, os estudos para estabelecer a prevalência da anaplasmose bovina nos diferentes estados constataram que a infecção está disseminada pelo país, o que evidencia a necessidade de desenvolvimento de melhores métodos de diagnóstico e medidas de controle. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a ocorrência de infecção por Anaplasma marginale, por meio da técnica sorológica de imunofluorescência indireta (IFI), em duas regiões distintas do território nacional, os municípios de Macuco, no Estado do RJ, onde predomina o clima tropical úmido, e Carambeí, no Estado do PR, caracterizado pelo clima subtropical, com inverno rigoroso, portanto desfavorável à proliferação dos vetores. Ambos os municípios têm forte ligação com a produção leiteira, abrangendo grande parte dos rebanhos de bovinos leiteiros em seus respectivos Estados, tornando, desta forma, importante a pesquisa e identificação de enfermidades que possam gerar prejuízos econômicos à pecuária.

19 18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. HISTÓRICO Parasitos da família Anaplasmataceae são bactérias Gram-negativas, obrigatoriamente intracelulares transmitidos, principalmente, por carrapatos e que acometem seres humanos e animais. (INOKUMA et al., 2001 ; DAGNONE et al., 2001). Até o início da utilização da biologia molecular, a diferenciação entre as espécies parasitas era baseada no tipo de célula parasitada, na distribuição geográfica e na severidade da doença (SMITH et al.,1975). Esta classificação vem sendo modificada, tendo em vista análises baseadas na Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). (DUMLER & BAKKEN, 1995; POPOV et al., 1998; DUMLER et al. 2001). Os gêneros Ehrlichia e Anaplasma, primeiramente relacionados a famílias distintas, a partir de então passaram para a família Anaplasmataceae juntamente com os gêneros Cowdria, Wolbachia e Neorickettsia e a Família Rickettsciaceae passou a englobar os gêneros Rickettsia e Orientia. (DUMLER et al 2001). Até o ano de 2001, as espécies pertencentes à família Rickettsiaceae, da ordem Rickettsiales, eram pertencentes à tribo Ehrlichieae e subdivididos em três

20 19 genogrupos. Dentre as alterações propostas por Dumler et al (2001), todos os membros das tribos Ehrlichieae e Wolbachieae deveriam ser transferidos para a família Anaplasmataceae, a estrutura tribal da família Rickettsiaceae deveria ser eliminada, as espécies Anaplasma platys comb. novo e Anaplasma bovis comb. novo deveriam ser criadas em substituição às espécies Ehrlichia platys e Ehrlichia bovis, respectivamente, e E. equi, E. phagocytophila e o agente da Ehrlichiose Granulocítica Humana deveriam ser englobados como uma única espécie, a Anaplasma phagocytophila comb. novo. No ano de 2002, essas propostas foram homologadas, como publicado no International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (LIST EDITOR: Notification List: Notification that new names and new combinations have appeared in volume 51, part 6, of the IJSEM, V. 52, p. 5-6, 2002). Algumas correções foram realizadas, dentre elas, a espécie A. phagocytophila teve seu nome alterado para A. phagocytophilum. Desde então, a classificação da família Anaplasmataceae pode ser vista no quadro abaixo: Quadro 1: Classificação da família Anaplasmataceae a partir de Reino Procariotae Filo Proteobacteria Classe Alphaproteobacteria Ordem Rickettsiales Família Anaplasmataceae A. centrale A. marginale A. ovis Anaplasma A. bovis Gêneros A. platys e A. phagocytophilum Espécies E. ruminantium E. canis Ehrlichia E. chaffeensis E. muris

21 20 Neorickettsia Wolbachia (Compilado e corrigido a partir de DUMLER et al.,2001) E. ewingii N. helminthoeca N. risticii N. sennetsu W. pipientes 2.2. Anaplasma marginale É o hemoparasito de maior prevalência em ruminantes domésticos, sendo endêmico em regiões tropicais e subtropicais onde determina anemia hemolítica de grande morbidade e mortalidade (PALMER, 1989). Os parasitos se apresentam como corpúsculos basofílicos pequenos, arredondados e intraeritrocitários localizados na periferia destes, daí o nome A. marginale (FARIAS, 1995) Epidemiologia A anaplasmose ocorre mundialmente em regiões de clima tropical, subtropical e temperado, é uma doença de grande importância econômica afetando principalmente a produção bovina de muitos países (SOUZA et al., 2001; MOURA et al., 2003; FELSHEIM et al., 2010; KOCAN et al., 2010). Sua distribuição nas Américas Central e Sul é semelhante às babesioses, porém no sul da Argentina ocorrem surtos esporádicos, mesmo em áreas livres de carrapatos (GUGLIELMONE, 1995). A distribuição da anaplasmose acontece em: (1) áreas livres, possuem condições climáticas não favoráveis à multiplicação dos vetores; (2) áreas de instabilidade enzoótica onde as condições edafoclimáticas não são totalmente favoráveis ao desenvolvimento dos vetores, porém pode acontecer que em uma determinada época do ano, ocorram episódios de infestação temporária em

22 21 população de risco; (3) áreas de estabilidade enzoótica onde têm clima favorável ao desenvolvimento de vetores durante todo o ano (VIDOTTO; MARANA, 2001). As taxas de soroprevalência de A. marginale têm uma variação significativa entre os países das Américas, sendo que essa variabilidade contribui para o desenvolvimento de regiões de instabilidade enzoótica (KOCAN et al., 2010). A anaplasmose bovina tem maior destaque em regiões de instabilidade enzoótica, devido à presença de um grande percentual de animais susceptíveis a infecção por A. marginale, pois a maioria dos bovinos não se infecta nos primeiros meses de vida, quando são mais susceptíveis a essa infecção (MADRUGA et al., 1985). Nas áreas de estabilidade enzoótica, os animais que se infectam com A. marginale nos primeiros dias de vida, onde a presença dos vetores é persistente durante todo o ano, apresentam uma maior resistência devido à absorção de anticorpos maternos, através do colostro (VIDOTTO; MARANA, 2001). O percentual de animais doentes, bem como a taxa de mortalidade, pode depender de algumas condições epidemiológicas, tais como: número de vetores no ambiente, estado nutricional e doenças concomitantes (GONÇALVES, 2000). Diversos estudos têm sido realizados no mundo a fim de caracterizar a prevalência da infecção por A. marginale. No México, segundo estudos realizados por Cavazzani (1989), as taxas de prevalência foram estimadas entre 58 e 73%. Na ilha de Santa Lúcia, no Caribe, Knowles et al. (1982), encontraram índices de soropositividade em bovinos importados variando de 16%, após três meses da importação, até 100%, após decorridos doze meses. Estudos realizados na Colômbia, nas áreas de Córdoba e Antioquia, evidenciaram 90,3% de animais soropositivos (PATARROYO et al., 1978). Índices semelhantes foram observados na Bolívia por Nicholls et al. (1980), com médias de 87% na região de Sant Cruz de La Sierra e 98% para San Javier. No Brasil, considera-se como área de instabilidade enzoótica para A. marginale o nordeste do Estado do Pará (GUEDES JÚNIOR et al., 2008) e a região centro-sul do Estado do Paraná (MARANA et al., 2009). Já as áreas de estabilidade enzoótica são: a mesorregião do médio Paraíba (SOUZA et al., 2001) e a mesorregião Norte Fluminense-RJ (SOUZA et al., 2000a). Madruga et al. (1984) encontraram 51,92% de prevalência no Estado do Mato Grosso do Sul, enquanto Oliveira et al. (1992) encontraram prevalência em 16,3% em região produtora de

23 22 leite no Estado de Sergipe. Na região de Umuarama, no Paraná, foram detectados 76,01% de animais soropositivos (YOSHIHARA et al., 2003). O Quadro 2 fornece informações acerca de diferentes estudos de soroprevalência realizados no Brasil. Quadro 2: Frequência da infecção causada por Anaplasma marginale em soros bovinos nas diferentes regiões do Brasil. (Fonte: Vidotto e Marana,1999) Transmissão Anaplasma marginale é transmitido biologicamente por carrapatos e, mecanicamente por dípteros hematófagos e fômites contaminados por sangue (SOUZA et al., 2001; ARAÚJO et al., 2003; CARELLI et al., 2007). No Brasil, o carrapato dos bovinos, ou Rhipicephalus microplus, é o responsável pela

24 23 transmissão biológica da anaplasmose; entre os carrapatos, a transmissão pode ocorrer tanto transestadial como transovariana (KESSLER, 2001; PACHECO et al., 2004; BROWMAN, 2006). Nos animais pode acontecer ainda transmissão congênita ou transplacentária (RIBEIRO et al., 1995; KESSLER, 2001). A transmissão mecânica pode ser através da picada do inseto, que realiza a transferência direta de sangue de bovinos portadores para susceptíveis, ocorrendo poucos minutos após a alimentação no bovino infectado (MARTINS, 2002), porém a transmissão por insetos hematófagos deve ser objeto de mais estudos, devido à escassez de infecções experimentais (KESSLER, 2001). Pode ainda ocorrer inoculação do agente por agulhas contaminadas com sangue infectado durante a vacinação ou pequenos procedimentos cirúrgicos, como castração, marcação por tatuagem, entre outros (MARTINS, 2002; KOCAN et al., 2010). Nos carrapatos, a transmissão pode ocorrer entre diferentes ínstares (larva ou ninfa se infecta e transmite ao estádio subsequente ninfa ou adulta) sendo denominada transestadial ou pode ocorrer via transovariana (infecção na forma adulta que após replicação no intestino da fêmea, transmitir para a próxima geração) (MARTINS, 2002; BROWMAN, 2006). Pode ainda ocorrer uma transmissão mecânica pelo carrapato macho, este se infecta em bovino portador e transmite, posteriormente, para outro bovino sensível (KESSLER, 2001) Patogenia O início do ciclo biológico no hopedeiro vertebrado ocorre quando a rickettsia invade as hemácias através de um processo de endocitose, formando um corpúsculo inicial, que se adere à célula e forma uma invaginação em sua membrana. Então, o microrganismo invade a célula e permanece dentro de um vacúolo, onde o corpúsculo inicial divide-se por fissão binária dando origem a um corpúsulo de inclusão, delimitado por uma membrana possivelmente de origem eritrocítica. Podem ser observados de um a oito corpúsculos intra-eritrocíticos de localização periférica, medindo de 0,1 a 0,8mm. Após ser liberado sem romper a hemácia, cada corpúsculo inicial invadirá outra célula, razão pela qual o número de

25 24 células infectadas pode dobrar dentro de 24 a 48 horas após a infecção (RISTIC., 1981; KOCAN, 2010). O período de latência compreende de três a seis semanas, seguido por intensa parasitemia que caracteriza a fase aguda, onde a taxa de eritrócitos infectados pode ultrapassar 10x9 por mililitro de sangue (ALLEMAN et al., 1996), levando a um quadro de anemia hemolítica grave. Essas hemácias são posteriormente fagocitadas por células do sistema reticuloendotelial, resultando em desenvolvimento de anemia e icterícia, sem que apresente hemoglobinemia ou hemoglobinúria (KOCAN et al., 2010). Os animais que se recuperam da fase aguda permanecem como reservatório da doença, sendo importante fonte de infecção para outros indivíduos (ERIKS et al., 1993). Anaplasma marginale determina anemia hemolítica intra e extra-vascular, sendo esta última causada por processo imunológico (CARSON & BUENING, 1979). A resposta auto-imune durante a fase aguda é descrita como a principal responsável pela anemia na qual o baço tem importante função, pois os eritrócitos são rapidamente removidos da circulação, sem evidência de hemólise intravascular (MADRUGA et al., 1987; VIDOTTO et al, 2001) Sinais Clínicos Nos animais acometidos são observados anemia hemolítica, icterícia, dispneia, taquicardia, febre, fadiga, sialorreia, diarreia, anorexia, perda de peso, aborto, às vezes agressividade (RISTIC, 1981; BARBET, 1995). A morte pode sobrevir em menos de 24 horas (FARIAS, 1995) Diagnóstico O diagnóstico da anaplasmose bovina pode ser realizado mediante a observação dos sinais clínicos, no entanto tal método apresenta algumas desvantagens, visto que os sinais são inespecíficos, fazendo-se necessário o diagnóstico diferencial, além de tais sinais não estarem presentes em animais que já

26 25 saíram da fase clínica da enfermidade, mas permanecem como portadores assintomáticos (RIET-CORREA et al., 2007). O diagnóstico anátomo-patológico é efetuado por meio de necropsia, para pesquisa de lesões presentes no animal características de doença hemolítica, evidenciando-se mucosas e serosas anêmicas ou ictéricas, fígado e baço congestos e aumentados, linfonodos intumescidos, rins aumentados e escuros, vesícula biliar distendida contendo bile escura, densa e grumosa e congestão cerebral (RIET- CORREA et al., 2007). O esfregaço sanguíneo corado pela técnica de Giemsa representa o método de diagnóstico mais amplamente utilizado, possibilitando a visualização do parasita no interior do eritrócito, por meio de microscopia de imersão. No entanto, este método não é capaz de identificar animais na fase crônica da enfermidade, quando já apresentam baixos índices de parasitemia (MARANA et al., 2006). Os testes sorológicos são os mais utilizados para a identificação dos animais na fase crônica da enfermidade, assim como para estudos de soroprevalência. Dentre os mais utilizados, destacam-se os testes de aglutinação, imunofluorescência e imunoenzimáticos. O teste de conglutinação rápida (TCR) ou simplesmente teste do cartão, é uma técnica sorológica simples e prática, eficiente para uso a campo e adotada em alguns levantamentos epidemiológicos, como em estudo realizado por Madruga et al (1987b). O teste imunoenzimático de ELISA é capaz de detectar e quantificar a preseça de anticorpos em baixas concentrações. O soro a ser testado apresenta anticorpos específicos capazes de reconhecer o antígeno aderido a uma placa e de reagir com anticorpos anti-igg bovina marcados com uma enzima (fosfatase ou peroxidase, por exemplo). Tais enzimas degradam o seu substrato incolor específco, tornando visível a reação, que é quantificada por meio da leitura da densidade óptica obtida com espectrofotômetro (BARRY et al., 1986; NAKAMURA et al., 1988; NIELSEN et al., 1996). A intensidade da cor determina a concentração do anticorpo presente no soro testado, razão pela qual um teste realizado em soro negativo é incolor (TIZARD, 1992; FARIAS, 1995). O teste de imunofluorescência indireta (IFI) utiliza como antígenos esfregaços sanguíneos contendo eritrócitos parasitados. Os anticorpos anti-igg presentes no

27 26 soro teste reagem com o antígeno, sendo identificados por anticorpos anti-igg bovina marcados com isotiocianato de fluoresceína, denominado conjugado (MADRUGA et al., 1986). Um estudo realizado por Araújo et al (1997), comparou as técnicas de TCR, ELISA e IFI para detecção de soroprevalência em rebanhos leiteiros na Bahia, concluindo não haver diferença significativa entre os resultados dos três testes. Diversos métodos moleculares também podem ser empregados no diagnóstico da anaplasmose bovina. A reação em cadeia da polimerase convencional (C-PCR) (FRENCH et al., 1998), semi-nested, nested PCR (MOLAD et al., 2004) assim como PCR em tempo real (RT-PCR) (DECARO et al., 2008) são exemplos de tais métodos. A PCR em tempo real possui algumas vantagens, como a maior velocidade de obtenção dos resultados, quantificação do nível de infecção e menor probabilidade de contaminação (DECARO et al., 2008). 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. ÁREAS DE ESTUDO O município de Macuco localiza-se a latitude 21º59'02" sul e a longitude 42º15'10" oeste, estando a uma altitude de 266 metros. Sua área é de 77,08 km². Situado na mesorregião centro-fluminense do Estado do RJ, possui clima tropical sub-úmido e seco, com temperatura média anual de 22ºC. Em 2010 a população humana foi estimada em habitantes e, em 2007, a população bovina foi estimada em indivíduos (IBGE).

28 27 Figura 1. Regiões fisiográficas do Estado do Rio de Janeiro. O município de Macuco, onde foram coletadas as amostras, está localizado na região serrana, marcada com a cor laranja (Fonte: ptb.org.br). O município de Carambeí localiza-se na região dos Campos Gerais paranaenses, a uma latitude 24 55'04" sul e a uma longitude 50 05'49" oeste. Situado a 1120m acima do nível do mar, possui área aproximada de 650km². Seu clima é subtropical úmido, sendo a média de temperatura anual de 17ºC. No ano de 2010 a população do município foi de habitantes, e o rebanho bovino contava com cabeças (IBGE).

29 28 Figura 2. Regiões fisiográficas do Estado do Paraná. O município de Carambeí, onde foram coletadas as amostras, está localizado dos Campos Gerais e marcado com a cor vermelha (Fonte: ptb.org.br) ANIMAIS Foram coletadas amostras de sangue de quatrocentos bovinos, oriundos dos municípios de Macuco, localizado na região serrana do Estado do Rio de Janeiro, e de Carambeí, localizado na região dos campos gerais do Estado do Paraná. Estes bovinos são provenientes de fazendas de produção leiteira. Os rebanhos das propriedades do município de Macuco são predominantemente mestiços entre as raças Gir e Holandês, explorados em sua maioria em sistemas de criação semiintensivos, isto é, são mantidos no pasto e recebem suplementação de volumoso (principalmente na época seca) e concentrado (durante o ano todo, de acordo com a produção leiteira individual). Por outro lado, os rebanhos paranaenses são compostos quase que em sua totalidade por animais puros da raça Holandesa, criados sob regime de confinamento total (free-stall ou tie-stall).

30 29 Figura 3. Sala de ordenha em propriedade de exploração leiteira no município de Macuco, RJ, (Fonte: Arquivo pessoal). Figura 4. Sala de ordenha em propriedade de exploração leiteira no município de Carambeí, PR, (Fonte: Arquivo pessoal). As amostras obtidas de bovinos pertencentes à região de Macuco -RJ podem ser divididas em grupos quanto à idade dos animais, sendo que 83 (41,5%) tinham

31 30 idade inferior a um ano e 117 (58,5%) possuíam mais de dois anos de idade. Em relação ao sexo, 49 (24,5%) animais eram machos, enquanto 151 (75,5%) eram fêmeas. Já as amostras oriundas da região de Carambeí-PR foram em sua totalidade obtidas de bovinos fêmeas, com idade superior a dois anos COLETA DAS AMOSTRAS Após a devida contenção do animal, foi realizada venopunção da veia coccígea média (Figura 5), utilizando-se tubos de coleta à vácuo acoplados a agulhas específicas 0.8 x 32mm (BD Vacutainer ). Foram coletados dois tubos de cada animal. As amostras foram processadas nas dependências do Laboratório de Pesquisa Clínica e Molecular Marcílio Dias do Nascimento, da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense (UFF). Até o processamento, as amostras dos tubos foram mantidas sob refrigeração (4ºC). Figura 5. Coleta à vácuo de sangue bovino através de venopunção da veia coccígea média. (Macuco, RJ, Arquivo pessoal.)

32 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) As amostras de soro dos bovinos foram testadas pelo método de IFI, de acordo com o procedimento descrito pela bula do kit comercial, como pode ser visto no Anexo 1. Foram utilizados 10 µl dos soros a serem testados diluídos 1:40, assim como os controles negativo e positivo. Como conjugado, foi utilizada a anti-igg bovina total marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC), produzida em coelho (SIGMA ), na diluição de 1:300 em PBS, ph 7,2. Após diluição, 1:40, foram depositados 10µL em cada poço da lâmina contendo os antígenos. As lâminas foram incubadas por 45 minutos em estufa a 37 C, em câmara úmida. Posteriormente, foram lavadas cinco vezes em PBS diluído (ph 7,4 +- 0,2) e deixadas por cinco minutos imersas na solução (em cuba de vidro). As lâminas foram secas, e em cada poço adicionou-se 10 µl de conjugado (anti-igg bovina, marcada pelo isoticianato de fluoresceína) em cada poço das lâminas. As lâminas foram novamente incubadas por 45 minutos em estufa a 37 C, em câmara úmida e lavadas cinco vezes em PBS diluído (ph 7,4 +- 0,2) e deixadas imersas por cinco minutos em cuba de vidro. Foram secas em temperatura ambiente e posteriormente montadas com glicerina tamponada, entre lâmina e lamínula, e lidas em microscópio equipado com luz fluorescente (Olympus BX 41 ) usando objetiva de 40X. A leitura foi realizada nas dependências do Laboratório de Pesquisa Clínica e Molecular Marcílio Dias do Nascimento da Faculdade de Veterinária / UFF ANÁLISE ESTATÍSTICA Para a análise estatística foram utilizados métodos descritivos e testes para associação. A associação entre variáveis qualitativas foi realizada através dos testes qui-quadrado e exato de Fisher. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. AVALIAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

33 Presença de animais positivos no município de Macuco Dentre as 200 amostras avaliadas de bovinos oriundos da bacia leiteira de Macuco, 178 (89%) apresentaram resultados positivos para anticorpos da classe IgG para A. marginale, enquanto 22 amostras (11%) foram consideradas negativas, conforme demonstrado na Tabela 1. Tabela 1. Resultado da pesquisa de anticorpos da classe IgG para A. marginale em IFI de bovinos do município de Macuco RJ. Imunofluorescência Indireta Número de amostras Percentual Positiva % Negativa 22 11% Total % Os valores obtidos no presente estudo corroboram aqueles encontrados em estudos anteriores relativos à ocorrência de anaplasmose bovina em regiões tropicais, com clima semelhante ao da região estudada. Ao longo das últimas décadas, diversos autores têm pesquisado a soroprevalência da anaplasmose em todo o mundo. Na América Latina, Patarroyo et al. (1978) encontraram elevado índice de soropositividade, com 90,3% de animais acometidos, assim como na Bolívia, onde Nicholls et al. (1980), com taxas entre 87% e 98%, e na Argentina, com 90% de animais soropositivos encontrados por Habich et al. (1982). No continente africano, Jongejan et al (1988) revelaram média de 85% de animais positivos, assim como na Nigéria, onde Ajayi e Dipeolu (1986) evidenciaram 79,4% dos animais como reagentes. Tais índices refletem a ampla disseminação da doença em países com clima semelhante ao da região de Macuco-RJ, local do presente estudo, onde 89% dos animais foram positivos ao teste de IFI. As condições climáticas encontradas nos locais supracitados são propícias para a manutenção da população de vetores durante todo o ano, gerando por consequência alta carga parasitária nos animais, que acabam sendo infectados.

34 33 Com o clima tropical úmido abrangendo quase a totalidade do seu território e possuindo rebanho bovino de expressão internacional, o Brasil foi objeto de diversas pesquisas acerca da prevalência da anaplasmose bovina, nos últimos anos. Em levantamento sorológico realizado na região Norte Fluminense, de um total de nove municípios e 523 amostras coletadas, Souza et al. (2000) obtiveram valores de prevalência de 91,16%, estudando animais leiteiros e mestiços. De forma similar, o presente trabalho foi realizado numa bacia leiteira localizada na região Serrana do Estado do RJ, limítrofe à região Norte, com bovinos leiteiros e mestiços apresentando 89% de soropositividade. Na mesorregião do Médio Paraíba, no Estado do Rio de Janeiro, estudo realizado por Souza et al. (2001), em oito municípios e com um total de 223 soros bovinos testados, o valor de prevalência encontrado para A. marginale foi de 98,21%, ligeiramente superior ao encontrado no presente estudo, realizado em região com clima e rebanho semelhantes aos encontrados no Médio Paraíba. Na zona da mata mineira, em estudo realizado por Ribeiro et al. (1984) utilizando a técnica de IFI, foram encontrados 81,1% de animais soropositivos. De forma semelhante, levantamento realizado no Estado de Santa Catarina evidenciou a presença de 86% de bovinos positivos (DALAGNOL et al., 1995). Tais resultados ratificam que o valor de 89% obtido no presente trabalho, por meio da mesma técnica (IFI), reflete a realidade do comportamento da anaplasmose bovina na região estudada. Na região do Araguaia, Estado do Tocantins, Trindade et al. (2011), analisando 506 soros bovinos de diferentes faixas etárias, obtiveram uma ta xa de prevalência de 89,9%, assim como na zona semi-árida do Estado da Bahia, em estudo sorológico abrangendo quatro municípios e 823 animais, onde Barros et al. (2005) obtiveram valores de 94,8 e 97%, utilizando dois sistemas de ELISA. Ao analisar 324 amostras de três microrregiões do estado da Bahia, Araújo et al. (1998) observaram que a prevalência pelo ELISA indireto (96,9%) não diferiu significativamente do resultado pela IFI (97,2%); embora, diferissem do teste de conglutinação rápida (91,0%). A técnica de PCR foi utilizada por Brito, Luciana Gatto et al. (2010) a fim de avaliar a ocorrência de A. marginale na região sudeste da Amazônia. Foram encontrados 98,6% de animais positivos no Estado de Rondônia e 92,87% no Acre. Desta forma, a soropositividade de 89% na região de Macuco-RJ

35 34 acompanha os índices das diversas regiões do país com clima e rebanho semelhantes. Os resultados obtidos no presente estudo permitem afirmar, segundo a metodologia descrita por Mahoney e Ross (1972), que a região de Macuco é de estabilidade enzoótica para A. marginale. Desta forma, a maoiria dos bovinos pertencentes a esta região já foi exposta ao agente etiológico, indicando que os animais se infectam quando jovens e sofrem sucessivas reinfecções, mantendo o estado de portador e a imunidade. A resistência natural à anaplasmose perdura por pouco tempo; em torno do 12o ao 60º dia de vida do bezerro (Ribeiro & Reis 1981b, Madruga et al., 1985), quando os níveis de anticorpos colostrais garantem proteção. A anaplasmose é uma enfermidade freqüente em bezerros no Brasil, mesmo em áreas de estabilidade enzoótica (Fonseca & Braga 1924, Tokarnia & Döbereiner 1962, Ribeiro & Reis 1981b, Oliveira et al., 1992). A soroprevalência observada no presente trabalho indicou que os animais se infectam quando jovens e sofrem sucessivas reinfecções, mantendo o estado de portador e a imunidade (SOUZA et al., 2000). Caso bovinos oriundos de áreas livres ou de instabilidade enzoótica sejam introduzidos na bacia leiteira de Macuco, medidas profiláticas deverão ser tomadas de forma a se evitar a manifestação clínica da anaplasmose bovina, o que poderia gerar importantes perdas econômicas, incluindo óbitos Classificação dos animais positivos quanto à idade No presente estudo foram avaliados soros bovinos de animais de diferentes faxias etárias, que foram agrupados em duas categorias (Tabela 2). Em relação aos 83 animais com idade inferior a um ano, 73 (87,95%) apresentaram-se positivos no teste de IFI, enquanto 10 (12,05%) foram considerados negativos. Já nos 117 animais com idade superior a dois anos, foram encontrados 105 (89,7%) positivos e 12 (10,3%) negativos. Não houve diferença significativa (p > 0,05) entre os resultados encontrados, segundo a análise estatística. Tais resultados vão ao encontro daqueles obtidos em estudos anteriores nos quais foi avaliada a prevalência de A. marginale em relação ao sexo, como nas regiões de Araguaína-TO (TRINDADE et al., 2011); na mesorregião Norte

36 35 Fluminense (SOUZA et al., 2000) e no semi-árido do Estado da Bahia (BARROS et al., 2005). Tabela 2. Comparação das faixas etárias dos bovinos positivos em IFI no município de Macuco RJ. Idade Imunofluorescência Imunofluorescência Total de indireta positiva indireta negativa amostras colhidas < 1 ano 73 (87,95%) 10 (12,05%) 83 (41,5%) > 2 anos 105 (89,7%) 12 (10,3%) 117 (58,5%) Total final 178 (89%) 22 (11%) 200 (100%) Classificação dos animais positivos quanto ao sexo Em relação ao sexo dos duzentos bovinos avaliados na bacia leiteira de Macuco RJ, 151 (75,5%) eram fêmeas e 49 (24,5%) machos. O resultado da sorologia (Tabela 3) foi de 133 (88,07%) de fêmeas positivas e 45 (91,83%) de machos com presença de anticorpos anti- A. marginale. A análise estatística revelou não haver diferença significativa (p > 0,05). Tabela 3. Comparação do sexo dos bovinos positivos em IFI no município de Macuco RJ. Total de Sexo Imunofluorescência Imunofluorescência amostras indireta positiva indireta negativa colhidas Fêmea 133 (88,07%) 18 (11,93%) 151 (75,5%)

37 36 Macho 45 (91,83%) 04 (8,17%) 49 (24,5%) Total final 178 (89%) 22 (11%) 200 (100%) Os resultados obtidos concordaram com aqueles encontrados por Souza et al. (2001), que concluíram não haver diferença significativa na prevalência da anaplasmose em relação ao sexo dos animais. Trindade et al. (2011) em levantamento sorológico na região de Araguaína - TO, demonstraram haver diferença significativa na prevalência da anaplasmose quanto ao sexo, observando maior taxa em machos. No entanto, os autores não chegaram a uma conclusão sobre o que teria levado a esta diferença, uma vez que os animais eram mantidos na mesma pastagem Presença de animais positivos no município de Carambeí Dentre as 200 amostras avaliadas de bovinos pertencentes à região de Carambeí, 76 (38%) apresentaram resultados positivos para anticorpos da classe IgG para A. marginale, enquanto 124 amostras (62%) foram consideradas negativas, conforme demonstrado na Tabela 4. Tabela 4. Resultado da pesquisa de anticorpos da classe IgG para A. marginale em IFI de bovinos do município de Carambeí PR. Imunofluorescência Indireta Número de amostras Percentual Positiva 76 38% Negativa % Total %

38 37 Os resultados obtidos no presente estudo são semelhantes àqueles encontrados por Marana et al. (2006) que, analisando 223 soros bovinos provenientes da região Centro-Sul do Estado do Paraná e utilizando a técnica de celisa, identificaram uma taxa de prevalência de 58,74%. No entanto, estudos realizados no mesmo Estado evidenciaram taxas de prevalência superiores à encontrada no presente trabalho. Na região de Londrina, situada no Norte paranaense, Andrade et al. (2001) e Vidotto et al. (1998) obtiveram 92,94% e 87,5% de animais soropositivos pela técnica de celisa, respectivamente. Em Umuarama, região Noroeste, Yoshihara et al. (2003) identificaram 76,10% de prevalência para anaplasmose, também por meio de celisa. A técnica de imunofluorescência indireta foi empregada por Vidotto et al. (1995) a fim de avaliar a ocorrência de anaplasmose bovina na região Norte do Estado do Paraná. O resultado obtido, 67,38%, mostra-se bem superior àquele encontrado no presente trabalho. A taxa de animais soropositivos identificados neste estudo pode ser explicada pelo clima subtropical da região estudada, uma vez que não propicia condições para o desenvolvimento dos vetores, notadamente tabanídeos e carrapatos ixodídeos. Assim, obedecendo aos critérios descritos por Mahoney e Ross (1972), a região de Carambeí-PR pode ser classificada como sendo de instabilidade enzoótica, uma vez que 62% dos animais apresenta-se soronegativo e pode vir a contrair a anaplasmose. Outras áreas de instabilidade enzoótica no Brasil foram identificadas em estudos anteriores. Oliveira et al. (1992) identificaram prevalência média de 16,30% no sertão de Sergipe, região de clima árido e semi-árido. Artiles et al. (1995), em levantamento realizado na microrregião de Bagé, no Estado do Rio Grande do Sul, obtiveram resultado de 64% de prevalência. Ambos os estudos utilizaram o teste do cartão na análise epidemiológica.

39 38 5. CONCLUSÃO A análise dos dados obtidos permite concluir que Anaplasma marginale está presente nos municípios de Carambeí, Estado do Paraná e Macuco, Estado do Rio de Janeiro, porém com índices de soropositiviade distintos. O município paranaense encontra-se sob instabilidade enzoótica, devido ao fato de haver grande parte dos animais susceptíveis à infecção, enquanto a região fluminense é de estabilidade enzoótica, pois a absoluta maioria dos animais já foi exposta ao agente infeccioso.

40 39 As diferenças encontradas no percentual de animais soropositivos, notadamente maior no município de Macuco, têm relação direta com o clima típico de cada local, uma vez que no Estado do Rio de Janeiro o clima tropical úmido propicia condições para o desenvolvimento dos vetores da anaplasmose bovina durante todo o ano, fato que não ocorre no município de Carambeí, Estado do Paraná, caracterizado por clima sub-tropical, com inverno rigoroso e seco. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALLEMAN A.R. & BARBET A.F. Evaluation of Anaplasma marginale major surface protein 3 (MSP3) as a diagnostic test antigen. J. Clin. Microbiol. 34: ANDRADE, G. M. Estudo sobre a prevalência e infecção natural por Anaplasma marginale em bovino da raça holandesa na região de Londrina - Pr. Londrina, ANDRADE, G. M.; VIDOTTO, O.; VIDOTTO, M. C.; YOSHIHARA, E.; KANO, F. S.; AMARAL, C. H. S. Seroprevalence of Anaplasma marginale in dairy cattle and, studies on the dynamics of natural infection of Holstein calves in Southern Brazil. Semina: Ciênicas Agrárias, v.22, n.2, p , ARAÚJO, F. R.; LEAL, C. R. B.; BASTOS, P. A. S.;MADRUGA, C. R.; MARQUES, A. P. C. Comparação dos testes de Imunoadsorção Enzimática, Conglutinação Rápida

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