REGENERAÇÃO DE PLANTAS IN VITRO DE LIMÃO 'CRAVO' (Citrus limonia L. Osbeck), VIA ORGANOGÊNESE

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1 REGENERAÇÃO DE PLANTAS IN VITRO DE LIMÃO 'CRAVO' (Citrus limonia L. Osbeck), VIA ORGANOGÊNESE Fabíola Santana Rebouças* Elma dos Santos Souza** Rosely Pereira da Silva*** Maria Angélica Pereira de Carvalho Costa**** Weliton Antônio Bastos de Almeida***** RESUMO: A transformação genética vem sendo bastante integrada nos programas de melhoramento vegetal. Os Estados de São Paulo e Paraná já estão desenvolvendo trabalhos de transformação genética em citros. Entretanto, a Região Nordeste, que é a segunda produtora de citros no país, ainda não iniciou os trabalhos de transformação genética para os cultivares cítricos adaptados às suas condições de clima e solo. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer sistemas de regeneração de plantas in vitro de limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), como requisito para utilizá-los em trabalhos de transformação genética. Para tal, utilizaram-se segmentos de epicótilo cultivados em meio de cultura MT suplementado com 0,0;,0; 2,0; 3,0; 4,0; ou 5,0 mg.l de BAP. Além disso, foram estudadas as condições de cultivo em fotoperíodo de 6 horas e diretamente no escuro por 30 dias. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial, com cinco repetições constituídas de uma placa de Petri contendo vinte segmentos de epicótilo. As variáveis avaliadas foram: percentual de explantes responsivos, número de brotos por explante responsivo, percentual de enraizamento e percentual de pegamento na aclimatação das plantas. Os resultados permitiram concluir que o mais eficiente protocolo de regeneração de plantas de in vitro de limão 'Cravo' foi quando se utilizou a concentração de,0 mg.l de BAP em condições de foto período de 6 horas, na ausência de auxina na fase de enraizamento. PALAVRAS-CHAVE: Citrus; morfogênese in vitro; transformação genética; biotecnologia. *Acadêmica de graduação da Escola de Agronomia da UFBA. **Acadêmica de graduação da Escola de Agronomia da UFBA. ***Pós-Graduanda do Mestrado em Ciências Agrárias da Escola de Agronomia da UFBA. ****Professora da FAMAM Faculdade Maria Milza e do Depto. de Fitotecnia da Escola de Agronomia da UFBA. (*) autor para correspondência welliton@mariamilza.com.br *****Professor da FAMAM Faculdade Maria Milza e do Depto. de Fitotecnia da Escola de Agronomia da UFBA. (*) autor para correspondência welliton@mariamilza.com.br Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.

2 32 Rebouças et al. ABSTRACT: The genetic transformations come being to much integrated in the vegetal improvement programs. The state of São Paulo and Paraná is already developing works of genetic transformation in citrus. But, Northern region, that is the second citrus producer in country, don't start still the works of genetic transformation to the citrus cultivates adapted to its weather and ground conditions. Thus, the objective of that work was to establish, reformation systems of plants in vitro of 'Cravo' lemon (Citrus limonia L. Osbeck), as need to use them in works of genetic transformations. For so much, were used epicotilo's segments cultivated in mid of MT culture supplemented with 0,0;,0; 2,0; 3,0; 4,0; or 5,0 mg.l of BAP. Besides were studied the cultivate conditions in photoperiod of 6 hours and directly in the dark for 30 days. The experimental trace was completely chanced in factorial brief, with five repetitions formed of Petri tablet containing twenty epicotilo's segments. The valued variables were: percentile about answer explants, the taking root percentile and the joining in the acclimatizing of plants. Results allowed to conclude that the most efficient protocol of plants reformation (de) in vitro of 'Cravo' lemon it was when we used a concentration of.0 mg.l of BAP in photoperiod conditions of 6 hours, in the auxin absence in the taking root phase. KEYWORDS: Citrus; morphogenesis in vitro; genetic transformation; biotechnology. INTRODUÇÃO O Brasil é atualmente o maior produtor de citros, com 8,2 milhões de toneladas (FAO, 2004). A cultura encontra-se disseminada por todo território nacional, ocupando posição de destaque dentre as culturas agrícolas, devido ao valor de exportação como também pela sua importância social, gerando grande número de empregos. Em 998, a laranja foi o primeiro produto de exportação do estado de São Paulo e em 999, foi o segundo (FUNDECITRUS, 2002). Mesmo diante dessa importância da citricultura, ainda existe a necessidade de encontrar alternativas para solucionar alguns problemas inerentes à cultura, tais como uso predominante do limão 'Cravo' como porta-enxerto, obtenção de cultivares resistentes e/ou tolerantes a determinados patógenos, bem como a obtenção de cultivares de laranja precoces, visando à industrialização (ALMEIDA, 2002). Uma importante alternativa em busca da solução dos problemas citados é o melhoramento genético de citros. Neste sentido, a biotecnologia apresenta importantes instrumentos que podem auxiliar no processo de melhoramento genético das espécies cítricas. Segundo Ollitrault & Luro (995), a cultura de tecidos, a biologia molecular, a fusão de protoplastos e a transformação genética são importantes ferramentas de auxí- Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.

3 Regeneração de plantas... lio aos métodos convencionais de melhoramento genético. Dentre as técnicas biotecnológicas utilizadas no melhoramento de citros, a transformação genética se destaca, pois permite a obtenção de plantas contendo genes exógenos, a qual não é possível de se realizar através de qualquer outra técnica (PERANI et al., 990). Contudo, a obtenção de plantas transgênicas requer em sistema eficiente de regeneração de plantas in vitro e que assegure a transferência gênica (ALMEIDA, 2002). O objetivo deste trabalho foi estabelecer sistemas de regeneração de plantas in vitro, a partir de segmentos de epicótilo de limão 'Cravo'. Neste sentido, buscou-se definir as concentrações do regulador vegetal mais adequadas à regeneração in vitro, as condições de cultivo para maximizar a indução de gemas adventícias e estabelecer condições para favorecer a aclimatação das plantas regeneradas in vitro. 33 MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal e fontes de explantes: Sementes extraídas de frutos maduros de limão 'Cravo' tiveram seus tegumentos retirados e foram desinfestadas em solução comercial de hipoclorito de sódio e água na proporção (:) durante 20 minutos, seguidas de três lavagens em água destilada e esterelizada. Essas foram incubadas em frascos contendo 20 ml de meio de cultura MT (Murashinge & Tucker, 969), acrescido de 25 g.l de sacarose para favorecer a germinação e mantidas a 27 2 ºC, em ausência de luz por três semanas seguido de uma semana sob fotoperíodo de 6 h. Após este período, utilizou-se como explante segmentos de epicótilo com comprimento aproximado de,0 cm. Indução de gemas adventícias: O cultivo dos explantes foi realizado em placa de Petri, contendo 20 ml de meio de cultura MT, suplementado com 25 gl de sacarose e variando-se as con- centrações de BAP em: 0,0;,0; 2,0; 3,0; 4,0 ou 5,0 mgl. O material foi cultivado a 27 2 ºC, sob fotoperíodo de 6 horas ou durante 30 dias no escuro. Posteriormen- te, as brotações obtidas foram cultivadas em meio de alongamento, MT + 25 gl de sacarose + 0,8% de ágar +,0 mgl de ácido giberélico (GA ), durante trinta dias. Indução de enraizamento de brotos: Após o período de alongamento, brotos com altura de 2,5 a 3,0 cm foram transferidos para os seguintes meios de enraizamento: MT + 25 g.l de sacarose + 0,5 mg.l de carvão ativado +,0 mg.l de ANA; MT + 25 g.l de sacarose + 0,5 mg.l de carvão ativado +,0 mg.l de IBA e MT + 25 g.l de sacarose + 0,5 mg.l de carvão ativado na ausência de auxina. As brotações foram cultivadas nas mesmas condições anteriormente citadas, durante 60 dias. Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro,

4 34 Rebouças et al. Aclimatação das plantas in vitro: As plantas enraizadas foram transferidas para casa de vegetação sendo acondicionadas em copos plásticos descartáveis contendo terra vegetal autoclavada e cobertos com sacos plásticos transparentes para manter a umidade. Os sacos eram retirados periodicamente por h, 2h, 3h e assim sucessivamente, até a retirada completa dos sacos. As plantas foram irrigadas diariamente para assegurar o suprimento hídrico. Delineamento estatístico: O delineamento experimental para indução da organogênse in vitro foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial, com cinco repetições, sendo cada parcela constituída por 20 segmentos de epicótilo. Os parâmetros avaliados foram: percentual de explantes responsivos e o número de brotações por explantes. Para indução do enraizamento de brotos regenerados in vitro, utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro repetições, sendo cada repetição constituída por um frasco com quatro brotos. Avaliou-se o percentual de brotos que emitiram raízes. Para aclimatação, 50 plantas foram utilizadas e avaliou-se o pegamento das mesmas. RESULTADOS E DISCUSSÃO O efeito isolado das concentrações de BAP sobre o percentual de explantes responsivos e o número de brotos por explante responsivo está apresentado na Figura. Observou-se que a concentração,0 mg.l foi aquela que apresentou o maior percentual de explantes responsivos com 88,0%, sendo diferente significa- tivamente das concentrações 0,0; 4,0 e 5,0 mg.l de BAP (Figura a). Neste caso, a concentração ótima estimada é,9 mg.l de BAP. Explantes responsivos (%) a y = -3,9286x 2 + 5,629x + 67,857 R 2 = 0, ,0,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 Concentrações de BAP (mg.l ) Brotos por explantes responsivos (n ) b y = -0,5839x 2 + 2,696x + 3,2536 R 2 = 0, ,0,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 Concentrações de BAP (mg.l ) Figura. Resposta morfogenética in vitro em segmentos de epicótilo de limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), em função de concentrações de BAP. a) percentual de explantes responsivos; b) número de brotos por explantes responsivos. Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.

5 Regeneração de plantas... Os resultados mostraram que o adicionamento exógeno de citocinina foi fundamental para maximizar a resposta organogenética, sendo que a concentra- ção de 2,0 mg.l foi aquela que proporcionou a maior resposta para o número de brotos, com 7,0 brotos por explantes responsivos, não sendo diferente significati- vamente apenas da concentração de,0 mg.l de BAP. Ressalta-se que a con- centração ótima aqui estimada é de 2,2 mg.l de BAP. Analisando a combinação dos resultados entre o percentual de explantes responsivos x número de brotos por explantes, pode-se afirmar que a utilização de BAP entre,0 e 2,0 mg.l maximizou a organogênese in vitro em segmentos de epicótilo de limão 'Cravo'. Cons- tatou-se ainda que elevadas concentrações de BAP, tais como 4,0 e 5,0 mg.l, induziram efeito antagônico em relação à resposta organogenética in vitro (Figura b). Este fato também foi constatado em diversos trabalhos de organogênese de citros (MOURA et al., 200; ALMEIDA et al., 2002). Possivelmente, as elevadas concentrações de BAP causaram efeito fitotóxico interagindo com o nível endógeno de citocinina e dificultando a desdiferenciação e determinação celular, influenciando negativamente na formação de gemas adventícias. As condições de cultivo (fotoperíodo de 6h e escuro por 30 dias) exerceram efeito significativo no percentual de explantes responsivos, bem como no número de brotos por explante responsivo, sendo que o cultivo diretamente em condições de fotoperíodo de 6 horas mostrou-se mais favorável na indução da organogênese in vitro, conforme Figura % de explantes responsivos 00 a a 59,8b Fotoperíodo de 6h Escuro por 30 dias Condições de cultivo Número de brotos/explante b ,a 4,b Fotoperíodo de 6h Escuro por 30 dias Condições de cultivo Figura 2. Resposta morfogenética em segmentos de epicótilo de limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck) em função de condições de cultivo. a) percentual de explantes responsivos; b) número de brotos por explantes responsivos. O efeito combinado das concentrações de BAP com as condições de cultivo está apresentado na Tabela. Conforme se pode constatar, as concentrações de,0 e 2,0 mg.l de BAP foram aquelas de melhores respostas, independentemente das condições de cultivo. Entretanto, a análise desta combinação permite afirmar que é possível obter 624 brotos partindo de 00 explantes iniciais, quando se utiliza a concentração 2,0 mg.l de BAP e cultivando-se os explantes inicialmente por 30 dias no escuro (78% de explantes responsivos x 8,0 brotos/explante responsivos). Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.

6 36 Rebouças et al. Tabela. Explantes responsivos e brotos por explante responsivo de limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), em função de concentrações de BAP e condições de cultivo. Concentração de BAP (mg.l ) Cultivo em fotoperíodo de 6 h Explantes responsivos (%) Brotos/explante responsivo (n ) Cultivo no escuro por 30 dias Explantes responsivos (%) Brotos/explante responsivo (n ) 0,0 88,0ab A 2,6d A 36,0d B 2,4d A,0 93,0ab A 6,0a A 83,0a B 6,6b A 2,0 95,0a A 5,7a B 78,0ab A 8,0a A 3,0 86,0b A 4,3b B 70,0b B 6,0b A 4,0 62,0c A 3,4c A 5,0c B 3,4c A 5,0 68,0c A 3,cd B 4,0d B 3,9c A Médias seguidas da mesma letra minúscula na vertical e maiúscula na horizontal não diferem significativamente (Tukey 0,05). Recentemente, muitos trabalhos têm verificado efeitos significativos para a luminosidade nas respostas organogenéticas in vitro. Para Duran-Vila et al. (992) o cultivo de células e/ou tecidos in vitro no escuro, por um determinado tempo, tem favorecido à desdiferenciação celular e a conseqüente formação de órgãos ou embriões. Entretanto, em alguns trabalhos este fato não se tem confirmado, onde o cultivo na presença diretamente de luz tem proporcionado melhores respostas (MOREIRA-DIAS et al., 2000). No presente trabalho, embora a combi- nação de 2,0 mg.l com o cultivo por 30 dias no escuro tenha sido aquela de máxima resposta em relação ao número de brotos obtidos, verificou-se que, na presença da luz (fotoperíodo de 6 h), as brotações apresentaram-se mais vigorosas e com melhor desenvolvimento que aquelas cultivadas inicialmente por 30 dias no escuro. É possível que a ausência de luz tenha favorecido à desdiferenciação celular, porém deve ter dificultado o desenvolvimento posterior das brotações. A análise de variância, para o percentual de enraizamento dos brotos em função de concentrações de BAP combinadas com diferentes fontes de auxinas, demonstrou que não houve diferenças significativas entre as concentrações de BAP e fontes de auxinas, bem como na interação concentrações de BAP x fontes de auxinas. As auxinas têm sido reportadas como os reguladores vegetais que mais influenciam na formação de raízes in vitro (GHORBEL et al., 998). Neste trabalho, não foi constatado a influência das fontes de auxinas utilizadas na indução de raízes. O epicótilo é o eixo desenvolvido acima do cotilédone da semente, onde se sabe que em seu interior há síntese de auxina que promove o crescimento celular (GOH et al., 995). Assim, como foram utilizados segmentos de epicótilo, é possível que o nível endógeno de auxina dos explantes tenha sido suficiente para promover a formação das raízes. A aclimatação consiste na adaptação das plantas cultivas in vitro, sob condições controladas de umidade, temperatura e luminosidade, na transferência para as condições de campo (BORDÓN et al., 2000). Esta fase é fundamental para o êxito do cultivo in vitro, porque se trata em adaptar a planta para realizar o mecanismo de abertura e fechamento dos estômatos de forma eficiente. Neste tra- Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.

7 Regeneração de plantas... balho, verificou-se que o tratamento utilizado para aclimatação das plantas foi de alta eficiência, pois houve 00% de pegamento das plantas. 37 CONCLUSÕES Baseado nas condições em que foi realizado este trabalho, os resultados permitiram concluir que: a) A concentração de 2,0 mg.l de BAP proporcionou a máxima proliferação de brotos, independentemente das condições de cultivo. b) Os brotos regenerados em condições de luminosidade (fotoperíodo de 6 horas) mostraram-se mais vigorosos e com melhor desenvolvimento. c) O uso de auxina para indução de enraizamento não mostrou-se essencial. d) 00% das plantas de limão 'Cravo' regeneradas in vitro foram aclimatadas. e) Para regeneração de plantas in vitro de limão 'Cravo', via organogênese, recomenda-se a utilização de 2,0 mg.l de BAP na fase de multiplicação em condições de luminosidade (fotoperíodo de 6 horas) e ausência de auxina na fase de enraizamento. REFERÊNCIAS ALMEIDA W. A. de. Caracterização Anatômica da Organogênese In vitro e transformação Genética Via Agrobacterium tumefaciens em Citrus sp s. Tese (Doutorado em Agronomia, Fitotecnia). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz., Piracicaba: ALMEIDA, W. A. B. de; MOURÃO FILHO, F. A. A.; MENDES, B. M. J.; RODRIGUEZ, A. P. M. In vitro organogenesis optimization and plantlet regeneration in Citrus sinesis and C. limonia. Sciencia Agricola, v. 59. p , BORDÓN, Y.; GUARDIOLA, J. L.; GARCIA-LUIS, A. Genotype affects the morphogenic response in vitro of epicotyl segments of Citrus rootstocks. Annals of Botany, v. 86, p. 5966, DURAN-VILA, N.; GORGOCENA, Y.; ORTEGA, V.; ORTIZ, J.; NAVARRO, L.; Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.

8 38 Rebouças et al. Morphogenesis and tissue culture of sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osb.): effect of temperature and photosynthetic radiation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 29, p. 8, 992. FAO. FAOSTAT statistics database. Disponível em: < Acesso em: 25 março FUNDECITRUS. Disponível em < Acesso em: 3 junho GHORBEL, B. R.; NAVARRO, L.; DURAN-VILA, N. Morphogenesis and regeneration of whole plants of grapefruit (Citrus paradisi), sour orange (C. aurantium) and alemow (C. macrophylla). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. v 73, p , 998. GOH, C. J.; SIM, G. E.; MORALES, C. L.; LOH, C. S. Plantlet regeneration through different morphogenic pathways in pummelo tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 43, p , 995. MOURA, T. L. de; ALMEIDA, W. A. B. de; MENDES, B. M. J.; MOURÃO FILHO, F. A.A. Organogênese in vitro de Citrus em função de concentrações de BAP e seccionamento do explante. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 23, p , 200. MOREIRA-DIAS, J. M.; MOLINA, R. V.; BORDÓN, Y.; GUARDIOLA, J. L.; GARCIA-LUIS, A. Direct and indirect shoot organogenic pathways in epicotyl cuttings of Troyer citrange differ in hormone requirements and their response to light. Annals of Botany. v. 85, p.030, MURASHIGE, T.; TUCKER, D.P.H. Growth factor requeriment of citrus tissue culture. In: INTERNATIONAL CITRUS SYPOSIUM,., Riverside, 969. Proceedings. Riverside: University of California, 969. p.5569 OLLITRAUT, P.; LURO, F. Amélioration des agrumes et biotechnologie. Fruits, v. 50, p , 995. PERANI, L.; RADKE, S.; WILK-DOUGLAS, M. BOSSERT, M. Gene transfer methods for crop improvement: introduction of foreign DNA into plants. Physiologia Plantarum, v.68, p.2534, 990. Textura, Cruz das Almas-BA, v. 0, n.º, p. 338, janeiro, 2006.