hematológicos em camundongos (Mus musculus) do

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1 ARTIGO original Determinação de parâmetros bioquímicos e hematológicos em camundongos (Mus musculus) do biotério central da UFMS ISSN Elisangela Tieko Matida 1, Alessandro Eduardo Zancanaro 1, Tamy Ingrid Restel 1, Valeria Maria Wanderley Gomes 2, Telma Bazzano 1, Claudia Madalena Cabrera Mori 3 e Maria Araújo Teixeira 1 RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar os perfis bioquímicos e hematológicos de camundongos Swiss Webster do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Foram utilizados 18 animais de 180 dias de idade (10 machos e 8 fêmeas) e 16 de 60 dias (8 machos e 8 fêmeas), todos de padrão sanitário convencional monitorizado, dos quais se coletou sangue para a realização de provas bioquímicas e hematológicas. Os parâmetros hematológicos analisados foram: contagem de hemácias, hemoglobina, volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média, concentração de hemoglobina corpuscular média, contagem de plaquetas, contagem total de leucócitos e diferencial de células. Os parâmetros bioquímicos foram: proteína total, albumina, fosfatase alcalina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase. A maioria dos valores obtidos situou-se dentro da faixa de variação normal para a espécie. A importância de determinar valores de referência para exames laboratoriais de cada colônia animal deve ser considerada, pois os resultados podem ser influenciados por sexo, linhagem, genótipo, idade, dieta, manuseio e ambiente, entre outros fatores. Palavras-chave: Camundongos Swiss Webster, hematologia, bioquímica. 1. Biotério-UT/CCBS - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS 2. CCBS - Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal, Campo Grande, MS 3. Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, SP, Iniciação Cientifica UFMS CNPq Campo Grande, MS. Autor para Correspondência: Maria Araújo Teixeira Maria.teixeira@Ufms.br Data Recebimento: 08/10/2014 Aceito para a Publicação: 02/03/ introdução O aprimoramento das técnicas de investigação necessárias para responder perguntas cada vez mais complexas, levou ao conceito de padronização de animais de laboratório associada à criação e a manutenção de modelos animais controlados sob o ponto de vista genético, sanitário e ambiente, além de atender os aspectos éticos da experimentação animal. Tal colocação deve ser considerada, pois modernamente, entende-se o animal de laboratório como um reagente biológico. Sendo assim, de pouco adiantaria um excelente estado sanitário na vigência de condições que implicassem em outras alterações fisiológicas que impedissem a correta interpretação dos resultados. Dessa forma, torna-se relevante, dentre outros, os traçados dos perfis bioquímico e hematológico, uma vez que os valores de referência determinados para provas bioquímicas e constituintes do hemograma, como discutido na literatura, podem não representar precisamente aqueles de certa população ou espécie animal e, por esta razão, devem ser interpretados cuidadosamente 1,2, uma vez que existe uma ampla faixa de variação fisiológica para tais avaliações. Além deste fato, é importante considerar-se que essas determinações estão sujeitas à influência das condições ambien- 30 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg , 2015

2 Elisangela Tieko Matida, Alessandro Eduardo Zancanaro, Tamy Ingrid Restel, Valeria Maria Wanderley Gomes, Telma Bazzano, Claudia Madalena Cabrera Mori e Maria Araújo Teixeira tais 3, sexo 3, idade 3,4, local de coleta 4, procedência, sistema de criação, dieta e linhagem 3, entre outras, que podem intervir nos resultados 5,10 obtidos nestas provas. A importância de determinar os valores dos parâmetros fisiológicos dos animais e suas possíveis variações torna-se evidente quando se observa que camundongos têm, por exemplo, uma taxa muito alta de linfócitos 11,12 comparada aos valores em humanos 13. Vale ressaltar ainda que camundongos apresentam proteinúria em condições normais 12 e polimorfismo das proteínas séricas 14,15, desta forma, estudos realizados com esses animais precisam considerar tais condições. Assim sendo, o recomendado para a adequada interpretação dessas análises seria que, para cada biotério, fossem estabelecidos os próprios valores de referência de avaliações laboratoriais. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer os valores de referência de parâmetros bioquímicos e hematológicos de camundongos Swiss Webster do Biotério Central da Universidade Federal Mato Grosso do Sul. 2. materiais e métodos Animais: Para a realização do experimento foram utilizados 16 camundongos Swiss Webster, sendo 8 machos e 8 fêmeas jovens (60 dias de idade) e 18 adultos (180 dias de idade), 10 machos e 8 fêmeas de padrão sanitário convencional 16, com barreiras sanitárias de pouca segurança, provenientes do Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Aos animais foram fornecidos: fotoperiodos de 12 horas de claro e 12 horas de escuro; alojamento em gaiolas plásticas de acordo com recomendações internacionais de densidade populacional 17 ; ração comercial Nuvilab CR-1 (Nuvital Curitiba, PR); água ad libitum, cama de maravalha de Pinnus sp peneirada e as condições de climatização existente neste Biotério, ou seja, ar condicionado de parede e ventilação natural efetuada pelas janelas permanentemente abertas e teladas para impedir a entrada de insetos e animais indesejáveis. Os animais, após jejum de quatro horas, foram levados ao laboratório, pesados e anestesiados por via intraperitoneal com solução de pentobarbital sódico a 5%, na dose de 25mg/kg. Em seguida foi realizada punção cardíaca e coletado sangue para as dosagens bioquímicas e para os exames hematológicos. A alteração da técnica de coleta de sangue por punção da artéria aorta abdominal 10,18, para as dosagens bioquímicas e os exames hematológicos, pela técnica acima descrita, fez-se necessário devido à relação peso corpóreo/volume de sangue do camundongo 2, bem como, pela facilidade de coleta. Após este procedimento os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia. Para os exames bioquímicos foram coletados dos camundongos cerca de 0,5 ml de sangue, sem anticoagulante para obtenção do soro, e foram realizadas dosagens bioquímicas de proteínas totais, albumina sérica, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), utilizando kits LABTEST. A leitura espectrofotométrica foi realizada em sistema de fluxo contínuo em analisador de bioquímica semiautomático modelo MICRO- LAB 100, no laboratório de Análises Clínica da Empresa Matter Clínica e Diagnósticos. Para os exames hematológicos foram coletados 0,5ml de sangue com anticoagulante EDTA K3 onde foram realizadas: a contagem manual na câmara de Neubauer das hemácias, dos leucócitos e das plaquetas, a determinação do microhematócrito (Hct) pela centrifugação do sangue em tubos capilares de vidro a dosagem de hemoglobina (Hb) no espectrofotômetro e esfregaços sanguíneos, fixados e corados pelo método de Rosenfeld, para contagem diferencial de células. Os índices hematimétricos: o volume corpuscular médio (VCM), a hemoglobina corpuscular média (HCM), a concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram calculados. Tais procedimentos foram realizados no laboratório de controle sanitário do Biotério. Os procedimentos desse protocolo foram realizados sob licença número 21/2002 da Comissão de Ética para o Uso de Animais (CEUA/UFMS). RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg ,

3 Determinação de parâmetros bioquímicos e hematológicos em camundongos (Mus musculus) do biotério central da UFMS 3 resultados e discussão De acordo com a recomendação da International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) a amostra adequada para estabelecer o perfil de referrência para o Bioterio seria acima de 120 animais saudavéis de ambos os sexos, idade e linhagem. Os parâmetros determinados nesse trabalho são apenas uma caracterização preliminar dos camundongos Swiss Webster mantidos em colônia de padrão sanitário convencional no Biotério da UFMS, Os valores apresentados nas Tabelas 1, 2 e 3 referem-se respectivamente, aos elementos constituintes do hemograma, à contagem diferencial de células, e aos parâmetros bioquímicos de camundongos Swiss Webster machos e fêmeas de 60 e 180 dias de idade. Devido à relação peso corpóreo/volume de sangue de camundongo obteve-se quantidade de soro insuficiente para realização dos parâmetros bioquímicos em todas as amostras, desse modo alguns parâmetros estão representados por número muito pequeno. Uma comparação exata dos resultados obtidos no presente trabalho com os resultados de outros autores não é possível, devido à falta de referências precisas das linhagens, sexo, idade, entre outras, dos animais usados para obtenção dos dados descritos na literatura. Fernandez e cols 4 avaliando duas técnicas de coleta de sangue, plexo retro orbital e veia submandibular em camundongos C57BL/6J, observou diferenças significativas em oito dos 9 parâmetros bioquímicos analisados. Tabela 1 Valores (média ± desvio-padrão) hematológicos obtidos em camundongos machos e fêmeas de 60 e 180 dias do Biotério Central/UFMS mantidos em sistema de criação convencional. Diferencial hematológico Hemácias (x10 6 /mm 3 ) Hemoglobina (g/dl) Hematócrito (%) VCM (fl) HCM (pg) CHCM (g/dl) Plaquetas (x10 6 /mm 3 ) Camundongos Machos Fêmeas 60 dias 180dias 60 dias 180 dias 5,16±0,72 7,10±1,75 8,06±0,60 7,69±1,55 12,28±2,64 14,48±1,38 15,78±1,00 13,48±2,29 44±2,83 40,09±3,78 45,71±2,56 40,87±4,52 86,39±10,65 63,31±24,17 56,78±2,31 54,95±10,46 24,06±5,51 22,38±8,65 19,62±1,41 17,85±2,78 27,90±5,41 35,82±2,35 34,53±1,56 31,82±5,86 298,75±47,64 593,70±222,68 394,28±101,30 510,86±108,15 VCM - Volume Corpuscular Médio; HCM - Hemoglobina Corpuscular Média; CHCM - Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média. 32 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg , 2015

4 Elisangela Tieko Matida, Alessandro Eduardo Zancanaro, Tamy Ingrid Restel, Valeria Maria Wanderley Gomes, Telma Bazzano, Claudia Madalena Cabrera Mori e Maria Araújo Teixeira Tabela 2 Valores (média + desvio-padrão) da contagem diferencial de células obtidos por leitura de lâminas de camundongos machos e fêmeas de 60 e 180 dias do Biotério Central/UFMS mantidos em sistema de criação convencional. Diferencial de células Leucócitos (x 10 3 / mm 3 ) Linfócitos (%) Neutrófilos (%) Monócitos (%) LEosinófilos (%) Camundongos Machos Fêmeas 60 dias 180dias 60 dias 180 dias 2,74±0,92 2,28±1, ±0.81 2,99±3,30 77,37±5,07 74,14±6,72 78,43±3,73 76,50±6,41 19,12±4,52 18,71±5,59 16,71±4,88 19,33±5,61 1,75±1,03 2,43±1,62 3,43±2,07 2,5±1,05 0,87±0,64 4,71±3,04 1,43±0,78 1,66±1,03 Tabela 3 Valores (média ± desvio - padrão) das provas bioquímicas obtidas em camundongos machos e fêmeas de 60 e180 dias do Biotério Central/UFMS mantidos em sistema de criação convencional. Provas Bioquímicas Proteínas Totais (g/dl) Albumina Sérica (g/dl) ALT (U/l) AST (U/l) Fosfatase Alcalina (U/I) Uréia (mg/dl) Creatinina (mg/dl) Camundongos Machos Fêmeas 60 dias 180dias 60 dias 180 dias 5,00±0,17 4,13±0,27 5,67±0,46 4,17±0,15 2,62±0,27 2,38±0,11 2,60±0,04 2,53±0,14 33,50±4,09 23,09±5,03 31,17±5,57 38,37±18,01 87,75±37,28 88,73±35,97 79,00±17,35 128,75±69,94 n=4 282,37±103,68 271,40±91,16 231,33±133,90 321,00±120,62 n=5 85,00 52,44±22,46 43,00±7,07 39,90±12,66 n=1 n=5 n=5 0,38 0,42±0,07 0,52±0,22 n=1 ALT - Alanina aminotransferase; AST - Aspartato aminotransferase. RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg ,

5 Determinação de parâmetros bioquímicos e hematológicos em camundongos (Mus musculus) do biotério central da UFMS Como relatado na introdução, os parâmetros de referência determinados para os constituintes do hemograma e para as provas bioquímicas podem não representar precisamente aqueles de certa população ou espécie animal e, por esta razão devem ser interpretados cuidadosamente 1,2, uma vez que existe uma ampla faixa de variação fisiológica para tais avaliações. Embora tenham sido constatadas diferenças entre alguns autores, o confronto comparativo da maioria desses resultados com aqueles descritos na literatura indica que os parâmetros fisiológicos encontrados neste trabalho estão dentro da faixa de variação normal para a espécie 1,2,7,19. Os linfócitos foram às células predominantes na circulação periférica, cerca de 76% para todos os grupos, os quais também estão em concordância com a literatura 2,19. Na presente investigação o valor de volume corpuscular médio encontrado para machos de 60 e 180 dias, apresentou-se um pouco acima do descrito por Sanderson e Phiips 19. Menendez 20 relata que camundongos podem apresentar variações dos parâmetros fisiológicos, relacionados com sexo, linhagem, genótipo idade, dieta, manuseio, ambiente, entre outros fatores, apesar de apresentarem mecanismos próprios de controle dos mesmos. Yoshida e cols. 21 trabalhando com camundongos da linhagem Swiss Webster Webster com 60 dias encontrou valores maiores de leucócitos do que nos camundongos de 60 dias do presente trabalho. Estes resultados diferentes podem ser explicados uma vez que no trabalho de Yoshida e cols. 21, a coleta foi realizada em local diferente ou seja por punção retro-orbital e a dieta alimentar não foi especificada. Sendo assim, tais parâmetros dos animais experimentais podem variar de acordo com as condições a que estão submetidos nos diferentes locais de criação. 4 conclusões Os parâmetros determinados nesse trabalho são referencia de perfis bioquimicos e hematologicos de camundongos Swiss Webster Webster, machos e fêmeas de 60 e 180 dias de idade, mantidos em colônia de padrão sanitário convencional no Biotério da UFMS, que poderão ser úteis aos usuários que utilizam estes animais com os mais diversos objetivos experimentais. De acordo com os dados obtidos nesse estudo e os descritos na literatura, sugerimos que o recomendado para a adequada interpretação dessas análises seria que, para cada biotério, fossem estabelecidos os próprios valores de referência de avaliações laboratoriais, devido a ampla faixa de variação e dos parâmetros fisiológicos que podem ser alterados em função das condições em que os animais estão submetidos o que poderia inviabilizar resultados experimentais. Biochemical and hematological parameters in mice (Mus musculus) from the UFMS central laboratory animal facilities This study evaluated the biochemical and hematological profiles of Swiss Webster mice reared at the Central Laboratory Animal Facilities of the Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Blood samples were drawn from 18 animals (10 males, 8 34 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg , 2015

6 Elisangela Tieko Matida, Alessandro Eduardo Zancanaro, Tamy Ingrid Restel, Valeria Maria Wanderley Gomes, Telma Bazzano, Claudia Madalena Cabrera Mori e Maria Araújo Teixeira females) aged 180 days and 16 animals (8 males, 8 females) aged 60 days, all of them of monitored conventional sanitary status. The hematological variables investigated were RBC count, hemoglobin, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet count, and total and differential WBC counts. The biochemical variables were total protein, albumin, alkaline phosphatase, urea, creatinine, alanine aminotransferase, and aspartate aminotransferase. Most results lay within the normal range for the species. Biochemical and hematological reference values for each colony are important because the results of exams can influenced by sex, strain, genotype, age, diet, handling, and environment, among other factors. ABSTRACT Keywords: Swiss Webster mice, hematology, biochemistry. 1. Bihun C. Basic anatomy, physioology, husbandry, and clinical techniques. In: Hillyer EV, Quesenberry KE. Ferrets, rabbits, and rodents: clinical medicine and surgery. Philadelphia: W.B. Saunders Company; p Hrapkiewicz k, Medina L, Holmes DD. Clinical laboratory animal medicine an introduction. 2nd ed. Ames: Iowa State University Press; p. 3. Spinelli MO, Cruz RJ, Godoy CMS, Motta MC. Comparação dos parâmetros bioquímicos de camundongos criados em diferentes condições sanitárias. Scientia Plena [periódico na internet] Jan [acesso em 2014 Mai 9]; 8(1): Disponível em: plena.org.br 4. Fernández I, Peña A, Del Teso N, Pérez V, Rodrígues-Cuesta J. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. J. Am. Assoc. Anim. Sci. 2010; 49(2): Ringler DH, Dabich L. Hematology and clinical biochemistry. In: Baker HJ, Lindsey JR, Weisbroth SH. The laboratory rat. New York: Academic Press; p Birgel EH Jr., Benesi FJ, Birgel EH. Estudo das variações do quadro hemático de ratos (Rattus norvegicus). 41ª Conferência Anual da Sociedade Paulista de Medicina Veterinária; 5-9 mai. 1986; São Paulo, BR. São Paulo: Sociedade Paulista de Medicina Veterinária; Resumo. 7. Loeb WF. Clinical biochesmistry of laboratory rodents and rabbits. In: Kaneko JJ. Clinical biochemistry of domestic animals. 4th ed. London: Academic Press; p CCAC Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. 2nd ed. Ottawa; 1993; 1: Teixeira MA, Sinhorini IL, Souza NL, Merusse JLB. Microenvironmental ventilation system for laboratory animals facilities with air distribution by means of plennum chambers. Anim Technol. 1999; 50(3): Teixeira MA, Chaguri LCAA, Carissimi AS, Souza NL, Mori CMC, Gomes VMW, e cols. Hematological and biochemical profiles of rats (Rattus norvegicus) kept under microenvironmental ventilation system. Braz J Vet Res Anim Sci. 2000; 37(5). 11. Heinecke H. Das blutbild der maus (eine übersicht) in das normale qualitative blutbild. Z. Versuchstierk. 1961; 1: Thung PJ. Physiological proteinuria in mice. Acta Physiol. Pharmacol. Neer. 1962; 10: Schroeder SA, Tierney Junior LM, Mcphee SJ, Papadakis MA, Krupp MA, editors. Current medical diagnosis and treatment. 31st ed. Norwalk: Appleton & Lange; Cinader B, Dubinski S. An alphaglobulin allotype in the mouse. Nature. 1963; 200: Wunderlich JR, Herzenberg LA. A second gamma-globulin isoantigen (allotype). Genetics Mai; 47: Lushbough CH, Moline SW. Improved terminal bleeding method. In: Loeb WF, Quimby FW, editors. The clinical chemistry of laboratory animals. Oxford: Pergamon Press; p ILAR- Guide for the care and use of laboratory animals. Institute of laboratory animal resources. National Research Council; p. 18. ILAR NEWS. Long-term holding of laboratory rodents. 1976; 19(4): L Sanderson JH, Philips CE. An atlas of laboratory animal hematology. New York: Oxford University Press; p. 20. Menendez RC. Animales de laboratorio en las investigaciones biomedicas. La Habana : Editorial Ciencias medicas; p. 21. Yoshida HS, Spinelli MO, Guedes R, Cruz RJ, Damy SB, Takano JO e cols. Valores hematológicos e bioquímicos em linhagens de camundongos isogênicas. A/SNELL,BALB/c,C57BL/6 e heterogênica. R. Bras. Med. Vet. 2000; 22 (3): REFERêNCias RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg ,