ULTRASSOM COMBINADO À SANITIZANTES NA INATIVAÇÃO DE Salmonella enterica subsp. enterica ADERIDAS EM SUPERFÍCIE DE MORANGOS

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1 ULTRASSOM COMBINADO À SANITIZANTES NA INATIVAÇÃO DE Salmonella enterica subsp. enterica ADERIDAS EM SUPERFÍCIE DE MORANGOS D.K.A Rosário 1, Y.S. Mutz 1, J.M.C. Peixoto 2, R.V. Carvalho 1, J.F.B. São José 3, P.C. Bernardes 1 1- Departamento de Engenharia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias e Engenharias, Universidade Federal do Espírito Santo, , Alegre, Brasil - s: deneskaic@hotmail.com, yhan.mutz@hotmail.com, raquelvcarvalho@hotmail.com, paticbernardes@gmail.com 2- Departamento de Farmácia e Nutrição, Centro de Ciências Exatas, Naturais e da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo, , Alegre, Brasil jaquelinecurtis@hotmail.com 3 - Departamento de Educação Integrada em Saúde, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Espírito Santo, , Vitória, Brasil jackiefreitas02@yahoo.com.br RESUMO Métodos alternativos de sanitização vêm sendo estudados com objetivo de melhorar a segurança dos alimentos e substituir os compostos clorados. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a sanitização de morangos intencionalmente inoculados com Salmonella enterica subsp. enterica, utilizando ácido acético, ácido peracético e dodecilbenzeno sulfonato de sódio aplicados individualmente e em combinação com ultrassom. O ultrassom potencializou o efeito do ácido peracético na inativação do patógeno em estudo, e foi o melhor tratamento, obtendo redução de 2,1 log de UFC.g -1 e contagem não detectável na solução sanitizante após a sanitização. Com isso, a combinação do ácido peracético com ultrassom possui eficiente aplicação industrial, principalmente por evitar a contaminação cruzada pela solução sanitizante. ABSTRACT Alternative methods of sanitization have been study in order to improve food safety and replace the chlorine compounds. Therefore, the study aimed evaluate the sanitization of strawberries intentionally inoculated with Salmonella enterica subsp. enterica, using acetic acid, peracetic acid and sodium dodecylbenzene sulfonate individually and in combination with ultrasound. Ultrasound improved the effect of peracetic acid in inactivation of the pathogen in study, and it was the best treatment, obtained a reduction 2.1 log of cfu.g -1 and not detectable count in sanitizer solution after sanitization. Therefore, the combination of peracetic acid and ultrasound has efficient industrial application, mainly to prevent cross-contamination by sanitization solution. PALAVRAS-CHAVE: ácido peracético; ultrassom; sanitização; Salmonella enterica. KEYWORDS: peracetic acid; ultrasound; sanitization; Salmonella enterica. 1. INTRODUÇÃO A incidência de surtos de origem alimentar causada por consumo de frutas e hortaliças frescas tem aumentado nos últimos anos (CDC, 2013). Os patógenos mais envolvidos nos surtos são Listeria monocytogenes, Salmonella e Escherichia coli (CDC, 2015). Para melhorar a segurança dos alimentos in natura, a sanitização é considerada a etapa crítica na redução do número de microrganismos. Os compostos clorados são os mais utilizados na

2 indústria para este fim, entretanto alguns países têm proibido sua utilização devido à formação de subprodutos cancerígenos como os trihalometanos (Fava et al., 2011; Pérez-Gregorio et al., 2011). Atualmente, métodos de sanitização alternativos ao cloro tem recebido destaque. Dentre eles, o ultrassom vem sendo muito estudado, e seu efeito benéfico em alimentos tem sido comprovado (Kentish e Feng, 2014). Além disso, a combinação deste método com compostos químicos tem gerado resultados promissores na inativação de microrganismos patogênicos e deterioradores (Ferrario et al., 2015, Chen et al., 2011; São José et al., 2014a). A aplicação do ultrassom em frutas e hortaliças visa inativar microrganismos patogênicos e deterioradores, com baixo consumo de energia, a custo competitivo, respeito pelo ambiente e alto grau de segurança (Chemat et al., 2011; Ferrario et al., 2015). A inativação ocorre devido a geração de energia mecânica e química localizada ocasionada pela cavitação (Gogate e Kabadi, 2009). A cavitação gera microjatos que podem causar desagregação de microrganismos e lesões na membrana, além da liberação radicais livres que podem causar danos em seu DNA (Chemat et al., 2011; São José et al., 2014b). Tendo em vista os riscos à saúde pública ao consumir alimentos crus e a eficiência do ultrassom em inativar microrganismos, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do ácido acético, ácido peracético e dodecilbenzeno sulfonato de sódio aplicados individualmente e em combinação com ultrassom sobre Salmonella enterica subsp. enterica aderidas em superfície de morangos. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Obtenção das amostras As amostras de morango (Fragaria x ananassa Duch.) cultivar Oso Grande foram obtidas do município de Santa Maria de Jetibá / ES durante o período de junho a novembro de Os frutos foram transportados em caixas isotérmicas até o laboratório para análise. Os morangos foram selecionados antes das análises, descartando-se os danificados, retirados a sépala e o pedicelo e lavados em água potável. 2.2 Procedimentos de sanitização Os procedimentos aplicados foram: água esterilizada, ácido acético a 800 mg.l -1 (Toscano, São Paulo, Brasil), dodecilbenzeno sulfonato de sódio (DBSS) a 1200 mg.l -1 (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), ácido peracético a 40 mg.l -1 (Proxitane, Paraná, Brasil), ultrassom de banho (US) a 40 khz e 500 W (Modelo Soniclean 15, Sanders Medical, Brasil), e nas mesmas concentrações descritas, estes três compostos químicos separadamente aplicados em combinação com US de forma simultânea. Cada procedimento foi aplicado durante 5 minutos, em 200g de morango utilizando 500 ml de solução sanitizante à 7 ± 1 C. Foi realizado um tratamento controle lavado apenas com água potável (não sanitizado). 2.3 Preparo do inóculo A cultura de Salmonella enterica subsp. enterica foi proveniente do isolamento de hortaliças do comércio local. Foi feita sua ativação por duas repicagens consecutivas em caldo Brain Heart Infusion (BHI) (Himedia, Mumbai, Índia) e incubada à 35 C por 24 h até atingir a população entre 10 8 e 10 9 UFC.mL Inoculação dos morangos

3 Foram colocados 200 g do fruto em sacos de polietileno previamente esterilizados e em seguida foi adicionado o inóculo (10 ml) juntamente com 500 ml de água peptonada 0,1%, obtendose uma solução com aproximadamente 10 6 UFC.mL -1. Os morangos foram mantidos em contato com a suspensão por 60 min à 25 ± 1 C (São José, 2013). A suspensão foi drenada e os morangos foram colocados em sacos plásticos esterilizados e incubados à 25 C por 24 h para permitir maior adesão da bactéria ao morango (São José, 2013). 2.5 Quantificação de S. enterica A contagem foi realizada nos morangos sanitizados logo após a aplicação dos tratamentos pela técnica de espalhamento em superfície em ágar Hektoen Enteric (Himedia, Mumbai, Índia) com incubação por 18 a 24 h, a 37 ºC. O resultado foi expresso em UFC.g -1 (Downes e Ito, 2001). Também foi realizada a contagem nas soluções após a sanitização, para verificar se houve inativação ou remoção das células, utilizando a mesma técnica e meio de cultura descritos anteriormente. O resultado foi expresso em UFC.mL Análise estatística As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software Genes (Minas Gerais, Brasil). Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste de Duncan. Foram realizadas três repetições com duplicata. O nível de significância utilizado foi de 0, RESULTADOS E DISCUSSÃO A contagem inicial de células de S. enterica foi de 6,8 log de UFC.g -1, o que indica que esta bactéria possui capacidade de aderir na superfície de morangos. As reduções decimais da contagem deste patógeno estão representadas nas Figura 1. Após aplicação dos tratamentos de sanitização dos morangos a contagem de S. enterica foi reduzida entre 0,5 a 2,1 log de UFC.g -1 em relação à contagem nos morangos não sanitizados. O ultrassom melhorou significativamente o efeito do ácido peracético, obtendo redução de 2,1 log de UFC.g -1 e foi o tratamento mais eficiente na inativação do patógeno, enquanto o ácido peracético isolado reduziu 1,6 log UFC.g -1. Além disso, os tratamentos com ácido peracético promoveram a máxima inativação das células de S. enterica na solução sanitizante a após a sanitização (Tabela 1). São José e Vanetti (2012) sanitizaram por 10 minutos tomates cereja com células de Salmonella enterica Typhimurium aderidas intencionalmente e obtiveram o mesmo efeito de potencialização do ácido peracético pelo ultrassom (45 khz). A contínua e intensa pressão gerada durante o processo de cavitação auxilia na penetração da solução sanitizante através da membrana celular do microrganismo, potencializando o efeito da sanitização (Gogate e Kabadi, 2009). Figura 1 - Reduções decimais da contagem de Salmonella enterica subsp. enterica aderidas em superfície de morangos em relação ao tratamento controle (não sanitizado). Tratamentos seguidos pela mesma letra não diferem significativamente (p > 0,05) entre si. DBSS: dodecilbenzeno sulfonato de sódio, US: ultrassom.

4 O ácido acético e o DBSS combinados ao ultrassom obtiveram reduções de 0,8 e 1,3 log de UFC.g -1 respectivamente e não apresentaram diferença significativa (p > 0,05) quando comparados aos tratamentos isolados, 0,6 e 0,9 log de UFC.g -1, respectivamente. É possível afirmar que estes compostos químicos possuem baixa eficiência de inativação do patógeno em estudo, o que é comprovado pela sua presença em valores superiores a 5 log de UFC.mL -1 na solução sanitizante (Tabela 1). Além disso, o método de inoculação utilizado no presente trabalho proporcionou condições ideais para internalização e possivelmente formação de biofilme de S. enterica nos morangos. É compreendido que o biofilme é uma estrutura que proporciona proteção de células microbianas aos efeitos de santizantes (São José e Vanetti, 2012), assim como o próprio fruto pode proteger bactérias internalizadas (Bartz et al., 2015), o que justifica a não potencialização do ácido acético e DBSS na inativação de S. enterica aderidas na superfície de morangos. Tabela 1 - Valores médios e desvio-padrão da contagem de Salmonella enterica subsp. enterica nas soluções sanitizantes após a sanitização (5 minutos à 7 ± 1 C) Solução sanitizante Log de UFC.mL -1 * Água esterilizada 6,02 ± 0,26 a Ácido acético 5,51 ± 0,29 bc DBSS 5,87 ± 0,12 a Ácido peracético Nd US 5,40 ± 0,04 c US+Ácido acético 5,68 ± 0,17 ab US+DBSS 5,85 ± 0,05 ab US+Ácido peracético Nd

5 Nd = não detectado na menor diluição plaqueada (10-2 ), *Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si (p > 0,05), DBSS: dodecilbenzeno sulfonato de sódio, US: ultrassom. 4. CONCLUSÕES O ácido peracético é reconhecido como um sanitizante muito eficiente, e seu efeito pode ser aumentado quando combinado ao ultrassom, para a inativação de Salmonella enterica subsp. enterica aderidas em superfície de morangos, sendo uma alternativa aos compostos clorados. Além disso, a solução de sanitização é uma grande fonte de contaminação cruzada, que pode ser evitada com a utilização deste método combinado. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bartz, J. A., Yuke, H. G., Mahovicc, M. J., Warrend, B. R., Sreedharana, A., & Schneidera, K. R. (2015). Internalization of Salmonella enterica by tomato fruit. Food Control, 55, CDC, Centers for Disease Control and Prevention. (2013). Trends in Foodborne Illness in the United States Disponível em: CDC, Centers for Disease Control and Prevention. (2015). List of Selected Multistate Foodborne Outbreak Investigations. Disponível em: Chemat, F., Zill-E-Huma, & Muhammed, K. K. (2011). Applications of ultrasound in food technology: Processing, preservation and extraction. Ultrasonics Sonochemistry, 18 (4), Chen, Z., & Zhu, C. (2011). Combined effects of aqueous chlorine dioxide and ultrasonic treatments on postharvest storage quality of plum fruit (Prunus salicina L.). Postharvest Biology and Technology, 61 (2-3), Downes, F. P.; & Ito, K. (2001). Compendium of methods for microbiological examination of foods (4 ed.). Washington: American Public Health Association - APHA. Fava, J., Hodara, K., Nieto, A., Guerrero, S., Alzamora, S.M., & Castro, M. A. (2011). Structure (micro, ultra, nano), color and mechanical properties of Vitis labrusca L. (grape Berry) fruits treated by hydrogen peroxide, UV-C irradiation and ultrasound. Food Research International, 44 (9), Ferrario, M., Alzamora, S.M., & Guerrero, S. (2015). Study of the inactivation of spoilage microorganisms in apple juice by pulsed light and ultrasound. Food Microbiology, 46, Gogate, P.R., & Kabadi, A.M. (2009). A review of application of cavitation in biochemical engineering/biotechnology. Biochemical Engineering Journal, 44 (1), Kentish, S., & Feng, H. (2014). Applications of Power Ultrasound in Food Processing. Annual Review of Food Science and Technology, 5, Pérez-Gregorio, M. R., González-Barreiro, C., Rial-Otero, R., & Simal-Gándara, J. (2011). Comparison of sanitizing technologies on the quality appearance and antioxidant levels in onion slices. Food Control, 22 (12), São José, J. F. B. (2013). Caracterização físico-química e microbiológica de tomate cereja (Lycopersicum esculentum var. cerasiforme) minimamente processado submetido a diferentes tratamentos de sanitização (Tese de doutorado). Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. São José, J. F. B., & M. C. D Vanetti. (2012). Effect of ultrasound and commercial sanitizers in removing natural contaminants and Salmonella enterica Typhimurium on cherry tomatoes. Food Control, 24 (1-2), São José, J. F. B., Andrade, N. J., Ramos, A.M., Vanetti, M. C. D, Stringheta, P.C., & Chaves, J. B. P. (2014b). Decontamination by ultrasound application in fresh fruits and vegetables. Food Control, 35,

6 São José, J. F. B., Medeiros, H. S., Bernardes, P. C, & Andrade, N. J. (2014). Removal of Salmonella enterica Enteritidis and Escherichia coli from green peppers and melons by ultrasound and organic acids. International Journal of Food Microbiology, 190, 9 13.