UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Dinâmica das populações, estrutura genética e química cuticular de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Aline Borba dos Santos RIBEIRÃO PRETO -SP 2015

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Dinâmica das populações, estrutura genética e química cuticular de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Aline Borba dos Santos Autora Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento Orientador Tese apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia. RIBEIRÃO PRETO -SP 2015 ii

3 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Dinâmica das populações, estrutura genética e química cuticular de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Tese defendida por ALINE BORBA DOS SANTOS e aprovada em de de 2015 pela examinadora constituída pelos doutores: Prof (a). Dr(a).: Instituição: Parecer: Assinatura: Prof (a). Dr(a).: Instituição: Parecer: Assinatura: Prof (a). Dr(a).: Instituição: Parecer: Assinatura: Prof (a). Dr(a).: Instituição: Parecer: Assinatura: Prof (a). Dr(a).: Instituição: Parecer: Assinatura: iii

4 T minha querida avó, que me acompanhou desde sempre com tanto carinho me ensinando e incentivando a ser a cada dia uma pessoa melhor e que tanto vibrou pelas minhas vitórias, sei que onde estiver estará com aquele sorriso de sempre, que me trazia tanta paz, feliz por mais essa conquista... AAAA Wxw vé iv

5 Agradecimentos Agradeço a Deus por ter me proporcionado tantas experiências e conhecer tantas pessoas especiais... Ao Professor Fábio, meu orientador... mais que isso um amigo, por acreditar em mim, estando presente em todos os momentos sempre prestes a ajudar mesmo com tantos compromissos, me mostrando o caminho da ciência e que sempre é possível ir mais longe, pelas cobranças que me ajudaram a crescer e pelas não cobranças, que me fizeram querer crescer, obrigada pela confiança durante todos esses anos; Aos meus pais, Antônio e Eugênia, por cada preocupação, por cada ligação, por cada palavra, vocês que sempre me motivaram, entenderam as minhas faltas e momentos de afastamento e reclusão e me mostraram o quanto era importante estudar, obrigada pelo amor incondicional... não tenho palavras que consigam agradecer; À minha irmã por me apoiar em todos os momentos acreditando em mim mesmo quando eu não acreditava e aos meus primos e tios pelo carinho; À equipe do Laboratório de Entomologia da UFS e ao PPEC/UFS pelo apoio logístico e laboratorial durante a realização das coletas, A Profa. Dr. Yana pela colaboração sempre que necessário e ao Prof. Dr. Leandro pelas aulas de R, dicas da estatística e conselhos; Ao Prof. Dr. Tiago Francoy pela oportunidade de aprender sobre a morfometria geométrica e as análises moleculares; À SEMARH/SE e à Valdineide Santana pelo apoio logístico e aos gestores do MoNa Grota do Angico e da RVS Mata do Junco: Marcus Noronha, Maria Augusta e Thiago Roberto por serem tão atenciosos e prestativos; Ao Dr. Sidnei sempre disposto à colaborar me auxiliando em vários momentos; À Izabel Cristina e ao Dr. Túlio Nunes pelas contribuições quanto às análises químicas; Às estagiárias e futuras biólogas Jennifer, Mayane e Eduarda, que tanto contribuíram nas atividades de campo; aos companheiros de coleta, que tornaram as noites no alojamento divertidas e à todos que colaboraram durante as coletas, os mateiros Betinho, João, Marcelo, Wesley e Micael pelo auxílio no campo, Sr. Silvino (motorista) e aos vigilantes sempre atenciosos e dispostos a ajudar; Ao Léo e à Patrícia pelo auxílio na identificação das abelhas; À Francisca Segers, Christoph Grüter, Flavia Brasília pelas dicas e conselhos durante à preparação da proficiência; Aos amigos de Aracaju, em especial à Luiza, Bianca, Carina e Renata que estiveram sempre à disposição; v

6 Aos colegas pesquisadores visitantes do laboratório que possibilitaram uma nova experiência com a troca de conhecimento em diversas áreas. Aos colegas de laboratório em especial às minhas companheiras de sala pelos momentos de conversa e distração que tornaram os dias de trabalhos mais leves; Àqueles que sempre estiveram por perto não só nas horas de trabalho, mas em todos os momentos: Kátia, Ayrton e Glaúcya, obrigada apoio desde a minha chegada, me auxiliando sempre que precisei, e por tantos momentos que estivemos juntos, nossas conversas, risadas, festas, viagens... quantas aventuras, vocês estarão sempre comigo; Às queridas amigas e companheiras de apartamento e com as quais vivi tantos momentos importantes durante minha estadia em Ribeirão, sejam eles bons ou ruins vocês sempre estiveram por perto, especialmente à Ana por me receber logo que cheguei de Aracaju, pelos conselhos e por estar ao meu lado me ajudando tanto no momento mais complicado da minha vida em Ribeirão, à Bárbara e Adrielly, nem sei como descrever tantos momentos com vocês... os conselhos, as risadas até tarde da noite, as músicas, os jogos e não podia deixar de lembrar as dicas da Adrielly... com certeza levarei todas vocês pela vida. Aos colegas da organização do X Curso de Verão em Entomologia pela convivência e experiência; Às secretárias da Pós-Graduação Vera Lucca e Renata Cavallari pela eficiência e paciência para o bom andamento do curso; À Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto e ao Programa de Pós Graduação em Entomologia pela oportunidade concedida. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxílio financeiro concedido. Aos indivíduos de Euglossini pelo sacrifício involuntário indispensável à realização desse projeto; À todos que de alguma forma contribuíram para meu enriquecimento pessoal e profissional, agradeço pela ajuda, pelo apoio e pela força que dispuseram; Meu muito obrigada a todos!!! vi

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8 Resumo SANTOS, A.B. Dinâmica das populações, estrutura genética e química cuticular de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil f. Tese (Doutorado) Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. As abelhas Euglossini, comumente conhecidas como abelhas das orquídeas, são encontradas em florestas neotropicais e caracterizadas pela coloração metálica e língua longa, que em algumas espécies pode ser mais longa do que o corpo, e os machos apresentam a tíbia modificada para coleta de fragrâncias aromáticas. Essas abelhas são importantes polinizadores e indicadores ambientais. Apresentam voo rápido e o hábito varia de acordo com a espécie em solitário a primitivamente sociais e espécies parasitas. A tribo é composta por cinco gêneros: Euglossa Latreille, Eulaema Lepeletier, Eufriesea Cockerell, Exarete e Aglae Lepeletier & Serville. Esse trabalho teve o objetivo de estudar populações de Euglossini provenientes de diferentes biomas brasileiros a fim de analisar suas condições ecológicas, químicas e genéticas. Foram coletados com o uso de seis iscas aromáticas (acetato de benzila, β-ionone, cineol, eugenol, salicilato de metila e vanilina) 1770 machos de Euglossini pertencentes à dezessete espécies de quatro gêneros da tribo; estes apresentaram relação com as condições climáticas do ambiente em que foram coletadas, sendo a Mata Atlântica o bioma que apresentou maior riqueza e abundância de espécies. Dentre as iscas utilizadas o cineol foi o composto mais atrativo. Os hidrocarbonetos cuticulares permitiram a classificação dos indivíduos de acordo com as espécies pertencentes, isso porque houve uma variação quantitativa e qualitativa dos compostos entre organismos de diferentes táxons, sendo que a variação quantitativa se dá principalmente ao nível de gênero. Dentro de uma mesma espécie a composição cuticular não sofreu alterações significativas devido às condições ambientais. Os caracteres morfométricos mostraram pequenas variações entre os biomas, mas isso não interferiu na identificação dos organismos, foram utilizadas as espécies Eg. cordata e El nigrita tanto para esta como para a análise de marcadores do DNAmt que mostraram existir diferença significativa entre as áreas em estudo para as espécies estudadas. Palavras-chave: Euglossini, Caatinga, Mata Atlântica, hidrocarbonetos cuticulares, morfometria geométrica, mtdna. viii

9 Abstract SANTOS, AB Population dynamics, genetics structure and cuticular chemistry profiles of Euglossini in Caatinga and Atlantic Forest fragments of Sergipe, Brazil f. Thesis (Ph.D.) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. The Euglossini bees, commonly known as orchid bees, are found in neotropical areas and they are characterized by the brilliant iridescent color and long tongue, which in some species may be longer than the body. Males have the modified tibia to collect aromatic fragrances. These bees are important pollinators and environmental indicators of quality. They have fast flight and the habits vary according to the species: solitary to primitively social and parasitic behavior. The tribe consists of five genera: Euglossa Latreille, Eulaema Lepeletier, Eufriesea Cockerell, Exarete and Aglae Lepeletier & Serville. This work aimed to study Euglossini populations from different biomes in order to analyze their ecological, chemical and genetic conditions. We collected individuals by using six aromatic baits (benzyl acetate, β-ionone, cineole, eugenol, methyl salicylate and vanillin) Euglossini males belonging to seventeen species of four tribe s genera were collected; these bees showed distinct aspects according to the abiotic conditions in which they were collected, the Atlantic Forest biome had the highest species richness and abundance. Among the baits used, cineole was the most attractive aromatic compound. The cuticular hydrocarbons allowed the classification of individuals according to the species belonging, because there were a quantitative and a qualitative variation of the compounds between different taxa, and the quantitative variation is observed mainly among genera. Within the same species, the cuticular composition did not change significantly due to environmental conditions. The morphometric characters presented slight variations among biomes, but it did not interfere with the identification of organisms. We used Eg. cordata and El. nigrita for this morphometric and mtdna markers. The analyses showed that there were significant differences between the studied species across the biomes. Keywords: Euglossini, Caatinga, Atlantic Forest, hidrocardonetos cuticular, geometric morphometry, mtdna. ix

10 Lista de Figuras CAPÍTULO 1 Figura 1 Espécime macho de Euglossa ignita Smith; A - vista dorsal; B - vista da metatibia posterior apresentando a estrutura utilizada pelos machos para armazenamento das fragrâncias; C- vista lateral com destaque para a glossa que ultrapassa o tamanho do corpo. 3 Figura 2 Vista dorsal de Aglae caerulea Figura 3 Vista dorsal de Eufriesea atlantica Figura 5 Vista dorsal de Exaerete frontalis Figura 4 Vista dorsal de Euglossa ignita Figura 6 Vista dorsal de Eulaema cingulata Figura 7 Espécimes de Eulaema nigrita Lepeletier com destaque para a diferenciação na anatomia das pernas posteriores (esquerda macho; direita fêmea) Figura 8 Tíbia posterior de macho (A) e fêmea (B e C) de abelha das orquídeas do gênero Euglossa. O macho tem sua tíbia dilatada com uma pequena entrada para o compartimento esponjoso onde são armazenadas as fragrâncias coletas, já a fêmea apresenta uma estrutura em forma de cesta para armazenamento de pólen e resina coletados. Foto: Aaron Mullins, University of Florida, Ft. Lauderdale Research and Education Center Figura 9 Localização do bioma Caatinga no Brasil, onde pode ser visualizada a área desmatada e a vegetação remanescente Figura 10 Área de Caatinga no município de Canindé do São Francisco, Sergipe, Brasil, uma semana após o início do período de chuvas (A) e durante os meses secos (B) Figura 11 Bioma Mata Atlântica no Brasil, cobertura original (esquerda) e remanescente (direita). Quanto mais escuro o tom de verde mais conservada encontra-se a área Figura 12 Esquema utilizando Apis cerana Fabricius para representar o DNA mitocondrial de uma abelha. Com a posição aproximada de anelamento dos primers. Fonte: HONG-WEI, GUO-HUA, et al., CAPÍTULO 2 Figura 1 Algumas estruturas de ninhos encontradas para a tribo Euglossini. A ninho de Eulaema nigrita construído dentro de um tijolo onde as células foram construídas pelo uso de resina, barro e fezes; B ninho de Euglossa townsendi com células feitas a partir de resinas dentro de bambu; C ninho de Eufriesea sp. encontrado em ninho-armadilha feito em bambu com célula construídas em cortiça e folhas Figura 2 Localização do Monumento Natural Grota do Angico com pontos de coleta marcados em amarelo Figura 3 Localização do Refúgio da Vida Silvestre Mata do Junco com pontos de coleta marcados em amarelo Figura 4 Detalhe da isca aromática com macho de Eulaema cingulata visitando - A; Disposição das armadilhas utilizadas no campo - B Figura 5 Análise de similaridade entre os pontos de coleta da RVS Mata do Junco (A e B) e do MoNa Grota do Angico (C e D) Figura 6 Variação na abundância de indivíduos e sua relação de acordo com a flutuação da temperatura e umidade no bioma Caatinga entre Janeiro/2012 e Dezembro/ Figura 7 Variação na abundância de indivíduos e sua relação de acordo com a flutuação da temperatura e umidade no bioma Mata Atlântica entre Janeiro/2012 e Dezembro/ Figura 8 Correlação linear (Pearson) entre a abundância e os dados climáticos de umidade e temperatura Figura 9 Número de indivíduos (log) distribuídos de acordo com o mês de coleta, que ocorreu entre Janeiro/2012 e Dezembro/2013 no bioma Mata Atlântica (RVS Mata do Junco) x

11 Figura 10 Número de indivíduos (log) distribuídos de acordo com o mês de coleta, que ocorreu entre Janeiro/2012 e Dezembro/2013 no bioma Caatinga (MoNa Grota do Angico) Figura 11 Dendograma de dissimilaridade (índice Bray-Curtis, Método: UPGMA) entre os quatro pontos de coleta da Caatinga e Mata Atlântica com base na abundância total das espécies coletadas entre Janeiro/2010 e Dezembro/ Figura 12 Número de indivíduos atraídos por cada composto utilizado durante o período de janeiro de 2012 à dezembro de 2013, por ponto amostral Figura 13 Porcentagem de espécies distribuída de acordo com a preferência pelas iscas aromáticas nos biomas Caatinga e Mata Atlântica Figura 14 Diagrama de ordenação pelo método de escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) dos indivíduos coletados entre Janeiro/2012 e Dezembro/2013 de acordo com o ponto de coleta no bioma Figura 15 Abundância (média ± desvio) de machos de Euglossini por composto aromático utilizado para atração. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre as iscas detectadas pela análise de contraste (p<0,05) Figura 16 Abundância (média ± desvio padrão) de Euglossini por tipo de isca de acordo com o bioma em que foram coletados. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre as iscas detectadas pela análise de contraste (p<0,05) Figura 17 Variação sazonal na preferência de compostos aromáticos por machos de Euglossini na RVS Mata do junco entre Janeiro/2012 e Dezembro de / Figura 18 Número de indivíduos coletados em cada isca aromática durante o período de dez horas de coleta na RVJ Mata do Junco, Capela, Sergipe, entre janeiro de 2012 e dezembro Gráfico representando o período de coletas em blocos de hora Figura 19 Variação no número de indivíduos coletados na Caatinga ao longo do dia nos municípios de Canindé do São Francisco e Poço Redondo, Sergipe Figura 20 Área do MoNa Grota do Angico onde foi delimitado um dos pontos de coleta durante o período de chuvas (A) e o período de estiagem (B) CAPÍTULO 3 Figura 1 Macho de El. nigrita se aproximando de uma isca aromática protegida Figura 2 Localização da Reserva de Vida Silvestre Mata do Junco no estado de Sergipe, onde foram realizadas as coletas dos machos de Euglossini Figura 3 Reação de derivatização com dimetil-disulfido. Inserção dos radicais SCH3 na posição da insaturação. No exemplo, derivatização do alceno 7-tricoseno. Fonte: Nunes, Figura 4 Proporção percentual dos grupos de hidrocarbonetos entre as diferentes espécies de Euglossini Figura 5 Projeção em espaço bidimensional da Escala Multidimensdional (MDS) dos dados de hidrocarbonetos cuticulares presentes nas cutículas de 17 espécies de machos de Euglossini, coletados entre os meses de janeiro/2012 e dezembro/2013 em Sergipe, Brasil Figura 6 Diagrama de Análise de Coordenadas Principais (PCO) sobre os diferentes gêneros de machos de Euglossini, coletados entre janeiro de 2012 e dezembro de 2013 em Sergipe, separadas por biomas em relação aos hidrocarbonetos cuticulares. sp1 - Ef. atlantica; sp2 - Ef. surinamensis; sp3 - Ex. smaragdina; sp4 - Ex. frontalis; sp5 - El. niveofasciata; sp6 - El. nigrita; sp7 - El. cingulata; sp8 - El. atleticana; sp9 - Eg. towsendi; sp10 - Eg. securigera; sp11 - Eg. pleosticta; sp12 - Eg. nanomelanotricha; sp13 - Eg. liopoda; sp14 - Eg. ignita; sp15 - Eg. hemichlora; sp16 - Eg. fimbriata; sp17 - Eg. cordata Figura 7 Proporção (%) de CHCs nos machos de Euglossini agrupados de acordo com relações dissimilaridade entre os mesmos. A escala de cores indica quanto um composto contribuiu em média no total da área de pico para as dadas espécies Figura 8 Hipóteses propostas por diversos autores sobre as relações filogenéticas entre os gêneros da tribo Euglossini xi

12 CAPÍTULO 4 Figura 1 Representação gráfica e micrografia de um macho da espécie Euglossa cordata com destaque para a tíbia média onde estão localizados os coxins utilizados para identificação. Em vermelho destaque para o coxim anterior (A) e posterior (B). Adaptado de Bembé, Figura 2 Macho de Euglossa cordata coletado durante o estudo. A Vista Lateral; B - Vista frontal da cabeça Figura 3 Localização das áreas de proteção escolhidas cara coleta dos indivíduos de Eg. cordata nos municípios de Sergipe, Brasil durante o período seco e chuvoso. Fonte: Vieira, Oliveira, et al., Figura 4 Reação de derivatização com dimetil-disulfido. Inserção dos radicais SCH3 na posição da insaturação. No exemplo, derivatização do alceno 7-tricoseno. Fonte: Nunes, Figura 5 Projeção em espaço bidimensional do escalonamento multidimensional (MDS) dos dados de hidrocarbonetos cuticulares de Eg. cordata, utilizando: A - Todos os compostos, B - Apenas os hidrocarbonetos cuticulares, C Compostos alifáticos. CA Caatinga e MA Mata Atlântica Figura 6 Representação dos scores dos dois primeiros componentes (PCA-1 e PCA-2) para os indivíduos de Eg. cordata coletados nos bioma Mata Atlântica (representado na cor preta) e Catinga (representado na cor verde) Figura 7 Cromatogramas dos extratos cuticulares de Eg. cordata representando parte do tempo de retenção dos compostos. A - Caatinga; B Mata Atlântica. Compostos numerados: 1: tricosano; 2: Eicosenol acetato; 3: tetracosano; 4: Eicosyl acetato; 5: pentacosano; 6: acetato; 7: 3-hexacoseno; 8: (Z)-hexacoseno; 9: acetato; 10: 7,9-heptacoseno; 11: 5-heptacoseno; 12: Heptacosano; 13: (Z,Z)-Octacosadieno; 14: Octacosano; 15: Eicoseniol acetato; 16: 7,9- nonacoseno; 17: 5,9-nonacoseno; 18: Nonacosano; 19: 9-hentriaconteno; 20: 7- hentriaconteno CAPÍTULO 5 Figura 1 Localização geográfica mostrando a distância entre os pontos de coletas dos indivíduos utilizados nas análises Figura 2: Ciclos de reação para gene mitocondrial amplificação dos COI Figura 3 Lâminas semi-permanentes montadas com as asas retiradasdos machos de El. nigrita (A) e Eg. cordata (B) Figura 4 Vista da asa direita anterior de Euglossa cordata (A) e Eulaema nigrita (B) com a posição dos 15 marcos anatômicos, os pontos em vermelho representam o posicionamento dos marcos nas junções das nervuras Figura 5 Representação gráfica da padronização de tamanho das asas e alinhamento dos marcos anatômicos para realização da análise de morfometria geométrica. Fonte: (Grassi, 2009). 165 Figura 6 Gel de agarose 1% corado com brometo de etila e visualizado em luz UV mostrando os fragmentos de COI. a seta indica a direção de migração no gel Figura 7 Alinhamento entre sequências nucleotídicas de Euglossa cordata obtidas por meio do sequenciamento (Query) e do banco de dados NCBI (Sbjct), onde foi obtido 97% de alinhamento Figura 8 Rede de haplótipos para o gene COI da espécie Euglossa cordata. O tamanho das esferas representa o número de indivíduos e os pontos entre estas representam os sítios polimórficos Figura 9 Relações evolutivas de táxons usando o método de Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas, foram calculados usando o método Kimura Figura 10 Alinhamento entre sequências nucleotídicas de Eulaema nigrita obtidas por meio do sequenciamento (Query) e do banco de dados NCBI (Sbjct), onde foi obtido 100% de alinhamento xii

13 Figura 11 Rede de haplótipos para o gene COI da espécie Eulaema nigrita. O tamanho das esferas representa o número de indivíduos e os pontos entre estas representam os sítios polimórficos Figura 12 Relações evolutivas de táxons usando o método de Neighbor-Joining [1]. A árvore ideal com a soma do comprimento dos ramos = é apresentada. As distâncias evolutivas, foram calculados usando o método Kimura Figura 13 Disposição relativa das populações de Eg. cordata e El. nigrita, separadas por biomas nos quais foram coletadas, obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos Figura 14 Dendrograma de proximidade morfológica entre as populações de Eg. cordata e El. nigrita. A história evolutiva foi inferida usando o método Neighbor-Joining Figura 15 Resíduos de Procrustes dos 11 marcos anatômicos marcados nas junções das nervuras das asas dos machos de Eg. cordata. Pontos pretos representam os resíduos de Procrustes e pontos azuis apresentam a média obtida Figura 16 Representação gráfica da porcentagem da variância obtida para as vinte e seis deformações relativas dos Componentes Principais Figura 17 Análise dos Componentes de Principais das populações de Eg. cordata provenientes de três áreas distintas do Brasil: Caatinga (noroeste de Sergipe), Cerrado (norte de São Paulo) e Mata Atlântica (leste de Sergipe) Figura 18 Disposição relativa das populações de Eg. cordata em estudo obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos Figura 19 Discriminação par a par dos grupos estudados pela Análise de Função discriminante e pela validação cruzada entre as populações de Eg. cordata em cada bioma Figura 20 Resíduos de Procrustes dos onze marcos anatômicos marcados nas junções das nervuras das asas dos machos de El. nigrita. Pontos pretos representam os resíduos de Procrustes e pontos azuis apresentam a média obtida Figura 21 Variância obtida para as vinte e seis deformações relativas dos Componentes Principais de El. nigrita com suas respectivas porcentagens Figura 22 Disposição relativa das populações de El. nigrita em estudo obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos marcado nas junções das nervuras das asas Figura 23 Disposição relativa das populações de El. nigrita dos biomas Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica em estudo obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos Figura 24 Discriminação par a par dos grupos estudados pela Análise de Função discriminante e pela validação cruzada entre as populações de El. nigrita em cada bioma xiii

14 Lista de Tabelas CAPÍTULO 2 Tabela 1 Composição, abundância total e por localidade de coleta, riqueza, diversidade, uniformidade e dominância das espécies de Euglossini amostradas entre os meses de janeiro de 2012 e dezembro de 2013, no RVS Mata do Junco, Capela, e no MoNa Grota do Angico, Poço Redondo, Sergipe, Brasil Tabela 2. Frequência, dominância e categoria dos machos de Euglossini coletados na RVS Mata do Junco (Ponto A PA e Ponto B - PB) e no MoNa Grota do Angico (Ponto A PA e Ponto B - PB) coletados entre janeiro de 2012 e dezembro de Tabela 3 Valores de R e p da ANOSIM (Parâmetro: Iscas) entre os pontos de coletas da Caatinga e Mata Atlântica CAPÍTULO 3 Tabela 1 contribuição relativa (percentual) da composição do perfil cuticular de hidrocarbonetos alifáticos de machos de Euglossini Tabela 2 Resultados da análise de similaridade (ANOSIM, 999 permutações) dos hidrocarbonetos cuticulares dos machos de euglossini Tabela 3 Análise de SIMPER mostrando a contribuição dos principais hidrocarbonetos cuticulares para a dissimilaridade entre os gêneros dos machos de Euglossini identificados no estudo, coletados entre janeiro/2012 e dezembro/2013 em Sergipe, Brasil Tabela 4 Distância de centroides (média das variáveis) entre os gêneros dos machos de Euglossini coletados entre janeiro/2012 e dezembro/2013, em Sergipe, Brasil CAPÍTULO 4 Tabela 1 Composição cuticular percentual (média ± desvio padrão) de machos de Euglossa cordata coletados nos biomas Caatinga e Mata Atlântica Tabela 2 Distância de centróides (média das variáveis) entre os machos de Euglossa cordata coletados em áreas de Caatinga e Mata Atlântica, Sergipe, Brasil. S: Período seco; C: Período chuvoso CAPÍTULO 5 Tabela 1 Distância em linha reta entre as áreas de coleta Tabela 2 Haplótipos encontrados nas sequências analisadas da região COI de Euglossa cordata com polimorfismo de bases nitrogenadas em trinta e três sítios dos 612pb recuperados. Números nas colunas representam a posição em pb dos sítios polimórficos dentro do fragmento; H: haplótipos Tabela 3 Frequência da distribuição dos haplótipos nas populações de Euglossa cordata amostradas Tabela 4 Diversidade genética das populações de Eulaema nigrita para os haplótipos do gene mitocondrial COI. Número de sequencias analisadas N; Número de sítios polimórficos S; Número de haplótipos h; Diversidade haplotípica Hd; diversidade nucleotídica π; número médio de diferenças k Tabela 5 Na cor preta, valores de Fst par-a-par para 395pb da região COI de amostras de Eulaema nigrita dos três biomas em estudo. Na cor vermelho, valores da significância de cada Fst calculado (P). Em vermelho, Fst de valor significativo (p 0,05). Número de permutações: Tabela 6 Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada nas sequencias nucleotídicas de COI em Euglossa cordata xiv

15 Tabela 7 Haplótipos encontrados nas sequências analisadas da região COI de Eulaema nigrta com polimorfismo de bases nitrogenadas em vinte e nove sítios dos 395pb recuperados. Números nas colunas representam a posição em pb dos sítios polimórficos dentro do fragmento; H: haplótipo Tabela 8 Frequência relativa da distribuição dos haplótipos nas populações de Eulaema nigrita amostradas Tabela 9 Diversidade genética das populações de Eulaema nigrita para os haplótipos do gene mitocondrial COI. Número de sequencias analisadas N; Número de sítios polimórficos S; Número de haplótipos h; Diversidade haplotípica Hd; diversidade nucleotídica π; número médio de diferenças k Tabela 10 Abaixo da diagonal, valores de Fst par-a-par para 395pb da região COI de amostras de Eulaema nigrita dos três biomas em estudo. Acima da diagonal, valores da significância de cada Fst calculado (P). Em vermelho, Fst de valor significativo (p 0,05). Número de permutações: Tabela 11 Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada nas sequencias nucleotídicas de COI em Eulaema nigrita Tabela 12 Distâncias quadradas de Mahalanobis e distâncias de Procrustes com suas respectivas probabilidades, entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas Tabela 13 Variação dos dois eixos de Variáveis Canônicas Tabela 14 Distâncias quadradas de Mahalanobis e distâncias de Procrustes com suas respectivas probabilidades, entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas Tabela 15 Distância em linha reta entre as localidades (km) Tabela 16 ANOVA de Procrustes para o tamanho das asas entre os grupos analisados Tabela 17 ANOVA de Procrustes para a forma das asas entre os grupos analisados Tabela 18 Variação dos eixos de Variáveis Canônicas para machos de El. nigrita Tabela 19 Distâncias quadradas de Mahalanobis e distâncias de Procrustes com suas respectivas probabilidades, entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas dos machos de El. nigrita Tabela 20 Distância em linha reta entre as localidades (km) Tabela 21 ANOVA de Procrustes para o tamanho das asas entre os grupos analisados Tabela 22 ANOVA de Procrustes para a forma das asas entre os grupos analisados xv

16 Sumário CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO GERAL 1 BIOLOGIA DAS ABELHAS EUGLOSSINI 2 BIOMA CAATINGA 10 BIOMA MATA ATLÂNTICA 13 PERFIL QUÍMICO CUTICULAR DE INSETOS 15 CONSERVAÇÃO E GENÉTICA DE POPULAÇÕES 17 MORFOMETRIA GEOMÉTRICA 20 JUSTIFICATIVA E QUESTÕES NORTEADORAS 21 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 23 CAPÍTULO 2 ESTRUTURA E DINÂMICA DAS POPULAÇÕES DE EUGLOSSINI SOB A INFLUÊNCIA DA HETEROGENEIDADE AMBIENTAL E ISCAS AROMÁTICAS EM FRAGMENTOS DE CAATINGA E MATA ATLÂNTICA DE SERGIPE, BRASIL. 43 INTRODUÇÃO 45 OBJETIVOS 48 MATERIAIS E MÉTODOS 49 RESULTADOS 56 DISCUSSÃO 70 CONSIDERAÇÕES FINAIS 77 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 78 CAPÍTULO 3 HIDROCARBONETOS CUTICULARES DOS MACHOS DE EUGLOSSINI (HYMENOPTERA: APIDAE): VARIAÇÃO INTERESPECÍFICA E QUIMIOTAXONOMIA 92 INTRODUÇÃO 94 OBJETIVOS 95 MATERIAIS E MÉTODOS 96 RESULTADOS 100 DISCUSSÃO 111 CONSIDERAÇÕES FINAIS 116 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 116 CAPÍTULO 4 PERFIL CUTICULAR DE EUGLOSSA CORDATA L. (HYMENOPTERA: APIDAE: EUGLOSSINI) E SUA VARIAÇÃO NOS BIOMAS CAATINGA E MATA ATLÂNTICA 127 INTRODUÇÃO 129 OBJETIVOS 132 MATERIAIS E MÉTODOS 132 RESULTADOS 137 DISCUSSÃO 142 CONSIDERAÇÕES FINAIS 144 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 144 xvi

17 CAPÍTULO 5 ANÁLISE POPULACIONAL DE DUAS ESPÉCIES DE EUGLOSSINI POR MEIO DO DNA MITOCONDRIAL E MORFOMETRIA GEOMÉTRICA DE ASAS. 153 INTRODUÇÃO 155 OBJETIVOS 158 MATERIAIS E MÉTODOS 158 RESULTADOS 167 DISCUSSÃO 196 CONSIDERAÇÕES FINAIS 201 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 201 xvii

18 Capítulo 1 Introdução geral Vapítulo 1

19 Capítulo 1 Introdução geral Biologia das abelhas Euglossini As abelhas da tribo Euglossini, também conhecidas como abelhas das orquídeas, são endêmicas das regiões neotropicais, ocorrendo entre o norte do México e o norte da Argentina (DRESSLER, 1982; ROUBIK, 1989; BÚRQUEZ, 1997; MICHENER, 2000; NEMÉSIO, 2009; ZIMMERMANN, 2010) e na Flórida (EUA) com o estabelecimento da espécie Euglossa viridissima Friese (SKOV e WILLEY, 2005). Ao norte os limites são as regiões de Browsville, Texas e Silverbell, Arizona (MINCKLEY e REYES, 1996). E ao sul Córdoba, Argentina (MOURE, 1967) e nos remanescentes de florestas do estado do Rio Grande do Sul (WITTMANN, RADTKE, et al., 1988). No Brasil, os Euglossini já foram registrados para todas as regiões do país abrangendo a maioria de seus biomas como, por exemplo, na região norte nos estados do Acre (NEMÉSIO e MORATO, 2006; STORCK-TONON, MORATO e OLIVEIRA, 2009), Amazonas (OLIVEIRA e CAMPOS, 1995; DIAS, 2007), Roraima (NEMÉSIO, 2005), Tocantins (SANTOS, CARVALHO e SILVA, 2004), Amapá (MELO, 2006) e Pará (MOURA e MAUÉS, 2010), na região Centro-Oeste no estado do Mato Grosso (ANJOS-SILVA, 2006), na região Sudeste a exemplo de estudos realizados em Minas Gerais (NEMÉSIO e SILVEIRA, 2006; ALVARENGA, FREITAS e AUGUSTO, 2007), São Paulo (REBÊLO e GARÓFALO, 1997), Rio de Janeiro (TONHASCA JR, BLACKMER e ALBUQUERQUE, 2002; RAMALHO, GAGLIONE e OLIVEIRA, 2009), e no Sul do Brasil nos estados do Paraná (SANTOS e SOFIA, 2002; SOFIA e SUZUKI, 2004) e Santa Catarina (NEMÉSIO, 2006). Para o Nordeste foram registradas espécies no Maranhão (REBÊLO e CABRAL, 1997; CARVALHO, REGO e MENDES, 2006; SILVA, REGO, et al., 2009), Bahia (NEVES e VIANA, 1999; VIANA, KLEINERT e NEVES, 2002), Paraíba (BEZERRA e MARTINS, 2001; FARIAS, SILVA, et al., 2008), Ceará (DUCKE, 1907; 1908; 1910; 1911; GUIMARÃES, 2011), Alagoas e Sergipe (MOURA e SCHLINDWEIN, 2009). Além dos fatores como clima, vegetação e competição entre similares (ROSENZWEIG, 1995), as abelhas dependem de alguns recursos para a sua distribuição, como local para nidificação, fontes de resina, pólen, néctar e óleos, bem como a presença de hospedeiros para aquelas que são cleptoparasitas, podendo também ser afetadas por fatores históricos (WCISLO e CANE, 1996; ROUBIK e HANSON, 2004). Esse grupo de abelhas caracteriza-se por apresentar corpo robusto com tamanho variando de médio à grande, revestido por tegumento metálico brilhante, glossa 2

20 Capítulo 1 Introdução geral extremamente longa que em algumas espécies pode ser maior que o corpo e machos com tíbia modificada para coleta de substâncias aromáticas (Figura 1) (DRESSLER, 1982). Essa adaptação na tíbia dos machos proporcionou uma estreita relação entre estes e as flores de certas orquídeas (REBÊLO, 2001). A B C Figura 1 Espécime macho de Euglossa ignita Smith; A - vista dorsal; B - vista da metatibia posterior apresentando a estrutura utilizada pelos machos para armazenamento das fragrâncias; C- vista lateral com destaque para a glossa que ultrapassa o tamanho do corpo. 3

21 Capítulo 1 Introdução geral Quanto à classificação taxonômica existem discussões a respeito (MICHENER, 1974; ROIG-ALSINA e MICHENER, 1993; SCHULTZ, ENGEL e PRENTICE, 1999; MICHENER, 2000; CAMERON e MARDULYN, 2001; CAMERON, 2004). No presente estudo será adotada a classificação de Michener (2000) onde de acordo com o novo conceito da família Apidae, este grupo de abelhas é considerado a tribo Euglossini. A tribo é composta por aproximadamente 208 espécies distribuídas em cinco gêneros: Euglossa espécies, Eulaema - 26 espécies, Eufriessea - 61 espécies, Exarete- 7 espécies e Aglae - 1 espécie; destas 117 são encontradas no Brasil, tornando o país um dos maiores detentores da riqueza de Euglossini (ANJOS-SILVA e REBÊLO, 2006; OLIVEIRA, 2006; PARRA-H, OSPINA-TORRES e RAMÍREZ, 2006; FREITAS, 2009). Aglae Lepeletier & Serville, 1825 (Figura 2). As abelhas desse gênero são consideradas parasitas de ninhos, sendo o único da tribo composto por apenas uma única espécie: Aglae caerulea Lepeletier e Serville, esta tem como principal característica o corpo um pouco achatado, de cor azul escuro e chumbo, medindo cerca de 23 à 25 mm de comprimento (OLIVEIRA, 2011). O gênero está estritamente limitado à região Amazônica e florestas próximas (CHAVARRIA e CARPENTER, 1994), no estado do Maranhão, por exemplo, essa espécie está ausente (REBÊLO, RÊGO e ALBUQUERQUE, 2003). Figura 2 Vista dorsal de Aglae caerulea. 4

22 Capítulo 1 Introdução geral Eufriesea Cockerell, 1908 (Figura 3) é o segundo maior gênero da tribo, embora esse grupo não seja facilmente encontrado na natureza devido à sua sazonalidade, estando presente apenas durante alguns meses do ano. São abelhas com 15 à 20mm de comprimento sendo caracterizadas pelo corpo coberto por pelos, face completamente revestida por tegumento metálico brilhante sem nenhuma marca marfim e com labro preto (MORAWETZ e GRUBER, 2009). Euglossa Latreille, 1802 (FIGURA 5), é o gênero mais rico da tribo em espécies, com um colorido variando de verde e azul brilhante a violeta e cobreado (DARRAULT, MEDEIROS, et al., 2006), são abelhas pequenas, as menores dentro da tribo, com 10 à 14mm (MORAWETZ e GRUBER, 2009). Figura 3 Vista dorsal de Eufriesea atlantica. Exaerete Hoffmannsegg, 1817 (Figura 6) abrange seis espécies, todas elas, assim como Aglae, são cleptoparasitas (MICHENER, 1990). O tamanho corporal das espécies altera de acordo com estilo de vida variando entre 20 à 25mm com tegumento metálico com colorido entre azul e verde e asas pretas (MORAWETZ e GRUBER, 2009). Eulaema Lepeletier, 1841 (Figura 4). As abelhas desse gênero são consideradas as maiores abelhas da tribo, apresentam corpo robusto coberto de pelos, e podem ser confundidas com as do gênero Eufriesea pela coloração do corpo, mas distintos quando observadas as características faciais, enquanto o último apresenta rostro com coloração metálica, Eulaema pode apresentar marcas de marfim que nunca ocorrem em Eufriesea (MORAWETZ e GRUBER, 2009). 5

23 Capítulo 1 Introdução geral Figura 5 Vista dorsal de Euglossa ignita. Figura 4 Vista dorsal de Exaerete frontalis. 5mm Figura 6 Vista dorsal de Eulaema cingulata. 6

24 Capítulo 1 Introdução geral Essas abelhas apresentam voo muito rápido podendo visitar espécies vegetais bem distantes umas das outras na busca por pólen e néctar (JANZEN, 1971; DRESSLER, 1982; ROUBIK e HANSON, 2004). As fêmeas, por exemplo, podem voar cerca de 23km em uma única viagem de forrageio (JANZEN, 1971), ou em busca de parceiros sexuais (DRESSLER, 1982; ELTZ, ROUBIK e WHITTEN, 2003) o que proporciona uma grande dispersão das espécies da tribo, embora, segundo Cerântola (2009) alguns estudos com Euglossa cordata Linnaeus sugerem que fêmeas dessa espécie tenham comportamento filopátrico, coletando néctar e/ou construindo ninho próximo aos seus de origem ou ainda reutilizando-os. A procura por recursos pelos indivíduos dessa tribo é dividida entre machos e fêmeas: as fêmeas buscam pólen, néctar e resina (ACKERMAN, 1983; AUGUSTO, 1999); e os machos, por sua vez, coletam substâncias odoríferas (WHITTEN, YOUNG e STERN, 1993) acumulando-as em uma bolsa que apresentam no último par de pernas (Figura 7 e Figura 8), estes compostos aromáticos vão além das fontes florais, podendo ser coletados em madeiras podres, frutas em decomposição, troncos de árvores e fezes (VOGEL, 1966; ZUCCHI, SAKAGAMI e CAMARGO, 1969; WILLIAMS, 1982; ACKERMAN, 1983; REBÊLO e GARÓFALO, 1991; WHITTEN, YOUNG e STERN, 1993; ELTZ, WHITTEN, et al., 1999; ELTZ, ZIMMERMANN, et al., 2007; BRAGA e GARÓFALO, 2003; ZIMMERMANN, RAMIREZ e ELTZ, 2009). O acúmulo desses voláteis acontece ao longo da vida dos machos, ocorrendo assim diversas misturas complexas constituídas por terpenóides e aromáticos (ELTZ, WHITTEN, et al., 1999). Uma mistura desses compostos é apresentada à fêmea em pequenas amostras durante a corte (ELTZ, WHITTEN, et al., 1999; ELTZ, ROUBIK e WHITTEN, 2003; BEMBÉ, 2004; ELTZ, SAGER e LUNAU, 2005a; ELTZ, ROUBIK e LUNAU, 2005b). Devido a essa busca por aromas, a coleta de machos desse grupo de abelhas foi facilitada a partir da década de 60 quando as fragrâncias por estes coletadas foram sintetizadas e utilizadas para atração (DODSON, DRESSLER, et al., 1969; NEMÉSIO e RASMUSSEN, 2011). 7

25 Capítulo 1 Introdução geral 3mm Figura 7 Espécimes de Eulaema nigrita Lepeletier com destaque para a diferenciação na anatomia das pernas posteriores (esquerda macho; direita fêmea). Figura 8 Tíbia posterior de macho (A) e fêmea (B e C) de abelha das orquídeas do gênero Euglossa. O macho tem sua tíbia dilatada com uma pequena entrada para o compartimento esponjoso onde são armazenadas as fragrâncias coletadas, já a fêmea apresenta uma estrutura em forma de cesta para armazenamento de pólen e resina coletados. Foto: Aaron Mullins, University of Florida, Ft. Lauderdale Research and Education Center. A atividade de visitação e os padrões que os machos usam para coletar nas flores podem apresentar variação em função de diversos fatores, como o período do dia (ARMBRUSTER e MCCORMICK, 1990), nebulosidade e precipitação que podem reduzir o número de visitas (INOUYE, 1975; JANZEN, DEVRIES, et al., 1982); a velocidade do vento foi observada detalhadamente por Ackerman (1983) onde não foi encontrado nenhum efeito na atividade dos machos. Quanto à reprodução, Roubik e Ackerman (1987), mostram que o gênero Euglossa é capaz de se reproduzir durante todo o ano, embora seja visível uma flutuação sazonal na abundância das espécies. As fêmeas de Euglossini vivem entre 2 a 4 meses 8

26 Capítulo 1 Introdução geral produzindo células de cria em ninhos solitários ou primitivamente sociais; o período de desenvolvimento larval pode durar entre seis semanas e quatro meses dependendo da espécie e das condições climáticas do local (GARÓFALO, 1985; RAMIREZ-ARRIAGA, CUADRIELLO-AGUILAR e HERNANDEZ, 1996; AUGUSTO e GARÓFALO, 2004; ZIMMERMANN, SCHORKOPF, et al., 2011). Apesar das Euglossini estarem no grupo das abelhas corbiculadas juntamente com Meliponini, Apini e Bombini, que são abelhas com complexos sistemas sociais, a maioria das Euglossini é solitária, algumas espécies do gênero Euglossa e, aparentemente, todas as Eulaema são comunais à primitivamente eussociais (MICHENER, 2000), esse é um gênero da tribo que apresenta ninhos com mais de uma fêmea, divisão de tarefas e sobreposição de gerações (GARÓFALO, 1985; RAMIREZ- ARRIAGA, CUADRIELLO-AGUILAR e HERNANDEZ, 1996; AUGUSTO e GARÓFALO, 2004; AUGUSTO e GARÓFALO, 2009; COCOM PECH, MAY-ITZÁ, et al., 2008; AUGUSTO e GARÓFALO, 2010; ANDRADE-SILVA e NASCIMENTO, 2012). Já as espécies de Exaerete e Aglae apresentam comportamento cleptoparasita, parasitando ninhos de outros gêneros de Euglossini dependendo destas para construção e oviposição (MICHENER, 1990; CHAVARRIA e CARPENTER, 1994). As Euglossini são eficientes polinizadores florais de aproximadamente 200 gêneros vegetais (JANZEN, 1971; RAMIREZ, DRESSLE e OSPINA, 2002), com destaque para a família Orchidaceae, onde até o momento são conhecidas aproximadamente 650 espécies polinizadas (DODSON, 1966; 1967; 1975; HILL, WILLIAMS e DODSON, 1972). Mantendo, também, estreita relação com espécies do gênero Spathiphyllum e Anthurium (Araceae), Drymonia e Gloxinia (Gesneriaceae), Cyphomandra (Solanaceae), Dalechampia (Euphorbiaceae), Tovomia (Guttiferae) e Unonopsis (Annonaceae) (WILLIAMS e DRESSLER, 1976; WILLIAMS, 1982; SAZIMA, VOGUEL, et al., 1993; NOGUEIRA, MARSAIOLI, et al., 1998; CARVALHO e WEBBER, 2000; BRAGA e GARÓFALO, 2003). Além da evidente importância como polinizadores, tem sido demonstrado, que são possíveis indicadores ambientais devido à sensibilidade à fragmentação e ao desmatamento (SOFIA e SUZUKI, 2004). Brosi (2009), por exemplo, demonstrou que o tamanho do fragmento e a extensão de suas bordas mostram-se relacionados à riqueza e abundância das espécies. A fragmentação leva à redução no tamanho das populações e a restrição no fluxo gênico, causando a perda da diversidade genética dentro de populações e o aumento da diferenciação genética entre populações (FRANKHAM, 1995; 9

27 Capítulo 1 Introdução geral WATZEL et al., 2009). Populações pequenas sofrem com a perda da variabilidade genética através da deriva genética, causando a redução dos valores adaptativos (EWENS et al., 1987; ALMEIDA, 2002). Essas populações que sofrem redução de tamanho ou isolamento devido à fragmentação tendem a reduzir a diversidade genética ao longo do tempo e com isso uma influência negativa na possibilidade de persistência a longo prazo devido à depressão por endogamia e/ou diminuir a resistência às mudanças ambientais (DARVILL et al., 2006; FRANKHAM et al., 2002; KELLER e WALLER, 2002; ZIMMERMANN et al., 2011). Em um estudo das populações de Euglossini na região amazônica realizado por Power e Power (1987), foi revelado que para várias espécies a frequência de visita às iscas reduziam proporcionalmente ao tamanho do fragmento. As espécies de Euglossini do Brasil tem sua maior parte distribuída na Mata Atlântica, embora possa ocorrer em outros ambientes como as Matas Ciliares e de Galeria, Cerrado e ambientes antrópicos (DRESSLER, 1982). Dentre os diversos biomas existentes, no presente trabalho, a tribo Euglossini foi estudada com relação aos aspectos ecológicos, químicos e genéticos presentes nos biomas Caatinga e a Mata Atlântica que recobrem o estado de Sergipe, Brasil e sob as diferentes condições ambientais encontradas nestes. Bioma Caatinga A região constitui um dos três núcleos de aridez da América do Sul, sendo o mais dissimilar entre estes devido ao isolamento geográfico (SARMIENTO, 1975; AB SABER, 1980; LORENZON, MATRANGOLO e SCHOEREDER, 2003). É o tipo mais característico de vegetação encontrada no Nordeste brasileiro abrangendo uma área de km² que recobre todos os estados da região e uma faixa ao norte do estado de Minas Gerais (FERNANDES, 2006). A área total do bioma vem sendo crescentemente reduzida, entre 2002 e mil km² foram desmatados restando atualmente cerca de 54% da vegetação original (Figura 9). Deste total remanescente apenas 7,5%, ou seja, 845mil km², estão sob proteção dentro de 113 unidades de conservação cadastradas pelo Ministério do Meio Ambiente MMA (ANDRADE, 2003). 10

28 Capítulo 1 Introdução geral Figura 9 Localização do bioma Caatinga no Brasil, onde pode ser visualizada a área desmatada e a vegetação remanescente. É um dos biomas com o menor número de estudos realizados, sendo sua diversidade biológica subestimada, onde 41% da sua área total não foram amostradas e 80% estão subamostrada (SILVA e DINNOUTI, 1999; TABARELLI e SILVA, 2005). O estudo e a conservação da biodiversidade na Caatinga são os maiores desafios da ciência brasileira, por ser uma região exclusivamente nacional, ter um pequeno número de estudos desenvolvidos, sofrer intensa ação antrópica e apresentar-se como o bioma menos protegido do país, pois poucas áreas pertencem à alguma unidade de conservação (TABARELLI e SILVA, 2005). A Caatinga é uma região semiárida do nordeste brasileiro, onde são encontrados dois períodos sazonais bem distintos (Figura 10): um período chuvoso, com grande oferta de flores e consequentemente maior abundância de abelhas, e um período seco, quando as chuvas são escassas (ZANELLA e MARTINS, 2003); o índice pluviométrico varia entre 500 e 700mm/ano (LEAL, TABARELLI e SILVA, 2003; LOPES, MACHADO, et al., 2007). 11

29 Capítulo 1 Introdução geral A B Figura 10 Área de Caatinga no município de Canindé do São Francisco, Sergipe, Brasil, uma semana após o início do período de chuvas (A) e durante os meses secos (B). 12

30 Capítulo 1 Introdução geral É composta por uma vegetação xerófila de fisionomia e florística variadas, cobrindo a maior parte do nordeste (RODAL, SAMPAIO e FIGUEIREDO, 1992). O relevo é aplanado e levemente ondulado, com morros residuais dispersos, e solos rasos e pedregosos (ROSS, 2006). Machado e Lopes (2004) afirmam que cerca de 40% das plantas presentes na Caatinga necessitam da polinização realizada por abelhas. Embora exista uma falta de conhecimento no que diz respeito à apifauna da área, sendo esta pobremente conhecida (ZANELLA, 2000; ZANELLA e MARTINS, 2003). O primeiro a estudar as abelhas da Caatinga foi Ducke (DUCKE, 1907; 1908; 1910; 1911), no início do século XX, que coletou abelhas em diversas partes do Ceará, analisando a ecologia e a biogeografia. Posteriormente, outros estudos foram surgindo como o de Martins (1994) na Bahia e Aguiar e Martins (1997) na Paraíba, embora ainda sejam poucos. Em um mapeamento realizado por (FREIRE e PACHECO, 2005) nos municípios de Canindé do São Francisco, Poço Redondo e Porto da Folha, em Sergipe, além dos municípios de Piranhas, Pão-de-Açúcar e Olho D Agua do Casado, em Alagoas, foi possível constatar que estas áreas apresentam risco passível de desertificação, onde entre os anos de 1989 e 2003 houve aumento de 91,3% do solo exposto, diminuição de 21,2% de áreas agropastoris, diminuição de 9,7% de caatinga arbórea e 68,7% de caatinga arbustiva e aumento de 70% de áreas urbanas e antropizadas (SILVA, 2011). Dentre as Euglossini, poucas espécies foram identificadas até então, esse pequeno número está relacionado às condições climáticas, como também, à quantidade de estudos realizados no bioma. Bioma Mata Atlântica Nas áreas tropicais das Américas, já foram descritas aproximadamente 200 espécies de Euglossini (CAMERON, 2004; ROUBIK e HANSON, 2004), sendo que destas, cerca de 50 são conhecidas por serem endêmicas da Mata Atlântica (PERUQUETTI, CAMPOS, et al., 1999; NEMÉSIO, 2009), número que pode aumentar ainda mais, a exemplo da Floresta Atlântica ao norte do Rio São Francisco, onde mais de 20 espécies de Euglossini já foram registradas (MARTINS e SOUZA, 2005; MILET-PINHEIRO e SCHLINDWEIN, 2005; DARRAULT, MEDEIROS, et al., 2006; MOURA e SCHLINDWEIN, 2009), demonstrando que neste bioma pode ser encontrada uma grande diversidade de espécies de Euglossini. 13

31 Capítulo 1 Introdução geral A Mata Atlântica consiste em um habitat bastante diversificado, composto por densas florestas, manguezais e áreas restinga (TONHASCA, 2005; BLACKMER, TONHASCA e ALBUQUERQUE, 2007). De acordo com o mapa da vegetação publicado pelo IBGE em 1988 e o Decreto 750/93, é considerada um conjunto de formações florestais e ecossistemas unidos no domínio Mata Atlântica: Floresta Ombrófila Densa, Floresta Ombrófila Mista, Floresta Ombrófila Aberta, Floresta Estacional Semidecidual, Floresta Estacional Decidual, Manguezais, Restingas, Campos de Altitude, Brejos interioranos e encraves florestais no Nordeste (SATO, 1995). Ocorre em 17 estados brasileiros, nas regiões Nordeste, Sudeste, Centro-Oeste e Sul, numa faixa longitudinal com solos e temperaturas variáveis, no Nordeste, por exemplo, a temperatura fica em torno dos 24 C (MOURA, 2006). Esta faixa estende-se do Rio Grande do Sul ao Rio Grande do Norte ao longo da costa brasileira (FIASCHI e PIRANI, 2009). Devido ao alto nível de endemismo, está entre as vinte e cinco áreas prioritárias, hotspots, para ações de conservação da biodiversidade na Terra (MYERS, MITTERMEIER, et al., 2000). Embora de grande importância, a Mata Atlântica encontra-se entre os ecossistemas mais ameaçados do planeta, no início da ocupação europeia, cobria 15% do território brasileiro, hoje restam apenas 8% do total desta cobertura vegetal ( Figura 11) (SCHÄFFER e PROCHNOW, 2002; GALINDO-LEAL e CÂMARA, 2005). Figura 11 Bioma Mata Atlântica no Brasil, cobertura original (esquerda) e remanescente (direita). Quanto mais escuro o tom de verde mais conservada encontra-se a área. 14

32 Capítulo 1 Introdução geral A manutenção do fluxo gênico entre florestas neotropicais é de grande importância, algumas análises têm sugerido que as Euglossini são sensíveis à fragmentação florestal e a redução no tamanho do fragmento (POWELL e POWELL, 1987; SOFIA e SUZUKI, 2004; BROSI, 2009; FREIRIA, 2011), embora estudos genéticos com algumas espécies de Euglossini têm mostrado que mesmo em ambiente fragmentado, algumas destas mantêm altos níveis de diversidade genética de suas populações (SOFIA, PAULA, et al., 2005; SUZUKI, ARIAS, et al., 2010; ZIMMERMANN, SCHORKOPF, et al., 2011; FREIRIA, RUIM, et al., 2012). É crescente a necessidade de maiores informações sobre as populações remanescentes nestas áreas. Para tal, é importante conhecer as diversas características relacionadas à estes organismos, o que se dá com a ampliação das pesquisas em várias áreas, a exemplo da genética e da ecologia química. Perfil químico cuticular de insetos As plantas e os animais são capazes de produzir substâncias usadas na comunicação intraespecíficas e interespecífica, os chamados semioquímicos. Em geral, comunicação química pode ser classificada em dois grupos: a comunicação olfativa entre indivíduos de diferentes espécies (interespecífica) pelos chamados aleloquímicos, e entre indivíduos da mesma espécie (intraespecífica), onde estão classificados os feromônios (ZIMMERMANN, 2010). Os semioquímicos que são transmitidos e detectados entre indivíduos de diferentes espécies, aleloquímicos, estão divididos em três categorias de acordo com o organismo que está sendo beneficiado na interação, quando trata-se do benefício para o emissor é chamado alelomônio, para o receptor é cairomônio ou para ambos são os sinomônios (NORDLUND e LEWIS, 1976; NORDLUND, 1981; SCHMITT, 2004). A comunicação, que é fundamental à vida em todos os seus níveis, entre células, organismos, indivíduos e sociedades, nos insetos, é mediada por interações químicas (WILSON, 1971; MARTIN e DRIJFHOUT, 2009; NUNES, 2012). Alguns desses compostos são liberados pelas flores para atrair insetos a exemplo das orquídeas que liberam compostos voláteis atrativos aos machos das abelhas Euglossini a uma distância de aproximadamente 1km (MORI, 1998; REIS, 2000). Outros estão presentes na camada de cera, composta por lipídios, que reveste o corpo dos insetos; entre estes estão os chamados hidrocarbonetos cuticulares, substâncias que tem como função primária a 15

33 Capítulo 1 Introdução geral proteção contra desidratação (LOCKEY, 1988), e a penetração de microrganismos (GULLAN e CRANSTON, 1994; MARTIN, WEIHAO e DRIJFHOUT, 2009), mas também desempenham função de comunicação entre companheiras de ninho, acasalamento e reconhecimento de castas (CLÈMENT e BAGNÈRES, 1998; SINGER, ESPELIE e GAMBOA, 1998; VANDER MEER e MOREL, 1998). Um conjunto de outros compostos pode ser encontrado junto aos hidrocarbonetos cuticulares, como por exemplo: ésteres, álcoois e ácidos graxos (LOCKEY, 1988). Os hidrocarbonetos cuticulares funcionam como uma identificação de cada indivíduo, e é geneticamente determinado e relacionado por seu ambiente social e físico (CARLIN, 1989 revisado por LORENZI, BAGNÈRES e CLÉMENT, 1996; HOWARD e BLOMQUIST, 2005; MARTIN e DRIJFHOUT, 2009). Eles podem ajudar a delimitar o número de espécies diferentes em vários táxons, assim são utilizados como uma ferramenta adicional juntamente com métodos convencionais de morfologia, ecologia e biologia molecular para classificar os indivíduos (KATHER e MARTIN, 2012), sendo então utilizados como fatores na diferenciação quimiotaxonômica (BLOMQUIST, BLAILOCK, et al., 1976; LOCKEY, 1976). O estudo desses compostos é conhecido em insetos sociais para o reconhecimento entre os indivíduos; nas formigas, por exemplo, o reconhecimento é dado pelas antenas através da detecção de compostos não voláteis (FIELDE, 1901; 1903), já nas abelhas o foco dos estudos é voltado para o reconhecimento dos indivíduos e a diferenciação entre castas (HOWARD e BLOMQUIST, 2005; NUNES, TURATTI, et al., 2009; FERREIRA-CALIMAN, NASCIMENTO, et al., 2010). Os hidrocarbonetos cuticulares são os compostos fundamentais para o reconhecimento em Hymenoptera, até mesmo nas espécies solitárias o reconhecimento pode ter um efeito positivo sobre o fitness, evitando a consanguinidade o que resultaria em uma maior proporção de filhos diploides inférteis (SCHMITT, 2004). Em machos de Euglossini, além dos compostos naturalmente encontrados na cutícula, outros podem ser observados devido à coleta de fragrâncias. A mistura de compostos coletados pode ser utilizada pelos machos durante a corte para defender seu território (BEMBÉ, 2004; ELTZ, SAGER e LUNAU, 2005a), sendo que o mais provável é que a sinalização química por fragrâncias feita pelos machos envolva o reconhecimento e a escolha dos parceiros pela fêmea. 16

34 Capítulo 1 Introdução geral Poucos estudos avaliaram a composição cuticular dos Euglossini, sendo que estes na maioria das vezes analisam apenas os compostos voláteis presentes na cutícula, o que torna necessário conhecer mais profundamente a estrutura química desses indivíduos e suas variações interespecíficas. De acordo com Zimmerman e colaboradores (2009) o reconhecimento dos químicos que podem ser encontrados em machos de Euglossini é uma tarefa difícil devido ao acúmulo de diferentes substâncias provenientes de fontes com variação temporal e espacial, como pode ser visto em Eltz e colaboradores (2005b) onde é citado que a composição pode variar de acordo com as flores que visitam; e pela diversidade de indivíduos dentro da tribo. Conservação e Genética de Populações Os estudos genéticos são desenvolvidos mediante a aplicação de técnicas com marcadores moleculares, que visam revelar a variabilidade genética, para posteriormente detectar diferenças entre indivíduos (LOWE, HARRIS e ASHTON, 2004). As abelhas, como outros himenópteros, apresentam o sistema haplodiploide de determinação sexual (PAMILO, VARVIO-AHO e PEKKARINEN, 1978; BERKELHAMER, 1983; SHOEMAKER, COSTA e ROSS, 1992; PACKER e OWEN, 2001; FREIRIA, 2011). Nesse sistema, os ovos fecundados usualmente originam fêmeas enquanto que dos ovos não fecundados serão originados os machos (UNRUH e MESSING, 1993). A ocorrência de machos diploides em populações de abelhas é considerada um efeito da redução do tamanho das populações devido à fragmentação (ZAYED e PACKER, 2005), isso porque a taxa reprodutiva desses indivíduos é quase zero, a cada macho diploide produzido uma fêmea funcional deixa de ser produzida, sendo assim, são considerados um custo genético à população (ZAYDE, ROUBIK e PACKER, 2004; ZAYED e PACKER, 2005; FREIRIA, 2011). Em Euglossini a ocorrência de machos diploides em populações naturais é um pouco contraditória (CERÂNTOLA, OI, et al., 2011), uma alta frequência foi citada em estudos no Panamá por Roubik e colaboradores (1996) e Zayed e outros (2004) e na Colômbia por López-Uribe e colaboradores (2007), mas não foram encontrados no Brasil (TAKAHASHI, PERUQUETTI, et al., 2001). Ainda não é possível encontrar na 17

35 Capítulo 1 Introdução geral literatura um consenso sobre a frequência de machos diploides em populações de espécies da tribo Euglossini (FREIRIA, 2011). Para a realização das pesquisas genéticas são utilizados diversos tipos de marcadores, são eles: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PCR-RFLP, SSR (Simple Sequence Repeat ou microssatélites) e o sequenciamento direto de DNA. O uso varia de acordo com as características que apresentam, a disponibilidade e o tipo de estudo ser realizado (AVISE, 2004). Sendo que o estudo da biologia das populações deve estar concentrado no uso de marcadores haploides e/ou codominantes, por fornecerem dados mais robustos, quando comparado a outros marcadores (SUNNUCKS, 2000). A metodologia aqui adotada foi o estudo do DNA mitocondrial (mtdna), que fornece dados robustos (OLIVEIRA, 2002) e tem sido usado em análises populacionais e evolutivas por revelarem tipos diferentes de informação, sendo eficientes na detecção da diferenciação de espécies, como também na detecção de processo em uma perspectiva ecológica e evolutiva (HAAVIER, SAETRE e MOUM, 2000). Desde os anos de 1970 e 1980 o mtdna começou a ser utilizado e vem fazendo parte de muitos estudos envolvendo estrutura populacional, relações filogenéticas e vários aspectos biológicos e evolutivos de uma variedade de organismos (WILSON, CANN, et al., 1985; AVISE, ARNOLD, et al., 1987; MORITZ, DOWLING e BROWN, 1987; ARIAS, FRANCISCO e SILVESTRE, 2003). O estudo do DNA mitocondrial tem como principais características ser de herança exclusivamente materna (na maioria dos grupos), a ausência de recombinação e o sistema de reparo ineficiente que permite grande polimorfismo intraespecífico, e a exposição aos radicais livres gerados durante o processo de respiração (ARIAS e INFANTE-MALACHIAS, 2001; AVISE, 2004; AVISE, 2009; FREIRIA, 2011). Por ser transmitido por apenas um dos sexos, pode-se resumir o mtdna como uma herança uniparental com alta taxa de mutação quando comparada ao DNA nuclear (BROWN, GEORGE e WILSON, 1979), o que o torna muito útil para a sistemática molecular e a genética de populações, já que fornece dados sobre a evolução e dispersão dos organismos (PÉREZ-SWEENEY, RODRIGUES e MELNICK, 2004). O primeiro estudo no Brasil para a caracterização total do mtdna de abelhas aconteceu no ano de 1990 por Arias e colaboradores (1990) analisando a espécie Apis 18

36 Capítulo 1 Introdução geral mellifera Linnaeus; em abelhas sem ferrão o estudo teve início com cinco espécies do gênero Plebeia (FRANCISCO, SILVESTRE e ARIAS, 2001), já para a tribo Euglossini, alguns estudos podem ser citados, como, por exemplo, análises das espécies Euglossa iopoecila Dressler (PENHA, GAGLIANONE, et al., 2014), Euglossa fimbriata Rebêlo e Moure (SUZUKI, ARIAS, et al., 2010) e Euglossa cordata Linnaeus (LÓPEZ-URIBE, 2006; CERÂNTOLA, 2009; OI, 2010). O sequenciamento total do genoma mitocondrial de Apis mellifera Linnaeus por Crozier e Crozier (1993) contribuiu para o estudo de abelhas de um modo geral, principalmente em relação ao desenho de primers para amplificação de regiões de interesse (OLIVEIRA, 2002) (FIGURA 1Figura 12). Barbee mtd9 Figura 12 Esquema utilizando Apis cerana Fabricius para representar o DNA mitocondrial de uma abelha. Com a posição aproximada de anelamento dos primers. Fonte: HONG-WEI, GUO-HUA, et al.,

37 Capítulo 1 Introdução geral Morfometria geométrica Estudos da forma do corpo em relação ao tamanho utilizando dados numéricos são de grande importância para a biologia evolutiva (REYMENT, BLACKITH e CAMPBELL, 1984; REIS, 1988; ROHLF, 1990); o estudo estatístico das mudanças e variações na forma e tamanho (MONTEIRO e REIS, 1999) ou ainda a análise de mensuração do componente complexo multidimensional forma (MORAES, 2003) são conceitos dados à análise morfométrica. A morfometria, então, trata do estudo quantitativo da forma definida pela configuração de marcos anatômicos, sendo resumida em tamanho e conformação (SILVEIRA, 2011). A conformação representa as propriedades de configuração de pontos que não podem variar para mudanças de escala, rotação e translação (SLICE, BOOKSTEIN, et al., 2003), e o tamanho tem relação com as grandezas e dimensões, as medidas das estruturas estudadas contém informações de tamanho e conformação associadas (RICHTSMEIER, DELEON e LELE, 2002). Diversas áreas do conhecimento estão mostrando interesse por este tipo de estudo sejam os taxonomistas para mensurar diferenças existentes entre espécies; os ecólogos que relacionam a forma e o tamanho do organismo com aspectos como alimentação, uso de micro-habitat, pressão seletiva, competição, predação, entre outros; ou ainda os geneticistas que se preocupam em verificar a herdabilidade de caracteres morfométricos pois estes podem quantificar e separar influências genotípicas das ambientais sob o fenótipo de uma população (PERES-NETO, VALENTIN e FERNANDEZ, 1995). A análise morfométrica é dividida em duas categorias, a morfometria tradicional que engloba o estudo da variação e covariação de medidas de distâncias lineares entre pontos anatomicamente homólogos, que em geral são distâncias ou ângulos das estruturas (ROHLF e MARCUS, 1993); e a morfometria geométrica que visa descrever e representar a geometria das formas, reconstruindo e reconstituindo graficamente tais mudanças (FORNEL, 2005). Nas últimas décadas o conhecimento sobre esta tornou-se mais robusto teórico e tecnicamente, superando problemas devido às dificuldades matemáticas e computacionais apresentadas inicialmente (ROHLF e BOOKSTEIN, 1987) e cada vez mais aumentando o número de informações bibliográficas adequadas sobre a teoria, métodos e aplicações da técnica (MONTEIRO e REIS, 1999). 20

38 Capítulo 1 Introdução geral O uso da análise morfométrica para avaliar os padrões de variação geográfica e diferenciação intraespecífica vem sendo crescente para abelhas (RUTTNER, 1988), isso ocorre pelo fato do aspecto fenotípico macroscópico de uma estrutura biológica ser o resultado de interações entre regras morfogenéticas e os mecanismos extrínsecos relacionados aos fenômenos ecológicos e as forças evolutivas estocásticas e/ou determinísticas (LEVIN, 1992; CALASANS, 2012). As asas dos insetos são estruturas excelentes para esse tipo de análise já que são planas o que permite obter grande parte das informações necessárias (NUNES, COSTA- PINTO, et al., 2007) e apresentam diversos marcos anatômicos, principalmente entre as nervuras (GRODNITSKY, 2000). Em Apis, a morfometria está sendo útil para avaliar a biodiversidade, definir subespécies e verificar caracteres (RUTTNER, TASSENCOURT e LOUVEAUX, 1978; RUTTNER, 1988); o uso dos padrões de venação na morfometria geométrica tem contribuído para diferenciar espécies e subespécies de abelhas (RUTTNER, 1988; SCHRÖDER, DRESCHER, et al., 1995; SCHRÖDER, WITTMANN, et al., 2006; DRAUSCHKE, STEINHAGE, et al., 2007). A técnica de morfometria geométrica foi testada por Silva (2010) para avaliar a divergência dentro do gênero Plebeia com seis espécies, onde obteve uma diferenciação de 93,4% dos indivíduos nos testes de validação cruzada. Esse método de estudo também foi eficiente na discriminação de indivíduos de Nannotrigona testaceicornis Lepeletier (MENDES, FRANCOY, et al., 2007), ou ainda na identificação de grupos de acordo com a distribuição geográfica de Melipona quadrifasciata Lepeletier da região semiárida da Bahia (NUNES, ARAÚJO, et al., 2008). Até o momento poucas são as informações sobre o uso da morfometria em abelhas da tribo Euglossini, onde podemos destacar a análise de machos e fêmeas de Euglossa annectans Dressler através da aplicação da morfometria tradicional (RIBEIRO, HILÁRIO e CORTOPASSI-LAURINO, 2008), e o estudo realizado por Francoy e colaboradores (2012) no qual buscou-se identificar cinco diferentes espécies do gênero Euglossa. Justificativa e Questões norteadoras Compreender as relações ambientais das diversas espécies tem sido um desafio, devido ao acelerado ritmo de degradação dos recursos naturais. Assim, estudar os 21

39 Capítulo 1 Introdução geral diversos aspectos que podem estar relacionados aos organismos e os ambientes ameaçados é um fator crucial para o entendimento dos processos naturais e da ação antrópica sobre a dinâmica das populações. Apesar da importância desse tipo de estudo na Caatinga, principalmente no Estado de Sergipe, nenhum trabalho foi desenvolvido buscando verificar diferenciações nas populações de Euglossini. Já na Mata Atlântica alguns estudos vêm sendo realizados, mas sem levar em consideração fatores importantes como a taxonômica química e a genética das populações. Estudos sobre a fauna de Euglossini no Nordeste brasileiro têm mostrado alterações nas populações devido à fragmentação e alterações ambientais causadas pela ação humana, estas alterações muitas vezes estão relacionadas à diminuição do tamanho das populações e/ou a redução da variabilidade genética. Em vista do exposto, para melhor inferir a respeito desses eventos sobre as comunidades de Euglossini é necessário ampliar os estudos; assim, neste projeto buscou-se estudar as populações de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica do Estado de Sergipe, comparando parâmetros ecológicos, químicos e genéticos das populações em ambientes fragmentados, tendo como questões norteadoras da pesquisa: Qual a composição da fauna de Euglossini nas áreas de estudo até então não conhecidas? Conhecendo estes insetos seria possível caracterizar ecologicamente a fauna e suas relações com os biomas em estudo? É possível identificar um fluxo gênico dentro e entre os ambientes, analisando duas espécies de Euglossini de diferentes gêneros, comportamento e porte físico? Há uma variedade ou variabilidade genética entre os indivíduos? Esta se relaciona a sua localização? A presença de compostos nas cutículas dos indivíduos sofre alterações de acordo com o ambiente em que o indivíduo se encontre, podendo ser em áreas mais abertas ou ambientes com vegetação mais fechada? Essa variação pode acontecer relacionada aos fatores climáticos (seca e chuva)? A partir dos compostos químicos presentes na cutícula dos machos de Euglossini é possível caracterizar taxonomicamente os indivíduos? Caso seja possível quais seriam estes compostos? 22

40 Capítulo 1 Introdução geral Referências Bibliográficas AB SABER, A. N. O domínio semi-árido morfoclimático das caatingas brasileiras. Craton Intracraton Escr. Doc., v. 6, p. 35, ACKERMAN, J. D. Diversity and seasonality of male euglossine bees (hymenoptera: Apidae) in Central Panama. Ecology, v. 64(2), p , AGUIAR, C. M. L.; MARTINS, C. F. Abundância relativa, diversidade e fenologia de abelhas (Hymenoptera, Apoidea) na caatinga, São João do Cariri, Paraíba, Brasil. Iheringia sér. Zool., v. 83, p , ALVARENGA, P. E. F.; FREITAS, R. F.; AUGUSTO, S. C. Diversidade de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) em áreas de cerrado do Triângulo Mineiro, MG. Bioscience Journal, v. 23, p , ANDRADE, R. O. As muitas faces do sertão. Revista FAPESP, n. 209, p , julho ANDRADE-SILVA, A.; NASCIMENTO, F. Multifemale nests and social behavior in Euglossa melanotricha (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Journal of Hymenoptera Research, v. 26, p. 1, ANJOS-SILVA, E. J. Fenologia das abelhas Euglossini Latreille (Hymenoptera: Apidae) e a variação sazonal e geográfica na escolha e preferência por iscasodores no Parque Nacional de Chapada dos Guimarães e na Província Serrana de Mato Grosso, Brasil. Ribeirão Preto, SP: Universidade de São Paulo (Tese), ANJOS-SILVA, E. J.; REBÊLO, J. M. M. A new species of Exaerete Hoffmannsegg (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) from Brazil. Zootaxa, v. 1105, p. 27:35, ARIAS, M. C.; FRANCISCO, F. O.; SILVESTRE, D. O DNA mitocondrial em estudos populacionais e evolutivos de meliponíneos. In: MELO, G. A. R.; ALVES-DOS-SANTOS, I. Apoidea Neotropica: Homenagem aos 90 anos de Jesus Santiago Moure. Crisciúma: UNESC, p ARIAS, M. C.; INFANTE-MALACHIAS, M. E. RFLP: o emprego de enzimas de restrição para detecção de polimorfismos do DNA. In: MARTIOLI, S. R. Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos, p

41 Capítulo 1 Introdução geral ARIAS, M. C.; SOARES, A. E.; NOBREGA, F. G. Improvements to the mitochondrial restriction maps for Italian nad Africanized honey bees. Brazilian Journal of Genetics, v. 13, p , ARMBRUSTER, W. S.; MCCORMICK, K. D. Diel Foraging Patterns of Male Euglossine Bees: Ecological Causes and Evolutionary Response by Plants'. Biotropica, v. 22, n. 2, p , AUGUSTO, S. C. Bionomia e organização social de Euglossa (Euglossa) fimbriata Rebêlo & Moure, 1995 e Euglossa (Euglossa) townsendi Cockerell, Tese de Doutorado: [s.n.], p. AUGUSTO, S. C.; GARÓFALO, C. A. Nesting biology and social structure of Euglossa (Euglossa) townsendi Cockerell (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Insectes Sociaux, v. 51, p , AUGUSTO, S. C.; GARÓFALO, C. A. Bionomics and sociological aspects of Euglossa fimbriata (Apidae, Euglossini). Genetics and molecular research, v. 8, p , AUGUSTO, S. C.; GARÓFALO, C. A. Task allocation and interactions among females in Euglossa carolina nests (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Apidologie, v. 42, p , AVISE, J. C. Molecular Markers, Natural History and Evolution. Sunderland: Sinaur Associates, Inc, p. AVISE, J. C. Phylogeography: retrospect and prospect. Journal of Biogeography, v. 36, p. 3-15, AVISE, J. C.; ARNOLD, J.; BAL, R. M. L.; BERMINGHAM, E.; LAMB, T.; NEIGEL, J. E.; REEB, C. A.; SAUNDERS, N. C. Intraspecific phylogeography: the mitochandrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Reviews of Ecology and Systematic, v. 18, p , BEMBÉ, B. Functional morphology in male euglossine bees and their ability to spray fragrances (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Apidologie, v. 35, p , BERKELHAMER, R. C. Intraspecific genetic variation and haplodiploidy, eusociality, and polygyny in the Hymenoptera. Evolution, v. 37, p ,

42 Capítulo 1 Introdução geral BEZERRA, C. P.; MARTINS, C. F. Diversidade de Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em dois fragmentos de Mata Atlântica localizados na região urbana de João Pessoa, Paraíba, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 18, p , BLACKMER, J. L.; TONHASCA, J. R. A.; ALBUQUERQUE, G. S. Behavioral ecology of euglossine bees of the Atlantic rain forest. Perspectivas Online, v. 1(4), p , BLOMQUIST, G. J.; BLAILOCK, T. T.; SCHEETZ, R. W.; JACKSON, L. L. Cuticular lipids of insects: VII. Cuticular hydrocarbons of the crickets Acheta domesticus, Gryllus pennsylvanicus and Nemobius fasciatus. Comp. Biochem. Physiol., v. 54B, p , BRAGA, A. K.; GARÓFALO, C. A. Coleta de fragrâncias por machos de Euglossa towsendi Cockerell (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) em flores de Crinum procerum Carey (Amaryllidaceae). In: MELO, G. A. R.; ALVES-DOS-SANTOS, I. Apoidea Neotropica: Homenagem aos 90 anos de Jesus Santiago Moure. Crisciúma.: UNESC, p BROSI, B. J. The effects of forest fragmentation on Euglossini bee communities (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Conserv. Biol., v. 142, p , BROWN, W. M.; GEORGE, M. J.; WILSON, A. C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 76, p , BÚRQUEZ, A. Distributional limits of euglossine and meliponine bees (Hymenoptera: Apidae) in Nortwestern Mexico. Pan-Pacific Entomologist, v. 73, n. 2, p , CALASANS, H. C. M. Avaliação morfométrica e molecular de abelhas mandaçaias (Melipona spp.) da região da Foz do Rio Sâo Francisco. São Cristóvão: Universidade Federal de Sergipe, CAMERON, S. A. Phylogeny and biology of Neotropical orchid bees (Euglossini). Annu. Rev. Entomol., v. 49, p , CAMERON, S. A.; MARDULYN, P. Multiple molecular data sets suggest independent origins of highly eusocial behaviour in bees (Hymenoptera: Apinae). Systematic Biology, v. 50, p , CARLIN, N. F. Discrimination between and within colonies of social insects: Two null hypotheses. Netherlands Journal of Zoology, v. 39, p ,

43 Capítulo 1 Introdução geral CARVALHO, C. C.; REGO, M. M. C.; MENDES, F. N. Dinâmica de populações de Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em mata ciliar, Urbano Santos, Maranhão, Brasil. Ilheringia, Série Zoologia, v. 96, n. 2, p , CARVALHO, R.; WEBBER, A. C. Biologia floral de Unonopsis guatterioides (A.D.C.) R.E. Fr., uma Annonaceae polinizada por Euglossini. Revista Brasileira de Botânica, v. 23(4), p , CERÂNTOLA, N. C. M. O padrão de dispersão é sexo-assimétrico nos Euglossíneos (Hymenoptera: Apidae: Euglossini)? Um estudo de caso: Euglossa cordata. São Carlos: Dissertação de mestrado, CERÂNTOLA, N. C. M.; OI, C. A.; CERVINI, M.; DEL LAMA, M. A. Genetic differentiation of urban populations of Euglossa cordata from the state of São Paulo, Brazil. Apidologie, v. 42, p , CHAVARRIA, G.; CARPENTER, J. M. Total Evidence and the evolution of highly social bees. Cladistics, v. 10, p , CLÈMENT, J.-L.; BAGNÈRES, A. G. Nestmate recognition in termites. In: VANDER MEER, R. K.; BREED, M. D.; WINSTON, M. L.; ESPELIE, E. K. Pheromone communication in social insects. Westview: Boulder, p COCOM PECH, M. E.; MAY-ITZÁ, W. J.; MEDINA MEDINA, L. A.; QUEZADA-EUÁN, J. G. Sociality in Euglossa (Euglossa) viridissima Friese (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Insectes Sociaux, v. 55, p , CROZIER, R. H.; CROZIER, Y. C. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and the genome organization. Genetics, v. 133, p , DARRAULT, R.; MEDEIROS, P. C.; LOCATELLI, E.; LOPES, A. V.; MACHADO, I. C.; SCHLINDWEIN, C. Abelhas Euglossini. In: Brasil/MMA. Diversidade biológica e conservação da Floresta Atlântica ao norte do Rio São Francisco. Brasília: Ministério do meio Ambiente, p DIAS, R. L. Abelhas Euglossina das serras do norte do estado do Amazonas. Manaus, AM: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Dissertação),

44 Capítulo 1 Introdução geral DODSON, C. D. Ethology of some bees on the tribe Euglossini. Journal of Kansas Entomological Society, v. 39, p , DODSON, C. D. Studies on orchid pollination: the genus Notylia. American Orchid Society Bulletin, v. 36, p , DODSON, C. D. Coevolution of orchids and bees. In: GILBERT, L. E.; RAVEN, P. H. Coevolution of Animals and Plants. Austin: University of Texas press, p DODSON, C. H.; DRESSLER, R. L.; HILLS, H. G.; ADAMS, R. M.; WILLIAMS, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science, v. 164, p , DRAUSCHKE, M.; STEINHAGE, V.; POGODA, A.; MÜLLER, S.; FRANCOY, T.; WITTMANN, D. Reliable Biometrical Analysis in Biodiversity Information Systems. In: FRED, A.; JAIN, A. K. 7th International Workshop on Pattern Recognition in Information Systems - PRIS. Funcha. Proceedings: [s.n.], p DRESSLER, R. L. Biology of the orchid bees (Euglossini). Annu. Rev. Ecol. Syst., v. 13, p , DUCKE, A. Contribution à la connaissance de la faune hyménoptérologique du nord-est du Brésil. Rev. Entomol., v. 26, p , DUCKE, A. Contribution à la connaissance de la faune hyménoptérologique du nord-est du Brésil. II. hyménoptéres récoltés dans l État de Ceara en Rev. Entomol., v. 27, p , DUCKE, A. Explorações botânicas e entomológicas no estado do Ceará. Rev. trimes. do Inst. do Ceará, v. 24, p. 3-61, DUCKE, A. Contribution à la connaissance de la faune hyménoptérologique du nord-est du Brésil. III. hyménoptéres récoltés dans l État de Ceara en 1909 et supplément aux deux listes antérieures. Rev. Entomol., v. 29, p , ELTZ, T.; WHITTEN, W. M.; ROUBIK, D. W.; LINSENMMAIR, K. E. Fragance collection, storage, and accumulation by individual male orchid bees. Journal of Chemical Ecology, v. 25(1), p , ELTZ, T.; ZIMMERMANN, Y.; HAFTMANN, J.; TWELE, R.; FRANCKE, W.; QUEZADA-EUAN, J. J.; LUNAU, K. Enfleurage, lipid recycling, and the origin of perfume collection in orchid bees. Proceedings of the Royal Society B, v. 274, p ,

45 Capítulo 1 Introdução geral ELTZ, T.; ROUBIK, D. W.; LUNAU, K. Experience-dependent choices ensure speciesspecific fragrance accumulation in male orchid bees. Behavioral Ecology and Sociobiology, v. 59, p , 2005b. ELTZ, T.; ROUBIK, D. W.; WHITTEN, M. W. Fragrances, male display and mating behavior of Euglossa hemichlora a flight cage experiment. Physiol. Entomol., v. 28, p , ELTZ, T.; SAGER, A.; LUNAU, K. Juggling with volatiles: exposure of perfumes by displaying male orchid bees. Journal of Comparative Physiology A, v. 191, p , 2005a. FARIAS, R. A.; SILVA, M. M.; PEIXOTO, P. M.; MARTINS, C. F. Composição e sazonalidade de espécies de Euglossina (Hymenoptera: Apidae) em mata e duna na Área de Proteção Ambiental da Barra do Rio Mamanguape, Rio Tinto, PB. Neotropical entomology, v. 37, n. 3, p , FERNANDES, A. Fitogeografia brasileira: províncias florísticas. 3ed. ed. Fortaleza: Realce, p. FERREIRA-CALIMAN, M. J.; NASCIMENTO, F. S.; TURATTI, I. C.; MATEUS, S.; LOPES, N. P.; ZUCCHI, R. The cuticular hydrocarbons profiles in the stingless bee Melipona marginata reflect task-related differences. J. Insect Physiol., v. 56(7), p , FIASCHI, P.; PIRANI, J. R. Review of plant biogeographic studies in Brazil. Journal of Systematics and Evolution, v. 00(0), p. 1-20, FIELDE, A. M. Further study of an ant. Proc. Acad. Nat. Sci. USA, v. 53, p , FIELDE, A. M. Supplementary notes on an ant. Proc. Acad. Nat. Sci. USA., v. 55, p. 493, FORNEL, R. Estudo da variação morfológica craniana entre quatro blocos populacionais de Ctenomys lami (Rodentia, Ctenomyidae) através de morfometria geométrica. Dissertação de mestrado: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, p. FRANCISCO, F. O.; SILVESTRE, D.; ARIAS, C. M. Mitochondrial DNA characterization of five species of Plebeia (Apidae: Meliponini): RFLP an restriction maps. Apidologie, v. 32, p ,

46 Capítulo 1 Introdução geral FRANCOY, T. M.; FARIA-FRANCO, F.; ROUBIK, D. W. Integrated landmark and outlinebased morphometric methods efficiently distinguish species of Euglossa (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Apidologie, v. 43, p , FREIRE, N. C. F.; PACHECO, A. P. Aspectos da detecção de áreas de risco à desertificação na região de Xingó. Anais XII Simpósio Brasileiro de Sensoriamento Remoto. Goiânia: INPE FREIRIA, G. A. Diversidade genética da abelhas Eufriesea violaceae (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Dissertação de Mestrado: Universidade Estadual de Londrina, FREIRIA, G. A.; RUIM, J. B.; SOUZA, R. F.; SOFIA, S. H. Population structure and genetic diversity of the orchid bee Eufriesea violacea (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) from Atlantic Forest remnants in southern and southeastern Brazil. Apidologie, v. 43, p , FREITAS, R. F. Diversidade e sazonalidade de abelhas Euglossini Latreille (Hymenoptera: Apidae) em fitofisionomias do bioma cerrado em Uberlância, MG. Uberlândia: Universidade Federal de Uberlândia, f p. GALINDO-LEAL, C.; CÂMARA, I. G. Mata Atlântica: biodiversidade, ameaças e perspectivas. São Paulo: Fundação SOS Mata Atlântica, GARÓFALO, C. A. Social structure of Euglossa cordata nests (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Entomologia Generalis, v. 11, p , GRODNITSKY, D. L. Form and function of insect wings: The evolution of biological structures. Baltimore: Johns Hopkins University Press, GUIMARÃES, M. O. Comunidade de abelhas Euglossina (Hymenoptera: Apidae) em fragmentos de Mata Atlântica e Mata Litorânea no estado do Ceará. Ceará: Universidade Federal do Ceará, GULLAN, P. J.; CRANSTON, P. S. The insects: an outline of entomology. London: Chapman and Hall, HAAVIER, J.; SAETRE, G. -P.; MOUM, T. Discrepances in population differentiation a microsatellites, mitochondrial DNA an plumage colour in the pied flycatcher inferring evolutionary processes. Molecular Ecology, v. 9, p ,

47 Capítulo 1 Introdução geral HILL, S. H. C.; WILLIAMS, N. H.; DODSON, C. H. Floral fragrances and isolation in the genus Catasetun. Biotropica, v. 4(2), p , HONG-WEI, T.; GUO-HUA, L.; XIA, D.; RUI-QING, L.; HUI-QUN, S.; SI-YANG, H.; ZI-GUO, Y.; GUANG-HUI, Z.; XING-QUAN, Z. The Complete Mitochondrial Genome of the Asiatic Cavity-Nesting Honeybee Apis cerana Hymenoptera Apidae. PLoS ONE, v. 6, n. 8, p. 1-10, HOWARD, R. W.; BLOMQUIST, G. J. Ecological, behavioral, and biochemical aspects of insect hydrocarbons. Annual Review of Entomology, v. 50, p , INOUYE, D. W. Flight temperatures of male euglossine bees (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Journal of the Kansas Entomological Society, v. 48, p , JANZEN, D. H. Euglossine bees as long-distance pollinators of tropical plants. Science, v. 171, p , JANZEN, D. H.; DEVRIES, P. J.; HIGGINS, M. L.; KIMSEY, L. S. Seasonal and site variation in Costa Rican euglossine bees at chemical baits in lowland desciduos and evergreen forest. Ecology, v. 63, n. 1, p , KATHER, R.; MARTIN, S. Cuticular hydrocarbon profiles as a taxonomic tool: advantages, limitations and technical aspects. Physiol. Entomol., v. 37, p , LEAL, I. R.; TABARELLI, M.; SILVA, J. M. C. Ecologia e conservação da Caatinga. Recife: Editora Universitária, UFPE, p. LEVIN, S. A. The Problem of Pattern and Scale in Ecology: The Robert H. MacArthur Award Lecture. Ecology, v. 73, n. 6, p , LOCKEY, K. H. Cuticular hydrocarbons of Locusta, Schistocera and Periplaneta and their role in waterproofing. Insect Biochem., v. 6, p , LOCKEY, K. H. Lipids of the insect cuticle: origin, composition and function. Comparable Biochemistry and Physiology, v. 89B, p , LOPES, A. V.; MACHADO, I. C.; AGUIARA, A. V.; REBÊLO, J. M. A scientific note on the occurrence of Euglossini bees in the Caatinga a Brazilia tropical dryforest. Apidologie, v. 38, p ,

48 Capítulo 1 Introdução geral LÓPEZ-URIBE, M. M. Dinâmica e estrutura genética populacional de abelhas Euglossini (Hymenoptera: Apidae) visitantes florais de Thevetia peruviana em áreas urbanas. São Carlos, SP: UFSCar, p. LÓPEZ-URIBE, M. M.; ALMANZA, M. T.; MARINA ORDOÑEZ, M. Diploid male frequencies in Colombian populations of euglossine bees. Biotropica, v. 39, p , LORENZI, M. C.; BAGNÈRES, A. G.; CLÉMENT, J. L. The role of cuticular hydrocarbons in social insects: is it the same in paper wasps?. In: TURILLAZZI, S.; WEST-EBERHARD, M. J. Natural History and Evolution of Paper Wasps. UK: Oxford University Press, p LORENZON, M. C.; MATRANGOLO, C. A. R.; SCHOEREDER, J. H. Flora visitada pelas abelhas eussociais (Hymenoptera, Apidae) na Serra da Capivara, em Caatinga do Sul do Piauí. Neotropical Entomology, v. 32, p , LOWE, A.; HARRIS, S.; ASHTON, P. Ecological genetics: design, analysis and application. New Jersey: Blackwell Publishing, p. MACHADO, I. C.; LOPES, A. V. Floral traits and pollination systems in the Caatinga, a brazilian tropical dry forest. Ann. Bot., v. 94, p. 1-12, MARTIN, S. J.; DRIJFHOUT, F. P. A review of ant cuticular hydrocarbons. J. Chem. Ecol., v. 35(10), p , MARTIN, S. J.; WEIHAO, Z.; DRIJFHOUT, F. P. Long-term stability of cuticular hydrocarbons facilitates chemotaxonomy using museum specimens. Biological Journal of the Linnean Society, v. 96, p , MARTINS, C. F. Comunidade de abelhas (Hym., Apoidea) da Caatinga e do Cerrado com elementos de campo rupestre do estado da Bahia, Brasil. Rev. Nordestina Biol., v. 9, p , MARTINS, C. F.; SOUZA, A. K. P. Estratificação vertical de abelhas Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em uma área de Mata Atlântica, Paraíba, Brasil. Rev. Bras. Zool., v. 22, p , MELO, G. A. R. Apidae (subtribos Meliponina e Euglossina) da região dos lagos do Amapá. In: COSTA NETO, S. V. Inventário Biológico das Áreas do Sucuriju e Região dos Lagos, no Amapá: PROBIO. Macapá: IEPA, p

49 Capítulo 1 Introdução geral MENDES, M. F.; FRANCOY, T. M.; NUNES-SILVA, P.; MENEZES, C.; IMPERATRIZ-FONSECA, V. L. Intra-populational variability of Nannotrigona testaceicornis Lepeletier 1836 (Hymenoptera, Meliponini) using relative warp analysis. Bioscience Journal, v. 23, p , MICHENER, C. D. The social behavior of the bees. A comparative study. Cambridge: Harvard University Press, MICHENER, C. D. Classification of the Apidae (Hymenoptera). University of Kansas Science Bulletin, v. 54(4), p , MICHENER, C. D. The bees of the world. Baltimore, London: Johns Hopkins, MILET-PINHEIRO, P.; SCHLINDWEIN, C. Do euglossine males (Apidae, Euglossini) leave tropical rainforest to collect fragrances in sugarcane monocultures? Rev. Bras. Zool., v. 22, p , MINCKLEY, R. L.; REYES, S. G. Capture of the orchid bees, Eulaema polychrome (Friese) (Apide: Euglossini) in Arizona, with notes on N+orthern distributions of other Mesoamerican bees. Journal of the Kansas Entomological Society, v. 69(1), p , MONTEIRO, L. R.; REIS, S. F. Princípios de morfometria geométrica. Ribeirão Preto: Holos, p. MORAES, D. A. A Morfometria Geométrica e a Revolução na Morfometria : localizando mudanças na forma dos organismos. Boletim, São Paulo: USP, v. 3, n. 3, MORAWETZ, L.; GRUBER, M. H. Orchid bees. In: JARAU, S.; MORAWETZ, L; REICHLE, C.; GRUBER, M. H.; HUBER, W.; WEISSENHOFER, A. Corbiculate Bees of the Golfo Dulce Region, Costa Rica. Vienna: Verein zur Förderung der Tropenstation La Gamba, p MORI, K. Semiochemical Synthesis, Stereochemistry and Bioactivity. European Journal Organic Chemistry, v. 8, p , MORITZ, C.; DOWLING, T. E.; BROWN, W. M. Evolution of animal mitochondrial DNA. Relevance for populaton biology and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, v. 18, p ,

50 Capítulo 1 Introdução geral MOURA, D. C.; SCHLINDWEIN, C. Mata ciliar do Rio São Francisco como biocorredor para Euglossini (Hymenoptera: Apidae) de florestas tropicais úmidas. Neotropical Entomology, v. 38(2), p , MOURA, F. B. P. A Mata Atlântica em Alagoas. Maceió: Edufal, p. MOURA, T. S.; MAUÉS, M. M. Diversidade de abelhas Euglossina (Hymenoptera, Apidae, Apini) no município de Marabá, Estado do Pará. XXVIII Congresso Brasileiro de Zoologia. Bemém: [s.n.] p MOURE, J. S. A checklist for the known euglossine bees (Hymenoptera: Apidae). [S.l.]:[s.n.] p MYERS, N.; MITTERMEIER, R. A.; MITTERMEIER, C. G.; FONSECA, G. A.; KENT, J. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature, v. 403, p , NEMÉSIO, A. Orchid bees (Hymenoptera: Apidae) of Ilha de Maracá, Roraima, Northern Brazil. Lundiana, v. 6, p , NEMÉSIO, A. Euglossa anodorhynchi sp. n. (Hymenoptera: Apidae), a new orchid bee from Southern Brazil. Neotropical Entomology, v. 35, n. 2, p , NEMÉSIO, A. Orchid bees (Hymenoptera: Apidae) of Brazilian Atlantic Forest. Zootaxa, v. 2041, p , NEMÉSIO, A.; MORATO, E. F. The orchid-bee fauna (Hymenoptera: Apidae) of Acre state (Northwestern Brazil) and a re-evaluation of euglossine bait-trapping. Lundiana, v. 7, p , NEMÉSIO, A.; RASMUSSEN, C. Nomenclatural issues in the orchid bees (Hymenoptera: Apidae: Euglossina) and an updated catalogue. Zootaxa, v. 3006, p. 1 42, NEMÉSIO, A.; SILVEIRA, F. A. Edge Effects on the Orchid-Bee Fauna (Hymenoptera: Apidae) at a Large Remnant of Atlantic Rain Forest in Southeastern Brazil. Neotropical Entomology, v. 35, n. 3, p , NEVES, E. L.; VIANA, B. F. Comunidade de machos de Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) das Matas Ciliares da margem esquerda do Médio Rio São Francisco, Bahia. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, v. 28, p ,

51 Capítulo 1 Introdução geral NOGUEIRA, P. C.; MARSAIOLI, A. J.; AMARAL, M. C.; BITTRICH, V. The fragrante floral oils of Tovomita species. Phytochemisty, v. 49(4), p , NORDLUND, D. Semiochemicals: a review of the terminology. In: NORDLUND, D.; JONES, R.; LEWIS, W. Semiochemicals. Their Role in Pest Control. New York: Wiley & Sons, p NORDLUND, D.; LEWIS, W. Terminology of chemical releasing stimuli in intraspecific and interspecific interactions. Journal of Chemical Ecology, v. 2, p , NUNES, L. A.; COSTA-PINTO, M. F.; CARNEIRO, P.; PEREIRA, D. G.; WALDSCHMIDT, A. M. Divergência genética em Melipona scutellaris Latreille (Hymenoptera: Apidae) com base em caracteres morfológicos. Bioscience Journal, v. 23, p. 1-9, NUNES, L. A.; ARAÚJO, E. D.; CARVALHO, C.; WALDSCHMIDT, A. M. Population divergence of Melipona quadrifasciata anthidioides (Hymenoptera: Apidae) endemic to the semi-arid region of the State of Bahia, Brazil. Sociobiology, v. 52, p , NUNES, T. M. Sobre a ecologia química de Friesella schrottkyi Friese 1900 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) com ênfase na regulação social. Tese de Doutorado: Universidade de São Paulo, f. p. NUNES, L. A.; ARAÚJO, E. D.; CARVALHO, C.; WALDSCHMIDT, A. M. Cuticular hydrocarbons in the stingless bee Schwarziana quadripunctata (Hymenoptera, Apidae, Meliponini): differences between colonies, castes and age. Gen. Mol. Res., v. 8, p , OI, C. A. Estrutura sociogenética de ninhos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) e estrutura genética das populações urbanas de Euglossa cordata do estado de São Paulo. São Carlos, SP: UFSCar, OLIVEIRA, B. G. D. A. Avaliação da diversidade de abelhas silvestres Euglossini (Hymenoptera, Apoidea) na região do Delta do Parnaíba, Brasil e a percepção da importância das abelhas pela população local. Dissertação: Universidade Federal do Piauí, OLIVEIRA, F. F. Diversidade genética de populações da abelha sem ferrão Plebeia remota: análise do DNA mitocondrial e microssatélites. Dissertação de mestrado: Universidade de São Paulo,

52 Capítulo 1 Introdução geral OLIVEIRA, M. L. Nova hipótese de relacionamento filogenético entre os gêneros de Euglossini e entre as espécies de Eulaema Lepeletier, 1841 (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Acta Amazônica, v. 36, p , OLIVEIRA, M. L.; CAMPOS, L. A. O. Abundância, riqueza e diversidade de abelhas Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em florestas contínuas de terra firme na Amazônia Central, Brasil. Revista brasileira Zoologia, v. 12, n. 3, p , PACKER, L.; OWEN, R. Population genetic aspects of pollinator decline. Conservation Ecology, v. 5(1), p. 4, PAMILO, P.; VARVIO-AHO, S. L.; PEKKARINEN, A. Low enzyme gene 702 variability in Hymenoptera as a consequence of haplodiploidy. Hereditas, v. 88, p , PARRA-H, A.; OSPINA-TORRES, R.; RAMÍREZ, S. Euglossa natesi n. sp., a new species of orchid bee from the Chogó region of Colombia and Ecuador (Hymenoptera: Apidae). Zootaxa, v. 1298, p , PENHA, R. E.; GAGLIANONE, M. C.; ALMEIDA, F. S.; BOFF, S.; SOFIA, S. Mitochondrial DNA of Euglossa iopoecila (Apidae, Euglossini) reveals two distinct lineages for this orchid bee species endemic to the Atlantic Forest. Apidologie, PERES-NETO, P. R.; VALENTIN, J. L.; FERNANDEZ, F. A. S. Introdução a análises morfométricas. Oecologia Australis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 2, p , PÉREZ-SWEENEY, B. M.; RODRIGUES, F. P.; MELNICK, D. J. Metodologias moleculares utilizadas em genética da conservação. In: CULLEN, L. J.; RUDRAN, R.; VALLADARES- PÁDUA, C. Métodos de estudo em biologia da conservação e manejo da vida Silvestre. Curitiba: Editora da UFPR, p PERUQUETTI, R. C.; CAMPOS, L. A.; COELHO, C. D.; LISBOA, L. C.; ABRANTES, C. V. Abelhas Euglossini (Apidae) de áreas de Mata Atlântica: abundância, riqueza e aspectos biológicos. Rev. Bras. Zool., v. 16, p , POWELL, A. H.; POWELL, G. V. N. Population dynamics of male euglossine bees in Amazonian forest fragments. Biotropica, v. 19, p , RAMALHO, A. V.; GAGLIONE, M. C.; OLIVEIRA, M. L. Comunidade de abelhas Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em fragmentos de Mata Atlântica no Sudeste do Brasil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 53, n. 1, p ,

53 Capítulo 1 Introdução geral RAMIREZ, S.; DRESSLE, R. L.; OSPINA, M. Euglossine bees (Hymenoptera: Apidae) from the Neotropical Region: A species checklist with notes on their biology. Biota Colombiana, v. 3(1), p , RAMIREZ-ARRIAGA, E.; CUADRIELLO-AGUILAR, J. I.; HERNANDEZ, E. M. Nest structure and parasite of Euglossa atroveneta Dressler (Apidae: Bombinae: Euglossini) at Union Juarez, Chiapas, Mexico. J. Kansas Entomol. Soc., v. 69, p , REBÊLO, J. M. M. História natural das Euglossíneas. As abelhas das orquídeas. São Luis: Lithograf Editora, p. REBÊLO, J. M. M.; CABRAL, A. J. M. Abelhas Euglossinae de Barreirinhas, zona litoral da baixada oriental maranhense. Acta Amazônica, v. 27, p , REBÊLO, J. M. M.; GARÓFALO, C. A. Comunidades de Machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) em matas semidecíduas do nordeste do Estado de São Paulo. Anais Sociedade Entomológica do Brasil, v. 26, n. 2, p , REBÊLO, J. M. M.; RÊGO, M. M. C.; ALBUQUERQUE, P. M. C. Abelhas (Hymenoptera, Apoidea) da região setentorial do estado do Maranhão, Brasil. In: MELO, G. A. R.; ALVES- DOS-SANTOS, I. Apoidea Neotropica: Homenagem aos 90 anos de Jesus Santiago Moure. Crisciúma: Editora UNESC, p REBÊLO, M. M.; GARÓFALO, C. A. Diversidade e sazonalidade de machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) e preferências por iscas-odores em um fragmento de florestas no Sudeste do Brasil. Revista Brasileira de Biologia, v. 51, p , REIS, M. G. A contribuição da química para o estudo de Orchidaceae e seus polinizadores. Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP.: Dissertação de Mestrado, REIS, S. F. Morfometria e estatística multivariada em biologia evolutiva. Revista Brasileira de Zoologia, v. 5, n. 4, p , REYMENT, R. A.; BLACKITH, R. E.; CAMPBELL, N. A. Multivariate morphometrics. 2. ed. London: Academic Press, p. RIBEIRO, M. F.; HILÁRIO, S. D.; CORTOPASSI-LAURINO, M. Morfometria de machos e fêmeas de Euglossa annectans Dresler 1982 (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Anais do VIII Encontro sobre Abelhas. Ribeirão Preto,SP: [s.n.] p

54 Capítulo 1 Introdução geral RICHTSMEIER, J. T.; DELEON, V. B.; LELE, S. R. The Promise of Geometric Morphometrics. Yearbook of Physical Anthropology, v. 45, p , RODAL, M. J. N.; SAMPAIO, E. V. S.; FIGUEIREDO, M. A. Manual sobre métodos de estudo florístico e fitossociológico - Ecossistema Caatinga. Brasília: Sociedade Botânica do Brasil. 24p. Brasília: Sociedade Botânica do Brasil, p. ROHLF, F. J. Morphometric. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, v. 21, p , ROHLF, F. J.; BOOKSTEIN, F. L. A comment on shearing as a method for "size correction". Systematic Zoology, v. 36, n. 4, p , ROHLF, F. J.; MARCUS, L. F. A revolution in morphometrics. Trends in Ecology and Evolution, v. 8, p , ROIG-ALSINA, A.; MICHENER, C. D. Studies of the phylogeny and classification of longtongued bees (Hymenoptera: Apoidea). University of Kansas Science Bulletin, v. 55, p , ROSENZWEIG, M. Species diversity in space and time. New York: Cambridge University Press, ISBN 436. ROSS, J. Ecogeografia do Brasil: subsídios para planejamento ambiental. São Paulo: Oficina de Textos, ROUBIK, D. D. Ecology and natural history os tropical bees. New York: Cambridge Univ. Press, p. ROUBIK, D. W.; ACKERMAN, J. D. Long-term ecology of euglossine orchid bees (Apidae: Euglossini) in Panama. Oecologia, v. 73, p , ROUBIK, D. W.; HANSON, P. E. Orchid bees from tropical America: biology and field guide. Santo Domingo de Heredia, Costa Rica: INBio Press, ROUBIK, D. W.; WEIGHT, L. A.; BONILLA, M. A. Population genetics, diploid males, and limits to social evolution of euglossine bees. Evolution, v. 50, p , RUTTNER, F. Biogegraphy and Taxonomy of Honeybees. Berlin: Springer, p. RUTTNER, F.; TASSENCOURT, L.; LOUVEAUX, J. Biometrical-statistical analysis of the geographic variability of Apis mellifera L. Apidologie, v. 9, p ,

55 Capítulo 1 Introdução geral SANTOS, A. M.; SOFIA, S. H. Horário de atividade de machos de Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em um fragmento de floresta semidecídua no Norte do estado do Paraná. Acta Scientiarum, v. 24, p , SANTOS, F. M.; CARVALHO, C. A. L.; SILVA, R. F. Diversidade de abelhas (Hymenoptera: Apoidea) em uma área de transição Cerrado - Amazônia. Acta Amazonica, v. 34, n. 2, p , SARMIENTO, G. The dry plant formation of South America and their floristic connections. J. Biogeography, v. 2, p , SATO, J. Mata Atlântica - Direito Ambiental e a Legislação. São Paulo: Hemus, SAZIMA, M.; VOGUEL, S.; COCUCCI, A.; HAUSNER, G. The perfume of flowers of Cyphomandra (Solanacea): pollination by euglossine bees, bellows mechanism, osmophores, and volatiles. Plant Systematics and Evolution, v. 187, p , SCHÄFFER, W. B.; PROCHNOW, M. A Mata Atlântica e você: como preservar, recuperar e se beneficiar da mais ameaçada floresta brasileira. Brasília: APREMAVI, SCHMITT, T. Communication in the Hymenoptera Chemistry, Ecology and Evolution. Würzburg: Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von, SCHRÖDER, S.; DRESCHER, W.; STEINHAGE, V.; KASTENHOLZ, B. An Automated Method for the Identification of Bee Species (Hymenoptera: Apoidea). International Symposium on Conserving Europe's Bees, Proceedings, London: International Bee Research Association & Linnean Society, SCHRÖDER, S.; WITTMANN, D.; DRESCHER, W.; ROTH, V.; STEINHAGE, V.; CREMERS, A. B. The new key to bees: Automated Identification by image analysis of wings. In: KEVAN, P.; IMPERATRIZ-FONSECA, V. L. Pollinating Bees. The conservation link between agriculture and nature. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, p SCHULTZ, T.; ENGEL, M. S.; PRENTICE, M. Resolving conflict between morphological and molecular evidence for the origin of eusociality in the "corbiculate" bees (Hymenoptera: Apidae): a hypothesis testing approach. The University of Kansas Natural History Museum Spec. Publ., v. 24, p ,

56 Capítulo 1 Introdução geral SHOEMAKER, D. D.; COSTA, J. T. I.; ROSS, K. G. Estimates of heterozygosity in two social insects using a large number of electrophoretic markers. Heredity, v. 69, p , SILVA, A. C. C. Monumento Natural Grota do Angico: florística, estrutura da comunidade, aspectos autoecológicos e conservação. Dissertação de Mestrado: Universidade Federal e Sergipe, f p. SILVA, J. M. C.; DINNOUTI, A. Análise de Representatividade das unidades de conservação federais de uso indireto na Floresta Atlântica e Campos Sulinos. In: PINTO, L. P. Padrões de Biodiversidade da Mata Atlântica do Sul e do Suldeste. São Paulo, Campinas: Conservation International, p SILVA, O.; REGO, M. M.; ALBUQUERQUE, P. M.; RAMOS, M. C. Abelhas Euglossina (Hymenopter: Apidae) em Área de Restinga do Nordeste do Maranhão. Neotropical entomology, v. 38(2), p , SILVA, R. A. O. A morfometria geométrica e a diferenciação de espécies do gênero Plebeia (Apidae, Meliponini). Ribeirão Preto, São Paulo: FFCLRP, SILVEIRA, B. E. Morfometria geométrica comparativa de asas de Sarcophagidae (Diptera) de interesse forense: uma ferramenta eficaz para a identificação? Curitiba: Universidade Federal do Paraná, SINGER, T. L.; ESPELIE, K. E.; GAMBOA, G. J. Nest and nestmate discrimination in independent-founding wasps. In: VANDER MEER, R. K.; BREED, M. D.; WINSTON, M. L.; ESPELIE, E. K. Pheromone communication in social insects. Westview: Boulder, p SKOV, C.; WILLEY, J. Establishment of the neotropical orchid bee Euglossa viridissima (Hymenoptera: Apidae) in Florida. Florida Entomologist, v. 88, p , SLICE, D.; BOOKSTEIN, F.; MARCUS, L.; ROHLF, F. J. A Glossary for Geometric morphometrics. [S.l.]: Acesso: Janeiro de 2011, SOFIA, S. H.; PAULA, F. M.; SANTOS, A. M.; ALMEIDA, F. S.; SODRÉ, L. M. Genetic structure analyses of Eufriesea violacea (Hymenoptera, Apidae) populations from southern Brazilian Atlantic rainforest remnants. Genet. Mol. Biol., v. 28, p ,

57 Capítulo 1 Introdução geral SOFIA, S. H.; SUZUKI, K. M. Comunidades de machos de abelhas Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em fragmentos florestais no sul do Brasil. Neotropical Entomology, v. 33, p , STORCK-TONON, D.; MORATO, E. F.; OLIVEIRA, M. L. Fauna de Euglossina (Hymenoptera: Apidae) da Amazonia sul-ocidental, Acre, Brasil. Acta Amazonica, v. 39, n. 3, p , SUNNUCKS, P. Efficient genetic markers for population biology. Trends in Ecology and Evolution, v. 15, p , SUZUKI, K. M.; ARIAS, M. C.; GIANGARELLI, D. C.; FREIRIA, G. A.; SOFIA, S. H. Mitochondrial DNA diversity of orchid bee Euglossa fimbriata (Hymenoptera: Apidae) populations assessed by PCR-RFLP. Biochem. Genet., v. 48, p , TABARELLI, M.; SILVA, J. M. C. Ecologia e conservação da Caatinga. Recife: UFPE, p. TAKAHASHI, N C; PERUQUETTI, R C; DEL LAMA, M A; CAMPOS, L A O; A reanalysis of diploid male frequencies in euglossine bees (Hymenoptera: Apidae). Evolution, v. 55, p , TONHASCA JR, A.; BLACKMER, J. L.; ALBUQUERQUE, G. S. Abundance and diversity of euglossine bees in the fragmented landscape of the Brazilian Atlantic Forest. Biotropica, v. 34, p , TONHASCA, A. J. Ecologia e História Natural da Mata Atlântica. Rio de Janeiro: Interciência, UNRUH, T. R.; MESSING, R. H. Intraspecific biodiversity in Hymenoptera: Implications for conservation and biological control. In: LASALLE, J.; GAULD, I. D. Hymenoptera and Biodiversity. Wallingford: C-A-B International, p VANDER MEER, R. K.; MOREL, L. Nestmate recognition in ants. In: VANDER MEER, R. K.; BREED, M. D.; WINSTON, M. L.; ESPELIE, E. K. Pheromone communication in social insects. Westview: Boulder, p VIANA, B. F.; KLEINERT, A. M. P.; NEVES, E. L. Comunidade de Euglossini (Hymenoptera, Apidae) das dunas litorâneas do Abaeté, Salvador, Bahia, Brasil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 46, n. 4, p ,

58 Capítulo 1 Introdução geral VOGEL, S. Parfümsammelnde Bienen als Bestäuber von Orchidaceen und Gloxinia. Österr. Botan. Zeit, v. 113, p , WCISLO, W. T.; CANE, J. H. Floral resource utilization by solitary bees (Hymenoptera: Apoidea) and exploitation of their stored foods by natural enemies. Annual Review of Entomology, 41, WHITTEN, W. M.; YOUNG, A.; STERN, D. L. Nonfloral sources of chemicals that attract male euglossine bees (Apidae: Euglossini). J. Chem. Ecol., v. 19, p , WILLIAMS, N. H. The biology of orchids and euglossine bees. In: ARDITTI, J. Orchid biology: reviews and perspectives, II. Ithaca, NY: Cornell University Press, p WILLIAMS, N. H.; DRESSLER, R. L. Euglossine pollination of Spathiphyllum (Araceae). Selbyana, v. 1, p , WILSON, A C; CANN, R L; GEORGE, M; GYLLENSTEN, U B; HELMBYCHOWSKI, K M; HIGUSHI, R G; PALUMBI, E M; SAGE, R D; STONEKING, M. Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological Journal of Linnean Society, v. 26, p , WILSON, E. O. The insects societies. Cambridge: Belknap Press. Harvard University Press. Cambridge Massachusetts, p. WITTMANN, D.; RADTKE, R.; HOFFMANN, M.; BLOCHTEIN, B. Seasonality and seasonal changes in preferences for chemical baits of males Eufriesea violacea in Rio Grande do Sul, southern Brazil. In: EDER, J.; H, R. Chemistry and Biology of social insects. Munique: Verlag J. Peerny, p ZANELLA, F. C. V. The bees of the Caatinga (Hymenoptera, Apoidea, Apiformes): A species list and comparative notes regarding their distribution. Apidologie, v. 31, p , ZANELLA, F. C. V.; MARTINS, C. F. Abelhas da caatinga: biogeografia, ecologia e conservação. In: LEAL, I. R.; TABARELLI, M.; SILVA, J. M. C. Ecologia e conservação da Caatinga. Recife: Universitária da UFPE, p ZAYDE, A.; ROUBIK, D. W.; PACKER, L. Use of diploid male frequency data as an indicator of pollinator decline. Proc. R. Soc. Lond. B, v. 271, p. 9 12,

59 Capítulo 1 Introdução geral ZAYED, A.; PACKER, L. Complementary sex determination substantially increases extinction proneness of haplodiploid population. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 102, p , ZIMMERMANN, Y. Chemical and molecular ecology of orchid bees (Euglossini). [S.l.]: Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, ZIMMERMANN, Y.; SCHORKOPF, D. L.; MORITZ, R. F.; PEMBERTON, R. W.; QUEZADA- EUAN, J. J.; ELTZ, T. Population genetic structure of orchid bees (Euglossini) in anthropogenically altered landscapes. Conserv. Genetic, v. 12, p , ZIMMERMANN, Y.; RAMIREZ, S. R.; ELTZ, T. Chemical niche differentiation among sympatric species of orchid bees. Ecology, v. 90(11), p , ZUCCHI, R.; SAKAGAMI, S. F.; CAMARGO, J. M. F. Biological observations on a neotropical parasocial bee, Eulaema nigrita, with a review on the biology of Euglossinae (Hymenoptera, Apidae). A comparative study. Journal of the Faculty os Science Hokkaido University VI Zoology, v. 17(2), p ,

60 Vapítulo 2 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil.

61 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. ESTRUTURA E DINÂMICA DAS POPULAÇÕES DE EUGLOSSINI SOB A INFLUÊNCIA DA HETEROGENEIDADE AMBIENTAL E ISCAS AROMÁTICAS EM FRAGMENTOS DE CAATINGA E MATA ATLÂNTICA DE SERGIPE, BRASIL. As abelhas das orquídeas apresentam diferentes características quando comparadas às demais corbiculadas, grupo monofilético de abelhas no qual atualmente são classificadas. Um exemplo disto são os machos que vistam flores em busca de compostos aromáticos; apresentam grande importância na polinização principalmente das orquídeas e são caracterizadas como indicadores ambientais. Endêmicas de regiões neotropicais essas abelhas ainda são pouco conhecidas. Nesse contexto, objetivou-se caracterizar a fauna de Euglossini e suas relações ecológicas em áreas remanescentes da Caatinga e Mata Atlântica do estado de Sergipe. Foram coletados com uso de seis compostos aromáticos 1770 machos de Euglossini de 17 espécies pertencentes à quatro dos cinco gêneros da tribo. Os resultados demonstraram que a abundância de indivíduos variou de acordo com as condições ambientais e ao longo do dia, sendo esta maior nos fragmentos de Mata Atlântica. O período de maior frequência de visitação foi entre as 9:00h e 10:00h com pequena variação entre os biomas; a isca mais atrativa foi o cineol que foi responsável por 53,83% do total de indivíduos coletados. As áreas de estudos apresentaram-se distintas com uma similaridade de 28% entre os biomas; os fatores ambientais analisados exerceram influência sobre a abundância dos machos. A estrutura da comunidade de abelhas apresentou semelhança com alguns estudos realizados na região nordeste. 44

62 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Introdução As abelhas Euglossini ocorrem exclusivamente na região Neotropical (NEMÉSIO, 2009) constituindo um grupo monofilético (RAMÍREZ, ROUBIK, et al., 2010) que tem como principais características morfológicas o corpo robusto com tamanho variando de médio à grande, revestido por tegumento metálico brilhante, glossa extremamente longa que em algumas espécies pode ser maior que o corpo e machos com tíbia modificada para coleta de substâncias aromáticas (DRESSLER, 1982); essas substâncias coletadas possivelmente são utilizadas pelos machos durante a corte (CAMERON, 2004; RAMÍREZ, ROUBIK, et al., 2010). São abelhas que apresentam voo rápido e difíceis de serem observadas, o que dificultou os estudos iniciais (FARIAS, MADEIRA-DA-SILVA, et al., 2007; GRANDOLFO, BOZZA JUNIOR, et al., 2013), e que estão classificadas em cinco gêneros: Aglae, Eufriesea, Euglossa, Eulaema e Exaerete (DODSON, DRESSLER, et al., 1969), sendo algumas das espécies consideradas indicadores ambientais de áreas perturbadas (ZUCCHI, SAKAGAMI e CAMARGO, 1969). As fêmeas de Euglossini, com exceção das espécies cleptoparasitas, utilizam resinas e outros materiais como lama, cortiça, talos, folhas e fezes para a construção dos ninhos (Figura 1) que, em geral, são construídos no solo (DRESSLER, 1982), localizados nas partes altas das árvores (RAMIREZ-ARRIAGA, CUADRIELLO-AGUILAR e HERNANDEZ, 1996; YOUNG, 1985) ou em cavidades pré-existentes (SANTOS e GARÓFALO, 1994), cerca de 80 % da biologia de nidificação das espécies ainda é desconhecida por conta da dificuldade em achar os ninhos dessas espécies na natureza (CAMERON, 2004). Devido à grande capacidade de voo, podem se deslocar por longas distâncias em florestas contínuas, destacando-se assim por serem polinizadores de espécies vegetais com distribuição esparsa (JANZEN, 1971), como também são consideradas importantes para a manutenção de muitos ecossistemas devido à polinização das famílias Orchidaceae (HILL, WILLIAMS e DODSON, 1972; SINGER e SAZIMA, 1999), Lecythidaceae (PRANCE, 1976; KNUDSEN e MORI, 1996), Euphorbiaceae (ARMBRUSTER, KELLER, et al., 1989), Araceae (MONTALVO e ACKERMAN, 1986), Solanaceae (SOARES, CAMPOS, et al., 1989), entre outras. 45

63 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Figura 1 Algumas estruturas de ninhos encontradas para a tribo Euglossini. A ninho de Eulaema nigrita construído dentro de um tijolo onde as células foram construídas pelo uso de resina, barro e fezes; B ninho de Euglossa townsendi com células feitas a partir de resinas dentro de bambu; C ninho de Eufriesea sp. encontrado em ninhoarmadilha feito em bambu com célula construídas em cortiça e folhas. Fonte: LÓPEZ-URIBE, Os machos da tribo visitam as flores em busca de substâncias odoríferas (WHITTEN, YOUNG e STERN, 1993) acumulando-as em uma bolsa que apresentam no último par de pernas, estes compostos aromáticos vão além das fontes florais, podendo ser coletados em madeiras podres, frutas em decomposição, troncos de árvores e fezes (VOGEL, 1966; ZUCCHI, SAKAGAMI e CAMARGO, 1969; WILLIAMS, 1982; ACKERMAN, 1983; REBÊLO e GARÓFALO, 1991; WHITTEN, YOUNG e STERN, 1993; ELTZ, WHITTEN, et al., 1999; ELTZ, ZIMMERMANN, et al., 2007; BRAGA e GARÓFALO, 2003; ZIMMERMANN, RAMIREZ e ELTZ, 2009). O uso destes voláteis pelos machos está associado à síntese de feromônios sexuais (WILLIAMS e WITTHEN, 1983). A produção de compostos sintéticos similares à estas fragrâncias têm auxiliado no estudo da riqueza e diversidade das abelhas Euglossini em diferentes ambientes aumentando o número de espécies descritas (KIMSEY e DRESSLER, 1986). A abundância, composição e riqueza das populações sofre grande influência do tamanho e condições do fragmento vegetal em que se encontram (BROSI, 2009), onde a estabilidade das populações florais e destas abelhas estão intimamente ligadas, de modo 46

64 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. que a redução de um afeta a estabilidade do outro (POWELL e POWELL, 1987). A alta sensibilidade das Euglossini à fragmentação e ao desmatamento tem inserido estas no grupo dos possíveis indicadores ambientais (Sofia e Suzuki, 2004). Brosi (2009), por exemplo, demonstrou que o tamanho do fragmento e a extensão de suas bordas mostram-se relacionado à riqueza e abundância das espécies. Em um estudo das populações de Euglossini na região amazônica por Power e Power (1987), foi revelado que para várias espécies a frequência de visita às iscas reduzia proporcionalmente ao tamanho do fragmento. A fragmentação de habitats está relacionada ao uso da terra, abrangendo questões econômicas, sociais, culturais, institucionais e tecnológicas. A presença de monoculturas, pastagens, clareiras e áreas irrigadas, com vistas ao aumento da produção de alimentos são os elementos que mais destroem os habitats naturais (Kevan, 1999; Viana et al., 1997). De acordo com Ramalho (2006) estas abelhas precisam ser estudadas em busca de um maior conhecimento sobre sua diversidade, modo de vida, reprodução e habitats por serem excelentes polinizadores, tendo assim influência sobre o sucesso reprodutivo de muitas plantas e consequentemente sobre os processos de regeneração das matas. No Brasil, estudos sistematizados sobre a fauna de Euglossini tem se concentrado em florestas tropicais com destaque para a região da Amazônia Central (POWELL e POWELL, 1987; BECKER, MOURE e PERALTA, 1991; MORATO, CAMPOS e MOURE, 1992) e estado de São Paulo (REBÊLO e GARÓFALO, 1991; REBÊLO, 1993). No entanto, devido à relevância desses indivíduos como polinizadores e indicadores da qualidade ambiental há uma necessidade de um maior número de trabalhos fora destas áreas úmidas, caso contrário o uso destas como bioindicadores fica restrito (PERUQUETTI, CAMPOS, et al., 1999; SOFIA e SUZUKI, 2004; FERREIRA, PINHO, et al., 2011), ainda que muitos estados continuem tendo sua fauna de Euglossini desconhecida apesar do acelerado processo de devastação ambiental (BRITO e RÊGO, 2001). Para a região nordeste, vários trabalhos foram desenvolvidos em diferentes ambientes, tais como numa área de Cerrado na baixada litorânea (REBÊLO e CABRAL, 1997), floresta secundária (BRITO e RÊGO, 2001), mata ciliar (CARVALHO, REGO e MENDES, 2006) e mata de restinga (SILVA, REGO, et al., 2009) do Maranhão, em matas ciliares (NEVES e VIANA, 1999) e dunas costeiras com vegetação de restinga (VIANA, KLEINERT e NEVES, 2002) e da Caatinga arbórea (ANDRADE-SILVA e NASCIMENTO, 2012) da Bahia, remanescentes de Mata Atlântica (BEZERRA e MARTINS, 2001; SOUZA, 47

65 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. HERNÁNDEZ e MARTINS, 2005), mata e duna (FARIAS, SILVA, et al., 2008) da Paraíba em a mata ciliar do Rio São Francisco onde foram coletados indivíduos de Euglossini nos estados de Alagoas, Bahia, Pernambuco e Sergipe (MOURA e SCHLINDWEIN, 2009). Além deste estudo, que ocorreu nas bordas do Rio São Francisco, no estado de Sergipe, o outro relato sobre essas espécies no interior do estado foi feito de maneira geral em um estudo não sistemático por Michelette (2005) na região agreste do estado, nesta área, pode ser encontrada uma vegetação de transição entre Caatinga e Mata Atlântica, onde foi coletado um pequeno número de indivíduos do gênero Euglossa que não foram classificados ao nível de espécie e El. nigrita. Objetivos Em vista do exposto, essa seção objetivou realizar um estudo comparativo sobre as espécies de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica buscando identificar a composição da fauna de Euglossini nessas áreas, que até então era praticamente desconhecida e caracterizá-la ecologicamente, estabelecendo suas relações com os biomas. Desta forma, os objetivos específicos foram: Realizar levantamento das espécies de Euglossini presente em áreas de Caatinga e Mata Atlântica; Analisar a similaridade da fauna de Euglossini nas áreas, comparando à composição amostrada em outros estudos para um maior entendimento da biogeografia do grupo; Analisar ecologicamente a fauna de Euglossini entre as fitofisionomias Caatinga e Mata Atlântica, levando em consideração aspectos como: riqueza em espécies, abundância relativa e flutuação sazonal; Avaliar a atratividade dos machos por diferentes compostos aromáticos utilizados buscando relacionar esses dados aos fatores ambientais; Verificar a variação nos sazonal e os horários de atividades dos machos de Euglossini das áreas estudadas. 48

66 Materiais e Métodos Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Localização e caracterização das áreas de estudo. O experimento foi desenvolvido na região nordeste do Brasil em duas unidades de conservação de proteção integral do Estado de Sergipe: Monumento Natural Grota do Angico (Caatinga) e Refúgio de Vida Silvestre Mata do Junco (Mata Atlântica). Monumento Natural Grota do Angico (MoNa G.A.) Criado através do Decreto nº de 21 de dezembro de 2007 com o objetivo de preservar o ecossistema da Caatinga, o Monumento Natural Grota do Angico, localizado nos municípios de Poço Redondo e Canindé do São Francisco (Figura 2), possui uma área de 2183 hectares composta por remanescentes florestais da Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro e, em quase sua totalidade, nordestino (SERGIPE, 2007; SEMARH/SE, 2010). Essa região consiste de áreas de alta à extrema importância biológica, recomendada de proteção integral com necessidade de ação urgente, composta por caatinga arbórea arbustiva e resíduos de caatinga arbórea, onde ocorre a espécie ameaçada de extinção Ara maracana e espécies endêmicas da caatinga como Capparis cynophalophora, Capparis jacobinae, Penelope jacucaca, Crypturellus noctivagus, além de apresentar áreas areníticas com flora própria e espécies de distribuição rara a exemplo de Tropidurus cocorobensis e Psilophtalmus paeminosus (SILVA, TABARELLI e FONSECA, 2004). Apesar do grande número de espécies endêmicas e raras até então encontradas, apenas algumas pertencentes à flora da região, aves, répteis, anfíbios e invertebrados foram estudados. Os municípios de Poço Redondo e Canindé do São Francisco pertencem ao território do Alto Sertão Sergipano, localizado na região noroeste do estado de Sergipe, que corresponde a Microrregião Sergipana do Sertão do São Francisco. É uma região marcada por irregularidades pluviométricas e condições geofísicas diferenciadas (SANTOS, 2010). 49

67 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Figura 2 Localização do Monumento Natural Grota do Angico com pontos de coleta marcados em amarelo. 50

68 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. De acordo com a classificação de Köppen, o clima da região é Tropical Semiárido Quente tipo BSh, com precipitações irregulares variando entre 300 a 700 mm, sendo a média anual há mais de 30 anos inferior a 500mm. O período seco nessa área em alguns anos pode ser superior a oito meses e as chuvas geralmente ocorrem entre os meses de março e julho, com maiores índices de precipitação no mês de abril. A temperatura média anual é de 25,6 C, sendo o mês mais quente e mais frio dezembro e agosto, respectivamente. Os rios na região são temporários, com exceção do Rio São Francisco, e o solo apresenta-se de dois tipos: Neossolo Litólico e Planossolo (LEITE e WANDERLEY, 1976; SANTOS e ANDRADE, 1992; OLIVEIRA, 2012). Unidade de Refúgio de Vida Silvestre Mata do Junco (RVSMJ) O Refúgio de Vida Silvestre Mata do Junco (Figura 3), que está localizado no município de Capela, é o segundo maior remanescente de Mata Atlântica do Estado de Sergipe com cerca de 894,76 hectares. Criado pelo decreto de 26 de dezembro de 2007, esta área, de grande importância ambiental apresenta 14 nascentes de rios e é refúgio de uma espécie de primata (Callicerbus coimbrai) endêmica do estado de Sergipe e litoral norte da Bahia, estando atualmente ameaçada de extinção (SEMARH/SE, 2010; SANTOS, SOUZA e SOUZA, 2007). Situado em uma área de relevo denominada Depressão Sertaneja com a presença de solo arenoso (SEMARH/SE, 2011), O RVSMJ está localizado entre áreas de cultivo de cana-de-açúcar e pequenos núcleos habitacionais, tendo sofrido com a exploração de madeira apresentando, assim, muitos trechos de sucessão ecológica e áreas bem preservadas, principalmente, próximo às nascentes dos pequenos rios (SOUZA, 2009). É caracterizado como um remanescente florestal constituído por três estratos arbóreos distintos: sub-bosque, caracterizado por apresentar folhas largas; subdossel, composto por arvoretas, lianas e trepadeiras; e dossel, formado por árvores a cima de 15 metros de altura (DANTAS, RIBEIRO, et al., 2007). 51

69 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. A B Figura 3 Localização do Refúgio da Vida Silvestre Mata do Junco com pontos de coleta marcados em amarelo. 52

70 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Coleta do material biológico e dados ambientais. As coletas foram realizadas com uso de seis armadilhas contendo os seguintes compostos aromáticos como atrativo: eucaliptol (cineol), vanilina, eugenol, salicilato de metila, acetato de benzila e β-ionona. Todos os compostos foram utilizados na forma pura, exceto para vanilina, que foi dissolvida em álcool até o ponto de saturação. Estas armadilhas estavam dispostas em uma trilha de 30m de extensão, penduradas em galhos de árvores a uma distância de aproximadamente 1.5m do solo; (REBÊLO e CABRAL, 1997; RAMALHO, 2006; KRUG e ALVES-DOS-SANTOS, 2008) e 5m entre si; próximos às iscas olfatórias ficavam dois coletores munidos com redes entomológicas, ao se aproximarem, os machos eram coletados. Os chumaços de algodão embebido pelas essências ficavam protegidos por frascos plásticos com pequenos furos (Figura 4). Devido às diferentes taxas de evaporação dos compostos e às condições apresentadas pelos biomas, os compostos foram reaplicados no algodão à cada duas horas na Mata Atlântica e a cada hora na Caatinga. A B Figura 4 Detalhe da isca aromática com macho de Eulaema cingulata visitando - A; Disposição das armadilhas utilizadas no campo - B. 53

71 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. As coletas foram realizadas mensalmente, em cada bioma, no período de janeiro de 2012 à dezembro de 2013, totalizando vinte e quatro coletas por ponto amostral no período das 07:00h às 17:00h, obtendo ao final um esforço amostral de 480 horas em cada bioma, seguindo a metodologia anteriormente descrita. Seguindo a metodologia de coleta, ainda em campo, as abelhas capturadas com a utilização de rede entomológica foram acondicionadas independentemente em frascos de vidro etiquetados com data, tipo de essência e identificação da unidade amostral e, imediatamente, resfriadas. A identificação dos indivíduos coletados foi feita com base em chaves dicotômicas e, quando necessário, enviadas à especialistas. Os dados ambientais foram fornecidos por meio do Centro Meteorológico de Sergipe (CEMESE), já os dados microclimáticos (temperatura, umidade e velocidade do vento) nas unidades amostrais foram obtidos por meio da utilização de termohigrômetro digital com sensor Sppencer modelo SP e luxímetro multifunções DataHold modelo HMM-489. Análises estatísticas. Após as identificações, os dados foram organizados em planilhas contendo as informações necessárias para realização das análises. O índice de diversidade foi calculado pela função de Shannon-Wiener (H ) que expressou a diversidade apresentada nas áreas; os índices de uniformidade foram calculados segundo Pielou (1966): J =H /H Max, onde H é o índice de Shannon-Wiener e H Max é logaritmo neperiano (ln) do número total de espécies encontradas na amostra; este índice varia entre 0 e 1. O índice de Simpson (D), escolhido para análise de dominância entre e dentre biomas, demonstra uma baixa sensibilidade ao tamanho da amostra, em decorrência do fato da maior importância em relação à abundância das espécies mais comuns e menor sensibilidade à riqueza de espécies (FARIA JR, 2005). A frequência de ocorrência das espécies nas áreas em estudo foi expressada pela fórmula: FO=(Ai/A)x100, onde Ai expressa o número de amostras com a espécie i e A o número de amostras. Para FO 50% as espécies foram consideradas muito frequentes; para 50% > FO > 25% as espécies foram consideradas frequentes; e para FO 25% as espécies foram consideradas pouco frequentes. Já a dominância foi utilizada a fórmula D=(ni/N)x100, onde ni é a abundância da espécie i e N a abundância total. Neste caso, para D 5% as espécies foram consideradas dominantes; para 5% > D > 2,5% as espécies foram consideradas acessórias; e para D 2,5% as espécies foram consideradas 54

72 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. ocasionais. Após a análise da frequência e da dominância, os indivíduos puderam ainda ser categorizados como: comuns, intermediários ou raros (BRUSCHINI, 2006). O quociente de similaridade de Sorensen utilizado para identificar a semelhança entre as fitofisionomias de cada área e entre as áreas de mesmo bioma por meio das espécies coletadas tende a ponderar mais as presenças que as ausências entre as amostras sendo sugerido seu uso no caso de muitas espécies estarem presentes em uma amostra e ausentes em outras (PINTO-COELHO, 2007). Os valores resultantes da similaridade de Sorensen apresentam valores ente 0 e 1; quanto mais próximo de 1 maior será a similaridade (SCOLFORO, OLIVEIRA, et al., 2008). Para avaliar a similaridade entre aquelas de mesmo bioma, foi realizada a análise de grupamento (cluster analysis) a partir do método UPGMA (método não ponderado de agrupamento aos pares por médias aritméticas), utilizando o índice de MORISITA-HORN (MAGURRAN, 1988). Inicialmente para verificar a influência dos fatores ambientais sob a abundância dos indivíduos, os dados foram plotados em gráficos e realizado um teste de correlação de Pearson; após, os dados ambientais foram submetidos ao escalonamento multidimensional não-métrico (NMDS) buscando encontrar diferenças entre a abundância e estes; a ordenação foi realizada utilizando o índice de dissimilaridade de Bray-Curtis com índice de significância de 0,05. Para testar a diferença do número de indivíduos coletados nas diferentes substâncias, foi utilizado o teste Kruskal-Wallis, seguido por comparações pareadas de Mann-Whitney (SOKAL e ROHLF, 1995). As análises de NMDS foram aplicadas também para verificar a composição das espécies de acordo com as diferentes iscas aromáticas utilizadas. A ordenação foi realizada utilizando o índice de Bray-Curtis, adicionalmente a análise de similaridade (ANOSIM) foi conduzida para comparar as diferencias entre a abundância nas diferentes iscas; as diferenças entre os valores de R foram usadas para determinar para determinar padrões de similaridade (MATOS, SOUZA-SOUTO, et al., 2013). As análises da matriz de similaridade e os índices de uniformidade, diversidade e dominância e o quociente de similaridade, NMDS e ANOSIM foram conduzidas usando o software Past 2.14 (HAMMER, HARPER e RYAN, 2001). Os dados foram auto escalonados e em sequência submetidos à análise de contrastes com o uso do programa R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2010) para verificar a preferência por compostos dentro de cada bioma. 55

73 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Resultados Foram coletados 1770 espécimes de abelhas Euglossini distribuídas em quatro gêneros da tribo: Eufriesea, Euglossa, Eulaema e Exaerete. Deste total, 48 indivíduos foram coletados na Caatinga, sendo 47 machos e 1 fêmea; e 1723 machos na Mata Atlântica; também foram atraídos pelas iscas indivíduos do gênero Melipona, da família Halictidae e uma abelha da espécie Centris trachina perforator Smith. Entre os indivíduos coletados na Mata Atlântica podem ser encontradas dezessete espécies distribuídas nos quatro gêneros citados (Tabela 1). A espécie mais abundante foi Euglossa cordata com 41,61% dos espécimes capturados, seguida por Eulaema atleticana (18,17%), Eulaema nigrita (14,51%), Eulaema cingulata (8,13%), Euglossa ignita (7,95%), Euglossa securigera (3,02%), Exaerete smaragdina (1,97%) e Eulaema niveofasciata (1,22%). As demais espécies juntas representaram 3,43% do total da amostra. Já entre os 48 indivíduos encontrados na Caatinga foram identificados dois gêneros com a presença de duas espécies em cada (Tabela 1). A espécie mais abundante, assim como na Mata Atlântica, foi Euglossa cordata com 68,09% dos indivíduos coletados, seguida por Eulaema nigrita (27,66%), Eulaema cingulata (2,13) e Euglossa nanomelanotricha (2,13%). As áreas de Mata Atlântica apresentaram maiores valores de diversidade local, considerando os índices de Simpson (D) e de Shannon-Wiener (H ), onde o valor encontrado na RVS Mata do Junco, que variou pouco entre os pontos de coleta (Ponto A: D= 0,25; H = 1,70 / Ponto B: D= 0,24; H = 1,77), foi superior ao obtido no MoNa Grota do Angico, onde houve uma variação entre os pontos de coleta (Ponto A: D= 0,47; H = 0,82/ Ponto B: D = 0,74; H = 0,50). A equitabilidade de Pielou, que representou a maneira pela qual os indivíduos estão distribuídos entre as diferentes formações, apresentou uma pequena diferença dentre as áreas de Mata Atlântica (Ponto A: J = 0,63; Ponto B: J = 0,67), já nas áreas de Caatinga houve uma diferenciação do Ponto A (J = 0,75) com a abundância de espécies mais próximas e o Ponto B (J = 0,46) com as espécies se diferenciando entre si. 56

74 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Tabela 1 Composição, abundância total e por localidade de coleta, riqueza, diversidade, uniformidade e dominância das espécies de Euglossini amostradas entre os meses de janeiro de 2012 e dezembro de 2013, no RVS Mata do Junco, Capela, e no MoNa Grota do Angico, Poço Redondo, Sergipe, Brasil. Eufrisea Táxons coletados RVS Mata do Junco Mona Grota do Angico MA MB Total CA CB Total Ef. atlantica Nemésio, Ef. surinamensis Linnaeus, Euglossa Eg. cordata Linnaeus, Eg. fimbriata Moure, Eg. hemichlora Cockerell, Eg. ignita Smith, Eg. liopoda Dressler, Eg. nanomelanotricha Nemésio, Eg. pleosticta Dressler, Eg. securigera Dressler, Eg. townsendi Cockerell, Eulaema El atleticana Nemésio, El. cingulata Fabricius, El. nigrita Lepeletier, El. niveofasciata Friese, Exaerete Ex. frontalis Guérin-Méneville, Ex. smaragdina Guérin, Abundância Riqueza Diversidade - H (log e) 1,70 1,77-0,82 0,50 - Índice de uniformidade J 0,63 0,67-0,75 0,46 - Dominância (Simpson D) 0,253 0,248-0,470 0,746 - * MA, MB, CA, CB Pontos de coleta A e B na Mata Atlântica e Caatinga, respectivamente. 57

75 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Com a categorização das espécies feita após a análise da frequência e dominância nas áreas em estudo, na Mata Atlântica cinco foram consideradas comuns no ambiente, ao passo que Eg. fimbriata, El. niveofasciata e Ex. frontalis variaram entre intermediárias e raras entre os pontos de coleta; já no MoNa Grota do Angico, todas as espécies coletadas foram consideradas intermediárias (Tabela 2). A análise de similaridade de Sorensen demonstrou que a composição das espécies entre os biomas foi distinta com um índice de 28% de similaridade; em relação à composição dentro dos biomas, pode ser observada uma alta similaridade entre os pontos das duas áreas de Mata Atlântica (86%) e entre aqueles das duas áreas da Caatinga (66%), fato reafirmado pela análise de grupamento (Figura 5). CCC = 0,76 Figura 5 Análise de similaridade entre os pontos de coleta da RVS Mata do Junco (A e B) e do MoNa Grota do Angico (C e D). A coleta ao longo dos anos de 2012 e 2013 no MoNa Grota do Angico (Figura 6) foi relacionada aos fatores ambientais, como os períodos de estiagem na região. Na RVSMJ, a abundância de indivíduos também variou com a influência dos fatores ambientais, estando aqui relacionados à pluviosidade (Figura 7). A correlação de Pearson, realizada para ambos os biomas mostrou uma relação significativa entre a abundância e os fatores analisados, onde a abundância é diretamente proporcional à temperatura e inversamente proporcional à umidade relativa do ar (Figura 8). 58

76 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Tabela 2. Frequência, dominância e categoria dos machos de Euglossini coletados na RVS Mata do Junco (Ponto A PA e Ponto B - PB) e no MoNa Grota do Angico (Ponto A PA e Ponto B - PB) coletados entre janeiro de 2012 e dezembro de RVS Mata do Junco MoNa Grota do Angico Espécies Frequência Dominância Categoria Frequência Dominância Categoria Ef. atlântica PF - Ef. surinamensis PF - PA PB PA PA PA PB PA PB PA PB PA PB O C O C - R - - R Eg. cordata MF MF D D C C F F D D I I Eg. fimbriata PF F O C OC R I Eg. hemichlora - PF - OC - R Eg. ignita MF MF D D C C Eg. liopoda PF PF Eg. pleosticta PF PF Eg. nanomelanotricha Eg. securigera F MF Eg. townsendi PF PF O C O C OC R R OC R R O C O C D I I OC R R PF - A - I El. atleticana MF MF D D C C El. cingulata MF MF D D C C - PF - D - I El. nigrita MF MF D D C C PF PF A A I I El niveofasciata F PF O OC I R C Ex. frontalis F PF O OC I R C Ex. lepeletieri PF - O R - C Ex. smaragdina MF PF O OC I R C MF muito frequente; F frequente; PF pouco frequente; D dominante; A acessória; OC ocasional; C comum; I intermediária; R rara 59

77 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. MoNa Grota do Angico A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B Janeiro Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Nº de indivíduos Temperatura Umidade Figura 6 Variação na abundância de indivíduos e sua relação de acordo com a flutuação da temperatura e umidade no bioma Caatinga entre Janeiro/2012 e Dezembro/ RVS Mata do junco A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B Janeiro Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Nº de indivíduos Umidade Temperatura 0 Figura 7 Variação na abundância de indivíduos e sua relação de acordo com a flutuação da temperatura e umidade no bioma Mata Atlântica entre Janeiro/2012 e Dezembro/

78 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Figura 8 Correlação linear (Pearson) entre a abundância e os dados climáticos de umidade e temperatura. O gênero Eufriesea, como citado por muitos autores, foi sazonal apresentando apenas 2 indivíduos nos meses de janeiro e fevereiro; Eg. cordata, Eg. ignita, El. atleticana, El. cingulata e El. nigrita estiveram presentes durante todo o ano Eg. townsenti, El. niveofasciata, Ex. frontalis e Ex. smaragdina tiveram sua maior abundância 61

79 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. nos meses de menor intensidade de chuva, sendo que algumas estiveram até ausentes durantes os meses de chuva (Figura 9). Na Caatinga, a abundância sofreu interferência das condições climáticas, sendo Eg. cordata a espécie que melhor distribuiu durante o ano estando ausente apenas nos meses de abril, setembro e dezembro, Eg. nanomelanotricha e El. cingulata tiveram apenas um indivíduo coletado, respectivamente, nos meses de novembro e fevereiro, já El. nigrita pode ser coletada logo após períodos de chuva dos meses de fevereiro, março, maio e agosto (Figura 10). Por meio do escalonamento multidimensional não-métrico (NMDS; Figura 11) é possível verificar a influência dos fatores ambientais sobre a distribuição dos indivíduos, onde tem-se a Mata Atlântica se dividindo claramente em um período seco com pouca ocorrência de chuvas e a Caatinga que constantemente sofre com as altas temperaturas. Figura 9 Número de indivíduos (log) distribuídos de acordo com o mês de coleta, que ocorreu entre Janeiro/2012 e Dezembro/2013 no bioma Mata Atlântica (RVS Mata do Junco). 62

80 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Figura 10 Número de indivíduos (log) distribuídos de acordo com o mês de coleta, que ocorreu entre Janeiro/2012 e Dezembro/2013 no bioma Caatinga (MoNa Grota do Angico). Figura 11 Dendograma de dissimilaridade (índice Bray-Curtis, Método: UPGMA) entre os quatro pontos de coleta da Caatinga e Mata Atlântica com base na abundância total das espécies coletadas entre Janeiro/2010 e Dezembro/

81 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Dentre as seis iscas aromáticas utilizadas, a mais atrativa foi o cineol com 53,93% dos indivíduos coletados, seguido por β-ionone (13,51%) e acetado de benzila (14,08%). Na área de Mata Atlântica o segundo composto mais atrativo foi o acetato de benzila seguido por β-ionone, já no ponto B deste bioma a terceira isca mais atrativa foi o eugenol (Figura12); neste bioma, com as análises de Kruskal-Wallis e comparações de Mann-Whitney (H chi^2: 8,495; p=0,13), houve diferença significativa entre as iscas que continham: cineol x ß-ionone (0,015), cineol x vanilina (0,014) cineol x salicitato de metila (0,042). No bioma Caatinga as iscas que continham acetato de benzila, eugenol e salicilato de metila, não atraíram nenhum indivíduo durante os dois anos de estudo em ambos os pontos de coleta, sendo a isca mais atrativa para o Ponto A o cineol e, no Ponto B, ß- ionone (Figura12); para as análises de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (H chi^2: 9,01; p=0,11), houve diferença significativa nas iscas compostas por: cineol x eugenol (0,02), cineol x acetato de benzila (0,02) e cineol x salicilato de metila (0,02) Acetato ß-ionone Cineol Eugenol Salicilato Vanilina RVSMJ_A RVSMJ_B MoNaGA_A MoNaGA_B Figura12 Número de indivíduos atraídos por cada composto utilizado durante o período de janeiro de 2012 à dezembro de 2013, por ponto amostral. 64

82 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Considerando os dois biomas, todas as espécies demonstraram preferência por uma determinada fragrância. Eg. cordata esteve presente em todas as iscas, embora tenha apresentado cerca de 63% dos seus indivíduos coletados no cineol, mesmo fato pode ser visto com El. atleticana (54%); Eg. fimbriata, bem como, Eg. pleosticta, puderam ser coletadas no eugenol, β-ionone e no cineol. O cineol também foi escolhido pela maioria de indivíduos de Eg. liopoda, El. nigrita e Ex. smaragdina com mais de 50 % dos seus indivíduos sendo coletados; Eg. ignita e El cingulata foram atraídos em sua maioria pelo acetato de benzila. Eg. securigera e Ex. frontalis tiveram uma alta taxa de indivíduos sendo atraídos pelo eugenol; e apenas El. niveofasciata com 62% dos espécimes teve alta incidência na isca contendo salicilato de metila. As demais espécies apresentaram apenas um indivíduo coletado (Figura 13). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Acetato β-ionone Cineol Eugenol Salicilato Vanilina Figura 13 Porcentagem de espécies distribuída de acordo com a preferência pelas iscas aromáticas nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. 65

83 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. O resultado da análise multidimensional não-métrica (NMDS) entre a preferência por iscas e os locais estudados, mostra uma ordenação dos machos de euglossini na escolha dos compostos por bioma em que se encontram, formando assim dois grupos distintos um composto pelos indivíduos do bioma Caatinga e outro pelos indivíduos da Mata Atlântica (ANOSIM; Figura 14; Tabela 3). Figura 14 Diagrama de ordenação pelo método de escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) dos indivíduos coletados entre Janeiro/2012 e Dezembro/2013 de acordo com o ponto de coleta no bioma. Tabela 3 Valores de R e p da ANOSIM (Parâmetro: Iscas) entre os pontos de coletas da Caatinga e Mata Atlântica. Local R p M. atlântica A x M. atlântica B -0,03 0,48 M. atlântica A x Caatinga A 0,47 0,003 M. atlântica A x Caatinga B 0,61 0,003 M. atlântica B x Caatinga A 0,41 0,005 M. atlântica B x Caatinga B 0,52 0,009 Caatinga A x Caatinga B 0,083 0,915 66

84 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. De acordo com a análise de contraste realizada utilizando a abundância total dos indivíduos coletados em ambos os biomas por isca aromática, é possível verificar apenas o cineol apresentando diferença significativa comparada às outras iscas (Figura 15). Já quando há separação da abundância por biomas, fazendo a relação com as iscas é possível identificar a formação de 4 grupos de preferência por compostos (Figura 16). Figura 15 Abundância (média ± desvio) de machos de Euglossini por composto aromático utilizado para atração. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre as iscas detectadas pela análise de contraste (p<0,05). Figura 16 Abundância (média ± desvio padrão) de Euglossini por tipo de isca de acordo com o bioma em que foram coletados. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre as iscas detectadas pela análise de contraste (p<0,05). 67

85 Devido ao baixo número de indivíduos coletados no MoNa Grota do Angico, a análise da variação sazonal na escolha das iscas atrativas pelos machos foi analisada apenas para o RVS Mata do Junco, onde apenas durante o mês de julho houve a ausência de atração por dois compostos: vanilina e β-ionone, fato que pode estar relacionado ao baixo número de indivíduos coletados no período (Figura 17). No que se refere a preferência de fragrâncias em relação ao período de coleta, o cineol atraiu os machos durante toda a amostragem, das 7:00 às 17:00. Após as 14:00 este juntamente com o eugenol foram as iscas que se mantiveram atrativas até o término do período de coletas (Figura 18) RVS Mata do Junco jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez Acetato ß-ionone Cineol Eugenol Salicilato Vanilina Figura 17 Variação sazonal na preferência de compostos aromáticos por machos de Euglossini na RVS Mata do junco entre Janeiro/2012 e Dezembro de /

86 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. Acetato de benzila ß-ionone Cineol Eugenol Salicilato de metila Vanilina Nº de indivíduos :00 08:00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 Período de coleta Figura 18 Número de indivíduos coletados em cada isca aromática durante o período de dez horas de coleta na RVJ Mata do Junco, Capela, Sergipe, entre janeiro de 2012 e dezembro Gráfico representando o período de coletas em blocos de hora. De maneira geral, quanto ao período de coleta, as primeiras horas da manhã se apresentam como mais abundantes durante todo o período de coleta isto se dá nos dois pontos de coleta de ambos os biomas (Figura 19 e Figura 20). Nº de indivíduos MoNa Grota do Angico Nº de indivíduos RVS Mata do Junco Figura 19 Variação no número de indivíduos coletados na Caatinga ao longo do dia nos municípios de Canindé do São Francisco e Poço Redondo, Sergipe. Figura 20 Variação no número de indivíduos coletados na Caatinga ao longo do dia nos municípios de Canindé do São Francisco e Poço Redondo, Sergipe. 69

87 Discussão De acordo com os resultados do estudo, a diversidade e abundância dos machos de Euglossini estão relacionadas às condições do ambiente em que se encontram; na área de Mata Atlântica, com temperatura mais amena, umidade elevada e vegetação densa, os valores encontrados foram muito mais altos em relação à área de proteção da Caatinga, que sofre com prolongados períodos de estiagem e a vegetação aberta. Essas características do ambiente trazem, consequentemente, mudanças relativas ao tipo de alimento disponível, dispersão e local de nidificação das espécies, tipos de predadores, entre outros, que vem a demonstrar a sensibilidade desse grupo de abelhas às influências que o ambiente sofre. Milet-Pinheiro e Schlindwein (2005), apontam as espécies estão intimamente ligadas aos habitats florestais, assim, os machos evitam voar em áreas abertas. A presença de pastagens também já foi observada como barreira. A redução ou ainda a ausência da distância de voo entre áreas florestais tem efeito negativo sobre o sucesso reprodutivo das plantas que dependem da polinização por estas abelhas. Como inferido pelas análises, o gênero que apresentou maior riqueza foi Euglossa, esses resultados corroboram com Grandolfo e colaboradores (2013) em estudos realizados em Floresta Estacional Semidecidual e Cerrado stricto sensu, ou ainda os dados de Neves e Viana (2003) em Manguezal, Restinga, Caatinga, floresta estacional e na Mata Atlântica da Bahia; esse não foi só o mais rico como também abundante dentre os gêneros assim como foi encontrado por Brito e Rêgo (2001) em estudos no estado do Maranhão. As áreas em estudo apresentaram diferenciação quanto à abundância e riqueza das espécies coletadas, fato esperado devido às diferentes composições vegetais encontradas nos biomas. Enquanto o Refúgio da Vida Silvestre Mata do Junco (Mata Atlântica) apresenta-se como uma área formada por uma grande diversidade vegetal desde arvoretas, lianas e trepadeiras até árvores com mais de 15 metros de altura com folhas largas (DANTAS, RIBEIRO, et al., 2007), o Monumento Natural Grota do Angico (Caatinga) é uma área com vegetação mais aberta formada por espécies que muitas vezes mantém suas folhas apenas na estação chuvosa (ANDRADE-LIMA, 1981). Observando entre os pontos de coleta em cada bioma, a diferenciação não foi verificada na Caatinga; já na Mata Atlântica a diferença existente na abundância se deu 70

88 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. principalmente pelas condições dos fragmentos escolhidos, no ponto A, o fragmento além de ser maior apresenta-se mais conservado e o seu formato também contribui para uma maior abundância. A estrutura das comunidades pode ser afetada significativamente pelo tamanho, forma, isolamento, efeito de borda, a matriz, as mudanças no microclima e cobertura vegetal do fragmento que se encontram (BROSI, 2009; LAURANCE e VASCONCELOS, 2009). Espécies intolerantes à borda são mais bem sucedidas em fragmento maiores, já as espécies de borda ocorrem com sucesso também em ambientes alterados com ação antrópica (DIAMOND e MAY, 1976); embora essa interpretação deva ser feita cuidadosamente, tendo em vista as variações naturais do ambiente que ocorrem dentro da mata contínua (SOUSA, 1984). A abundância de indivíduos aqui encontrada foi positivamente proporcional ao tamanho da área, o mesmo resultado pode ser observado em estudos realizados no sul da Costa Rica (BROSI, 2009). Três das espécies coletadas puderam ser vistas em ambos os biomas, enquanto que outras 14 foram amostradas apenas na RVSMJ e uma foi exclusiva do MoNa G.A.; quanto à riqueza e a abundância foram constatadas diferenças significativas entre os biomas, sendo esta maior na Mata Atlântica. De acordo com Nemésio (2009), a fauna de Euglossini registrada para o bioma Mata Atlântica é de 54 espécies, considerando que não há nenhum estudo no estado de Sergipe que retrate esta fauna ao nível de espécie, pode ser afirmar a partir deste estudo que pelo menos 38% dos indivíduos registrados para o bioma ocorrem no estado. A riqueza de espécies da tribo coletada na Caatinga foi pequena quando comparada aos outros estudos realizados no Brasil. Fato, que provavelmente está relacionado por estas espécies serem encontradas em maior abundância e riqueza em florestas tropicais úmidas (DRESSLER, 1982). A diferenciação apontada ao realizar a análise de similaridade de Sorensen se dá principalmente pela diversidade encontrada nos pontos de coleta da área de Mata Atlântica em estudo; além do que, barreiras criadas por alterações ambientais como, por exemplo, a presença de pastos pode interferir na dispersão das espécies entre biomas (POWELL e POWELL, 1987). Becker e colaboradores (1991) sugerem ainda que o tamanho das abelhas esteja relacionado com a distância de voo. Já dentro das reservas em estudo é possível encontrar similaridade entre os pontos de coleta, devido ao fato 71

89 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. dos machos desse grupo conseguir se dispersar por longas distâncias durante sua vida, sem apresentar um local para se fixem ao qual possam retornar regularmente (RAW, 1989). Assim como no estudo realizado por Moura e Schlindwein (2009) nas matas ciliares da Foz do Rio São Francisco, Euglossa imperialis Cockerel e E. truncata Moure não foram coletadas no estudo, apesar destas serem abundantes na Floresta Atlântica nos estados de Pernambuco e Alagoas (MILET-PINHEIRO e SCHLINDWEIN, 2005; DARRAULT, MEDEIROS, et al., 2006). O alto número de indivíduos de Eg. cordata dá-se por esta ser uma espécie ecologicamente plástica, podendo ser encontrada em ambientes alterados como também em áreas mais preservadas, apresentando uma ampla faixa de distribuição, ocorrendo em praticamente todos os biomas brasileiros e em áreas antropizadas ou ainda dentro de perímetros urbanos (WITTMANN, HOFFMANN e SCHOLZ, 1988; REBÊLO e MOURE, 1996; LOPES, MACHADO, et al., 2007; LÓPEZ-URIBE e DEL LAMA, 2007; NEMÉSIO e SILVEIRA, 2007; MENDES, RÊGO e CARVALHO, 2008; ROCHA-FILHO, 2011). El. nigrita e Eg. cordata são espécies comuns à Caatinga (ZANELLA, 2000), bem como em áreas de Cerrado (REBÊLO e GARÓFALO, 1997) e áreas degradadas (MORATO, 1994). Estas também foram as únicas espécies encontradas em estudos nas áreas de Caatinga antropizada na Bahia e Pernambuco às margens do Rio São Francisco (MOURA e SCHLINDWEIN, 2009). Eulaema nigrita juntamente com El. cingulata, são caracterizadas por alguns autores como potenciais indicadores da qualidade ambiental, por serem facilmente encontradas em áreas perturbadas e/ou abertas (MORATO, CAMPOS e MOURE, 1992; MORATO, 1994; PERUQUETTI, CAMPOS, et al., 1999; SILVA e REBÊLO, 2002; TONHASCA JR, BLACKMER e ALBUQUERQUE, 2002; NEMÉSIO e SILVEIRA, 2006; AGUIAR e GAGLIONE, 2008). Estas duas espécies são consideradas de alta importância em estudos conservacionistas para diagnosticar as condições ambientais de uma determinada área (AGUIAR e GAGLIONE, 2008; JUSTINO e AUGUSTO, 2010). Entretanto outros autores indicam que El. cingulata é uma espécie encontrada em áreas de formação densa e não perturbada (OLIVEIRA, 2000), isto é, restrita aos ambientes florestais (REBÊLO e GARÓFALO, 1991; 1997; REBÊLO e SILVA, 1999), não saindo de áreas florestais fechadas (MILET-PINHEIRO e SCHLINDWEIN, 2005). No domínio da caatinga, alguns autores sugerem que esta espécie tenha avançado 72

90 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. utilizando-se das matas ciliares do Rio São Francisco como um biocorredor (JUSTINO e AUGUSTO, 2010). Esta espécie esteve ativa durante todo o período de amostragem na RVS Mata do Junco sendo mais ativa durante os meses de novembro e março, assim como encontrado por Brito e Rêgo (2001) Justino e Augusto (2010) estudando o Cerrado sugerem duas proposições sobre El. nigrita: a primeira seria de que esta é uma espécie associada aos ambientes naturalmente abertos, sendo estes preservados ou não; e a segunda proposição é de que a área em estudo pode está apresentando perturbações mesmo sendo uma reserva, mas por se apresentar como um fragmento sem conexões com áreas naturais. A ocorrência de Eg. nanomelanotricha Nemésio na área de caatinga foi um novo registro da espécie para o bioma, já que até então era dada como uma espécie restrita à Mata Atlântica entre Paraíba e alagoas (NEMÉSIO, 2009). Algumas espécies são características de áreas de mata, como Ex. frontalis e Ex. smaragdina, por serem sensíveis a áreas abertas (MORATO, 1994), o que justifica sua ausência em áreas como a Caatinga. Ex. smaragdina é um parasita de ninhos de Euglossini (KINSEY, 1979). O gênero Eufriesea em geral ocorre durante poucos meses do ano (ACKERMAN, MESLER, et al., 1982; ACKERMAN, 1983), nesse estudo foram encontrados apenas dois indivíduos sendo cada um deles pertencente à diferentes espécies. Os padrões de flutuação sazonais na abundância das espécies são explicados por alguns autores devido ao movimento das espécies (DRESSLER, 1968; WILLIAMS e DODSON, 1972) ou ainda pelo padrão sazonal de nidificação e emergência das abelhas (ACKERMAN, 1983). Assim, a ocorrência e manutenção de muitas espécies estão direta ou indiretamente afetadas pelas modificações microclimáticas (MORATO e CAMPOS, 2000; FERREIRA, PINHO, et al., 2011), assim como a distribuição de espécies da tribo está intimamente relacionada à variáveis como a umidade, à exemplo das espécies de Eufriesea que são altamente sazonais, estando restritas à um curto período do ano, com algumas espécies podendo ser encontradas por apenas um ou dois meses (DRESSLER, 1982; ROUBIK e ACKERMAN, 1987; WITTMANN, HOFFMANN e SCHOLZ, 1988; REBÊLO e GARÓFALO, 1991; SILVA, REGO, et al., 2009). Janzen (1981) relatou que embora muitas populações dessa tribo possam permanecer ativas durante todo o ano, provavelmente estas apresentam tamanho 73

91 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. populacional reduzido para poder permanecer nos locais de acordo com a disponibilidade do alimento. Portanto, era esperado um reduzido valor de abundância na Caatinga quando comparado à Mata Atlântica, isto também pode ser visto em florestas como as de altitude que estejam rodeadas por áreas secas (REBÊLO, 2001). Outro fator que atua fortemente na ocorrência dos indivíduos é o tamanho corporal destes, abelhas grandes e pubescentes como, por exemplo, Eulaema e Eufriesea tem a capacidade de regular a temperatura torácica e abdominal de acordo com a temperatura ambiente, ao contrário das pequenas como Euglossa (MAY e CASEY, 1983). A variação devido aos fatores climáticos ocorre também pelo ao fato da flutuação nos padrões locais de nidificação e emergência e pela variação padrão floral e consequentemente os recursos florais oferecidos para as abelhas também apresentar uma variação sazonal (ACKERMAN, 1983), a flora dessa região mantém suas folhas por um curto espaço de tempo estando restritas ao período de chuva, quando também a maioria das árvores e espécies herbáceas florescem (MOURA, 2009). Eg. townsendi e Eg. fimbriata, por exemplo, assim como nos estudos de Brito e Rêgo (2001) estiveram representadas na amostragem por poucas espécies, demonstrando também evidências de sazonalidade estando ativas no período correspondente ao final das chuvas e início da estação seca. Sendo este um fator determinante para a alta diversidade de abelhas durante a estação chuvosa na Caatinga, embora estas puderam ser encontradas espaçadas durante o ano; resultados semelhantes foram encontrados em áreas do Maranhão (BRITO e RÊGO, 2001) onde o período chuvoso foi o de maior atividade para os Euglossini. Os resultados da amostragem realizada nesse estudo foram afetados ainda mais pela presença de um período atípico onde durante o primeiro ano de coleta o período de seca que perdurou por muitos meses além do esperado, já no segundo foi possível registrar chuvas espaçadas. Nas áreas de Caatinga a abundância dos indivíduos foi afetada pela variação da umidade, mas não só esse fator interferiu como também a temperatura e os períodos de estiagem na região (Figura 21), onde só após a ocorrência de chuvas é possível coletar alguns exemplares de machos de Euglossini. Outros estudos em áreas que apresentam períodos distintos de seca e chuva demonstraram relação com a ocorrência de chuvas, a exemplo de Peruquetti e colaboradores (1999) e Brito e Rego (2001). 74

92 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. A área de coleta em estudo localiza-se próximo ao Rio São Francisco, único rio perene do semiárido, que apresenta em suas margens matas ciliares importantes para a manutenção de polinizadores com a presença de espécies arbóreas e perenifólias, e que durante a estação seca recebe uma grande abundância de abelhas (MOURA, 2009), apesar de tamanha importância a mata ciliar próxima às áreas de estudo encontra-se degradada com a presença de plantações de milho o que prejudica a manutenção das espécies na região. A B Figura 21 Área do MoNa Grota do Angico onde foi delimitado um dos pontos de coleta durante o período de chuvas (A) e o período de estiagem (B). A RVSMJ, assim como relatado em outras áreas de Mata Atlântica por Inouye (1975), Williams (1982), Tonhasca e colaboradores (2002) e Rocha-Filho (2011), tem sua abundância sofrendo interferência pelo elevado índice de precipitação, umidade elevada e temperaturas mais baixas; o maior número de machos foi coletado entre os meses de outubro e março, com um decréscimo no número destes entre junho e agosto quando o índice de pluviosidade é elevado na região. Para Abrahamczyk e colaboradores (2012), a força da sazonalidade tanto em relação à temperatura como a precipitação de uma área interfere na preferência por iscas entre as abelhas, sendo esta alterada durante as estações. Silva e Rebêlo (2002) apontam que algumas espécies de Euglossini, são bastante específicas na escolha pelo composto, sendo atraídas por poucas, algumas vezes uma ou duas, substâncias aromáticas, tornando necessário o uso de várias iscas já que algumas podem não ser atrativas para as espécies da área em estudo; e aquelas que são atraídas por um grande número de substâncias aromáticas tendem a mudar as suas preferências entre as estações (PEARSON e DRESSLER, 1985; ACKERMAN, 1989). 75

93 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. A preferência por uma determinada isca pode estar relacionada à disponibilidade e diversidade da flora local ou ainda ao clima da região, sendo assim quanto maior o número de armadilhas dispostas, maior seria a diversidade e abundância dos indivíduos coletados (OLIVEIRA e CAMPOS, 1995; 1996). Em geral, a visita às flores em buscas das substâncias odoríficas envolve os machos jovens de Euglossini, pois os mesmos precisam recolher essas substâncias na busca de estabelecer territórios, enquanto os adultos visitam fontes de néctar (ZIMMERMAN e MADRINAN, 1988). No presente estudo, a isca mais atrativa foi o cineol, Justino e Augusto (2010) apontam que a alta atratividade do cineol esteja relacionada à sua volatilidade, assim seu odor pode alcançar maiores áreas comparadas aos outros compostos, atraindo assim abelhas de diferentes distancias dos pontos amostrais (SILVA e REBÊLO, 2002; STORCK-TONON, MORATO e OLIVEIRA, 2009). Outros estudos em diversos tipos de habitats também apontam o cineol como isca mais atrativa, como em remanescentes de Floresta Atlântica no Sudeste do Brasil (SILVEIRA, NASCIMENTO, et al., 2011), Floresta Amazônica (POWELL e POWELL, 1987; BECKER, MOURE e PERALTA, 1991; REBÊLO e SILVA, 1999), Floresta Secundária (BRITO e RÊGO, 2001), Floresta Atlântica Semidecidual (REBÊLO e GARÓFALO, 1991; 1997) e no Cerrado (NEMÉSIO e FARIA JR, 2004; ALVARENGA, FREITAS e AUGUSTO, 2007), ou ainda em estudos realizados no Panamá (ROUBIK e ACKERMAN, 1987) e Costa Rica (JANZEN, DEVRIES, et al., 1982). Estudos realizados em Floresta Atlântica têm apresentado resultados onde é possível ratificar os dados encontrados, onde as iscas aromáticas são mais atrativas aos machos da tribo no período entre 7:00h e 12:00h, isso ocorre também em áreas de matas e restingas do Nordeste brasileiro (FARIAS, MADEIRA-DA-SILVA, et al., 2007). Em algumas áreas de estudo esse período pode ser ainda mais restrito, como no litoral norte da Paraíba entre as 8:00h e 10:00h (FARIAS, MADEIRA-DA-SILVA, et al., 2007) ou ainda no Maranhão onde a maior atividade foi entre 9:00 e 10:00 (BRITO e RÊGO, 2001) comprovando o fato observado de que no período vespertino o número de indivíduos coletados ser muito pequeno. Em estudos na Amazônia (Braga, 1976) observou que o período de atividade dos machos ocorre entre as 8:00h e as 14:00h sendo reduzido a partir das 12:00h, em estudos na Costa Rica, Armbruster e McCormick (1990) resumiram a atividade de visitação para os machos de Euglossini com início cerca de uma a duas horas após o 76

94 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. amanhecer, tendo seu pico máximo entre as 10:30h e 11:30h e caindo vertiginosamente após as 14:00h, sendo quase completamente cessada as 15:30h. Nas análises aqui realizadas o período onde foi coletado o maior número de indivíduos foi entre as 7:00h e 13:00h, sendo que na Caatinga o pico se deu entre as 8:00h e 10:00h e na Mata Atlântica das 8:00h às 11:00h. Santos e Sofia (2002) observaram que independente das condições ambientais a atividade dos machos ocorre invariavelmente ao longo do ano reduzindo após as 14:00h, elas sugerem que esse ritmo adotado pelos indivíduos determina suas atividades diárias na exploração de fragrâncias no ambiente A atividade sazonal e diária desses machos sofre a influência de diversos fatores, os machos, por exemplo, podem mostrar-se mais ativos nos períodos em que as fêmeas desempenham mais atividades fora dos ninhos (OLIVEIRA, 1999), que de acordo com Augusto (1999) essa atividade para algumas espécies de Euglossa pode variar das 9:00h às 13:00h. Outro fator que pode influenciar a atividade dos machos está na abundância da produção de substâncias odoríferas pelas plantas (OLIVEIRA, 1999; ARMBRUSTER e BERG, 1994); ou ainda a disponibilidade de néctar, que constitui a principal fonte de energia para a manutenção das atividades biológicas, além de ser uma fonte de energia para que os indivíduos visitem as flores em dias de baixas temperaturas do ambiente e consigam regular a temperatura corpórea (HEINRICH e RAVEN, 1972; SANTOS e SOFIA, 2002). A temperatura também é apontada como um fator de interferência (BRAGA, 1976; OLIVEIRA, 1999), as abelhas de maior porte regulam muito bem a temperatura, podendo resistir às diferentes variações, ao contrário das pequenas (MAY e CASEY, 1983). Considerações finais Através da análise da fauna de Euglossini em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica foi possível conhecer a composição das espécies presentes no estado de Sergipe, caracterizando-as ecologicamente e identificando as relações destes com o bioma em que se encontram. Assim, verificou-se que a fauna desses indivíduos demonstra estreita relação com as condições climáticas sendo mais abundantes no período do ano em que estas características ambientais se tornam mais favoráveis. Os fatores ambientais foram portanto fatores que influenciaram da diferenciação entre biomas; dentre os biomas a Caatinga demonstra-se mais semelhante nos pontos de 77

95 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. coleta quando comparados as áreas de estudo da Mata Atlântica onde as condições dos fragmentos foram mais distintas. Este último bioma apresentou-se mais rico e abundante quando comparado ao outro, embora a Caatinga tenha sofrido com um ano atípico com período de seca prolongado. A preferência por compostos aromáticos utilizados no estudo coincidiu com os dados encontrados por diversos outros autores, os quais apontam o cineol como mais atrativos aos machos de Euglossini nos biomas em questão, o mesmo ocorre com o horário de pico da abundância dos indivíduos. Referências bibliográficas ABRAHAMCZYK, S.; GOTTLEUBER, P.; KESSLER, M. Seasonal changes in odour preferences by male euglossine bees (Hymenoptera: Apidae) and their ecological implications. Apidologie, v. 43, p , ACKERMAN, J. D. Diversity and seasonality of male euglossine bees (hymenoptera: Apidae) in Central Panama. Ecology, v. 64(2), p , ACKERMAN, J. D. Geographic and seasonal variation in fragrance choices and preferences of male euglossine bees. Biotropica, v. 21, p , ACKERMAN, J. D.; MESLER, M. R.; LU, K. L.; MONTALVO, A. M. Food-foraging behavior of male Euglossini (Hymenoptera: Apidae): Vagabonds or Trapliners? Biotropica, v. 14, n. 4, p , AGUIAR, W. M.; GAGLIONE, M. C. The comunities of Euglossine bees (Hymenoptera: Apidae) in remants of Lowland Forest on tertiary Tabuleiro in the Rio de Janeiro state. Neotropical Entomology, v. 37, n. 2, p , ALVARENGA, P. E. F.; FREITAS, R. F.; AUGUSTO, S. C. Diversidade de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) em áreas de cerrado do Triângulo Mineiro, MG. Bioscience Journal, v. 23, p , ANDRADE-LIMA, D. The Caatingas Dominium. Revista Brasileira de Botânica, v. 4, p ,

96 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. ANDRADE-SILVA, A. C. R.; NEMÉSIO, A.; OLIVEIRA, F. F.; NASCIMENTO, F. S. Spatial Temporal Variation in Orchid Bee Communities (Hymenoptera: Apidae) in Remnants of Arboreal Caatinga in the Chapada Diamantina Region, State of Bahia, Brazil. Neotropical Entomology, v. 41, p , ARMBRUSTER, W. S.; KELLER, S.; MATSUKI, M.; CLAUSEN, T. P. Pollination of Dalechampia magnollifolia (Euphorbiaceae) by male euglossine bees. American Journal of Botany, v. 76, p , ARMBRUSTER, W. S.; BERG, E. E. Thermal ecology of male euglossine bees in a tropical wet forest: fragrance foraging in relation to operative temperature. Biotropica, Lawrence, v. 26, n. 1, p , ARMBRUSTER, W. S.; MCCORMICK, K. D. Diel Foraging Patterns of Male Euglossine Bees: Ecological Causes and Evolutionary Response by Plants. Biotropica, v. 22, n. 2, p , AUGUSTO, S. C. Bionomia e organização social de Euglossa (Euglossa) fimbriata Rebêlo & Moure, 1995 e Euglossa (Euglossa) townsendi Cockerell, Tese de Doutorado: [s.n.], p. BECKER, P.; MOURE, J. S.; PERALTA, F. J. A. More about euglossine bees in Amazonian forest fragments. Biotropica, Lawrence, v. 23, n. 4b, p , BEZERRA, C. P.; MARTINS, C. F. Diversidade de Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em dois fragmentos de Mata Atlântica localizados na região urbana de João Pessoa, Paraíba, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 18, p , BRAGA, P. I. S. Atração de abelhas polinizadoras de Orchidaceae com auxílio de iscasodores na Campina, Campinara e Floresta Tropical Úmida da região de Manaus. Ciência e Cultura, São Paulo, v. 28, n. 7, p , BRAGA, A. K.; GARÓFALO, C. A. Coleta de fragrâncias por machos de Euglossa towsendi Cockerell (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) em flores de Crinum procerum Carey (Amaryllidaceae). In: MELO, G. A. R.; ALVES-DOS-SANTOS, I. Apoidea Neotropica: Homenagem aos 90 anos de Jesus Santiago Moure. Crisciúma.: UNESC, p

97 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. BRITO, C. M. S.; RÊGO, M. C. Community of male Euglossina bees (Hymenoptera: Apidae) in a secondary forest, Alcântara, MA, Brazil. Brazilian Journal of Biology, v. 61, n. 4, p , BROSI, B. J. The effects of forest fragmentation on Euglossini bee communities (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Conserv. Biol., v. 142, p , BRUSCHINI, M. L. Species diversity and community structure in trap nesting bees in Southern Brazil. Apidologie, v. 45, p , CAMERON, S. A. Phylogeny and biology of Neotropical orchid bees (Euglossini). Annu. Rev. Entomol., v. 49, p , CARVALHO, C. C.; REGO, M. M. C.; MENDES, F. N. Dinâmica de populações de Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em mata ciliar, Urbano Santos, Maranhão, Brasil. Iheringia, Série Zoologia, v. 96, n. 2, p , DANTAS, T. V. P.; RIBEIRO, A. S.; NASCIMENTO-JÚNIOR, J. E.; MACHADO, A.; CRISTINA, K.; SANTOS, C. S. Caracterização florística. In: SEMARH/SE. Estudo técnico para a criação do Refúgio de Vida Silvestre da Mata do Junco, Capela, Sergipe. São Cristóvão: UFS, p DARRAULT, R.; MEDEIROS, P. C.; LOCATELLI, E.; LOPES, A. V.; MACHADO, I. C.; SCHLINDWEIN, C. Abelhas Euglossini. In: BRASIL/MMA Diversidade biológica e conservação da Floresta Atlântica ao norte do Rio São Francisco. Brasília: Ministério do meio Ambiente, p DIAMOND, J. M.; MAY, R. M. Island biogeography and the design of natural reserves. In: MAY, R. M. Theoretical ecology. Philadelphia: Saunders, p DODSON, C. H.; DRESSLER, R. L.; HILLS, H. G.; ADAMS, R. M.; WILLIAMS, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science, v. 164, p , DRESSLER, R. L. Observations on orchids and euglossine bees in Panama and Costa Rica. Revista de Biologia Tropical, v. 15, n. 1, p , DRESSLER, R. L. Biology of the orchid bees (Euglossini). Annu. Rev. Ecol. Syst., v. 13, p ,

98 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. ELTZ, T.; WHITTEN, W. M.; ROUBIK, D. W.; LINSENMMAIR, K. E. Fragance collection, storage, and accumulation by individual male orchid bees. Journal of Chemical Ecology, v. 25(1), p , ELTZ, T.; ZIMMERMANN, Y.; HAFTMANN, J.; TWELE, R.; FRANCKE, W.; QUEZADA-EUAN, J. J.; LUNAU, K. Enfleurage, lipid recycling, and the origin of perfume collection in orchid bees. Proceedings of the Royal Society B, v. 274, p , FARIA JR, L. R. R. Euglossina (Hymenoptra, Apidae) em áreas de Cerrado S.S. e Mata Ciliar em Brasilândia de Minas, MG, com uma discussão sobre a biogeografia do grupo no Cerrado. Belo Horizonte: UFMG, FARIAS, R. C. A. P.; MADEIRA-DA-SILVA, M. C.; PEREIRA-PEIXOTO, M. H.; MARTINS, C. F. Horário de atividade de machos de Euglossina (Hymenoptera: Apidae) e preferência por fragrâncias artificiais em mata e dunas na Área de Proteção Ambiental da Barra do Rio Mamanguape, Rio Tinto, PB. Neotropical Entomology, v. 36(6), p , FARIAS, R. C. A. P.; SILVA, M. M. C.; PEIXOTO, P. M. H.; MARTINS, C. F. Composição e sazonalidade de espécies de Euglossina (Hymenoptera: Apidae) em mata e duna na Área de Proteção Ambiental da Barra do Rio Mamanguape, Rio Tinto, PB. Neotropical entomology, v. 37, n. 3, p , FERREIRA, M. G.; PINHO, O. C.; BALESTIERI, J. B. P.; FACCENDA, O. Fauna and Stratification of Male Orchid Bees (Hymenoptera: Apidae) and their Preference for Odor Baits in a Forest Fragment. Neotropical Entomology, v. 40, n. 6, p , GRANDOLFO, V. A.; BOZZA JUNIOR, R. C.; SILVA NETO, C. M.; MESQUITA NETO, J. N.; GONÇALVES, B. B. Riqueza e Abundância de Abelhas Euglossini (Hymenoptera, Apidae) em Parques Urbanos de Goiânia, Goiás. EntomoBrasilis, v. 6, n. 2, p , HAMMER, O. ; HARPER, A. T.; RYAN, P. D. PAST: Palaeonthological Statistics Software Package for education and data analysis. Statistics Software Package for education and data analysis, v. 4, p. 1-9, HEINRICH, B.; RAVEN, P. H. Energetics and pollination ecology. Science, v. 176, p , HILL, S. H. C.; WILLIAMS, N. H.; DODSON, C. H. Floral fragrances and isolation in the genus Catasetun. Biotropica, v. 4(2), p ,

99 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. INOUYE, D. W. Flight temperatures of male euglossine bees (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Journal of the Kansas Entomological Society, v. 48, p , JANZEN, D. H. Euglossine bees as long-distance pollinators of tropical plants. Science, v. 171, p , JANZEN, D. H. Reduction in euglossine bee species richness on Isla del Cano, a Costa Rican Offshore Island. Biotropica, v. 13, n. 3, p , JANZEN, D. H.; DEVRIES, P. J.; HIGGINS, M. L.; KIMSEY, L. S. Seasonal and site variation in Costa Rican euglossine bees at chemical baits in lowland desciduos and evergreen forest. Ecology, v. 63, n. 1, p , 1982 JUSTINO, D. G.; AUGUSTO, S. C. Avaliação da eficiência de coleta utilizando armadilhas aromáticas e riqueza de Euglossini (Hymenoptera, Apidae) em áreas de Cerrado do Triângulo Mineiro. Revista Brasileira de Zoociencias, v. 12, n. 3, p , KIMSEY, L. S.; DRESSLER, R. L. Synonymic species list of Euglossini. The Pan-Pacific Entomologist, v. 62, p , KINSEY, S. L. An illustrated key to the genus Exarete with descriptions of male genitalia and biology. Journal of the Kansas Entomological Society, v. 52, p , KNUDSEN, J. T.; MORI, S. A. Floral scents and pollination in neotropical Lecythidaceae. Biotropica, v. 28, p , KRUG, C.; ALVES-DOS-SANTOS, I. O Uso de Diferentes Métodos para Amostragem da Fauna de Abelhas (Hymenoptera, Apoidea), um Estudo em Floresta Ombrófila Mista em Santa Catarina. Neotropical Entomology, v. 37(3), p , LAURANCE, W. F.; VASCONCELOS, H. L. Consequências ecológicas da fragmentação florestal na Amazônia. Oecologia Brasiliensis, v. 13, p , LEITE, I. R.; WANDERLEY, L. Zoneamento ecológico-florestal do estado de Sergipe. Aracaju: Sudene/Condese, p. LOPES, A. V.; MACHADO, I. C.; AGUIARA, A. V.; REBÊLO, J. M. A scientific note on the occurrence of Euglossini bees in the Caatinga a Brazilian tropical dryforest. Apidologie, v. 38, p ,

100 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. LÓPEZ-URIBE, M. M. Dinâmica e estrutura genética populacional de abelhas Euglossini (Hymenoptera: Apidae) visitantes florais de Thevetia peruviana em áreas urbanas. São Carlos, SP: UFSCar, p. LÓPEZ-URIBE, M. M.; DEL LAMA, M. A. Molecular identification of species of the genus Euglossa Latreille (Hymenoptera: Apidae, Euglossini. Neotropical Entomology, v. 36, p , MAGURRAN, A. E. Ecological diversity and its measurement. [S.l.]:[s.n.], p. MATOS, M. C. B.; SOUZA-SOUTO, L.; ALMEIDA, R. S.; TEODORO, A. V. Contrasting Patterns of Species Richness and Composition of Solitary Wasps and Bees (Insecta: Hymenoptera) According to Land-use. Biotropica, v. 45, n. 1, p , MAY, M. L.; CASEY, T. M. Thermoregulation and heat exchange in euglossine bees. Physiological Zoology, v. 56, n. 4, p , MENDES, F. N.; RÊGO, M. M. C.; CARVALHO, C. C. Abelhas Euglossina (Hymenoptera, Apidae) coletadas em uma monocultura de eucalipto circundada por Cerrado em Urbano Santos, Maranhão, Brasil. Iheringia, Sér. Zool., MICHELETTE, E. R. F. Distribuição Local das Abelhas. In: CARVALHO, C. M.; VILAR, J. C. Parque Nacional Serra de Itabaiana - Levantamento da Biota. Biologia Geral e Experimental - UFS. Aracaju: IBAMA, p MILET-PINHEIRO, P.; SCHLINDWEIN, C. Do euglossine males (Apidae, Euglossini) leave tropical rainforest to collect fragrances in sugarcane monocultures? Revista Brasileira de Zoologia, v. 22, p , MONTALVO, A. M.; ACKERMAN, J. Relative pollinator efectiveness and evolution of floral traits in Spathiphyllum friedrichsthalli (Araceae). Journal of American Botany, v. 73, p , MORATO, E. F. Abundância e riqueza de machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) em mata de terra firme e áreas de derrubada, nas vizinhanças de Manaus (Brasil). Boletim do Museu Paraense Emílio Goeldi, série Zoologia, v. 10, n. 1, p ,

101 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. MORATO, E. F.; CAMPOS, L. A. O. Efeito da fragmentação florestal sobre vespas e abelhas solitárias em uma área da Amazônia Central. Revista Brasileira de Zoologia, v. 17, p , MORATO, E. F.; CAMPOS, L. A. O.; MOURE, J. S. As abelhas Euglossini (Hymenoptera, Apidae) coletadas na Amazonia Central. Revista Brasileira de Entomologia, v. 34, p , MOURA, D. C. Interações entre plantas e abelhas nas matas ciliares do Rio São Francisco. Recife: UFPE, p. MOURA, D. C.; SCHLINDWEIN, C. Mata ciliar do Rio São Francisco como biocorredor para Euglossini (Hymenoptera: Apidae) de florestas tropicais úmidas. Neotropical Entomology, v. 38, n. 2, p , NEMÉSIO, A. Orchid bees (Hymenoptera: Apidae) of Brazilian Atlantic Forest. Zootaxa, v. 2041, p , NEMÉSIO, A.; FARIA JR, L. R. R. First assessment of orchid bee fauna (Hymenoptera: Apidae: Apini: Euglossina) of Parque Estadual do Rio Preto, a Cerrado area in Southeastern Brazil. Lundiana, v. 5, p , NEMÉSIO, A.; SILVEIRA, F. A. Edge Effects on the Orchid-Bee Fauna (Hymenoptera: Apidae) at a Large Remnant of Atlantic Rain Forest in Southeastern Brazil. Neotropical Entomology, v. 35, n. 3, p , NEMÉSIO, A.; SILVEIRA, F. A. Diversity and distribution of orchid bees (Hymenoptera: Apidae) with a revised checklist of species. Neotropical Entomology, v. 36, p , NEVES, E. L.; VIANA, B. F. Comunidade de machos de Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) das Matas Ciliares da margem esquerda do Médio Rio São Francisco, Bahia. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, v. 28, p , NEVES, E. L.; VIANA, B. F. A fauna de abelhas da subtribo Euglossina (Hymenoptera, Apidae) do Estado da Bahia, Brasil. In: MELO, G. A. R.; SANTOS, I. A. Apoidea Neotropica: Homenagem aos 90 anos de Jesus Santiago Moure. Criciúma: UNESC, p

102 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. OLIVEIRA, A. C. F. Formigas epigéicas em resposta a um gradiente sucessional em fragmentos de caatinga no alto sertão sergipano. Dissertação de Mestrado: Universidade Federal de Sergipe, OLIVEIRA, M. L. Sazonalidade e horário de atividade de abelhas Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em florestas de terra firme na Amazônia Central. Revista Brasileira de Zoologia, Curitiba, v. 16, n. 1, p , OLIVEIRA, M. L. O gênero Eulaema Lepeletier, 1841 (Hymenoptera, Apidae, Euglossini): filogenia, biogeografia e relações com as Orchidaceae. Ribeirão Preto: Tese, OLIVEIRA, M. L.; CAMPOS, L. A. O. Abundância, riqueza e diversidade de abelhas Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em florestas contínuas de terra firme na Amazônia Central, Brasil. Revista brasileira Zoologia, v. 12, n. 3, p , OLIVEIRA, M. L.; CAMPOS, L. A. O. Preferência por estratos florestais e por substâncias odoríferas em abelhas Euglossinae (Hymenoptera, Apidae). Revista Brasileira de Zoologia, Curitiba, v. 13, n. 4, p , PEARSON, D. L.; DRESSLER, R. B. Two-year study of male orchid bee (Hymenoptera: Apidae; Euglossini) attraction to chemical baits in lowland soth-eastern Peru. Journal of Tropical Ecology, v. 1, p , PERUQUETTI, R. C.; CAMPOS, L. A. O.; COELHO, C. D. P.; LISBOA, L. C. O.; ABRANTES, C. V. M. Abelhas Euglossini (Apidae) de áreas de Mata Atlântica: abundância, riqueza e aspectos biológicos. Rev. Bras. Zool., v. 16, p , PIELOU, E. C. An introduction to mathematical ecology. New York: John Wile & Sons, p. PINTO-COELHO, R. M. Fundamentos em Ecologia. Porto Alegre: Artmed, POWELL, A. H.; POWELL, G. V. N. Population dynamics of male euglossine bees in Amazonian forest fragments. Biotropica, v. 19, p , PRANCE, G. T. The pollination and androphore structure of some Amazonian Lecythidaceae. Biotropica, v. 8, p ,

103 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: A language and environmet for statistical computing. Vietna, AT: Disponivel em: < RAMALHO, A. V. Comunidades de abelhas Euglossini (Hymenoptera; Apidae) em remanescentes de Mata Atlântica na bacia do Rio São João, RJ. Dissertação de Mestrado: Universidade Estadual do Norte Fluminense, f. p. RAMÍREZ, S. R.; ROUBIK, D. W.; SKOV, C.; PIERCE, N. E. Phylogeny, diversification patterns and historical biogeography of euglossine orchid bees (Hymenoptera: Apidae). Biological Journal of the Linnean Society, v. 100, n. 3, p , RAMIREZ-ARRIAGA, E.; CUADRIELLO-AGUILAR, J. I.; HERNANDEZ, E. M. Nest structure and parasite of Euglossa atroveneta Dressler (Apidae: Bombinae: Euglossini) at Union Juarez, Chiapas, Mexico. J. Kansas Entomol. Soc., v. 69, p , RAW, A. The dispersal of Euglossine bees between isolated patches of Eastern Brazilian wet forest (Hymenoptera, Apidae). Revista Brasileira de Entomologia, Curitiba, v. 33, n. 1, p , REBÊLO, J. M. M. Dinâmica de populações de machos de Euglossinae (Hymenoptera - Apidae) e considerações sobra sua Sistemática, Filogenia e Biogeografia. Rio Claro, SP: Instituto de Biociências de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, REBÊLO, J. M. M. História Natural das Euglossíneas. As abelhas das orquídeas. [S.l.]: Lithograf, REBÊLO, J. M. M.; CABRAL, A. J. M. Abelhas Euglossinae de Barreirinhas, zona litoral da baixada oriental maranhense. Acta Amazônica, v. 27, p , REBÊLO, J. M. M.; GARÓFALO, C. A. Comunidades de machos de Euglossini (Hymenoptera, Apidae) em matas semidecíduas do Nordeste do estado de São Paulo. Anais da Sociedade Entomológica Brasileira, v. 26, p , REBÊLO, J. M. M.; GARÓFALO, C. A. Comunidades de Machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) em matas semidecíduas do nordeste do Estado de São Paulo. Anais Sociedade Entomológica do Brasil, v. 26, n. 2, p , REBÊLO, J. M. M.; MOURE, J. S. As espécies de Euglossa Latreille do nordeste de São Paulo (Apidae, Euglossinae). Revista Brasileira de Zoologia, v. 51, p ,

104 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. REBÊLO, J. M. M.; SILVA, F. S. Distribuição das abelhas Euglossini (Hymenoptera, Apidae) no Estado do Maranhão, Brasil. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, v. 26, n. 3, p , REBÊLO, M. M.; GARÓFALO, C. A. Diversidade e sazonalidade de machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae) e preferências por iscas-odores em um fragmento de florestas no Sudeste do Brasi. Revista Brasileira de Biologia, v. 51, p , ROCHA-FILHO, L. C. Estrutura genética e ecologia de comunidades das abelhas Euglossini (Hymenoptera; Apidae) do Parque Estadual da Serra do Mar e Parque Estadual da Ilha Anchieta, Ubatuba, SP, Brasil. Ribeirão Preto: Tese, ROUBIK, D. W.; ACKERMAN, J. D. Long-term ecology of euglossine orchid bees (Apidae: Euglossini) in Panamá. Oecologia, v. 73, p , SANTOS, A. F.; ANDRADE, J. A. Caracterização e delimitação do semiárido sergipano. Aracaju: CNPq/UFS, SANTOS, A. M.; SOFIA, S. H. Horário de atividade de machos de Euglossinae (Hymenoptera, Apidae) em um fragmento de floresta semidecídua no Norte do estado do Paraná. Acta Scientiarum, v. 24, p , SANTOS, C. L. O Alto Sertão Sergipano: análise das políticas de desenvolvimento neste Território rural. B. Goiano. Geogr., v. 30(1), p , SANTOS, M. J. S.; SOUZA, H. T. R.; SOUZA, R. M. Biomonitoramento de indicadores ambientais abióticos Mata do Junco (Capela-SE). Scientia plena, v. 3(5), p , SANTOS, M. L.; GARÓFALO, C. A. Nesting biology and nest re-use of Eulaema nigrita (Hymenoptera, Apidade, Euglossini). Insects sociaux, v. 41, p , SCOLFORO, J. R.; OLIVEIRA, A. D.; FERRAZ-FILHO, A. C.; MELLO, J. M. Diversidade, equabilidade e similaridade no domínio da caatinga. In: MELLO, J. M.; SCOLFORO, J. R.; CARVALHO, L. M. T. Inventário Florestal de Minas Gerais: Floresta Estacional Decidual - Florística, Estrutura, Similaridade, Distribuição Diamétrica e de Altura, Volumetria, Tendências e Crescimento e Manejo Florestal. Lavras: UFLA, Cap. 6, p

105 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. SEMARH/SE. Unidades de Conservação, Disponivel em: < Acesso em: 24 setembro SEMARH/SE. SEMARH/SE, Disponivel em: < Acesso em: 10 nov SERGIPE. Decreto N , de 21 de Dezembro de Cria o Monumento Natural Grota do Angico, nos municípios de Poço Redondo e Canindé de São Francisco, Estado de Sergipe, e dá outras providências. Aracaju, 186 da Independência e 119 da República,2007: Secretaria de Estado do Meio Ambiente, Governo de Sergipe, SILVA, F. S.; REBÊLO, J. M. M. Population dynamics of Euglossinae bees (Hymenoptera, Apidae) in an early second-growth forest of Cajual Island, in the state of Maranhão, Brazil. Brazilian Journal of Biology, v. 62, n. 1, p , SILVA, J. M.; TABARELLI, M.; FONSECA, M. T. Áreas e ações prioritárias para a conservação da biodiversidade da Caatinga. In: SILVA, J. M. C.; TABARELLI, M.; FONSECA, M. T.; LINS, L. V. Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. Brasília: MMA e UFPE, p SILVA, O.; REGO, M. M.; ALBUQUERQUE, P. M.; RAMOS, M. C. Abelhas Euglossina (Hymenopter: Apidae) em Área de Restinga do Nordeste do Maranhão. Neotropical entomology, v. 38(2), p , SILVEIRA, G. C.; NASCIMENTO, A. M.; SOFIA, S. H.; AUGUSTO, S. C. Diversity of the euglossine bee community (Hymenoptera, Apidae). Revista Brasileira de Entomologia, v. 55, n. 1, p , SINGER, R. B.; SAZIMA, M. The pollination mechanism in the "Pelexia alliance" (Orchidaceae: Spiranthinae). Botanical Journal of the Linnean Society, v. 131, p , SOARES, A. A.; CAMPOS, L. A. O.; VIEIRA, M. F.; MELO, G. A. R. Relações entre Euglossa (Euglossella) mandibularis Friese, 1899 (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) e Cyphomandra calycina (Solanaceae). Ciência e Cultura, v. 41, p ,

106 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. SOFIA, S. H.; SUZUKI, K. M. Comunidades de machos de abelhas Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em fragmentos florestais no sul do Brasil. Neotropical Entomology, v. 33, p , SOKAL, R. R.; ROHLF, J. F. Biometry: the principles and practices of statistics in biological research. 3rd. ed. New York: Freeman, p. SOUSA, W. P. The role of disturbance in natural communities. Annual Review of Ecology and Systematics, v. 15, p , SOUZA, A. K. P.; HERNÁNDEZ, M. I. M.; MARTINS, C. F. Riqueza, abundância e diversidade de Euglossina (Hymenoptera, Apidae) em três áreas da Reserva Biológica Guaribas, Paraíba, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 22, p , SOUZA, M. C. Atualidades Ornitológicas On-line, v. 149, p , STORCK-TONON, D.; MORATO, E. F.; OLIVEIRA, M. L. Fauna de Euglossina (Hymenoptera: Apidae) da Amazonia sul-ocidental, Acre, Brasil. Acta Amazonica, v. 39, n. 3, p , TONHASCA JR, A.; BLACKMER, J. L.; ALBUQUERQUE, G. S. Abundance and diversity of euglossine bees in the fragmented landscape of the Brazilian Atlantic Forest. Biotropica, v. 34, p , VIANA, B. F.; KLEINERT, A. M. P.; NEVES, E. L. Comunidade de Euglossini (Hymenoptera, Apidae) das dunas litorâneas do Abaeté, Salvador, Bahia, Brasil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 46, n. 4, p , VOGEL, S. Parfümsammelnde Bienen als Bestäuber von Orchidaceen und Gloxinia. Österr. Botan. Zeit, v. 113, p , WHITTEN, W. M.; YOUNG, A.; STERN, D. L. Nonfloral sources of chemicals that attract male euglossine bees (Apidae: Euglossini). J. Chem. Ecol., v. 19, p , WILLIAMS, N. H. The biology of orchids and euglossine bees. In: ARDITTI, J. Orchid biology: reviews and perspectives, II. Ithaca, NY: Cornell University Press, p WILLIAMS, N. H.; DODSON, C. H. Selective attraction of male euglossine bees to orchid floral fragrance and its importance in long distance pollen flow. Evolution, v. 26, p ,

107 Capítulo 2 Estrutura e dinâmica das populações de Euglossini sob a influência da heterogeneidade ambiental e iscas aromáticas em fragmentos de Caatinga e Mata Atlântica de Sergipe, Brasil. WILLIAMS, N. H.; WITTHEN, W. M. Orchid floral fragrance and male euglossine bees. Methods and advances in the last sesquidecade. Biological Bulletin, v. 164, p , WITTMANN, D.; HOFFMANN, M.; SCHOLZ, E. Southern distributional limts of euglossine bees in Brazil linked to habitats of the Atlantic- and Subtropical rain forest (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Entomologia Generalis, v. 14, p , YOUNG, A. M. Notes on the nest structure and emergence of Euglossa turbinifex Dressler (Hymenoptera: Apidae: Bombinae: Euglossini) in Costa Rica. Journal of the Kansas Entomological Society, v. 58, p , ZANELLA, F. C. V. The bees of the Caatinga (Hymenoptera, Apoidea, Apiformes): A species list and comparative notes regarding their distribution. Apidologie, v. 31, p , ZIMMERMAN, J. K.; MADRINAN, S. R. Age structure of male Euglossa imperialis (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) at nectar and chemical sources in Panama. Journal of Tropical Ecology, v. 4, p , ZIMMERMANN, Y.; RAMIREZ, S. R.; ELTZ, T. Chemical niche differentiation among sympatric species of orchid bees. Ecology, v. 90(11), p , ZUCCHI, R.; SAKAGAMI, S. F.; CAMARGO, J. M. F. Biological observations on a neotropical parasocial bee, Eulaema nigrita, with a review on the biology of Euglossinas (Hymenoptera, Apidae). A comparative study. Journal of the Faculty os Science Hokkaido University VI Zoology, v. 17(2), p ,

108 Vapítulo 3 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia

109 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. HIDROCARBONETOS CUTICULARES DOS MACHOS DE EUGLOSSINI (HYMENOPTERA: APIDAE): VARIAÇÃO INTERESPECÍFICA E QUIMIOTAXONOMIA. As abelhas Euglossini, também conhecidas como abelhas das orquídeas, apresentam comportamento diferenciado de outros grupos de Apidae por apresentar espécies solitárias, cleptoparasitas, comunais a primitivamente eussociais. Devido à essa característica a composição dos hidrocarbonetos cuticulares desses táxons merece atenção para verificar se há um padrão no perfil químico entre os espécimes de uma mesma espécie e se esse perfil se diferencia entre os demais organismos do mesmo gênero, já que estudos atuais em sua maioria visam os insetos sociais. Assim, o objetivo deste capítulo foi caracterizar e comparar o perfil químico cuticular de diferentes espécies de Euglossini buscando analisar se é possível utilizar essa ferramenta como auxiliar na identificação taxonômica. Foram analisados os hidrocarbonetos cuticulares de dezessete espécies pertencentes à quatro gêneros da tribo: Eufriesea atlantica, Ef. surinamensis, Exaerete. smaragdina, Ex. frontalis, Eulaema niveofasciata, El. nigrita, El. cingulata, El. atleticana, Euglossa cordata, Eg. fimbriata, Eg. hemichlora, Eg. ignita, Eg. liopoda, Eg. nanomelanotricha, Eg. pleosticta, Eg. securigera, Eg. towsendi; por meio do extrato da cutícula destas espécies foi possível caracterizar taxonomicamente os indivíduos à nível de gênero e espécie. Os compostos comuns a todas as espécies foram: (Z)-9-nonacoseno, tricosano, pentacosano, heptacosano, nonacosano e o hentriacontano; em geral a diferenciação entre gêneros foi qualitativa, já dentro de cada gênero as espécies variaram na quantidade dos compostos. 92

110 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Introdução As abelhas das orquídeas (Hymenoptera, Apidae, Euglossini) são endêmicas das regiões neotropicais (DRESSLER, 1982; ROUBIK, 1989; BÚRQUEZ, 1997; NEMÉSIO, 2009; ZIMMERMANN, 2010), com complexos sistemas sociais, podendo ser solitárias, comunais a primitivamente eussociais (MICHENER, 2000), ou ainda cleptoparasitas (MICHENER, 1990; CHAVARRIA e CARPENTER, 1994). Apresentam corpo robusto, tegumento metálico brilhante, glossa longa, e machos com tíbia modificada para coleta de substâncias aromáticas (DRESSLER, 1982), essas estruturas juntamente à outras características morfológicas são utilizadas para identificação dos indivíduos (ROUBIK e HANSON, 2004). A posição filogenética dos Euglossini dentro das abelhas corbiculadas vem sendo debatida. Estudos utilizando caracteres moleculares afirmam que Euglossini seria grupo irmão de Apini, enquanto Meliponini e Bombini formariam outro clado dentro dos corbiculados (CAMERON, 1993; KOULIANOS, SCHMID-HEMPEL, et al., 1999; MARDULYN e CAMERON, 1999; ASCHER, DANFORTH e JI, 2001; CAMERON e MARDULYN, 2001; CAMERON e MARDULYN, 2003). Outros trabalhos que usam caracteres comportamentais e morfológicos suportam a hipótese de que Euglossini seria um táxon basal das abelhas corbiculadas (ROIG-ALSINA e MICHENER, 1993; ENGEL, 1999; SCHULTZ, ENGEL e PRENTICE, 1999; NOLL, 2002; CANEVAZZI e NOLL, 2014). De acordo com Cardinal e Danforth (2011), a maior parte dessas abelhas são solitárias, comunais e fracamente sociais, embora tenha sido relatado que em alguns táxons possa ocorrer traços mais avançados de socialidade como sobreposição de gerações e cuidados cooperativos com a cria (AUGUSTO e GARÓFALO, 2004; 2009). Como auxiliar para a classificação taxonômica, nos últimos 30 anos, o estudo da composição química da cutícula em vários grupos de insetos (NEMÉSIO, 2009) vem sendo utilizado como marcadores taxonômicos (JALLON e DAVID, 1987; HAVERTY, PAGE, et al., 1988; ETEGES e JACKSON, 2001). A cutícula apresenta inúmeros compostos, entre os quais estão os hidrocarbonetos cuticulares (CHCs) formados por uma complexa mistura de cadeias lineares e/ou ramificadas, usualmente entre 20 e 40 carbonos (CALDERÓN-FERNÁNDEZ, GIROTTI e JUÁREZ, 2011); estes são sintetizados juntamente com lipídios, pelos enócitos (LANDIM, 2009), e apresentam-se característicos para cada espécie como impressões digitais (MARTIN, HEIKKI e FALKO, 2008). 93

111 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Em muitos insetos os hidrocarbonetos encontrados na cutícula são formados por um conjunto de n-alcanos, alcenos, ocorrendo frequentemente uma mistura de isômeros (BLOMQUIST, NELSON e RENOBALES, 1987; LOCKEY, 1988; RENOBALES, NELSON e BLOMQUIST, 1991), sendo os alcadienos e alcatrienos pouco comuns (LOCKEY, 1988; BUCKNER, PITTS-SINGER, et al., 2009). Os CHCs têm sido estudados em várias espécies de himenópteros, entre suas funções a que se encontra melhor difundida é a de comunicação entre os indivíduos (NELSON, 1978; BLOMQUIST e JACKSON, 1979; HADLEY, 1981; HOWARD e BLOMQUIST, 1982; BLOMQUIST, NELSON e RENOBALES, 1987; BUCKNER, 1993; NELSON e BLOMQUIST, 1995). Outra função que vem sendo estudada é a que estes possivelmente atuem como feromônios sexuais, ou ainda usados no reconhecimento entre espécies e entre colônias, bem como atuam como inibidores da atratividade sexual (ESPELIE e HERMANN, 1990; BROWN, SPRADBERY e LACEY, 1991; ESPELIE, GAMBOA, et al., 1994; SINGER, ESPELIE e GAMBOA, 1998). Em abelhas solitárias, como por exemplo na espécie Megachile rotundata Fabricius, Paulmier e colaboradores (1999) reportaram a presença de feromônios sexuais na composição da cutícula; embora, nessas abelhas, poucos são os estudos que avaliam a composição dos lipídios cuticulares (BUCKNER, PITTS-SINGER, et al., 2009). Para Euglossini é relatada uma descrição das espécies Euglossa viridissima e Euglossa dilemma (POKORNY, LUNAU, et al., 2014) buscando verificar a possível identificação de espécies irmãs por meio dos hidrocarbonetos. Objetivos Em vista do exposto buscou-se neste estudo compreender melhor sobre a estrutura química cuticular de machos de Euglossini enfatizando os hidrocarbonetos cuticulares de dezessete espécies distribuídas em quatro gêneros da tribo: Euglossa, Eulaema, Eufriesea e Exaerete, especificamente visou-se: Traçar o perfil químico cuticular para cada espécie; Analisar se há diferença na composição química cuticular que permita a classificação taxonômica por meio dos hidrocarbonetos cuticulares; Identificar quais compostos permitem essa classificação; Verificar de maneira geral como a distinção química está relacionada à filogenia. 94

112 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Materiais e Métodos Coleta de indivíduos. Espécimes machos de Euglossini foram coletados na Reserva da Vida Silvestre Mata do Junco (Figura 1), uma área de proteção ambiental localizada no Figura 2 Macho de El. nigrita se aproximando de uma isca aromática protegida. município de Capela, Sergipe, Brasil, entre os meses de janeiro/2012 e dezembro/2013. No momento da coleta o indivíduo foi capturado com rede entomológica ao se aproximar das iscas aromáticas, individualmente, colocados, em frascos de vidro e sacrificados resfriamento. Para evitar contaminação da cutícula com o composto utilizado para atração, as armadilhas foram protegidas de forma que permitisse a volatilização dos aromas mantendo os indivíduos afastados (Figura 2). As análises de identificação e detecção das substâncias presentes na cutícula foram feitas no Laboratório de Comportamento e Ecologia de Insetos Sociais da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo. Foram analisados machos de quatro gêneros pertencentes à dezessete espécies de Euglossini: Eufriesea atlantica, Ef. surinamensis, Exaerete smaragdina, Ex. frontalis, Eulaema niveofasciata, El. nigrita, El. cingulata, El. atleticana, Euglossa cordata, Eg. fimbriata, Eg. hemichlora, Eg. ignita, Eg. liopoda, Eg. nanomelanotricha, Eg. pleosticta, Eg. securigera, Eg. towsendi. por 95

113 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Figura 1 Localização da Reserva de Vida Silvestre Mata do Junco no estado de Sergipe, onde foram realizadas as coletas dos machos de Euglossini. Extração e processamento dos compostos cuticulares. Os compostos cuticulares foram extraídos a partir da adição de 2ml do solvente apolar n-hexano 95% (Mallinckrodt Chemicals) por 2 minutos; o material obtido foi submetido a análise por meio de um sistema de Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectometria de Massas (CC- EM) SHIMADZU, modelo GCMS-QP2010ultra, equipado com uma coluna capilar de silicone (DB-5MS 30m) utilizando como gás carregador o gás hélio (1ml/min), e empregando o método de ionização eletrônica (EI) e de ionização química (CI), para determinação do espectro de pico molecular e demais informações das estruturas. Com base em testes realizados previamente, criou-se um protocolo de temperatura adequado para as análises com indivíduos da tribo Euglossini variando a temperatura de 150 C a 300 C com aumento de 5 C/min, a temperatura final se manteve constante por 15 minutos. 96

114 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Para uma identificação mais precisa da posição das duplas ligações em alcenos e alcadienos, o restante do extrato obtido com hexano para análise dos compostos dos machos foi reagido com dimetil-disulfido (DMDS) seguindo as instruções descritas por Carlson et al (1989) e Nunes (2012)(Figura 3). Figura 3 Reação de derivatização com dimetil-disulfido. Inserção dos radicais SCH3 na posição da insaturação. No exemplo, derivatização do alceno 7-tricoseno. FONTE: NUNES, Para cada espécie ficou adotado o seguinte procedimento: o extrato de três indivíduos após ser evaporado foi ressuspendido em 200μl de hexano, e adicionado uma solução de 50μl de iodo diluído em dimetil éter (5%) e 100μl de DMDS. Seguindo a metodologia, selou-se o recipiente com nitrogênio, este foi mantido a 55 C durante 24 horas. Passado o período de 2 horas uma solução de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) foi acrescida à mistura e a fase orgânica consequentemente separada da fase inorgânica. A fase orgânica foi seca e ressuspendida em 20μl de hexano, dessa solução 2μl foram injetados no CG-EM. Devido à baixa concentração de compostos em algumas amostras, foi feito um pool a partir da ressuspensão das amostras de 3 indivíduos em 50µl de hexano, visando concentrar as amostras e assim identificar esses compostos que se apresentaram em pequenas quantidades nas mostras individuais. Identificação dos compostos. Os dados fornecidos pelo GCMS são cromatogramas formados por picos em diferentes tempos de retenção (TR em minutos) de cada composto químico na coluna. Estes cromatogramas foram analisados com auxílio do programa GCMS solutions for Windows (Shimadzu Corporation) para caracterização do espectro de massa. Comprimentos de cadeias equivalentes puderam ser determinados utilizando-se n-alcanos padrões (Sigma Chemical Co.), e a quantificação baseou-se nas 97

115 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. áreas de pico obtidas pelos cromatogramas (SINGER e ESPELIE, 1992). Além do uso de padrões, para identificação foram usadas as bibliotecas NIST 8.0 e FFNSC 1.3 (Flavors and Fragrances of Natural and Synthetic Compounds) como referência, outros componentes necessitaram da identificação através do cálculo do índice de Kovats. Análises estatísticas. Após obtidos os cromatogramas e identificados os compostos, as áreas dos picos absolutos foram padronizadas para representar as contribuições relativas percentuais de cada, estes foram, então, transformados em raiz quadrada. Um perfil típico para cada espécie em cada área de estudo e nas diferentes condições ambientais foi obtido tomando as porcentagens médias em todo as espécies. Os dados adquiridos foram submetidos à análise de escalonamento multidimensional não-métrico (MDS), para tal foi empregado o índice de Bray-Curtis como medida para a similaridade/dissimilaridade química entre as amostras (espécies). A partir destes dados foi derivada uma matriz de similaridade baseada no índice citado e os percentuais de similaridade foram ordenados em duas e três dimensões. Os desvios nesta análise são expressos como stress, quando os valores obtidos nesse são menores que 0,15 (S<0,15) indicam um bom ajuste da estrutura obtida; análises de similaridade (ANOSIM) one-way foram testadas entre as espécies (CLARKE e GREEN, 1988). A análise de similaridade testou diferenças entre os grupos com valores médios classificados de acordo com as medidas de dissimilaridade para dados multivariados de Bray-Curtis (BRAY e CURTIS, 1975); nesta análise os valores de R variam entre -1 e 1, quanto mais próximo de R=0 tende à similaridade, quanto mais próximo de R=1 à dissimilaridade (VALENTIN, 1995). Nesse tipo de análise, valores negativos são raros, quando ocorrem são resultados de uma alta dissimilaridade dentro de cada grupo do que entre eles (POKORNY, LUNAU, et al., 2014). Já a análise dos percentuais de similaridade (SIMPER) identificou os principais compostos que diferem entre as espécies. A fim de verificar a influência individual dos hidrocarbonetos identificados nas cutículas sobre as espécies e sua tendência à separação por gêneros foi feita uma análise canônica de coordenadas principais, CAP (ANDERSON e ROBINSON, 2003). Eixos resultantes da análise de coordenadas principais (PCO) foram plotados para visualização dos principais compostos que separam os grupos; a PCO é uma generalização do PCA, e foi escolhida por preservar diferentes distâncias de similaridade 98

116 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. ao contrário da PCA que utiliza apenas distância Euclidiana (LEGENDRE e LEGENDRE, 1998). Para estas análises foi utilizado o software Primer v.6.0. Com auxílio de pacotes disponíveis para análises na plataforma R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2011), realizou-se uma análise de grupamento (cluster analysis) para separar as espécies encontradas de acordo com os componentes presentes na cutícula e assim verificar uma possível similaridade e separação destas. Este tipo de análise possibilita agrupar os objetos estudados em classes baseadas no grau de similaridade considerando todas as variáveis presentes (MANLY, 1986). O método de centroide, que tem proposto tratar da distância entre os grupos utilizados e a distância entre o centroide (SOKAL e MICHENER, 1958), foi empregado para verificar as distâncias entre os gêneros coletados. Resultados A análise dos hidrocarbonetos presentes na cutícula das dezessete espécies de machos de Euglossini revelou um total de 108 compostos, que foram identificados incluindo alcanos saturados e insaturados, alcenos e alcadienos; estes variaram de 16 a 37 átomos de carbono no comprimento da cadeia. Os seis compostos comuns a todas as espécies foram o alceno (Z)-9-nonacoseno e os alcanos: tricosano, pentacosano, heptacosano, nonacosano e o hentriacontano (Tabela 1). A diversidade química foi maior para as espécies dos gêneros Eulaema e Exaerete. O gênero Exaerete foi o único que apresentou compostos exclusivos presentes em todas as espécies identificadas no mesmo, estes compostos foram um alcadieno do tritriacontano e dois do tetratriacontano, os demais gêneros apresentaram compostos que variaram a presença/ausência entre as espécies, também o que apresentou as maiores porcentagens de alcadienos na composição cuticular (Ex. frontalis: 33,33% e Ex. smaragdina: 25%). 99

117 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Tabela 1 contribuição relativa (percentual) da composição do perfil cuticular de hidrocarbonetos alifáticos de machos de Euglossini. Composto Eufriesea atlantica Eufriesea surinamensis Exaerete smaragdina Exaerete frontalis Eulaema niveofasciata Eulaema nigrita Eulaema cingulata Eulaema atleticana Euglossa towsendi Euglossa securigera Euglossa pleosticta Euglossa nanomelanotricha Hexadecano ± ± Heptadecano ± Euglossa securigera Euglossa ignita Euglossa hemichlora Euglossa fimbriata Euglossa cordata Octadecano ± ± ± ± ± ± ± 0.05 Z-nonadeceno Nonadecano ± ± ± Eicosano ± ± ± ± ± ± ± ± 0.08 (Z)-11-heneicoseno ± (Z)-9-henicoseno ± ± (Z)-7-henicoseno ± Henicosano ± ± ± ± ± ± ± (Z)-9-docoseno ± ± ± Docosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.15 (Z)-9-tricoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.06 (Z)-7-tricoseno ± ± ± ± ± (Z)-5-tricoseno ± ± Tricosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± MeC ± MeC ± MeC ± MeC ± ± ± 1.99 (Z)-11-tetracoseno ± (Z)-9-tetracoseno ± ± ± (Z)-7-tetracoseno ± Tetracosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

118 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Composto Eufriesea atlantica Eufriesea surinamensis Exaerete smaragdina Exaerete frontalis Eulaema niveofasciata Eulaema nigrita Eulaema cingulata Eulaema atleticana Euglossa towsendi Euglossa securigera 4me tetracosano ± 0.20 Euglossa pleosticta Euglossa nanomelanotricha Euglossa securigera Euglossa ignita Euglossa hemichlora Euglossa fimbriata Euglossa cordata MeC ± ± me - tricosano ± ± 0.15 (Z)-9-pentacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.12 (Z)-7-pentacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.02 Pentacosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.80 (Z)-3-hexacoseno ± MeC25 e 13-Mec ± ± (Z)-9-hexacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± 0.17 (Z)-7-hexacoseno ± (Z)-5-hexacoseno ± Hexacosano ± ± ± ± me - hexacosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± me-pentacosano (Z.Z)-heptacosadieno ± ± ± (Z)-3-heptacoseno ± (Z)-11-heptacoseno ± (Z)-9-heptacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± (Z)-7-heptacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± (Z)-5-heptacoseno ± ± 0.87 Heptacosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.62 (Z.Z)-octacosadieno ± ± ± ± 0.34 (Z)-9-octacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± Octacosano ± ± ± ± ± ± (Z.Z)-nonacosadieno ± ± ± ±

119 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Composto Eufriesea atlantica Eufriesea surinamensis Exaerete smaragdina Exaerete frontalis Eulaema niveofasciata Eulaema nigrita Eulaema cingulata Eulaema atleticana (Z.Z)-nonacosadieno ± ± (Z.Z)-nonacosadieno ± Euglossa towsendi Euglossa securigera Euglossa pleosticta Euglossa nanomelanotricha Euglossa securigera Euglossa ignita Euglossa hemichlora Euglossa fimbriata Euglossa cordata Nonacoseno ± (Z)-9-nonacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± 3.29 (Z)-7-nonacoseno ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± (Z.Z)-5.9-nonacoseno ± 1.01 Nonacosano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.77 (Z.Z)-tricontadieno ± ± (Z.Z)-tricontadieno ± ± (Z)-9-triaconteno ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.17 (Z)-8-triaconteno ± Triacontano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.08 Z-me-C ± ± (Z.Z)-hentriacontadieno ± ± ± ± (Z.Z)-hentriacontadieno ± ± ± (Z.Z)-hentriacontadieno ± ± (Z)-15-hentriaconteno ± (Z)-11-hentriaconteno ± ± (Z)-10-hentriaconteno ± (Z)-9-hentriaconteno ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.67 (Z)-7-hentriaconteno ± ± ± ± ± ± ± ± 0.23 Hentriacontano ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± meC23 (158/9; 308/9); 13 -me C31 (196/7; 281/2); 15-mec31 (224/5; 252/3) ± (Z.Z)-dotriacontadieno ± ± ± ± (Z.Z)-dotriacontadieno ± ±

120 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Composto Eufriesea atlantica Eufriesea surinamensis Exaerete smaragdina Exaerete frontalis Eulaema niveofasciata Eulaema nigrita Eulaema cingulata Eulaema atleticana (Z)-11-dotriaconteno ± ± ± ± ± (Z)-9-dotriaconteno ± ± ± Euglossa towsendi Euglossa securigera Euglossa pleosticta Euglossa nanomelanotricha Euglossa securigera Euglossa ignita Euglossa hemichlora Euglossa fimbriata Euglossa cordata Dotriacontano ± ± ± ± ± ± ± (Z.Z)-tritriacontadieno ± ± ± ± ± (Z.Z)-tritriacontadieno ± ± ± ± (Z.Z)-tritriacontadieno ± ± ± ± 0.14 (Z.Z)-tritriacontadieno ± ± (Z)-14-tritriaconteno ± (Z)-11-tritriaconteno ± (Z)-9-tritriaconteno ± ± ± ± ± ± ± (Z)-7-tritriaconteno ± ± ± ± (Z)-5-tritriaconteno ± Tritriacontano ± ± ± ± ± ± ± ± ± (Z.Z)-tetratriacontadieno ± ± ± (Z.Z)-tetratriacontadieno ± ± ± ± (Z.Z)-tetratriacontadieno ± ± (Z.Z)-tetratriacontadieno ± ± Tetratriacontano ± ± ± ± 0.78 (Z.Z)-pentatriacontadieno ± ± ± (Z.Z)-pentatriacontadieno ± ± ± (Z.Z)-pentatriacontadieno ± ± ± (Z.Z)-pentatriacontadieno ± ± ± (Z)-pentatriaconteno ± ± (Z)-10-pentatriaconteno ± (Z)-9-pentatriaconteno ± 0.2* ± ±

121 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Composto Eufriesea atlantica Eufriesea surinamensis Exaerete smaragdina Exaerete frontalis Eulaema niveofasciata Eulaema nigrita Eulaema cingulata Eulaema atleticana Euglossa towsendi Euglossa securigera Euglossa pleosticta Euglossa nanomelanotricha (Z)-7-pentatriaconteno ± Pentatriacontano ± ± ± ± (Z.Z)-hexatriacontadieno ± Hexatriacontano ± ± ± Z.Z)-heptacontatriacontadieno ± Z.Z)-heptacontatriacontadieno ± (Z)-10-heptatriaconteno ± Euglossa securigera Euglossa ignita Euglossa hemichlora Euglossa fimbriata Euglossa cordata (Z)-9-heptatriaconteno ± (Z)-7-heptatriaconteno ± (-) composto não encontrado; (Z) indica uma instauração; (Me) grupo metil. 104

122 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Eulaema foi o segundo grupo que mais apresentou alcadienos na composição, que estiveram ausentes em Eufriesea, e algumas espécies de Euglossa, ao contrário dos metilados que apresentaram maiores porcentagens nas espécies desse último. Os grupos de compostos mais comuns para todas as espécies foram os alcanos e alcenos representando uma porcentagem média da composição de 42% e 44%, respectivamente (Figura 4). (%) Porcentagem dos grupos de hidrocarbonetos por espécie Metilados Alcanos Alcenos Alcadienos Ef. atlantica Ef. surinamensis Ex. smaragdina Ex. frontalis El. niveofasciata El. nigrita El. cingulata El. atleticana Eg. towsendi Eg. securigera Eg. pleosticta Eg. nanomelanotricha Eg. liopoda Eg. ignita Eg. hemichlora Eg. fimbriata Eg. cordata Figura 4 Proporção percentual dos grupos de hidrocarbonetos entre as diferentes espécies de Euglossini. O escalonamento multidimensional (Figura 5) utilizando os CHCs provenientes dos machos de Euglossini resultou um stress=0,1, indicando que a ordenação foi capaz de recuperar os principais padrões da composição cuticular dos indivíduos; isso sugere que existe uma tendência à proximidade entre os indivíduos de mesmo gênero considerando a similaridade de Bray-Curtis, sendo Ex. smaragdina a espécie mais distinta de todas. 105

123 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Figura 5 Projeção em espaço bidimensional da Escala Multidimensdional (MDS) dos dados de hidrocarbonetos cuticulares presentes nas cutículas de 17 espécies de machos de Euglossini, coletados entre os meses de janeiro/2012 e dezembro/2013 em Sergipe, Brasil. Já a variabilidade de compostos presentes nas diferentes espécies em estudo avaliada por meio dos testes de permutação da ANOSIM revelou diferenças significativas na similaridade entre os gêneros (R=0,635, P<0,02). Ao examinar a hipótese de diferenças significativas entre gêneros, a análise de similaridade evidenciou também que as maiores diferenças estão entre Eufriesea x Exaerete e Euglossa x Exaerete (Tabela 2). Tabela 2 Resultados da análise de similaridade (ANOSIM, 999 permutações) dos hidrocarbonetos cuticulares dos machos de euglossini. Grupos R Nível de significância Eufriesea x Exaerete 1 33,1 Eufriesea x Eulaema -0,107 73,3 Eufriesea x Euglossa 0,144 32,7 Exaerete x Eulaema 0,643 6,7 Exaerete x Euglossa 1 1,8 Eulaema x Euglossa 0,672 0,4 106

124 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Os compostos que mais contribuíram para a similaridade e dissimilaridade dentro e entre os grupos formados na análise de agrupamento estudada foram definidos por meio das porcentagens de similaridade (SIMPER). Assim, quanto ao diagnóstico dentro de cada gênero a maior similaridade foi dada entre os indivíduos do grupo Eufriesea (67,12%), seguido por Exaerete (65,50%), Euglossa (65,14%) e Eulaema (52,51%), já a proporção de dissimilaridade para os grupos (Tabela 3) foi maior entre os gêneros Exaerete e Euglossa, essa variação na taxa de dissimilaridade foi encontrada em todos os gêneros principalmente devido à presença de alcenos com dupla ligação na posição 9. Tabela 3 Análise de SIMPER mostrando a contribuição dos principais hidrocarbonetos cuticulares para a dissimilaridade entre os gêneros dos machos de Euglossini identificados no estudo, coletados entre janeiro/2012 e dezembro/2013 em Sergipe, Brasil. Grupos Compostos Contribuição (%) (Z,Z)- Pentatriacontadieno -3 8,68 Eufriesea x Exaerete Dissim. média: 66,34% (Z)-11-heptacoseno 6,38 (Z)-9-tritriaconteno 5,82 (Z)-9-nonacoseno 5,75 (Z)-11-heptacoseno 10,36 Eufriesea x Eulaema Dissim. média: 44,30% (Z)-9-tricoseno 7,12 (Z)-9-pentacoseno 6,16 (Z)-9-heptacoseno 5,47 (Z,Z)-pentatriacontadieno-3 8,07 Exaerete x Eulaema Dissim. média: 62,89% (Z)-9-tritriaconteno 5,40 (Z)-9-nonacoseno 4,13 (Z,Z)-pentatriacontadieno-4 4,10 (Z)-11-heptacoseno 14,84 Eufriesea x Euglossa Dissim. média: 36,86% (Z)-9-heptacoseno 7,75 (Z)-9-nonacoseno 7,31 (Z)-7-heptacoseno 6,53 (Z,Z)-pentatriacontadieno-3 8,33 Exaerete x Euglossa Dissim. média: 70,69% (Z)-9-nonacoseno 7,57 (Z)-9-tritriacoseno 6,25 (Z)-9-heptacoseno 4,44 (Z)-9-nonacoseno 7,89 Eulaema x Euglossa Dissim. média: 48,34% (Z)-9-pentacoseno 6,38 (Z)-9-tricoseno 6,31 (Z)-9-heptacoseno 5,41 107

125 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Os resultados da análise de correspondência canônica demonstraram que os indivíduos tendem a apresentar grupamentos relacionados ao gênero que pertencem, exceto para os indivíduos de Eufriesea; complementando esta análise, a PCO realizada (Figura 6) mostrou que 52,6% da variação é explicada pelos dois primeiros eixos, sendo os compostos mais importantes para a separação dos indivíduos: (Z)-9-nonacoseno, (Z,Z)-pentatriaconteno-3, (Z)-9-tricoseno,(Z)-9-pentacoseno e (Z)-9-heptacoseno. Figura 6 Diagrama de Análise de Coordenadas Principais (PCO) sobre os diferentes gêneros de machos de Euglossini, coletados entre janeiro de 2012 e dezembro de 2013 em Sergipe, separadas por biomas em relação aos hidrocarbonetos cuticulares. sp1 - Ef. atlantica; sp2 - Ef. surinamensis; sp3 - Ex. smaragdina; sp4 - Ex. frontalis; sp5 - El. niveofasciata; sp6 - El. nigrita; sp7 - El. cingulata; sp8 - El. atleticana; sp9 - Eg. towsendi; sp10 - Eg. securigera; sp11 - Eg. pleosticta; sp12 - Eg. nanomelanotricha; sp13 - Eg. liopoda; sp14 - Eg. ignita; sp15 - Eg. hemichlora; sp16 - Eg. fimbriata; sp17 - Eg. cordata. O resultado das análises realizadas anteriormente vem a ser firmadas e representadas pelo padrão apontado na análise de cluster utilizando todos hidrocarbonetos cuticulares identificados, onde pode ser observado a presença/ausência de todos os compostos e a intensidade da porcentagem de área apresentada nos cromatogramas de cada por espécies (Figura

126 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Figura 7 Proporção (%) de CHCs nos machos de Euglossini agrupados de acordo com relações dissimilaridade entre os mesmos. A escala de cores indica quanto um composto contribuiu em média no total da área de pico para as dadas espécies. 109

127 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. A distância entre centroide representou a distância que os gêneros em estudo encontram entre si, assim foi possível observar que o gênero Exaerete é o mais distinto entre todos, já Eulaema encontra-se em um nível intermediário, evidenciado pelas análises de MDS e cluster, os quais mostrou El. cingulata próxima às espécies de Euglossa (Tabela 4). Tabela 4 Distância de centroides (média das variáveis) entre os gêneros dos machos de Euglossini coletados entre janeiro/2012 e dezembro/2013, em Sergipe, Brasil. Eufriesea Exaerete 62,712 Distância entre centroides (variação: 0 - ) Eufriesea Exaerete Eulaema Euglossa Eulaema 29,54 53,494 Euglossa 24,361 65,057 30,707 Discussão Os dados obtidos durante as análises realizadas permitiram caracterizar cada espécie de acordo com sua composição cuticular. Essa diferenciação do perfil entre espécies é reforçada pelas discussões de Howard e Blomquist (2005) que tratam da importância do perfil de hidrocarbonetos para os sinais e distinção de espécies, ou ainda por estudos em formigas onde é demonstrado que as espécies podem ser distintas de acordo com sua composição de hidrocarbonetos na cutícula (SEPPÄ, HELANTERÄ, et al., 2011). Aqui foram encontrados alcanos lineares e metilados, alcenos e alcadienos que, de acordo com Leonhardt e colaboradores (2013), são compostos produzidos pelo próprio organismo, os metil-alcanos não tiveram ainda sua função definida já os demais compostos tem como função proteção contra dessecação, danos e predadores, além de funcionarem no reconhecimento das companheiras de ninhos e como marcadores de cheio. Além dos diversos hidrocarbonetos cuticulares analisados, outros compostos também puderam ser observados, estes foram isolados das análises pois muitas vezes são adquiridos do ambiente não apresentando uma origem do próprio animal. Hölldobler e Michener (1980) já haviam sugerido que o perfil particular é formado por 110

128 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. uma mistura complexa de compostos químicos, e apontaram como uma das funções desse conjunto a sinalização entre indivíduos (BREED, WILLIAMS e FEWELL, 1988) ou ainda como reconhecimento de companheiras de ninho (GETZ, BRFICKNER e SMITH, 1989; PAGE, METCALF, et al., 1991). Em algumas espécies de abelhas solitárias, os lipídios cuticulares já foram citados como indicadores de status sexual e feromônios (PAULMIER, AFONSO, et al., 1999; AYASSE, ENGELS, et al., 1999; SIMMONS, ALCOCK e REEDER, 2003; MANT, BRÄNDLI, et al., 2005; BUCKNER, PITTS-SINGER, et al., 2009). Nos machos de Euglossini, essa mistura de compostos recebe ainda um adicional proveniente dos compostos aromáticos coletados por estes nas flores. Os hidrocarbonetos são compostos promissores a serem utilizados como caracteres na taxonomia química, podendo através destes identificar espécies irmãs até então não separadas (POKORNY, LUNAU, et al., 2014). Compostos característicos para uma espécie vêm sendo estudados há algum tempo em grupos de insetos sociais como Camponotus vagus Scopoli, Cataglyphis cursor Fonscolombe, Solenopsis invicta Buren, Manica rubida Latreille, Formica selysi Bondroit, Apterostigma dentigerum Wheeler, e A. collare Emery (OBIN, 1986; VANDER MEER, SALIWANCHIK e LAVINE, 1989; NOWBAHARI, LENOIR, et al., 1990; BONAVITA-COUGOURDAN, CLEMENT e LANGE), ou ainda em operárias de vespas das espécies Mischocyttarus consimilis Zikán, M. cerberus Richards e M. latior Fox (FERREIRA, 2012). Aqui foi possível verificar que existe uma distinção das espécies da tribo Euglossini por meio dos hidrocarbonetos cuticulares, sendo esta uma ferramenta importante para caracterização taxonômica. As abelhas são capazes de fazer distinções olfativas muito finas (BREED e STILLER, 1992), um exemplo disso é que elas são capazes de aprender e discriminar entre alcanos que diferem por apenas dois átomos de carbono (GETZ e SMITH, 1987). Para Breed e Stiller (1992), os alcanos constituem um exemplo interessante de como o sistema de quimiorrecepção pode funcionar. A classe de CHCs presente em maior número de compostos no estudo foram os alcenos com ligação nas posições 9 e 7, respectivamente. O elevado número de alcenos, com a dupla ligação nessas posições, também foi apontado para abelhas do gênero Bombus, como em Bombus appositus Cresson que apresentou 48% da formação da cutícula composta por alcenos com ligação dupla na posição 7 ou ainda em B. occidentailis Greene onde foi encontrado 35% da composição formada por alcenos de posição 9 (HADLEY, BLOMQUIST e LANHAM, 1981). 111

129 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Estudos em Apis mellifera Linnaeus apontam que os alcenos, juntamente com outros compostos cuticulares como os ácidos graxos, podem ser utilizados para determinar a divisão de tarefas entre os indivíduos (KATHER, DRIJFHOUT e MARTIN, 2011) ou reconhecimento das companheiras de ninho (DANI, JONES, et al., 2005; BREED e STILLER, 1992). Os alcanos ramificados e insaturados têm sido indicados como marcadores para caracterização quimiotaxonômica em diversas espécies de Diptera (SUTTON e CARLSON, 1993; YE, LI, et al., 2007; BLOMQUIST e BAGNÈRES, 2010; VANÍčKOVÁ, VIRGILIO, et al., 2014), Hemiptera (GEMENO, LASERNA, et al., 2012), Isoptera (HAVERTY, NELSON e PAGE, 1990), Orthoptera (CHAPMAN, ESPELIE e SWORD, 1995) e Hymenoptera (DAHBI, HEFETZ e LENOIR, 2008; MARTIN e DRIJFHOUT, 2009; GUILLEM, DRIJFHOUT e MARTIN, 2012; POKORNY, LUNAU, et al., 2014). O nível de n-alcanos, segunda classe de compostos mais abundante no estudo, está associado aos ambientes áridos e de temperaturas mais altas (HADLEY e SCHULTZ, 1987; KATHER, DRIJFHOUT e MARTIN, 2011), isso porque formam a melhor classe dos hidrocarbonetos para impermeabilização devido ao ponto de fusão e forma (GIBBS e POMONIS, 1995; GIBBS, 1998; KATHER, DRIJFHOUT e MARTIN, 2011); assim, esses compostos estão presentes mais para o controle da perda de água do que para comunicação entre os indivíduos (DANI, JONES, et al., 2005; BREED, STILLER e MOOR, 1988). Analisando o perfil cuticular de duas espécies irmãs de Euglossa, Eg. viridissima Friese e Eg. dilemma Bembé & Eltz, Pokorny e colaboradores (2014) verificaram que é possível diferenciar duas espécies irmãs, nesse caso a diferença deu-se, principalmente, por diferenças quantitativas dos compostos (Z)-9-heptacoseno, (Z)-9-pentacoseno; concluindo que os CHCs são ferramentas potencialmente promissoras para a taxonomia química em espécies de Euglossini, auxiliando no reconhecimento das fêmeas dessa tribo que muitas vezes apresentam problemas na identificação. Dentre as análises aqui realizadas esses dois compostos juntamente com (Z)-9-nonacoseno, (Z,Z)- pentatriaconteno-3, (Z)-9-tricoseno foram os principais responsáveis pela diferenciação entre as espécies estudadas. Igualmente importante ao reconhecimento entre espécies é a diferenciação por gênero (Howard e Blomquist, 2005). No presente estudo, onde foram empregadas dezessete espécies distribuídas em quatro dos cinco gêneros de Euglossini, todas as 112

130 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. análises realizadas apontam para uma diferenciação entre estas por meio do uso dos CHCs, sendo a distinção ainda mais clara quando a observação parte da identificação dos gêneros encontrados. A diversidade dos hidrocarbonetos cuticulares entre as espécies reflete em parte as variações relativas ao habitat em que vivem, tamanho corporal e suas relações filogenéticas (HADLEY, BLOMQUIST e LANHAM, 1981). Os cinco gêneros de Euglossini que existem atualmente apresentam mais de 200 espécies descritas (MOURE, MELO e FARIA, 2007) e várias são as hipóteses sobre as relações entre as abelhas e sua classificação dentro destes, tendo a análise de suas relações avançada com base em caracteres moleculares e morfológicos (RAMÍREZ, ROUBIK, et al., 2010). Quanto à composição de hidrocarbonetos, espécies pertencentes ao mesmo gênero, apresentam-se qualitativamente similares entre si (SOLIDAY, BLOMQUIST e JACKSON, 1974; LOK, CUPP e BLOMQUIST, 1975; LOCKEY, 1976), o que pode ser visto no presente estudo como também em Bombus appositus e B. occidentalis ao comparar as porcentagens de n-alcanos e alcenos (HADLEY, BLOMQUIST e LANHAM, 1981). Dentre os vários estudos sistemáticos que buscam demonstrar a relação entre os cinco gêneros da tribo Euglossini, diversos cenários com base no uso de caracteres morfológicos, associação entre esses caracteres e dados fósseis ou ainda associação entre a morfologia e sequenciamento gênico, vêm surgindo ao longo das décadas (KIMSEY, 1982; KIMSEY, 1987; ENGEL, 1999; MICHENER, 1990; MICHAEL-SALZAT, CAMERON e OLIVEIRA, 2004; OLIVEIRA, 2006). Análises recentes realizadas por Ramirez e colaboradores (2010) propuseram a caracterização dos indivíduos da tribo em gêneros e espécies através da utilização de análises moleculares, em geral os gêneros Eulaema e Eufriesea foram inconsistentes quanto ao método utilizado. Dentre estes os resultados utilizando como marcador molecular a arginina quinase (ArgK) foram os que mais se aproximaram aos dados aqui obtidos com o uso dos hidrocarbonetos cuticulares por meio da análise de agrupamento das espécies (Figura 8). Considerando que os hidrocarbonetos apresentam uma origem do próprio indivíduo, alguns desses compostos poderiam então afetar a classificação, bem como foi demonstrado para os caracteres morfológicos e genéticos, assim verificouse que a diferenciação entre esses se deu devido principalmente a quantidade desses compostos na cutícula (Tabela 1). 113

131 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Figura 8 Hipóteses propostas por diversos autores sobre as relações filogenéticas entre os gêneros da tribo Euglossini. Observando as análises moleculares com arginina quinase e os nossos resultados temos Exaerete como o grupo mais externo, o mais basal entre os gêneros de Euglossini e o único a apresentar compostos exclusivos, pelas análises é considerado irmão dos demais gêneros das abelhas das orquídeas (RAMÍREZ, ROUBIK, et al., 2010), isso ocorre porque é improvável considerar a ocorrência de uma reversão do parasitismo de ninho (DANFORTH, 2002; MICHENER, 2007). Até o momento foram identificadas cinco espécies desse grupo, sendo estas parasitas de Eufriesea e Eulaema (CAMERON, 2004). Martin e colaboradores (2007) agrupando dados obtidos no estudo do gênero Formica com CHCs com outros obtidos pelo uso de marcadores genéticos de DNA mitocondrial (GOROPASHNAYA, 2003), aloenzimas (PAMILO, VEPSÄLÄINEN, et al., 19879), morfologia e comportamento (CZECHOWSKI, RADCHENKO e CZECHOWSKA, 2002), demonstram que os CHCs têm origem genética, estando todos estes dados alinhados entre si. Análises moleculares e químicas se complementam já que os CHCs são resultantes de herança genética, assim os indivíduos de mesma espécie carregam com sigo características semelhantes independente do ambiente ao qual esteja exposto (KATHER e MARTIN, 2012). 114

132 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Considerações finais A análise da cutícula das dezessete espécies em questão possibilitou a diferenciação entre indivíduos demonstrando que esta pode ser utilizada como auxiliar na identificação taxonômica dessas abelhas, atingindo níveis de gênero e espécie, isso porque indivíduos do mesmo gênero são qualitativamente semelhantes, já entre espécies, como era esperado, assemelham-se qualitativamente e quantitativamente. Essa caracterização pode ser reafirmada ou mesmo complementada por outros tipos de análise como as genéticas, já testadas em outros grupos de insetos. A diferenciação dentro de cada gênero ocorre principalmente pela variação quantitativa dos compostos, já entre os gêneros pode ser apontada uma variação qualitativa dos compostos. Em vista do exposto, nossas análises estatísticas do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de dezessete machos de Euglossini, mostraram que apesar da presença de compostos comuns à todas as espécies, é possível identificar diferentes espécies por meio do uso da composição dos hidrocarbonetos presentes na cutícula dos machos da tribo Euglossini. Referências Bibliográficas ANDERSON, M. J.; ROBINSON, J. Generalized discriminant analysis based on distances. Australian & New Zealand Journal of Statistics, v. 45, p , ASCHER, J. S.; DANFORTH, B. N.; JI, S. Phylogenetic utility of the major opsin in bees (Hymenoptera: Apoidea): a reassessment. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 19, p , AUGUSTO, S. C.; GARÓFALO, C. A. Nesting biology and social structure of Euglossa (Euglossa) townsendi Cockerell (Hymenoptera, Apidae, Euglossini). Insectes Sociaux, v. 51, p , AUGUSTO, S. C.; GARÓFALO, C. A. Bionomics and sociological aspects of Euglossa fimbriata (Apidae, Euglossini). Genetics and molecular research, v. 8, p , AYASSE, M.; ENGELS, W.; LÜBKE, G.; TAGHIZADEH, T.; FRANCKE, W. Maiting expenditures reduced via female sex pheromone modulation in the primitively eusocial 115

133 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. halictine bee, Lasioglossum (Evylaeus) malachurum (Hymenoptera:Halictidae). Behavioral Ecology and Sociobiology, v. 45, p , BLOMQUIST, G. J.; BAGNÈRES, A. G. Insect Hydrocarbons Biology, Biochemistry, and Chemical Ecology. New York: Cambridge University Press, BLOMQUIST, G. J.; NELSON, D. R.; RENOBALES, M. Chemistry, biochemistry and physiology of insect cuticular lipids. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, v. 6, p , BLOMQUIST, G. L.; JACKSON, L. L. Chemistry and biochemistry of insect waxes. Progress in Lipid Research, v. 17, p , BONAVITA-COUGOURDAN, A.; CLEMENT, J. -L.; LANGE, C. Nestmate recognition: The role of cuticular hydrocarbons in the ant Camponotus vagus Scop. J. Entomol. Sci. 1987, v. 22, p BRAY, J. R.; CURTIS, J. T. An ordination of the upland forest communities of Southern Wisconsin. Ecological Monographs, v. 27, p , BREED, M. D.; STILLER, T. M. Honeybee, Apis mellifera, nestmate discrimination: hydrocarbon effects and the evolutionary implications of comb choice. Animal Behaviour, v. 43, p , BREED, M. D.; STILLER, T. M.; MOOR, M. J. The ontogeny of kin discrimination cues in the hoeny bee, Apis mellifera. Behavior Genetics, v. 18, p , BREED, M. D.; WILLIAMS, K. R.; FEWELL, J. H. Comb wax mediates the acquisition of nest-mate recognition cues in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 85, n. 22, p , BROWN, W. V.; SPRADBERY, J. P.; LACEY, M. J. Changes in the cuticular hydrocarbon composition during development of the social wasp, Vespula germanica (F.) (Hymenoptera: Vespidae). Comparative Biochemistry and Physiology Part B, v. 99, p , BUCKNER, J. S. Polar cuticular lipids. In: STANLEY-SAMEULSON, D. W.; NELSON, D. R. Insect Lipids: Chemistry, Biochemistry and Biology. Lincoln, NE: University of Nebraska Press, p

134 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. BUCKNER, J. S.; PITTS-SINGER, T. L.; GUÉDOT, C.; HAGEN, M. M.; FATLAND, C. L.; KEMP, W. P. Cuticular lipids of female solitary bees, Megachile rotundata (F.) and Osmia lignaria Say (Hymenoptera: Megachilidae). Comparative Biochemistry & Physiology, Part B, v. 153, p , BÚRQUEZ, A. Distribitional limits of euglossine and meliponine bees (Hymenoptera: Apidae) in Nortwestern Mexico. Pan-Pacific Entomologist, v. 73, n. 2, p , CALDERÓN-FERNÁNDEZ, G. M.; GIROTTI, J. R.; JUÁREZ, M. P. Cuticular hydrocarbons of Triatoma dimidiata (Hemiptera: Reduviidae): intraspecific variation and chemotaxonomy. Journal of Medical Entomology, v. 48, p , CAMERON, S. A. Multiple origins of advanced eusociality in bees inferred from mitochondrial DNA sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v. 90, p , CAMERON, S. A. Phylogeny and biology of Neotropical orchid bees (Euglossini). Annu. Rev. Entomol., v. 49, p , CAMERON, S. A.; MARDULYN, P. Multiple molecular data sets suggest independent origins of highly eusocial behaviour in bees (Hymenoptera: Apinae). Systematic Biology, v. 50, p , CAMERON, S. A.; MARDULYN, P. The major opsin gene is useful for inferring higher level phylogenetic relationships of the corbiculate bees. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 28, p , CANEVAZZI, N. C. S.; NOLL, F. B. Cladistic analysis of self-grooming indicates a single origin of eusociality in corbiculate bees (Hymenoptera: Apidae). Cladistics, p. 1-16, CARDINAL, S.; DANFORTH, B. N. The Antiquity and Evolutionary History of Social Behavior in Bees. PLos one, v. 6, n. 6, p. e21086, CARLSON, D. A.; ROAN, C.; YOST, R. A.; HECTOR, J. Dimethyl disulfite derivatives of long chain alkenes, alkadienes, and alkatrienes for gas chromatography/masss spectomatry. Anal. Chem., v. 61, p ,

135 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. CHAPMAN, R. F.; ESPELIE, K. E.; SWORD, G. A. Use of cuticular lipids in grasshopper taxonomy: a study of variation in Schistocerca shoshone (Thomas). Biochemical Systematics and Ecology, v. 23, p , CHAVARRIA, G.; CARPENTER, J. M. Total Evidence and the evolution of highly social bees. Cladistics, v. Cladistics, p , CLARKE, K. R.; GREEN, R. H. Statistical design and analysis for a biological effects study. Marine Ecology Progress Series, v. 46, p , CZECHOWSKI, W.; RADCHENKO, A.; CZECHOWSKA, W. The ants (Hymenoptera, Formicidae) of Poland. Warsaw: Museum and Institute of Zoology PAS, p. DAHBI, A.; HEFETZ, A.; LENOIR, A. Chemotaxonomy of some Cataglyphis ants from Morocco and Burkina Faso. Biochemical Systematics and Ecology, v. 36, p , DANFORTH, B. N. Evolution of sociality in a primitively eusocial lineage of bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United stages of America, v. 99, p , DANI, F. R.; JONES, G. R.; CORSI, S.; BEARD, R.; PRADELLA, D.; TURILLAZZI, S. Nestmate recognition cues in the honey bee: Differential importance of cuticular alkanes and alkenes. Chemical Senses, v. 30, p , DRESSLER, R. L. Biology of the orchid bees (Euglossin). Annual Review of Ecology and Systematics, v. 13, p , DRESSLER, R. L. Biology of the orchid bees (Euglossini). Annu. Rev. Ecol. Syst., v. 13, p , ENGEL, M. S. The first fossil Euglossa and phylogeny of the orchid bees (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). American Museum Novitates, v. 3272, p. 1-14, ESPELIE, K. E.; GAMBOA, G. J.; GRUDZIEN, T. A.; BURA, E. A. Cuticular hydrocarbons of the paper wasp, Polistes fuscatus: a search for recognition pheromones. Journal of Chemical Ecology, v. 20, p , ESPELIE, K. E.; HERMANN, H. R. Surface lipids of the social wasp Polistes annularis (L.) and its nest and nest pedicel. Journal of Chemical Ecology, v. 16, p ,

136 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. ETEGES, W. J.; JACKSON, L. L. Epicuticular hydrocarbon variation in Drosophila mojavensis cluster species. Journal of Chemical Ecology, v. 27, p , FERREIRA, A. C. Estudo dos perfis de hidrocarbono cuticular da vespa Mischocyttarus consimilis (Hymenoptera: Vespidae) por cromatografia gasosa. Dourados: Dissertação (Mestrado) em Recursos Naturais, p. GEMENO, C.; LASERNA, N.; RIBA, M.; VALLS, J.; CASTAÑÉ, C.; ALOMAR, O. Cuticular hydrocarbons discriminate cryptic Macrolophus species (Hemiptera: Miridae). Bulletin of Entomological Research, v. 102, p , GETZ, W. M.; BRFICKNER, D.; SMITH, K. B. Ontogeny of chemosensory cues in worker honey bees Apis mellifera. Apidologie, v. 20, p , GETZ, W. M.; SMITH, K. B. Olfactory sensitivity and discrimination of mixtures in the honey bee Apis mellifera. Journal of Comparative Physiology A, v. 160, p , GIBBS, A. G. Water-proofing properties of cuticular lipids. American Zoologist, v. 38, p , GIBBS, A.; POMONIS, J. G. Physical properties of insect cuticular hydrocarbons: The effects of chain length, methyl-branching and unsaturation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, v. 112, p , GOROPASHNAYA, A. Phylogeographic Structure and Genetic Variation in Formica Ants. Norbyv, Sweden: Uppsala University, GUILLEM, R. M.; DRIJFHOUT, F. P.; MARTIN, S. J. Using chemo-taxonomy of host ants to help conserve the large blue butterfly. Biological Conservation, v. 148, p , HADLEY, N. F. Cuticular lipids of terrestrial plants and arthropods: a comparison of their structure, composition and waterproofing function. Biological review, v. 56, p , HADLEY, N. F.; BLOMQUIST, G. F.; LANHAM, U. N. Cuticular hydrocarbons of four species of Colorado Hymenoptera. Insect Biochemistry, v. 11, p , HADLEY, N. F.; SCHULTZ, T. D. Water-loss in 3 species of tiger beetles (Cicindela)- Correlations with epicuticular hydrocarbons. Journal of Insect Physiology, v. 33, p ,

137 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. HAVERTY, M. I.; PAGE, M.; NELSON, N. J.; BLOMQUIST, G. J. Cuticular hydrocarbons of the dampwood termiter, Zootermopsis: intra and intercolony variation and potential as taxonomic characters. Journal of Chemical Ecology, v. 14, p , HAVERTY, M. I.; NELSON, L. J.; PAGE, M. Cuticular hydrocarbons of four populations of Coptotermes formosanus Shikari in the United States: similarities and origins of introductions. Journal of Chemical Ecology, v. 16, p , HÖLLDOBLER, B.; MICHENER, C. D. Mechanisms of identification and discrimination in social Hymenoptera. In: MARKL, H. Evolution of Social Behavior: Hypotheses and Empirical Tests. Weinheim: Verlag Chemie, p HOWARD, R. W.; BLOMQUIST, G. J. Chemical ecology and biochemistry of cuticular hydrocarbons. Annual Review of Entomology, v. 27, p , HOWARD, R. W.; BLOMQUIST, G. J. Ecological, behavioral, and biochemical aspects of insect hydrocarbons. Annual Review of Entomology, v. 50, p , JALLON, J. -M.; DAVID, J. R. Variations in cuticular hydrocarbons among the eight species of the Drosophila melanogaster subgroup. Evolution, v. 41, p , KATHER, R.; DRIJFHOUT, F.; MARTIN, S. Task Group Differences in Cuticular Lipids in the Honey Bee Apis mellifera. Journal of Chemical Ecology, v. 37, p , KATHER, R.; MARTIN, S. Cuticular hydrocarbon profiles as a taxonomic tool: advantages, limitations and technical aspects. Physiol. Entomol., v. 37, p , KIMSEY, L. S. Systematics of bees of the genus Eufriesea (Hymenoptera, Apidae). University of California Publications, Entomology, v. 95, p , KIMSEY, L. S. Generic relationships within the Euglossini. Systematic Entomology, v. 12, p , KOULIANOS, S.; SCHMID-HEMPEL, R.; ROUBIK, D. W.; SCHMID-HEMPEL, P. Phylogenetic relationships within the corbiculate Apinae (Hymenoptera) and the evolution of eusociality. Journal of Evolutionary Biology, v. 12, p , LANDIM, C. D. C. Abelhas - Morfologia e Função de Sistemas. São Paulo: UNESP, p. LEGENDRE, P.; LEGENDRE, L. Numerical ecology. 2. ed. Amsterdam: Elsevier,

138 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. LEONHARDT, S. D.; RASMUSSEN, C.; SCHMITT, T. Genes versus environment: geography and phylogenetic relationships shape the chemical profiles of stingless bees on a global scale. Proceedings of the Royal Society B, v. 280, p , LOCKEY, K. H. Cuticular hydrocarbons of Locusta, Schistocera and Periplaneta and their role in waterproofing. Insect Biochem, v. 6, p , LOCKEY, K. H. Lipids of the insect cuticle:origin, composition and function. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B, v. 89, p , LOK, J. B.; CUPP, E. W.; BLOMQUIST, G. J. Cuticular lipids of the imported fire ants, Solenopsis invicta and richteri. Insect Biochemistry, v. 5, p , MANLY, B. F. J. Multivariate Satistical Methods: A Primer. New York: Chapman and Hall, MANT, J. G.; BRÄNDLI, C.; VEREECKEN, N. J.; SCHULTZ, C. M.; FRANCKE, W.; SCHIESTL, F. P. Cuticular hydrocarbons as sex pheromone of the bee Colletes cunicularis and the key to its mimicry by the sexually deceptive orchid, Ophhrys exaltata. Journal of Chemical Ecology, v. 31, p , MARDULYN, P.; CAMERON, S. A. The major opsin in bees (Insecta: Hymenoptera): a promising nuclear gene for higher level phylogenetics. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 12, p , MARTIN, S. J.; DRIJFHOUT, F. P. A review of ant cuticular hydrocarbons. J. Chem. Ecol., v. 35(10), p , MARTIN, S. J.; HEIKKI, H.; FALKO, P. D. Evolution of species-specific cuticular hydrocarbons patterns in Formica ant. Biological Journal of the Linnean Society, v. 95, n. 1, p , MARTIN, S. J.; JENNER, E.; DRIJFHOUT, F. P. Chemical deterrent enables a socially parasitic ant to invade multiple hosts. Proceedings of the Royal Society Series B, v. 274, p , MICHAEL-SALZAT, A.; CAMERON, S. A.; OLIVEIRA, M. L. Phylogeny of the bees (Hymenoptera: Apinae: Euglossini): DNA and morphology yield equivalent patters. Molecular Phylogenetcs and Evolution, v. 32, p ,

139 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. MICHENER, C. D. Classification of the Apidae (Hymenoptera). University of Kansas Science Bulletin, v. 54, n. 4, p , MICHENER, C. D. The Bees of the World. 2. ed. Baltimore: The Johns Hopins University Press, p. MOURE, J. S.; MELO, G. A. R.; FARIA, L. R. R. J. Euglossini Latreille, In: MOURE, J. S.; URBAN, D.; MELO, G. A. R. Catalogue of Bees (Hymenoptera, Apoidea) in the Neotropical Region. Curitiba: Sociedade Brasileira de Entomologia, p NELSON, D. R. Long-chain methyl-branched hydrocarbons: occurrence, biosynthesis and function. Advances in Insect Physiology, v. 13, p. 1-33, NELSON, D. R.; BLOMQUIST, G. J. Insect waxes. In: HAMILTON, R. J. Waxes: Chemistry, Molecular Biology and Functions. Dundee, Scotland: Oily Press, p NEMÉSIO, A. Orchid bees (Hymenoptera: Apidae) of Brazilian Atlantic Forest. Zootaxa, v. 2041, p , NOLL, F. B. Behavioral phylogeny of corbiculate Apidae (Hymenoptera; Apinae) with special reference to social behavior. Cladistics, v. 18, n. 2, p , NOWBAHARI, E.; LENOIR, A.; CLEMENT, J. L.; LANGE, C.; BAGNERES, A. G.; JOULIE, C. Individual, geographical and experimental variation of cuticular hydrocarbons of the ant Cataglyphis cursor (Hymenoptera: Formicidae): Their use in nest and subspecies recognition. Biochemical Systematics and Ecology, v. 18, p , NUNES, M. T. Sobre a ecologia química de Friesella schrottkyi Friese 1900 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) com ênfase na regulação social. Tese de Doutorado: Universidade de São Paulo, OBIN, M. Nestmate recognition cues in laboratory and field colonies of Solenopsis invicta Buren (Hymenoptera: Formicidae): Effect of environment and role of cuticular hydrocarbons. Journal of Chemical Ecology, v. 12, p , OLIVEIRA, M. L. Nova hipótese de relacionamento filogenético entre os gêneros de Euglossini e entre as espécies de Eulaema Lepeletier, 1841 (Hymenoptera: Apidae: Euglossini). Acta Amazônica, v. 36, n. 2, p ,

140 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. PAGE, R. E. JR.; METCALF, R. A.; METCALF, R. L.; ERICKSON, E. T. T. JR; LAMPMAN, R. L. Extractable hydrocarbons and kin recognition in the honey bee. Journal of Chemical Ecology, v. 17, p , PAMILO, P.; VEPSÄLÄINEN, K.; ROSENGREN, R.; VARVIOAHO, S.; PISARSKI, B. Population genetics of Formica ants. II Genic differentiation between species. Annales Entomologici Fennici, v. 45, p , PAULMIER, I.; BAGNÉRES, A. G.; AFONSO, C. M. M.; DUSTICIER, G.; RIVIÉRE, G.; CLÉMENT, J. -L. Alkenes as a sexual pheromone in the alfalfa leaf-cutter bee Megachile rotundata. Journal of Chemical Ecology, v. 25, p , POKORNY, T.; LUNAU, K.; QUEZADA-EUAN, J. J. G.; ELTZ, T. Cuticular hydrocarbons distinguish cryptic sibling species in Euglossa orchid bees. Apidologie, v. 45, p , R DEVELOPMENT CORE TEAM. R: A language and environment for language and environment for statistical computing. Vienna: R Foundation for Statistical Computing, Disponivel em: < RAMÍREZ, S. R.; ROUBIK, D. W.; SKOV, C.; PIERCE, N. E. Phylogeny, diversification patterns and historical biogeography of euglossine orchid bees (Hymenoptera: Apidae). Biological Journal of the Linnean Society, v. 100, n. 3, p , RENOBALES, M.; NELSON, D. R.; BLOMQUIST, G. J. Cuticular lipids. In: BINNINGTON, K.; RETNAKARAN, A. Physiology of the Insect Epidermis. Australia: CSIRO, p ROIG-ALSINA, A.; MICHENER, C. D. Studies of the phylogeny and classification of longtongued bees (Hymenoptera: Apoidea). University of Kansas Science Bulletin, v. 55, p , ROUBIK, D. D. Ecology and natural history os tropical bees. New York, Cambridge Univ. Press, 514p. New York: Cambridge Univ. Press, p. ROUBIK, D. W.; HANSON, P. E. Orchid bees from tropical America: biology and field guide. Santo Domingo de Heredia, Costa Rica: INBio Press, SCHULTZ, T.; ENGEL, M. S.; PRENTICE, M. Resolving conflict between morphological and molecular evidence for the origin of eusociality in the "corbiculate" bees (Hymenoptera: 123

141 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. Apidae): a hypothesis testing approach. The University of Kansas Natural History Museum Spec. Publ., v. 24, p , SEPPÄ, P.; HELANTERÄ, H.; TRONTTI, K.; PUNTTILA, P.; CHERNENKO, A.; MARTIN, S. J.; SUNDSTRÖM, L. The many ways to delimit species: hairs, genes and surface chemitry. Myrmecological News, v. 15, p , SIMMONS, L. W.; ALCOCK, J.; REEDER, A. The role of cuticular hydrocarbons in male attraction and repulsion by female Dawson's burrowing bee, Amegilla dawsoni. Animal Behaviour, v. 66, p , SINGER, T. L.; ESPELIE, K. E. Discriminant analysis of cuticular hydrocarbons of social wasp Polistes exclamans and nest surface hydrocarbons of its nest paper and pedicel. J. Chem. Ecol., v. 18, p , SINGER, T. L.; ESPELIE, K. E.; GAMBOA, G. J. Nest and nestmate discrimination in independent-founding wasps. In: VANDER MEER, R. K.; BREED, M. D.; WINSTON, M. L.; ESPELIE, E. K. Pheromone communication in social insects. Westview: Boulder, p SOKAL, R. R.; MICHENER, C. D. A statistical method for evaluating systematic relationships. University of Kansas science bulletin, v. 38, p , SOLIDAY, C. L.; BLOMQUIST, G. J.; JACKSON, L. L. Cuticular lipids of insects. VI. Cuticular lipids of the grasshoppers Melanoplus sanguinipes and Melanoplus packardii. Journal of Lipid Research, v. 15, p , SUTTON, B. D.; CARLSON, B. D. Interspecific variation in tephritid fruit fly larvae surface hydrocarbons. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, v. 23, p , VALENTIN, J. L. Agrupamento e Ordenação. In: PERES-NETO, P. R.; VALENTIN, J. L.; FERNANDEZ, F. A. S. Oecologia Brasiliensis, Vol. III: Tópicos de Dados Biológicos. Programa de Pós-Graduação em Ecologia: Instituto de Biologia - UFRJ, VANDER MEER, R. K.; SALIWANCHIK, D.; LAVINE, B. Temporal changes in colony hydrocarbon patterns of Solenopsis invicta: Implications for nestmate recognition. Journal of Chemical Ecology, v. 15, p , VANÍČKOVÁ, L.; VIRGILIO, M.; TOMČALA, A.; BŘÍZOVÁ, R.; EKESI, S.; HOSKOVEC, M.; KALINOVÁ, B.; DO NASCIMENTO, R. R.; DE MEYER, M. Resolution of three cryptic 124

142 Capítulo 3 Hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Euglossini (Hymenoptera: Apidae): variação interespecífica e quimiotaxonomia. agricultural pests (Ceratitis fasciventris, C. anonae, C. rosa, Diptera: Tephritidae) using cuticular hydrocarbon profiling. Bulletin of Entomological Research, v. 104, n. 5, p , YE, G.; LI, K.; ZHU, J.; ZHU, G.; HU, C. Cuticular hydrocarbon composition in pupal exuviae for taxonomic differentiation of six necrophagous flies. Journal of Medical Entomology, v. 44, p , ZIMMERMANN, Y. Chemical and molecular ecology of orchid bees (Euglossini). [S.l.]: Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf,

143 Vapítulo 4 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica

144 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. PERFIL CUTICULAR DE EUGLOSSA CORDATA L. (HYMENOPTERA: APIDAE: EUGLOSSINI) E SUA VARIAÇÃO NOS BIOMAS CAATINGA E MATA ATLÂNTICA. O perfil cuticular da espécie Euglossa cordata foi analisado por meio de cromatografia gasosa buscando verificar a proposição de que hidrocarbonetos cuticulares podem ser utilizados como ferramenta auxiliar na classificação taxonômica, e se a variação sazonal pode alterar a composição cuticular, para tal, machos da espécie foram coletados em áreas de Caatinga e Mata Atlântica do estado de Sergipe. Foram encontrados 52 compostostabela 1 entre hidrocarbonetos (65,38%), acetatos (15,38%), ésteres (9,62%), álcoois e outros (9,62%), que quando separados por biomas verificou-se que a diferenciação não está em diferentes composições entre biomas, mas na proporção quantitativa de cada composto presente na cutícula, possivelmente devido à disponibilidade de alimentos e resistência à dessecação. 127

145 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Introdução Asuperfície do corpo dos artrópodes é revestida por uma cutícula composta por camadas (HADLEY, 1986), sendo a mais externa, a epicutícula, formada por diversos compostos como os hidrocarbonetos saturados (de cadeia normal ou ramificada) ou insaturados, ésteres, álcoois, glicerídeos, aldeídos e ácidos graxos (LOCKEY, 1988). Estes lipídios cuticulares desempenham um importante papel na regulação da perda de água, bem como na proteção contra inseticidas e microrganismos (GENIN, JULLIEN, et al., 1986), comunicação (BLOMQUIST, NELSON e RENOBALES, 1987; BUCKNER, 1993; NELSON e BLOMQUIST, 1995) ou ainda como feromônios sexuais (ESPELIE e HERMANN, 1990). A sinalização química pode revelar muitas informações sobre um indivíduo, incluindo sexo, dieta, status social, identidade individual e do grupo, condições reprodutivas, idade, sanidade e outros aspectos fisiológicos (WYATT, 2003; KESSELER, 2006). Em insetos sociais, a mistura de hidrocarbonetos presentes na cutícula parecem agrupar os compostos necessários a serem utilizados como reconhecimento das companheiras de ninho (HOWARD e BLOMQUIST, 2005), embora para abelhas melíferas, em específico, foi observado que os ácidos graxos e ésteres podem também desempenhar um papel importante (VAN ZWEDEN e D'ETTORRE, 2010). Além das funções citadas, Seppä e colaboradores (2011) apontam que os hidrocarbonetos cuticulares (CHCs) podem ser uma ferramenta à qual funcionam como base na identificação de espécies. Isso ocorre porque os CHCs são produzidos pelo próprio inseto por meio de características hereditárias, sendo assim, um reflexo do genótipo (LOCKEY, 1991) compartilhado por indivíduos pertencentes à mesma espécie devido à descendência comum, logo homólogos ao indivíduo (KATHER e MARTIN, 2012). Esses semioquímicos presentes nas cutículas podem ser pensados como uma extensão fenotípica dos indivíduos (DAWKINS, 1983; KESSELER, 2006), onde alguns dos hidrocarbonetos constituintes são formados e determinados geneticamente, mas outros são adquiridos a partir do ambiente (CRUZ-LANDIM, 2008); de acordo com o observado por Hefetz e colaboradores (1993) ao utilizar indivíduos do gênero Bombus, a dieta e o tipo de alimento armazenado na colônia pode interferir na composição cuticular. Alguns estudos ainda apontam que a composição cuticular possa variar entre diferentes populações (DAPPORTO, 2007), de acordo com a disponibilidade alimentar e 128

146 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. variação sazonal (LIANG e SILVERMAN, 2000; LIU, BAGNÈRES, et al., 2001; BUCZKOWSKI, KUMAR, et al., 2005; MARTIN, SHEMILT e DRIJFHOUT, 2012), ou ainda pela localização geográfica e distância das populações (VANDER MEER, SALIWANCHIK e LAVINE, 1989; LIANG e SILVERMAN, 2000). Entre os insetos que já tiveram seus hidrocarbonetos cuticulares utilizados para auxiliar na identificação taxonômica estão: grilos (BROZA, BLONDHEIM e NEVO, 1998; MULLEN, MENDELSON, et al., 2007), borboletas (HAY-ROE, LAMAS e NATION, 2007), besouros (LOCKEY e METCALFE, 1988; PAGE, NELSON, et al., 1997), térmitas (HAY-ROE, LAMAS e NATION, 2007; KAIB, BRANDL e BAGINE, 1991), gafanhotos (CHAPMAN, ESPELIE e SWORD, 1995), formigas (MARTIN, HEIKKI e FALKO, 2008; LUCAS, FRESNEAU, et al., 2002) e moscas (BARTELT, ARMOLD, et al., 1986; URECH, BROWN, et al., 2005). Ainda que existam discussões a respeito do uso desses compostos como indicadores taxonômicos, Kather e Martin (2012) buscando compreender benefícios e limitações dessa ferramenta chegaram à conclusão de que é possível utilizá-la na identificação de espécies devido às suas características, como a possibilidade de identificar espécies crípticas, que em outros métodos necessitaria de uma estabilidade da população o que levaria muito tempo. Um exemplo desse tipo de estudo foi realizado por Pokorny e colaboradores (2014) com duas espécies irmãs do gênero Euglossa que resultou em uma clara distinção. Embora ainda seja comum a classificação baseada apenas nas estruturas morfológicas, algumas podem sofrer variações que dificultem a identificação, os CHCs poderiam então estar auxiliando na separação. Dentre os Euglossini uma estrutura muito utilizada nas chaves de identificação é uma área recoberta de pelos na tíbia mesotoráxica (Figura 1), também chamada de coxim, que em algumas espécies apresentam pequenas variações no formato dificultando a identificação. 129

147 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. A B A B Figura 1 Representação gráfica e micrografia de um macho da espécie Euglossa cordata com destaque para a tíbia média onde estão localizados os coxins utilizados para identificação. Em vermelho destaque para o coxim anterior (A) e posterior (B). Adaptado de Bembé, Um exemplo de indivíduos com uma variação no formato dos coxins são os pertencentes à espécie Euglossa (Euglossa) cordata Linnaeus (1978) (Figura2). Esta abelha, que ocorre do México até o Paraguai, com registros no Panamá, Colômbia, Guianas, Trinidad e em vários estados do Brasil (REBÊLO, 2001), é uma espécie que pertence ao gênero Euglossa, o mais diversificado da tribo e pode ser encontrado em ambientes com diferentes características chegando às áreas mais secas do Nordeste e regiões centrais do Brasil. Sidnei Mateus Sidnei Mateus 1mm Figura 2 Macho de Euglossa cordata coletado durante o estudo. A Vista Lateral; B - Vista frontal da cabeça. 130

148 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Devido à ampla distribuição geográfica e a variação morfológica dessa estrutura na espécie Eg. cordata algumas questões foram levantadas: indivíduos em ambientes com características distintas como a Caatinga, marcada por período de extrema seca e vegetação arbustiva, e a Mata Atlântica, caracterizada por uma vegetação fechada e ambiente úmido, sofrem alterações no seu perfil cuticular? Existindo uma mudança na composição, quais os grupos de compostos podem estar sofrendo interferindo para essa diferenciação? Os CHCs podem ser usados para auxiliar na identificação dos indivíduos? Objetivos Considerando que existe a possibilidade da identificação dos insetos por meio da sua composição cuticular e que esta pode apresentar diferenças de acordo com o ambiente em que estão inseridas, objetivou analisar o perfil de cuticular de machos de Eg. cordata de duas áreas de proteção localizadas no estado de Sergipe dos biomas Caatinga e Mata Atlântica, assim, os objetivos específicos foram: Traçar o perfil cuticular dos machos de Eg. cordata nos biomas Caatinga e Mata Atlântica, verificando se há similaridade dos indivíduos de acordo com os grupos de compostos encontrados; Identificar a possibilidade de caracterizar esta espécie por meio do reconhecimento dos compostos presentes na sua cutícula; Analisar possíveis interferências do meio ambiente em que os indivíduos se encontram inseridos na composição química cuticular e no uso desses compostos como instrumento auxiliar na taxonomia. Materiais e Métodos Coleta de indivíduos. Os machos de Euglossa cordata foram coletados em duas áreas de proteção ambiental (Figura ): Reserva da Vida Silvestre Mata do Junco (Mata Atlântica) e Monumento Natural Grota do Angico (Caatinga), localizados, respectivamente, nos municípios de Capela e Poço Redondo, Sergipe, Brasil, entre os meses de janeiro de 2012 e dezembro de Os indivíduos foram atraídos com o uso de compostos aromáticos e 131

149 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. capturados com auxílio de rede entomológica, acondicionados individualmente, em frascos de vidro e sacrificados por resfriamento. Para evitar contato dos machos com as iscas, estas ficavam protegidas permitindo apenas a difusão do aroma. O Monumento Natural Grota do Angico, localizado nos municípios de Poço Redondo e Canindé do São Francisco, é uma área de 2183 hectares composta por remanescentes florestais da Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro e quase totalmente nordestino (SERGIPE, 2007; SEMARH/SE, 2010). O clima é Tropical Semiárido Quente tipo BSh (KÖPPEN e GEIGER, 1928), com precipitações irregulares variando entre 300 a 700 mm, sendo a média há mais de 30 anos inferior a 500mm, e temperatura média anual de 25,6 C. Os rios são temporários, com exceção do Rio São Francisco, e o solo dos tipos: neossolo litólico e planossolo (LEITE e WANDERLEY, 1976; SANTOS e ANDRADE, 1992; OLIVEIRA, 2012). Figura 3 Localização das áreas de proteção escolhidas cara coleta dos indivíduos de Eg. cordata nos municípios de Sergipe, Brasil durante o período seco e chuvoso. Fonte: Vieira, Oliveira, et al., Já o Refúgio de Vida Silvestre Mata do Junco com cerca de 894,76 hectares apresenta 14 nascentes de rios e é uma área de refúgio de espécies endêmicas e ameaçadas de extinção (SEMARH/SE, 2010; SANTOS, SOUZA e SOUZA, 2007). É caracterizado como remanescente florestal com três estratos arbóreos: sub-bosque, apresenta folhas largas; subdossel, composto por arvoretas, lianas e trepadeiras; e dossel, formado por árvores a cima de 15m de altura (DANTAS, RIBEIRO, et al., 2007). O 132

150 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. clima é Metatérmico Subúmido (KÖPPEN e GEIGER, 1928), com temperatura e precipitação média anual de 24,9 C e 1.372mm, respectivamente (SEMARH/SE, 2007). Extração e processamento dos compostos cuticulares. Os indivíduos coletados foram submetidos a um banho para extração dos compostos. Assim, para obtenção desse material foi adicionado no frasco de vidro contendo os machos 2ml do solvente apolar n- hexano 95% (Mallinckrodt Chemicals) durante 2 minutos. Após esse período os indivíduos foram retirados e o material obtido foi submetido a análise por meio de um sistema de Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectometria de Massas (CG-EM) SHIMADZU, modelo GCMS-QP2010ultra, equipado com uma coluna capilar de silicone (DB-5MS 30m) utilizando como gás carregador o gás hélio (1ml/min), e empregando o método de ionização eletrônica (EI) e de ionização química (CI), para determinação do espectro de pico molecular e demais informações das estruturas. Com base em testes realizados previamente, criou-se um protocolo de temperatura adequado para as análises com indivíduos da tribo Euglossini variando a temperatura de 150 C a 300 C com aumento de 5 C/min, a temperatura final se manteve constante por 15 minutos. Para uma identificação mais precisa da posição das duplas ligações em alcenos e alcadienos, o restante do extrato obtido com hexano para análise dos compostos dos machos foi reagido com dimetil-disulfido (DMDS) seguindo as instruções descritas por Carlson e colaboradores (1989) e Nunes (2012)(Figura 4). Figura 4 Reação de derivatização com dimetil-disulfido. Inserção dos radicais SCH3 na posição da insaturação. No exemplo, derivatização do alceno 7-tricoseno. FONTE: NUNES, Para cada espécie ficou adotado o seguinte procedimento: o extrato de três indivíduos após ser evaporado foi ressuspendido em 200μl de hexano, e adicionado uma solução de 50μl de iodo diluído em dimetil éter (5%) e 100μl de DMDS. Seguindo a 133

151 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. metodologia, selou-se o recipiente com nitrogênio, este foi mantido a 55 C durante 24 horas. Passado o período de 2 horas uma solução de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) foi acrescida à mistura e a fase orgânica consequentemente separada da fase inorgânica. A fase orgânica foi seca e ressuspendida em 20μl de hexano, dessa solução 2μl foram injetados no CG-EM. Devido à baixa concentração de compostos em algumas amostras, foi feito um pool a partir da ressuspensão das amostras de 3 indivíduos em 50µl de hexano, visando concentrar as amostras e assim identificar esses compostos que se apresentaram em pequenas quantidades nas mostras individuais. Identificação dos compostos. Os dados fornecidos pelo GCMS são cromatogramas formados por picos em diferentes tempos de retenção (TR) de cada composto químico na coluna. Estes cromatogramas foram analisados com auxílio do programa GCMS solutions for Windows (Shimadzu Corporation) para caracterização do espectro de massa. Comprimentos de cadeias equivalentes puderam ser determinados utilizando-se n-alcanos padrões (Sigma Chemical Co.), e a quantificação baseou-se nas áreas de pico obtidas pelos cromatogramas (SINGER e ESPELIE, 1992). Além do uso de padrões, para identificação foram utilizadas as bibliotecas NIST 8.0 e FFNSC 1.3 (Flavors and Fragrances of Natural and Synthetic Compounds) como referência, outros componentes necessitaram da identificação através do cálculo do índice de Kovats. As análises de identificação e detecção das substâncias presentes na cutícula aconteceram no Laboratório de Comportamento e Ecologia de Insetos Sociais da FFCLRP/USP. Análises estatísticas. Inicialmente foi feita uma análise geral dos compostos encontrados e posteriormente estes foram tabelados de acordo com o bioma dos indivíduos verificando possíveis diferenças. As análises ocorreram usando todos os compostos e separando estes em subgrupos um utilizando apenas os hidrocarbonetos e outro com os demais compostos que foram encontrados. A similaridade intraespecífica foi avaliada pelo uso do método de escalonamento multidimensional não métrico (MDS) e com análises de similaridade (ANOSIM) one-way. A ANOSIM foi utilizada para testar diferenças entre os grupos com valores médios classificados de acordo com as medidas de dissimilaridade para dados multivariados de 134

152 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Bray-Curtis (1975); nesta, os valores de R variam entre -1 e 1, quanto mais próximo de R=0 tende à similaridade, mais próximo de R=1 à dissimilaridade (VALENTIN, 1995). Nesse tipo de análise valores negativos são raros, quando ocorrem são resultados de uma alta dissimilaridade dentro de cada grupo do que entre eles (POKORNY, LUNAU, et al., 2014). Para verificar a contribuição de cada composto para a diferenciação do perfil nos diferentes biomas foi calculado o percentual de similaridade de Bray-Curtis (SIMPER) usando one-way. A análise de SIMPER (Similarity Percentage Breakdown) utilizou os valores de densidade logaritmizados [log (x+1)] e procurou determinar a contribuição individual de cada composto para as dissimilaridades encontradas. O método de centroide, que tem proposto tratar da distância entre os grupos utilizados e a distância entre o centroide (SOKAL e MICHENER, 1958), foi empregado para verificar as distâncias entre os gêneros coletados. Todas as análises foram realizadas com o uso do software Primer v6 (CLARKE, 1993; CLARKE e GORLEY, 2006), e foram testadas com o uso de todos os compostos obtidos (all), apenas hidrocarbonetos (CHCs) e apenas com compostos alifáticos (aa). Uma análise de PCA foi realizada com auxílio do programa Past, para demonstrar os principais compostos que poderiam influenciar na diferenciação dos indivíduos entre os biomas. 135

153 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Resultados O perfil cuticular de Eg. cordata apresentou 52 compostos (Tabela 1), formados principalmente por hidrocarbonetos (65,38% do total), bem como foram encontrados acetatos (15,38%), ésteres (9,62%), álcoois e outros (9,62%). Um composto não pode ser identificado devido à sua baixa concentração nas amostras mesmo após a análise do pool, isso também aconteceu para dois acetatos e um metilado do carbono 23 que não teve sua posição identificada. Dentre os hidrocarbonetos identificados foram classificados como alcanos, alcenos, alcadienos e monometilalcanos. Do total de elementos identificados, 40 foram encontrados em ambos os biomas, todos os compostos considerados nas análises apresentaram porcentagem de área maior que 0,01. As análises de DMDS permitiram identificar a posição das duplas ligações nos alcenos, e por meio desta foi verificada a presença de apenas um alcadieno de baixa concentração, o que permitiu apenas reconhecer a sua presença, mas não foi possível a identificação da posição das ligações. Em todos os testes de permutação da análise de similaridade (ANOSIM) realizados, não existiu uma distinção entre os indivíduos de acordo com os diferentes biomas (all: R<0,14, p<0,05; CHCs: R<0,15, p<0,05), exceto para os compostos alifáticos (aa: R<0,05, p<0,66). O mesmo aconteceu quando ao considerar a hipótese de diferenças significativas entre as estações seca e chuvosa, não havendo diferença significativa (all: R<0,26, p<0,05; CHCs: R<0,26, p<0,03), exceto para os compostos alifáticos (aa: R<0,1, p<1,02). 136

154 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Tabela 1 Composição cuticular percentual (média ± desvio padrão) de machos de Euglossa cordata coletados nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Pico TR Composto Caatinga Mata Atlântica Octadecano - 0,02 ± 0, Icosano - 0,03 ± 0, Henicosano 0,03 ± 0,04 0,06 ± 0, Ester etílico de ácido graxo 0,08 ± ,15 ± 0, Ester metílico de ácido graxo 0,16 ± 0,19 0,05 ± 0, Docosano 0,03 ± 0,04 0,04 ± 0, Octadecanol acetato 0,51 ± 0,65 0,51 ± 0, Hexadecanal 0,05 ± 0,07 0,04 ± 0, Eicosenol - 0,03 ± 0, (Z)-9-tricoseno - 0,01 ± 0, Z-Me-tricosano 0,29 ± 0,05 0,02 ± 0, Tricosano 2,61 ± 0,80 2,89 ± 0, Eicosenol acetato 7,25 ± 4,88 8,18 ± 3, Tetracosano 0,31 ± 0,10 0,30 ± 0, Eicosil acetato 0,35 ± 0,23 0,29 ± 0, Me-tricosano - 0,02 ± 0, (Z)-9-pentacoseno 0,11 ± 0,08 0,12 ± 0, (Z)-7-pentacoseno - 0,00 ± 0, Pentacosano 9,88 ± 3,51 9,88 ± 1, Acetato 0,05 ± 0, (Z)-3-hexacoseno 0,03 ± 0,08 0,01 ± 0, (Z)-hexacoseno 0,13 ± 0, Octanoato de hexadecil / Ácido octadecanóico, Hexadecil ester 0,25 ± 0,13 0,21 ± 0, (Z)-9-hexacoseno 0,10 ± 0,11 0,04 ± 0, Hexacosano 0,14 ± 0,12 0,10 ± 0, Acetato 1,41 ± 0,94 1,46 ± 0, Não identificado 0,02 ± 0,05 0,02 ± 0, (Z)-7,9-heptacoseno 12,99 ± 5,58 15,91 ± 5, (Z)-5-heptacoseno 1,18 ± 1,24 0,49 ± 0, Heptacosano 2,78 ± 2,15 1,59 ± 0, (Z,Z)-Octacosadieno 0,84 ± 0,34 0,89 ± 0, Octacosano 25,98 ± 14,26 20,93 ± 8, Tetracosil acetato 0,08 ± 0,05 0,15 ± 0, Eicoseniol acetato 0,36 ± 0,23 0,20 ± 0, Octadienol acetato 0,02 ± 0, (Z)-7,9-nonacoseno 25,24 ± 9,39 30,20 ± 8, (Z)-5,9-nonacoseno 0,40 ± 0,39 0,32 ± 0, Nonacosano 3,30 ± 2,13 2,39 ± 0, (Z)-9-triaconteno 0,13 ± 0,15 0,12 ± 0, Triacontano 0,09 ± 0,13 0,02 ± 0, (Z)-9-hentriaconteno 1,14 ± 0,52 1,59 ± 0, (Z)-7-hentriaconteno 0,02 ± 0,05 0,01 ± 0, Hentriacontano 1,44 ± 1,67 0,54 ± 0, Álcool 0,02 ± 0, Ácido oleico, eicosil ester, (Z)-9-octadecenoato 0,01 ± 0,05 0,04 ± 0, Dotriacontano - 0,05 ± 0, (Z)-9-tritriaconteno - 0,05 ± 0, Tritriacontano 0,19 ± 0,30 0,02 ± 0,06 *TR: TEMPO DE RETENÇÃO (MIN) 137

155 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. As análises de MDS foram realizadas com base no índice de Bray-Curtis utilizando todos os compostos (stress = 0,11), apenas os hidrocarbonetos cuticulares (stress = 0,11) e ainda os demais compostos alifáticos (stress = 0,09). Apesar da pequena distinção visual, onde alguns indivíduos encontram-se mais afastados, a ordenação não apontou uma tendência à formação de dois grupos distintos por meio da composição cuticular dos machos de Eg. cordata entre os biomas Caatinga e Mata Atlântica em nenhum dos testes realizados (Figura 5). A análise de SIMPER determinou os compostos que mais contribuíram para a similaridade nos biomas e a dissimilaridade dentre estes, assim a contribuição média de dissimilaridade foi de apenas 20,07% ao analisar todos os compostos presentes na cutícula, já a similaridade para Caatinga (78,46%) foi menor que entre os indivíduos da Mata Atlântica (83,69%), embora ambas tenham sido elevadas corroborando para o fato que indivíduos da mesma espécie tendem a apresentar o mesmo perfil. Figura 5 Projeção em espaço bidimensional do escalonamento multidimensional (MDS) dos dados de hidrocarbonetos cuticulares de Eg. cordata, utilizando: A - Todos os compostos, B - Apenas os hidrocarbonetos cuticulares, C Compostos alifáticos. CA Caatinga e MA Mata Atlântica. 138

156 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Por meio da PCA foram identificados quais foram os compostos que mais contribuíram para essa dissimilaridade encontrada entre os biomas, são eles: Octacosano (taxa de contribuição 11, 12%), Eicosenol acetato (7,66%), (Z)-7,9- nonacoseno (7,33%) e (Z)-7,9-heptacoseno(5,82%); embora tenham colaborado para a dissimilaridade é possível verificar através das elipses do gráfico que a composição cuticular nos dois biomas se sobrepõe (Figura 6). A similaridade dos perfis entre os biomas é melhor representada ao analisar a distância entre centroides considerando cada bioma e os compostos cuticulares assim separados por análises: todos os compostos, hidrocarbonetos cuticulares e demais compostos encontrados. A partir desse conjunto de análises foi possível verificar que a diferença encontrada entre os indivíduos de Eg. cordata está no fato dos compostos alifáticos variarem entre biomas (Tabela 2). O que fica evidente ao observar o perfil cuticular dos indivíduos analisados é que diferentes composições não foram encontradas entre biomas ou entre período sazonal em cada um destes, mas na quantidade de cada composto presente na cutícula (Figura 7) (Z,Z)-7,9-heptacoseno Component 2 6 Eicosenol_acetato Acetato Octadecanol_acetato Eicosyl_acetato Icosano Henicosano_ Ester_etílico_de_ácido_graxo Ester_metílico_de_ácido_graxo Docosano Hexadecanal Eicosenol (Z)-9-tricoseno 3Me-tricosano (Z)-9-pentacoseno (Z)-7-pentacoseno (Z)-3-hexacoseno?-Me-tricosano Tricosano Hexadecyl_octanoate_/_Octanoic_acid,_hexadecyl_ester (Z)-9-hexacoseno Tetracosyl_acetate Eicoseniol_acetate Octadienol_acetato (Z,Z)-5,9-nonacoseno (Z)-9-triaconteno (Z)-7-hentriaconteno Alcool Oleic_acid,_eycosyl_ester,_9-octadecenoate Não_identificado (Z)-9-tritriaconteno Tetracosano (Z)-n-hexacoseno Hexacosano (Z)-5-heptacoseno Triacontano Tritriacontano (Z,Z)-Octacosadieno (Z)-9-hentriaconteno Hentriacontano Heptacosano Nonacosano Pentacosano Octacosano-6-12 (Z,Z)-7,9-nonacoseno Component 1 Figura 6 Representação dos scores dos dois primeiros componentes (PCA-1 e PCA-2) para os indivíduos de Eg. cordata coletados nos bioma Mata Atlântica (representado na cor preta) e Catinga (representado na cor verde). 139

157 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Tabela 2 Distância de centróides (média das variáveis) entre os machos de Euglossa cordata coletados em áreas de Caatinga e Mata Atlântica, Sergipe, Brasil. S: Período seco; C: Período chuvoso. Caatinga S Caatinga C Mata Atlântica S Mata Atlântica C Caatinga S Caatinga C 9,77 Mata Atlântica C 14,53 12,03 Mata Atlântica S 8,26 7,62 10,41 Figura 7 Cromatogramas dos extratos cuticulares de Eg. cordata representando parte do tempo de retenção dos compostos. A - Caatinga; B Mata Atlântica. Compostos numerados: 1: tricosano; 2: Eicosenol acetato; 3: tetracosano; 4: Eicosyl acetato; 5: pentacosano; 6: acetato; 7: (Z)-3-hexacoseno; 8: (Z)-hexacoseno; 9: acetato; 10: (Z)-7,9- heptacoseno; 11: (Z)-5-heptacoseno; 12: Heptacosano; 13: (Z,Z)-Octacosadieno; 14: Octacosano; 15: Eicoseniol acetato; 16: (Z,Z)-7,9-nonacoseno; 17: (Z,Z)-5,9-nonacoseno; 18: Nonacosano; 19: (Z)-9-hentriaconteno; 20: (Z)-7-hentriaconteno. 140

158 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Discussão Os hidrocarbonetos cuticulares de muitos de insetos solitários e sociais são específicos para cada espécie o que permite reconhecer uns aos outros ao entrar em contato com a cutícula (SINGER, 1998). Mesmo em diferentes biomas e, consequentemente, sob condições adversas, o perfil cuticular dos machos de Euglossa cordata manteve-se similar entre a Caatinga e a Mata Atlântica, exibindo pequenas variações quantitativas entre os compostos; por meio das análises de MDS foi possível verificar que as análises com todos os compostos ou ainda estes agrupados como apenas hidrocarbonetos ou compostos alifáticos não permitiram a diferenciação em dois grupos dos indivíduos analisados. Fato que vem a ser corroborado por Martin e colaboradores (2009) ao realizar estudo com indivíduos do gênero Formica, neste o ambiente não afetou o perfil de hidrocarbonetos dos indivíduos da espécie Formica lemani Bondroit proveniente de três ambientes com características bem diversificadas com os CHCs se mantendo estáveis, ou ainda verificando diferentes espécies (F. uralensis Ruzsk, F. candida Smith, e F. exsecta Nylander) provenientes de uma mesma área que mantiveram seus perfis distintos. Ao considerar a caracterização dos extratos cuticulares entre o período seco e chuvoso entre os biomas foram encontrados dados semelhantes por Pokorny e colaboradores (2014) ao examinarem Eg. dilemma Bembé & Eltz e Eg. viridissima Friese, onde a pequena variação sazonal não teve influência sobre a especificidade geral do perfil cuticular, a diferenciação observada esteve relacionada principalmente nas proporções relativas dos componentes ao invés de compostos exclusivos. Essa ligeira diferenciação entre os períodos seco e chuvoso pode estar relacionada à variação da disponibilidade de alimentos (pólen e/ou néctar) presentes no ambiente durante os períodos secos e chuvosos, estudos analisando modificações na dieta de formigas (LIANG e SILVERMAN, 2000; BUCZKOWSKI, KUMAR, et al., 2005), mariposas (PIRKOSKI, TREMATERRA e DORN, 2010), percevejos (GEMENO, LASERNA, et al., 2012) e cupins (LIEBIG, ELIYAHU e BRENT, 2009) apontam que o perfil cuticular sofre modificações correspondentes. Já aumento na proporção de alguns compostos cuticulares, em particular os CHCs, foi relatado em análises com adultos (NOORMAN e DEN OTTER, 2002) e ovos de mosca (URBANSKI, BENOIT, et al., 2010), onde este tem relação com a resistência à dessecação. 141

159 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Espécies que são encontradas em ambientes mais quentes e secos têm a tendência de apresentar maior quantidade de cera sob o corpo quando comparado às outras em ambientes mais amenos (HADLEY, 1984; SINGER, 1998). O baixo nível de significância apresentado pelos compostos alifáticos na ANOSIM mostra que estes não são suficientes para influenciar na distinção de dois grupos de indivíduos de acordo com o período ou o bioma. Eicosenol acetato, segundo composto que mais influenciou na diferenciação dos indivíduos e que está dento deste grupo, não teria origem relacionada ao ambiente, mas como apontado por Eltz e colaboradores (2007) é produto resultante das glândulas cefálicas labiais. O primeiro composto apontado pela análise de SIMPER e pela PCA como de maior influência na dissimilaridade entre os biomas foi o octacosano, apesar de ser encontrados nas abelhas dos dois biomas, essa diferença foi dada pela alta concentração desse composto nas abelhas da Caatinga, principalmente durante o período mais seco. Em geral o alto nível de n-alcanos está associado aos ambientes áridos e de temperaturas mais altas (HADLEY e SCHULTZ, 1987; KATHER, DRIJFHOUT e MARTIN, 2011), isso porque formam a melhor classe dos hidrocarbonetos para impermeabilização devido ao ponto de fusão e forma (GIBBS e POMONIS, 1995; GIBBS, 1998; KATHER, DRIJFHOUT e MARTIN, 2011); assim, esses compostos estão presentes mais para o controle da perda de água do que para comunicação entre os indivíduos (DANI, JONES, et al., 2005; BREED, STILLER e MOOR, 1988). Já a presença de alcenos e grupos de metilados é mais frequentemente associada ao reconhecimento entre os indivíduos das espécies (HOWARD e BLOMQUIST, 2005), entre os CHCs identificados no estudo os alcenos foram aqueles de maior porcentagem nos indivíduos. Em abelhas sociais foram descritos 14 hidrocarbonetos que talvez permitam o reconhecimento de parentesco (C23, C23:1, n-c25, n-c27, C27:1, MeC27, n-c29, C29:1, MeC29, n-c31, C31:1, MeC31, C33:1, C33:2) (Arnold G., et al., 1996). Hexadecano, octadecano, (Z)-9-heneicoseno e (Z)-9-tricoseno também foram testados em abelhas quanto ao reconhecimento produzindo resultados positivos (BREED, WILLIAMS e FEWELL, 1988; BREED e STILLER, 1992). Esses compostos também foram encontrados na cutícula dos machos de Eg. cordata. A composição da cutícula de algumas abelhas já foi verificada, sendo a proporção de hidrocarbonetos maior quando comparada aos demais compostos, como em Bombus appositus Cresson com 78% (HADLEY, BLOMQUIST e LANHAM, 142

160 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. 1981), ou ainda em Apis mellifera Linnaeus com 58%, nestas assim como obtido no estudo a quantidade de alcanos e alcenos foi aproximadamente semelhante, embora para essa espécie os maiores alcenos foram com dupla na posição 8 e 7 (BLOMQUIST e JACKSON, 1979; BLOMQUIST, CHU e REMALEY, 1980; HADLEY, BLOMQUIST e LANHAM, 1981), para Eg. cordata assim como em B. appositus e B. occidentalis Greene (HADLEY, BLOMQUIST e LANHAM, 1981) as duplas foram encontradas mais comumente nas posições 7 e 9. De acordo com Kather e Martin (2012) mostra que os CHCs se ajustam aos critérios necessários para serem adotados como marcadores taxonômicos, pois são produtos metabólicos estáveis, estáveis, comuns entre indivíduos de mesma espécie e de fácil identificação para espécies crípticas. Considerações finais A partir de nossas análises estatísticas do perfil de hidrocarbonetos cuticulares dos machos de Eg. cordata coletados em áreas e proteção com formação dos biomas Caatinga e Mata Atlântica do estado de Sergipe é possível inferir que o perfil cuticular não sofre alterações significativas nos indivíduos expostos à diferentes ambientes e condições climáticas, estes fatores podem afetar quantitativamente a composição da cutícula, mas não qualitativamente, sendo assim a taxonomia química, por meio do uso da composição e variação dos perfis cuticulares dos indivíduos, se destaca como uma importante ferramenta auxiliar aos métodos tradicionais de identificação. Referências Bibliográficas ARNOLD, G.; QUENET, B.; CORNUET, J. M.; MASSON, C.; SCHEPPER, B.; ESTOUP, A.; GASQUI, P. Kin recognition in honeybees. Nature, v. 379, p. 498, BARTELT, R. J.; ARMOLD, M. T.; SCHANER, A. M.; JACKSON, L. L. Comparative analysis of cuticular hydrocarbons in the Drosophila virilis species group. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 83B, p ,

161 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. BEMBÉ, B. Revision der Euglossa cordata - Gruppe und Untersuchungen zur Funktionsmorphologie und Faunistik der Euglossini (Hymenoptera, Apidae). Dissertation an der Ludwig-Maximilians: Universität München, p. BLOMQUIST, G. J.; CHU, A. J.; REMALEY, S. Biosynthesis of Wax in the Honey Bee Apis mellifera L. Insect Biochemistry, v. 10, p , BLOMQUIST, G. J.; NELSON, D. R.; RENOBALES, M. Chemistry, biochemistry and physiology of insect cuticular lipids. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, v. 6, p , BLOMQUIST, G. L.; JACKSON, L. L. Chemistry and biochemistry of insect waxes. Progress in Lipid Research, v. 17, p , BRAY, J. R.; CURTIS, J. T. An ordination of the upland forest communities of Southern Wisconsin. Ecological Monographs, v. 27, p , BREED, M. D.; STILLER, T. M. Honeybee, Apis mellifera, nestmate discrimination: hydrocarbon effects and the evolutionary implications of comb choice. Animal Behaviour, v. 43, p , BREED, M. D.; STILLER, T. M.; MOOR, M. J. The ontogeny of kin discrimination cues in the hoeny bee, Apis mellifera. Behavior Genetics, v. 18, p , BREED, M. D.; WILLIAMS, K. R.; FEWELL, J. H. Comb wax mediates the acquisition of nest-mate recognition cues in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 85, n. 22, p , BROZA, M.; BLONDHEIM, S.; NEVO, E. New species of mole crickets of the Gryllotalpa gryllotalpa group (Orthoptera: Gryllotalpidae) from Israel, based on morphology, song recordings, chromosomes and cuticular hydrocarbons, with comments on the distribution of the group in Europe and Mediterranean region. Syst. Entomol., v. 23, p , BUCKNER, J. S. Polar cuticular lipids. In: STANLEY-SAMEULSON, D. W.; NELSON, D. R. Insect Lipids: Chemistry, Biochemistry and Biology. Lincoln, NE: University of Nebraska Press, p

162 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. BUCZKOWSKI, G.; KUMAR, R.; SUIB, S. L.; SILVERMAN, J. Diet-related modification of cuticular hydrocarbon profiles of the argentine ant, Linepithema humile, dimishes intercolony agression. Journal of Chemical Ecology, v. 31, n. 4, p , CARLSON, D A; ROAN, C; YOST, R A; HECTOR, J. Dimethyl disulfite derivatives of long chain alkenes, alkadienes, and alkatrienes for gas chromatography/masss spectomatry. Anal. Chem., v. 61, p , CHAPMAN, R. F.; ESPELIE, K. E.; SWORD, G. A. Use of cuticular lipids in grasshopper taxonomy: a study of variation in Schistocerca shoshone (Thomas). Biochemical Systematics and Ecology, v. 23, p , CLARKE, K. R. Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. Australian Journal of Ecology, v. 18, p , CLARKE, K. R.; GORLEY, R. N. Primer v6: user manual/tutorial. Plymouth: PRIMER-E, CRUZ-LANDIM, C. Abelhas - Morfologia e Função de Sistemas. São Paulo: UNESP, p. DANI, F. R.; JONES, G. R.; CORSI, S.; BEARD, R.; PRADELLA, D.; TURILLAZZI, S. Nestmate recognition cues in the honey bee: Differential importance of cuticular alkanes and alkenes. Chemical Senses, v. 30, p , DANTAS, T. V. P.; RIBEIRO, A. S.; NASCIMENTO-JÚNIOR, J. E.; MACHADO, A.; CRISTINA, K.; SANTOS, C. S. Caracterização florística. In: SEMARH/SE. Estudo técnico para a criação do Refúgio de Vida Silvestre da Mata do Junco, Capela, Sergipe. São Cristóvão: UFS, p DAPPORTO, L. Cuticular lipd diversification in Lasiommata megera and Lasiommata paramegaera: the influence of species, sex and populayion (Lepidoptera: Nymphalidae). Biological Journal of the Linnean Society, v. 91, p , DAWKINS, R. The extended phenotype: the gene as the unit of selection. Oxford: Oxford University Press, ELTZ, T.; ZIMMERMANN, Y.; HAFTMANN, J.; TWELE, R.; FRANCKE, W.; QUEZADA-EUAN, J. J. G.; LUNAU, K. Enfleurage, lipid recycling and the origin of perfume collection in orchid bees. Biological Sciences, v. 274, n. 1627, p ,

163 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. ESPELIE, K. E.; HERMANN, H. R. Surface lipids of the social wasp Polistes annularis (l.) and its nest and nest pedicel. Journal of Chemical Ecology, v. 16, p , GEMENO, C.; LASERNA, N.; RIBA, M.; VALLS, J.; CASTAÑÉ, C.; ALOMAR, O. Cuticular hydrocarbons discriminate cryptic Macrolophus species (Hemiptera: Miridae). Bulletin of Entomological Research, v. 102, p , GENIN, E.; JULLIEN, R.; PEREZ, F.; FUZEAU-BRAESCH, S. Cuticular Hydrocarbons of Gregarious and Solitary Loctus Locusta migratoria cinerascens. Journal of Chemical Ecology, v. 12, n. 6, p , GIBBS, A. G. Water-proofing properties of cuticular lipids. American Zoologist, v. 38, p , GIBBS, A.; POMONIS, J. G. Physical properties of insect cuticular hydrocarbons: The effects of chain length, methyl-branching and unsaturation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, v. 112, p , HADLEY, N. F. Cuticle: Ecological significance. In: BEREITER-HAHN, J.; MATOLTSY, A. G.; RICHARDS, K. S. Biology of the integument. Berlin: Spring-Verlag, v. 1, p HADLEY, N. F. The arthropod cuticule. Scientific American, v. 255, n. 1, p , HADLEY, N. F.; BLOMQUIST, G. F.; LANHAM, U. N. Cuticular hydrocarbons of four species of Colorado Hymenoptera. Insect Biochemistry, v. 11, p , HADLEY, N. F.; SCHULTZ, T. D. Water-loss in 3 species of tiger beetles (Cicindela)- Correlations with epicuticular hydrocarbons. Journal of Insect Physiology, v. 33, p , HAY-ROE, M. M.; LAMAS, G.; NATION, J. L. Pre and postzygotic isolation and Haldane rule effects in reciprocal crosses of Danaus erippus and Danaus plexippus (Lepidoptera: Danaine), supported by differentiation of cuticular hydrocarbons, establish their status as separate species. Biological Journal of the Linnean Society, v. 91, p , HEFETZ, A.; TENGÖ, J.; LÜBKE, G.; FRANCKE, W. Inter-colonial and intra-colonial variation in Dufour's gland secretion in the bumble bee species Bombus hypnorum (Hymenoptera: Apidae). In: WIESE, K.; GRIBAKIN, F. G.; RENNINGER, G. Advances in life 146

164 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. sciences. Sensory system of Arthropods. Basel: Birkhause Verlag, v. 11, p HOWARD, R. W.; BLOMQUIST, G. J. Ecological, behavioral, and biochemical aspects of insect hydrocarbons. Annual Review of Entomology, v. 50, p , KAIB, M.; BRANDL, R.; BAGINE, R. K. N. Cuticular hydrocarbon profiles: A valuable tool in termite taxonomy. Naturwissenschaften, v. 95, p , KATHER, R.; DRIJFHOUT, F.; MARTIN, S. Task Group Differences in Cuticular Lipids in the Honey Bee Apis mellifera. Journal of Chemical Ecology, v. 37, p , KATHER, R.; MARTIN, S. Cuticular hydrocarbon profiles as a taxonomic tool: advantages, limitations and technical aspects. Physiol. Entomol., v. 37, p , KESSELER, A. Plant-insect interactions in the era of consolidation in biological sciences. Nicotiana attenuata as an ecological expression system. In: DICKE, M.; TAKKEN, W. Chemical ecology: from gene to ecosystem. Dordrecht: Springer, p KÖPPEN, W.; GEIGER, R. Klimate der Erde. Gotha: Verlag Justus Perthes. Wall-map 150cmx200cm: [s.n.], LEITE, I. R.; WANDERLEY, L. Zoneamento ecológico-florestal do estado de Sergipe. Aracaju: Sudene/Condese, p. LIANG, D.; SILVERMAN, J. "You are what you eat": diets midifies cuticular hydrocarbons and nestmates recognition in the Argentine ant, Linepithema humile. Naturwissenschaften, v. 87, p , LIEBIG, J.; ELIYAHU, D.; BRENT, C. S. Cuticular hydrocarbons profiless indicate reproductive status in the termite Zootermopsis nevadensis. Behavioral Ecology and Sociobiology, v. 63, p , LIU, Z. B.; BAGNÈRES, A. G.; YAMANE, S.; WANG, Q. C.; KOJIMA, J. Intra-colony, intercolony and seasonal of cuticular hydrocarbon profiles in Formica japonica (Hymenoptera: Formicidae). Insectes Sociaux, v. 48, p , LOCKEY, K. H. Lipids of the insect cuticle: origin, composition and function. Comparable Biochemistry and Physiology, v. 89B, p ,

165 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. LOCKEY, K. H. Insect hydrocarbon classes: Implications for chemotaxonomy. Insect Biochemistry, v. 21, n. 1, p , Disponivel em: < LOCKEY, K. H.; METCALFE, N. B. Cuticular hydrocarbons of adult Himatismus species and a comparasion with 21 other species of adult tenebrionid beetle using multivariate analysis. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 91B, p , LUCAS, C.; FRESNEAU, D.; KOLMER, K.; HEINZE, J.; DELABIE, J. H.; PHO, D. B. A multidisciplinary approach to discrimination different taxa in the species complex Pachycondyla villosa (Formicidae). Biological Journal of the Linnean Society, v. 75, p , MARTIN, S. J.; HEIKKI, H.; FALKO, P. D. Evolution of species-specific cuticular hydrocarbons patterns in Formica ant. Biological Journal of the Linnean Society, v. 95, n. 1, p , MARTIN, S. J.; SHEMILT, S.; DRIJFHOUT, F. P. Effect of time on colony odour stability in the ant Formica exsecta. Naturwissenschaften, v. 99, p , MARTIN, S. J.; WEIHAO, Z.; DRIJFHOUT, F. P. Long-term stability of cuticular hydrocarbons facilitates chemotaxonomy using museum specimens. Biological Journal of the Linnean Society, v. 96, p , MULLEN, S. P.; MENDELSON, T. C.; SCHAL, C.; SHAW, K. L. Rapid evolution of cuticular hydrocarbons in a species radiation of acoustically diverse Hawaiian crickets (Gryllidae: Trigonidiinae: Laupala). Evolution, v. 61, p , NELSON, D. R.; BLOMQUIST, G. J. Insect waxes. In: HAMILTON, R. J. Waxes: Chemistry, Molecular Biology and Functions. Dundee, Scotland: Oily Press, p NOORMAN, N.; DEN OTTER, C. J. Effects of relative humidity, temperature, and population density on production of cuticular hydrocarbons in housefly Musca domestica L. Journal of Chemical Ecology, v. 28, p , NUNES, M. T. Sobre a ecologia química de Friesella schrottkyi Friese 1900 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) com ênfase na regulação social. Tese de Doutorado: Universidade de São Paulo,

166 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. OLIVEIRA, A. C. F. Formigas epigéicas em resposta a um gradiente sucessional em fragmentos de caatinga no alto sertão sergipano. Dissertação de Mestrado: Universidade Federal de Sergipe, PAGE, M.; NELSON, L. J.; BOLMQUIST, G. J.; SEYBOLD, S. J. Cuticular hydrocarbons as chemotaxonomic characters of pine engraver beetles (Ips sp.) in the grandicolis subgeneric group. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 23, p , PIRKOSKI, R.; TREMATERRA, T.; DORN, S. Cuticular hydrocarbons profiles of codling moth larvae, Cydia pomonella (Lepdoptera: Tortricidae), reflect those of their host plant species. Biological Journal of the Linnean Society, v. 101, n. 2, p , POKORNY, T.; LUNAU, K.; QUEZADA-EUAN, J. J. G.; ELTZ, T. Cuticular hydrocarbons distinguish cryptic sibling species in Euglossa orchid bees. Apidologie, v. 45, p , REBÊLO, J. M. M. História Natural das Euglossíneas. As abelhas das orquídeas. [S.l.]: Lithograf, SANTOS, A. F.; ANDRADE, J. A. Caracterização e delimitação do semiárido sergipano. Aracaju: CNPq/UFS, SANTOS, M. J. S.; SOUZA, H. T. R.; SOUZA, R. M. Biomonitoramento de indicadores ambientais abióticos Mata do Junco (Capela-SE). Scientia plena, v. 3(5), p , SEMARH/SE. Estudo para a criação do Refúgio de Vida Silvestre Mata do Junco. Aracaju: [s.n.], p. SEMARH/SE. Unidades de Conservação, Disponivel em: < Acesso em: 24 setembro SEPPÄ, P.; HELANTERÄ, H.; TRONTTI, K.; PUNTTILA, P.; CHERNENKO, A.; MARTIN, S. J.; SUNDSTRÖM, L. The many ways to delimit species: hairs, genes and surface chemistry. Myrmecological News, v. 15, p , SERGIPE. Decreto N , de 21 de Dezembro de Cria o Monumento Natural Grota do Angico, nos municípios de Poço Redondo e Canindé de São Francisco, Estado de 149

167 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. Sergipe, e dá outras providências. Aracaju, 186 da Independência e 119 da República,2007: Secretaria de Estado do Meio Ambiente, Governo de Sergipe, SINGER, T. L. Roles of hydrocarbons in the recognition systems of insects. American Zoologist, v. 38, p , SINGER, T. L.; ESPELIE, K. E. Discriminant analysis of cuticular hydrocarbons of social wasp Polistes exclamans and nest surface hydrocarbons of its nest paper and pedicel. J. Chem. Ecol., v. 18, p , SOKAL, R. R.; MICHENER, C. D. A statistical method for evaluating systematic relationships. University of Kansas science bulletin, v. 38, p , URBANSKI, J. M.; BENOIT, J. B.; MICHAUD, M. R.; DENLINGER, D. L.; ARMBRUSTER, P. The molecular basis of increased desiccation resistance during diapause in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, v. 277, p , URECH, R.; BROWN, G. W.; MOORE, C. J.; GREEN, P. E. Cuticular hydrocarbons of buffalo fly, Haematobia exigua; and chemeotaxonimic differentiation form horn fly, H irritans. Journal of Chemical Ecology, v. 31, p , VALENTIN, J. L. Agrupamento e Ordenação. In: PERES-NETO, P. R.; VALENTIN, J. L.; FERNANDEZ, F. A. S. Oecologia Brasiliensis, Vol. III: Tópicos de Dados Biológicos. Programa de Pós-Graduação em Ecologia: Instituto de Biologia - UFRJ, VAN ZWEDEN, J. S.; D'ETTORRE, P. Nestmate recognition in social insects and the role of hydrocarbons. In: BLOMQUIST, G. J.; BAGNÈRES, A.-G. Insect Hydrocarbons: Biology, Biochemistry and chemical Ecology. Cambridge: Cambridge University Press, p VANDER MEER, R. K.; SALIWANCHIK, D.; LAVINE, B. Temporal changes in colony hydrocarbon patterns of Solenopsis invicta: Implications for nestmate recognition. Journal of Chemical Ecology, v. 15, p , VIEIRA, T. R. S. ; OLIVEIRA, D. G.; GUIMARÃES-PESSOA, F. M.; GOMES, L. J. Análise dos Processos de Averbação das Reservas Legais no Estado de Sergipe. Floresta e Ambiente, v. 20, n. 2, p ,

168 Capítulo 4 Perfil cuticular de Euglossa cordata L. (Hymenoptera: Apidae: Euglossini) e sua variação nos biomas Caatinga e Mata Atlântica. WYATT, T. D. Pheromones and animal behaviour: communication by smell and taste. Cambridge: Cambridge University Press,

169 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Vapítulo 5

170 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. ANÁLISE POPULACIONAL DE DUAS ESPÉCIES DE EUGLOSSINI POR MEIO DO DNA MITOCONDRIAL E MORFOMETRIA GEOMÉTRICA DE ASAS. Nesse capítulo foram feitas análises interpopulacionais e intrapopulacionais sobre os indivíduos de Eg. cordata e El. nigrita, espécies da tribo muito comuns em áreas do estado de Sergipe, e que são citadas como indicadores ambientais de diversos impactos ambientais. As análises foram baseadas na análise de sequenciamento utilizando os marcadores mitocondriais mtd09 e Barbee e no uso da morfometria geométrica das asas anteriores direitas das abelhas. Por meio da morfometria geométrica, que pode sofrer influência das condições ambientais em que se encontra, foi possível verificar que para a espécie Eg. cordata as populações foram classificadas corretamente com uma porcentagem a cima de 94%, já para El. nigrita os valores foram a cima de 86%. Os marcadores do mtdna mostraram que existe diferença significante entre as áreas em estudo para as espécies analisadas onde as populações encontram-se estruturadas em cada bioma, mas heterogêneas entre estes. Os resultados obtidos podem ser explicados pelas condições que se encontram as áreas em que os indivíduos foram coletados como também se deve a eventos antigos em consequência das mudanças climáticas ocorridas. 153

171 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Introdução Diversos estudos têm mostrado em consenso o declínio das populações e de maneira geral a saúde das abelhas por todo mundo, isso ocorre devido aos vários fatores conhecidos ou desconhecidos e que podem agir isoladamente ou em conjunto (WILLIAMS, TARPY, et al., 2010). Dentre os diversos fatores, a fragmentação do habitat natural tem sido apontada como uma das maiores causas da redução da biodiversidade local e global, e vem atuando de forma intensa em diversas populações (CHACOFF e AIZEN, 2006; KLEIN, STEFFAN-DEWENTER e TSCHARNTKE, 2006; MELO, MARTINS e GONÇALVES, 2006; TYLIANAKIS, KLEIN, et al., 2006; PAULA, 2009). A perda acelerada das espécies e ecossistemas é um problema visto no mundo inteiro, sendo agravada com a intensificação do desmatamento nos ecossistemas tropicais onde se concentra a maior parte da biodiversidade. No Brasil, esse impacto é sentido em todos os biomas, mas considerado ainda mais grave na Mata Atlântica por estar restrita à pequenos fragmentos, embora possa ser observada em áreas de Cerrado, no Pampa e na Caatinga (GANEM, 2011). Em vista a avançada degradação do ambiente, a perda da diversidade genética associada ao declínio do tamanho populacional pode ser agravada quando o fluxo gênico é limitado ou interrompido, levando à extinção potencial das populações locais (FRANKHAM, BALLOU e BRISCOE, 2010; PENHA, GAGLIANONE, et al., 2014). O conhecimento da estrutura genética de uma população é essencial para identificar as necessidades e permitir um trabalho de conservação das populações que estão sofrendo impactos antropogênicos (FRANKHAM, BALLOU e BRISCOE, 2010). Uma das ferramentas utilizadas no estudo de populações é o DNA mitocondrial (mtdna) que possui características únicas como herança uniparental e alta taxa de mutação (BROWN, GEORGE JR e WILSON, 1979; MORITZ, DOWLING e BROWN, 1987; FRANCISCO, 2002; OI, 2010) O genoma mitocondrial animal em geral é formado por uma molécula de DNA pequena e circular com uma estrutura simples (WILSON, CANN, et al., 1985). Desde a década de 1970 a análise do mtdna tem se estabelecido como uma poderosa ferramenta para estudos evolutivos em animais (MORITZ, DOWLING e BROWN, 1987). Em abelhas, o primeiro estudo do mtdna no Brasil ocorreu com a espécie Apis mellifera (ARIAS, SOARES e NOBREGA, 1990) sendo uma das principais 154

172 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. moléculas empregadas no entendimento da estrutura populacional, mecanismos de dispersão e determinação da capacidade de disseminação destas abelhas devido à barreiras geográficas (SHEPPARD, RINDERER, et al., 1991a; SHEPPARD, SOARES, et al., 1991b; LOBO, 1995), e foi esta, também, a primeira espécie de Hymenoptera que teve o sequenciamento total do genoma mitocondrial realizado (CROZIER e CROZIER, 1993). As abelhas Euglossini, conhecidas como abelhas das orquídeas, são importantes polinizadores de diversas espécies vegetais e desenvolveram uma íntima relação com a família Orchidaceae. Podendo ser encontradas em florestas Neotropicais, destacam-se pela sua coloração e uma longa glossa (DRESSLER, 1982; ROUBIK, 1989; BÚRQUEZ, 1997; NEMÉSIO, 2009; ZIMMERMANN, 2010; SANTOS, MATEUS e NASCIMENTO, 2012). Apontadas por vários autores como sendo indicadores de impactos sofridos pelo meio ambiente, à exemplo do desmatamento e da fragmentação de habitat, as espécies desta tribo estão sendo utilizadas como foco de estudos genéticos na última década (GIANGARELLI, FREIRIA, et al., 2009). Atualmente, é possível verificar o registro da primeira extinção local de uma espécie do grupo (NEMÉSIO, 2011), apesar disto os estudos da genética dessas abelhas tem apresentado altos níveis de diversidade e certa estruturação genética (ZIMMERMANN, SCHORKOPF, et al., 2011; ROCHA-FILHO, CERÂNTOLA, et al., 2013; BOFF, SORO, et al., 2014; SUNI, BRONSTEIN e BROSI, 2014; PENHA, GAGLIANONE, et al., 2014). Poucas são as informações encontradas em relação ao grau de diferenciação desse grupo quanto à morfologia nos diferentes ambientes. A definição da forma de uma estrutura biológica é regida por processos que operam em diferentes escalas e níveis organizacionais de complexidade, assim o aspecto fenotípico resultante de uma estrutura biológica é o resultado das interações entre os caracteres genéticos e as características desenvolvidas devido aos fenômenos ecológicos e as forças evolutivas provocadas por eventos aleatórios, estocásticos, e/ou determinados (Levin, 1992). Dados morfológicos como o tamanho corporal, extensão, largura e formato das asas são considerados passíveis de variação, sendo úteis na diferenciação de populações (Roubik, 1989). Para avaliar as características de diferentes populações buscando identificar possíveis subespécies algumas técnicas são aplicadas; um exemplo é a análise morfométrica, que é utilizada para avaliar os padrões de variação geográfica e diferenciação intraespecífica em abelhas (Ruttner, 1988), esta ferramenta tem se mostrado muito eficiente para identificar e separar espécies, subespécies e ecotipos 155

173 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. (FRANCOY, WITTMANN, et al., 2008; FRANCOY, SILVA, et al., 2009; FRANCOY e IMPERATRIZ-FONSECA, 2010). Em abelhas sociais, a caracterização das populações tem sido objeto de estudo dessa ferramenta onde estão sendo obtidas importantes informações sobre a discriminação e identificação das diferenças e semelhanças entre colônias nas diferentes localizações geográficas de sua distribuição (DINIZ-FILHO e MALASPINA, 1995; DINIZ- FILHO, BALESTRA, et al., 1998; WALDSCHMIDT, 1999; BAYLAC, VILLEMANT e SIMBOLOTTI, 2003; ARAÚJO, COSTA, et al., 2004; FRANCOY, PRADO, et al., 2006) Entre os métodos utilizados nessa ferramenta, os marcos anatômicos merecem destaque por representar as formas através de dados numéricos, que podem ser obtidos por coordenadas médias de marcos distribuídos perifericamente, ou ainda por meio da distância entre os marcos escolhidos (DI MARE e CORSEUIL, 2004). O teste é baseado nas variações das coordenadas Cartesianas desses marcos anatômicos permitindo analisar e identificar, nas estruturas morfológicas dos exemplares, variações de forma (ROHLF e MARCUS, 1993). Para tal, uma estrutura muito utilizada nas análises morfométricas são as asas dos insetos, isso ocorre por estas serem planas, o que possibilita a obtenção de muitas informações (NUNES, COSTA-PINTO, et al., 2007), e também devido à presença de diversos marcos anatômicos, principalmente na inserção das nervuras (GRODNITSKY, 1999). Os primeiros estudos utilizando essa ferramenta e os padrões de venação das asas anteriores foram realizados em abelhas africanizadas e algumas de suas subespécies conseguindo 85% de classificações corretas entre as subespécies de Apis mellifera Linnaeus (FRANCOY, GONÇALVES e WITTMANN, 2006; FRANCOY, WITTMANN, et al., 2008); em abelhas do gênero Plebeia Schwarz (SILVA, 2006), com populações das espécies Nannotrigona testaceicornis Lepeletier (MENDES, FRANCOY, et al., 2007) e Melipona quadrifasciata Lepeletier (NUNES, ARAÚJO, et al., 2008) também apresentaram resultados eficientes utilizando esta técnica. O uso dessa técnica exige do pesquisador um menor investimento laboratorial, baixo custo de análises, pois existem vários programas gratuitos para análises das espécies e estudos de variação populacional, biogeografia, evolução assimetria, além dos dados resultantes destas análises poderem ser associados aos dados moleculares (ARAÚJO, 2010). Os resultados até então encontrados demonstram uma eficácia desta 156

174 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. ferramenta, por ser rápida e de baixo custo, sendo assim, útil e adequada para identificação das espécies e análise da variabilidade dentro dos grupos em estudo. Devido ao exposto e visto que muitos trabalhos realizados com espécies da tribo Euglossini indiquem uma alta variabilidade genética nas populações do Brasil, buscou-se aqui verificar como as populações de Eg. cordata e El. nigrita encontram-se estruturadas nas áreas de estudo. Objetivos O objetivo deste capítulo foi por meio do uso de marcadores de DNA mitocondrial e da técnica de morfometria genética, discriminar populações de duas espécies de Euglossini (El. nigrita e Eg. cordata) provenientes de três biomas diferentes no Brasil, buscando avaliar a diversidade do DNA mitocondrial e dos padrões morfométricos e verificar a existência de possíveis ecotipos entre estes, mais especificamente: Estimar a variabilidade genética das populações amostradas; Verificar se as populações estão estruturadas geneticamente; Avaliar se as populações dessas espécies presentes em áreas de Caatinga, Mata Atlântica e Cerrado encontram-se morfologicamente distintas; Caracterizar por meio da morfometria geométrica as asas anteriores (direita) de El. nigrita e Eg. cordata; Comparar os dendrogramas de proximidade morfológica das espécies em estudos a partir das distâncias produzidas pelas análises de morfometria geométrica. Materiais e Métodos Coleta do material. As espécies Euglossa cordata Linnaeus e Eulaema nigrita Lepeletier foram escolhidas para as análises de mtdna por estarem presentes de forma abundante nas áreas de estudo; foram empregados apenas machos dessas espécies uma vez que apenas estes são atraídos pelas iscas odoríferas (ver detalhes Cap. 2). Os indivíduos foram atraídos com o uso de compostos aromáticos e capturados com auxílio de rede entomológica, acondicionados individualmente, em frascos de vidro e sacrificados por resfriamento. No laboratório, estes tiveram o primeiro par de pernas 157

175 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. removido e conservado em álcool etílico absoluto (P.A.-A.C.S Synth; 99,5%) até as análises, que foram realizadas no Laboratório de Biologia e Genética em Abelhas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Foram coletados 60 indivíduos, de cada das espécies em cada um dos biomas: Caatinga (municípios de Poço Redondo e Canindé do São Francisco), Mata Atlântica (município de Capela) e Cerrado (município de Pedregulho), sendo os dois primeiros áreas de proteção ambiental localizados no estado de Sergipe e o último em São Paulo (Figura 1). A Reserva de Vida Silvestre Mata do Junco é recoberta pelo bioma Mata Atlântica caracterizado pela alta diversidade de espécies e alto grau de endemismo, devido à sua grande extensão e diferentes composições vegetais podem ser encontrados em vários tipos de relevos, paisagens e características climáticas diversas (LAGOS e MULLER, 2007). O Monumento Natural Grota do Angico é composto pela Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro caracterizado pela presença de floresta arbórea ou arbustiva composta por árvores xerofíticas com regime de chuvas de deficiência hídrica na maior parte do ano e alta taxa de evapotranspiração o que influencia na disponibilidade e qualidade da vegetação (Moreira, et al., 2006). A Estância Alto da Boa Vista compreende uma área de Cerrado do estado de São Paulo, apresenta clima estacional com chuvas entre os meses de outubro e março e temperaturas amenas (KLINK e MACHADO, 2005). As distâncias par-a-par das áreas de coletas podem ser vistas na Tabela

176 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Ca Caatinga Ca Ce Cerrado Ma Mata Atlântica Ma Ce Figura 1 Localização geográfica mostrando a distância entre os pontos de coletas dos indivíduos utilizados nas análises. 159

177 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Tabela 1 Distância em linha reta entre as áreas de coleta Ponto de coleta Caatinga Cerrado Mata Atlântica Caatinga Cerrado 1568,29 Mata Atlântica 120, ,54 * Distância em quilômetros Extração do DNA mitocondrial. O método de Chelex (adaptado de Walsh et al. 1991) foi seguido para a obtenção do DNA das Euglossini. Assim o primeiro par de pernas da abelha foi removido, conservado em álcool etílico absoluto (P.A.-A.C.S Synth; 99,5%) e congelado até o período de análises, quando então as pernas foram maceradas levemente em 100μl da solução de Chelex 5% e adicionado de 5µl da proteínase K. A solução obtida foi incubada em termociclador por 60min à 55 C seguido por 15min à 99 C e finalizando por 1min a 37 C, sendo mantido refrigerado à 4 C até o congelamento. O DNA, pronto para análise foi mantido congelado à -20 C (SOFIA, PAULA, et al., 2005; PASCUAL, 2006). Reação de Polimerase em Cadeia PCR. A reação de PCR foi realizada em aparelho termociclador e compreendeu de 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão, seguindo o protocolo utilizado por Bonatti (2012). A reação de PCR foi realizada com 2µL do sobrenadante da extração com Chelex como DNA molde, 10µL de Promega Master Mix 2x, 1µL de cada primer totalizando um volume de 20µL com água Milli Q autoclavada. A amplificação do lócus de COI foi feita em um termociclador Applied Biosystems, geneamp, PCR System Foram realizados testes iniciais para encontrar as condições ideais para as PCRs de modo a evitar saturação. Após a amplificação, foi verificada a existência do fragmento esperado a partir de 2µL da reação de PCR submetidos a eletroforese em Gel de Agarose 1% contendo brometo de etídio (0,01 μl/ml de gel de agarose) em tampão 1x TBE (0,45M Tris Base; 0,45M Ácido Bórico; 0,5M EDTA, ph 8,0). Posteriormente, cada gel foi visualizado digitalmente com o uso de um foto-documentador KODAK EDAS 290. Um marcador de 160

178 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. peso molecular com intervalo de 100 pares de base (Invitrogen nº Cat ) foi utilizado em uma das pistas de cada gel. Purificação. O DNA amplificado restante da reação de polimerase em cadeia foi purificado de acordo com o protocolo do fabricante Promega (Wizard SV Gel and PCR Clean-up System) e submetidos ao sequenciamento no Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica CREBIO (FCAV UNESP Campus Jaboticabal). Amplificação do gene mitocondrial. Seguindo a metodologia de Bonatti (2012) no estudo de Melipona subnitida Ducke, foi feita a amplificação e análise do gene mitocondrial, de acordo com a metodologia que será descrita a seguir. O material genético foi submetido à PCR para amplificação do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI), para tal foram usados primers considerados universais mtd9 (5 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 3 ) e barbee (5 CAACAAATCATAAAAATATTGG 3 ) (Simon, Frati et al, 1994) que são assim classificados por amplificarem fragmentos em uma ampla variedade de organismos, de acordo com o programa a baixo (Figura 2): Figura 2: Ciclos de reação para gene mitocondrial amplificação dos COI Preparo do material para aquisição dos dados morfométricos. As abelhas tiveram sua asa anterior retirada do corpo dos exemplares com auxílio de pinça, seguindo estas foram umedecidas em uma mistura de álcool 70% e água e 161

179 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. posteriormente com auxílio de um pincel foram montadas com lâmina e lamínula de microscopia, previamente estas asas foram identificadas com um código referente ao indivíduo do qual foi retirada (Figura 3). Após a montagem, com a utilização de microscópio estereoscópio com câmera fotográfica acoplada as lâminas contendo as asas foram fotografadas e armazenadas digitalmente. Seguindo, as análises foram realizadas com auxílio de programas computacionais disponíveis gratuitamente na internet através do domínio: Figura 3 Lâminas semi-permanentes montadas com as asas retiradasdos machos de El. nigrita (A) e Eg. cordata (B). Para avaliar o padrão de venação das asas anteriores e suas deformações parciais foi criado um arquivo com extensão.tps com auxílio do programa tpsutil versão 1.40 (ROHLF, 2008a), que tem como função servir de banco de dados para o armazenamento de coordenadas Cartesianas dos marcos anatômicos assinalados nas imagens previamente armazenadas. As coordenadas cartesianas dos marcos anatômicos de cada conjunto amostral foram marcadas manualmente (Figura 4) nas junções de nervuras das células das asas com auxílio do software tpsdig 2.12 (ROHLF, 2008b); a ordem de 162

180 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. introdução dos marcos anatômicos foi a mesma pra cada indivíduo, este é um requisito para o estabelecimento da homologia das estruturas de acordo com as coordenadas obtidas, cada marco anatômico refere-se a uma coordenada (Silveira, 2011). Figura 4 Vista da asa direita anterior de Euglossa cordata (A) e Eulaema nigrita (B) com a posição dos 15 marcos anatômicos, os pontos em vermelho representam o posicionamento dos marcos nas junções das nervuras. Para gerar as mudanças de forma a partir dos marcos anatômicos, as configurações individuais foram alinhadas pelo Método de Superposição dos Quadrados Mínimos de Procrustes no programa e tpsrelw 1.42 (ROHLF, 2005). O método de Procrustes (Bookstein, 1996), consiste de três etapas, onde o tamanho das imagens das asas é uniformizado, por sobreposição destas com base em seus centroides e tiveram a interferência da orientação corrigidas para serem alinhadas de maneira correta e com o somatório das distâncias entre os marcos homólogos sendo 163

181 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. a menor possível (Figura 5) esse procedimento é realizado para reduzir a influência ambiental sobre o desenvolvimento dos indivíduos. Figura 5 Representação gráfica da padronização de tamanho das asas e alinhamento dos marcos anatômicos para realização da análise de morfometria geométrica. Fonte: (Grassi, 2009). Análises estatísticas. DNA mitocondrial A partir dos resultados obtidos com os marcadores as sequências foram editadas pelo software ChromasPro versão (Technelysium Pty Ltd., Qld, Australia) e alinhadas pelo BioEdit, Biological sequence alignment editor, versão (HALL, 1999); Após serem organizadas as sequências foram analisadas pelos com o uso do software DNAsp v.5.10 (LIBRADO e ROSAS, 2009) para separar os haplótipos em seus respectivos grupos e determinar o número de sítios polimórficos (S), número de haplótipos (h), diversidade haplotípica (Hd), diversidade nucleotídica (π) e o número médio de diferenças nucleotídicas (k)(francisco, 2002). 164

182 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Já o programa Arlequin 3.5 (EXCOFFIER e LISCHER, 2010) foi empregado para estimar o grau de diferenciação intrapopulacional (Fst), baseado nas frequências haplotípicas, realizando o teste exato juntamente com o método da cadeira de Markov; nesse mesmo software foi realizado o estudo da estrutura populacional empregando-se a análise de variância molecular (AMOVA) (EXCOFFIER, SMOUSE e QUATTRO, 1992), essa análise serviu para gerar estimativas da variância genética em diferentes níveis hierárquicos e o valor de estatística ϕst que é definido como a correlação entre haplótipos retirados ao acaso de uma população, em relação ao total de haplótipos da espécie (EXCOFFIER, SMOUSE e QUATTRO, 1992); como também calculou o índice Fst entre pares de população que pode ser usado como distância genética entre elas. A rede de haplótipos foi construída usando o software NETWORK v (POLZIN, 2013), empregando o algoritmo Median Joining que identifica os haplótipos mais proximamente relacionados. Também foi construído um dendograma baseado nas distâncias genéticas pelo método de Neighbor Joing com auxílio do programa MEGA v. 6 (TAMURA, STECHER, et al., 2013). Morfometria geométrica Com o uso do programa MorphoJ 1.03a (Klingenberg, 2008) a sobreposição de Procrustes, produção da matriz de covariância, análise de componente principal e de variável canônica para identificação dos grupos, análise discriminante para verificação da variabilidade dos grupos seguido de testes de validação foram realizadas, além disso foi feito o cálculo das distâncias de Mahalanobis. A construção do dendrograma de proximidade morfológica, método Neighbor Joining (SAITOU e NEI, 1987), foi realizada pelo programa MEGA versão 6.0 (TAMURA, STECHER, et al., 2013). A Análise de Componentes Principais não requer um agrupamento a priori por ser uma técnica exploratória, que possibilita verificar inicialmente a presença de grupos distintos em um conjunto de dados; já a Análise de Variável Canônica, assemelha-se à de Componentes Principais, exceto pela delimitação dos dados por grupo, o que permite identifica a variação entre e dentro dos grupos e assim formar agrupamentos (CAVALCANTE e LOPES, 1998). A distância geográfica, em linha reta entre as populações estudadas, foi dada em quilômetros a partir das coordenadas geográficas marcadas com uso de GPS e utilizando 165

183 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. a ferramenta Google Maps. Para verificar correlações entre estas distâncias e as distâncias morfológicas foi também utilizado o teste de Mantel com auxílio do software TFPGA. Resultados DNA mitocondrial A amplificação por PCR da região Citocromo Oxidase subunidade I, assim como o processo de purificação dos fragmentos amplificados foram bem sucedidos em ambas espécies (Figura 6). Figura 6 Gel de agarose 1% corado com brometo de etila e visualizado em luz UV mostrando os fragmentos de COI. A seta indica a direção de migração no gel. Eg. cordata Do total de reações de sequenciamento realizadas para a região do gene COI compreendida entre os primers BarbeeF/Mtd9 (SIMON, FRATI, et al., 1994; FRANCOSO e ARIAS, 2013) para Euglossa cordata foram analisadas 59 sequências de indivíduos provenientes da Caatinga da e Mata Atlântica; no Cerrado durante o período de coletas foram obtidos apenas 10 indivíduos, sendo que as sequências destes foram excluídas das 166

184 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. análises aqui apresentadas devido à problemas durante o sequenciamento e também pela contaminação de algumas amostras. As reações de PCR realizadas produziram fragmentos com 612pb, estando dentro do esperado (aproximadamente 600pb), nestes foram detectados 33 haplótipos correspondentes a 35 sítios variáveis (Tabela 2). Tabela 2 Haplótipos encontrados nas sequências analisadas da região COI de Euglossa cordata com polimorfismo de bases nitrogenadas em trinta e três sítios dos 612pb recuperados. Números nas colunas representam a posição em pb dos sítios polimórficos dentro do fragmento; H: haplótipos. H G C G A T A T A T T A A A A A 2 G C G A T A A A T T A T A A A 3 G C G A T A T T T T A T A A A 4 G C G A T A T A T T C A A A A 5 C C G A T A A T T T A T A A A 6 G C G A G C A A T A C T A A A 7 G C G A T A A A T T C T A A A 8 G C G A T A T A G T C A A A A 9 C T G A T A A A T T A T A A G 10 G C G A T A T A T T A T A A A 11 C T G C G C A A G A A T T T G 12 C T G A T C A A G T A A A A G 13 G C G A T A A A T T A T A A G 14 G C G A A C T A G T C A A A A 15 C C C A T A T A T T A T A A G 16 C C G A T A A A T T A T A A A 17 C C C A G C T T G A A A T T G 18 C C C A T A T A T T A T A A A 19 C C G A T A T A T T A T A A A 20 C C G C G C T T G A A A T A G 21 C T G A T A A T T T A T A A A 22 C C G A T A A A T T A T A A G 23 C C C A T C T T T T A T A A G 24 C T G A T A T A T T C T A A A 25 C C C C G C T T G A A A T T A 26 C C G A T C T T G T A A T T G 27 C C G A T A A T T T A A A A A 28 C C G A G C A T G A A T T T G O haplótipo H2 foi o mais frequente na análise, sendo encontrado apenas no bioma Mata Atlântica, em geral os haplótipos foram exclusivos para um único bioma, com exceção do H9 (Tabela 3). A composição nucleotídica foi de A= 46,41%, T/U= 30,59%, C= 10,91% e G= 12,09%. O fragmento consenso isolado foi alinhado à sequência do genoma mitocondrial de COI desta mesma espécie (número de acesso NCBI GeneBank: AY ) 167

185 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. (RAMÍREZ, ROUBIK, et al., 2010), correspondendo à posição nucleotídica 2 a 489 pb (Figura 7). Tabela 3 Frequência da distribuição dos haplótipos nas populações de Euglossa cordata amostradas. Haplótipo Caatinga (19) Mata Atlântica (39) H1 0 1 H H3 0 1 H4 0 2 H5 0 1 H6 0 1 H7 0 2 H8 0 1 H9 1 1 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

186 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Query 1 TGTTGATATAATACTGGATCTCCACCTCGTATAGGATCAAAAAATGATGTATTAAAATTA 60 Sbjct 489 TGTTGATATAATACTGGATCTCCTCCTCCTATAGGATCAAAAAATGATGTATTAAAATTA 430 Query 61 CGATCAAATAATAATATTGTAATAGCTCCAGCTAATACAGGTAAAGATAATAAGAATAAA 120 Sbjct 429 CGATCAAATAATAATATTGTAATAGCTCCAGCTAATACAGGTAAAGANAATAATAATAAA 370 Query 121 ATTATTGTAATAAAAACAGACCAAGGAAATAAAGGTATTTTATCTAAATCTAATCTAAAA 180 Sbjct 369 ATTATTGTAATAAAAACAGATCAAGGAAATAAAGGTATTTTATCTAAATCTAATCTAAAA 310 Query 181 TTTTTTATTAATATAATTGTAGTCATTAAATTTATAGCTCCTAAAAGTGATGAAATACCA 240 Sbjct 309 TTTTTTATTAATATAATTGTAGTTATTAAATTTATAGCTCCTAAAAGTGATGAAATACCA 250 Query 241 GATATATGTAAAGAAAAAATTGTAAAATCTACAGAAGGAGAAGAATGAAATATATAATGA 300 Sbjct 249 GATATATGTAAAGAAAAAATTGTAAAATCTACAGAAGGAGAAGAATGAAATATATAATTA 190 Query 301 GATCAAGGCGGATAATCAGTTCAACCAGTTCCAGATATAAAATTAAAAATTCTTCTAGTT 360 Sbjct 189 GATAAAGGAGGATATACAGTTCATCCAGTTCCAGATATAAAATTAAAAATTCTTCTAGTT 130 Query 361 AATAATAAAACTAATGAAGGAGGTAATAATCAAAATCTAATATTATTTATACGAGGAAAT 420 Sbjct 129 AATAATAATAATAATGAAGGAGGTAATAATCAAAATCTAATATTATTTATACGAGGAAAT 70 Query 421 GATATATCAGGTGATCTTAACATTAAAGGAATTAATCAATTACCAAATCCTCCAATTAAA 480 Sbjct 69 GATATATCAGGTGAACTTAATATTAAAGGAATTAATCAATTACCAAATCCTCCAATTAAA 10 Query 481 AAAGGTAT 488 Sbjct 9 AAAGGTAT 2 Figura 7 Alinhamento entre sequências nucleotídicas de Euglossa cordata obtidas por meio do sequenciamento (Query) e do banco de dados NCBI (Sbjct), onde foi obtido 97% de alinhamento. Ao contrário do indicado para a Mata Atlântica a diversidade nucleotídicas foi alta dentro da população da Caatinga. O número de sequências usadas, de sítios polimórficos (S) e de haplótipos (h), bem como a diversidade nucleotídica (π) e haplotípica (Hd) e o número médio de diferenças haplotípicas (K) para cada população foram resumidos na Tabela 4. A diferenciação genética total entre as populações foi estimada pelo parâmetro Fst, para examinar como esta variação se distribuía entre populações pareadas, foi estimado Fst par-a-par (Tabela 5). As inter-relações haplotípicas foram representadas por meio da rede de haplótipos (Figura 8), onde podem ser visualizados os passos mutacionais entre estes. O dendograma de proximidade genética foi criado pelo método Neighbor Joing para verificar a distribuição dos alelos nos respectivos biomas (Figura 9). 169

187 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Também foram realizadas análises da estrutura genética de populações empregando-se variância molecular (AMOVA Tabela 6), onde se verificou que segundo o valor de ϕst a probabilidade de que dois haplótipos tirados ao acaso de uma população sejam relacionados é maior que O teste de Tajima (TAJIMA, 1989) não foi significativo, apresentando D=0,41833 e p=0,72600, ao contrário do Fs de Fu (FU, 1997) resultou em -17,046 e p=0,0000. Tabela 4 Diversidade genética das populações de Eulaema nigrita para os haplótipos do gene mitocondrial COI. Número de sequencias analisadas N; Número de sítios polimórficos S; Número de haplótipos h; Diversidade haplotípica Hd; diversidade nucleotídica π; número médio de diferenças k. N S h Hd π K Caatinga ,971 0, ,357 Mata Atlântica ,625 0, ,275 Tabela 5 Na cor preta, valores de Fst par-a-par para 395pb da região COI de amostras de Eulaema nigrita dos três biomas em estudo. Na cor vermelho, valores da significância de cada Fst calculado (P). Em vermelho, Fst de valor significativo (p 0,05). Número de permutações: Caatinga Mata Atlântica Caatinga 0, Mata Atlântica 0,31362 Tabela 6 Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada nas sequências nucleotídicas de COI em Euglossa cordata. Fonte de variação Variância %do total P ϕst Interpopulacional 0,74608 Va 31,36 Intrapopulacional 1,63288 Vb 68,64 0, TOTAL 2, Número de permutações=1023; α=0,05 170

188 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Caatinga Mata Atlântica Figura 8 Rede de haplótipos para o gene COI da espécie Euglossa cordata. O tamanho das esferas representa o número de indivíduos e os pontos entre estas representam os sítios polimórficos. 171

189 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 9 Relações evolutivas de táxons usando o método de Neighbor-Joining. As distâncias evolutivas, foram calculados usando o método Kimura

190 El. nigrita Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Do total de reações de sequenciamento realizadas para a região do gene COI compreendida entre os primers BarbeeF/Mtd9 (SIMON, FRATI, et al., 1994; FRANCOSO e ARIAS, 2013) foram analisadas 59 sequências de indivíduos provenientes da Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica. As reações de PCR realizadas produziram fragmentos do tamanho esperado (aproximadamente 600pb), porém depois de alinhadas e editadas as sequências, obtivemos fragmentos e 395pb, nos quais foram detectados 16 haplótipos correspondentes a 29 sítios variáveis (Tabela 7). Os haplótipos H3 e H7 foram, respectivamente, os mais frequentes entre as populações, podendo ser encontrados em todos os biomas, outro haplótipo também foi frequente é o H1 que esteve presente apenas no Cerrado e na Mata Atlântica, haplótipos exclusivos forem encontrados para Caatinga (H12), Cerrado (H2. H4, H6, H11, H14, H15 e H16) e para a Mata Atlântica (H5, H8, H9, H10 e H13) (Tabela 8). A composição nucleotídica foi de A= 49,03%, T/U= 30,61%, C= 8,45% e G= 11,91%. O fragmento consenso isolado foi alinhado à sequência do genoma mitocondrial de COI desta mesma espécie (número de acesso NCBI GeneBank: KC ) (FRANCOSO e ARIAS, 2013), correspondendo à posição nucleotídica 94 a 488 pb (Figura 10). A diversidade nucleotídica foi baixa dentro das populações, exceto para a caatinga. O número de sequências usadas, de sítios polimórficos (S) e de haplótipos (h), bem como a diversidade nucleotídica (π) e haplotípica (Hd) e o número médio de diferenças haplotípicas (K) para cada população foram resumidos na Tabela 9. A diferenciação genética total entre as populações foi estimada pelo parâmetro Fst, para examinar como esta variação se distribuía entre populações pareadas, foi estimado Fst par-a-par (Tabela 10). As inter-relações haplotípicas foram representadas por meio da rede de haplótipos (Figura 11), onde temos os haplótipos H3 e H7 sendo compartilhado por indivíduos de todos os biomas em estudo e onde também podem ser visualizados os passos mutacionais entre estes. O dendrograma de proximidade genética foi criado pelo método Neighbor Joing para verificar a distribuição dos alelos nos respectivos biomas (Figura 12). 173

191 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Tabela 7 Haplótipos encontrados nas sequências analisadas da região COI de Eulaema nigrta com polimorfismo de bases nitrogenadas em vinte e nove sítios dos 395pb recuperados. Números nas colunas representam a posição em pb dos sítios polimórficos dentro do fragmento; H: haplótipo. H A T T A T A C A C T A T G A A A C T A G A G G C T C A T T 2 A T T A T A C A C T G T G G A G A T G C A G G C T C A T T 3 A T T A T A C A C T A T G A A A A T A G A G G C T C A T T 4 A T T A T A C A C T G T G A A A A T A C A G G A T C A A G 5 A T T A T A C A C T A T G A A A A T A G A T G C T C A T T 6 A T T A T A C A C G A T G A A A A T A C A G G C T C A T T 7 A T T A T A C A C T A T G A A A A T A C A G G C T C A T T 8 A T T A T A C A C T A G A A A A A T A C A T G C T C A T T 9 A T T A T A C A C T A T G A A A C T G G A G G C T A A T T 10 T A G G A T T T G T A T G A A G A T A G G G G C T C A T T 11 A T T A T A C A C T G T G A A A A T G C A G A C A C A T G 12 A T T A T A C A C T G T G G T G A T G C A G A A A C A A G 13 A T T A T A C A C T A T G A A G A T A G A G G C T C T T T 14 A T T A T A C A C T G T G A A A A T G C A G G C T C A T G 15 A T T A T A C A C T A T G A A G A T A C A G G C T C A T T 16 A T T A T A C A C T A T G A A A A G A C A G G C T C A T T

192 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Tabela 8 Frequência relativa da distribuição dos haplótipos nas populações de Eulaema nigrita amostradas. Haplótipo Cerrado (26) Caatinga (5) Mata Atlântica (28) H1 0,0769 0,143 H2 0,0385 H3 0,423 0,6 0,5 H4 0,0385 H5 0,0357 H6 0,0385 H7 0,231 0,2 0,179 H8 0,0357 H9 0,0357 H10 0,0357 H11 0,0385 H12 0,2 H13 0,0357 H14 0,0385 H15 0,0385 H16 0,0385 Query 1 TAATAAAATTATAGTAATAAATACAGATCAAGGAAATAAAGGTATTTTATCTAAACTTAA 60 Sbjct 488 TAATAAAATTATAGTAATAAATACAGATCAAGGAAATAAAGGTATTTTATCTAAACTTAA 429 Query 61 ACAAAAATTTTTTATTAATATAATTGTAGTTATTAAATTTAAAGAACCTAATAGAGATGA 120 Sbjct 428 ACAAAAATTTTTTATTAATATAATTGTAGTTATTAAATTTAAAGAACCTAATAGAGATGA 369 Query 121 AATTCCTGATAAATGTAAAGAAAAAATAGTAAAATCAACAGATGGAGAAGAATGAAAAAT 180 Sbjct 368 AATTCCTGATAAATGTAAAGAAAAAATAGTAAAATCAACAGATGGAGAAGAATGAAAAAT 309 Query 181 ATAATTTGATAAAGGAGGATAAATTGTTCATACTGTACCTGATGAAAAATTAAATAATCT 240 Sbjct 308 ATAATTTGATAAAGGAGGATAAATTGTTCATACTGTACCTGATGAAAAATTAAATAATCT 249 Query 241 ACTTATTATTATTAATAATAAAGATGGGAGTAATAATCAAAATCTAATATTATTTATTCG 300 Sbjct 248 ACTTATTATTATTAATAATAAAGATGGGAGTAATAATCAAAATCTAATATTATTTATTCG 189 Query 301 AGGAAAAGATATATCAGGAGAACCTAATATTAAAGGCACTAATCAATTACCAAATCCTCC 360 Sbjct 188 AGGAAAAGATATATCAGGAGAACCTAATATTAAAGGCACTAATCAATTACCAAATCCTCC 129 Query 361 AATTAAAAAAGGTATAACTATAAAAAAAATTATTA 395 Sbjct 128 AATTAAAAAAGGTATAACTATAAAAAAAATTATTA 94 Figura 10 Alinhamento entre sequências nucleotídicas de Eulaema nigrita obtidas por meio do sequenciamento (Query) e do banco de dados NCBI (Sbjct), onde foi obtido 100% de alinhamento. 175

193 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Tabela 9 Diversidade genética das populações de Eulaema nigrita para os haplótipos do gene mitocondrial COI. Número de sequencias analisadas N; Número de sítios polimórficos S; Número de haplótipos h; Diversidade haplotípica Hd; diversidade nucleotídica π; número médio de diferenças k. N S h Hd π K Cerrado ,782 0, ,00458 Caatinga ,700 0, ,01165 Mata Atlântica ,717 0, ,00506 Tabela 10 Abaixo da diagonal, valores de Fst par-a-par para 395pb da região COI de amostras de Eulaema nigrita dos três biomas em estudo. Acima da diagonal, valores da significância de cada Fst calculado (P). Em vermelho, Fst de valor significativo (p 0,05). Número de permutações: Cerrado Cerrado Caatinga Mata Atlântica Caatinga Mata Atlântica

194 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Caatinga Cerrado Mata Atlântica Figura 11 Rede de haplótipos para o gene COI da espécie Eulaema nigrita. O tamanho das esferas representa o número de indivíduos e os pontos entre estas representam os sítios polimórficos

195 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 12 Relações evolutivas de táxons usando o método de Neighbor-Joining [1]. A árvore ideal com a soma do comprimento dos ramos = é apresentada. As distâncias evolutivas, foram calculados usando o método Kimura

196 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Também foram realizadas análises da estrutura genética de populações empregando-se variância molecular (AMOVA Tabela 11), onde se verificou que segundo o valor de ϕst a probabilidade de que dois haplótipos tirados ao acaso de uma população sejam relacionados é maior que 0, O teste de Tajima (TAJIMA, 1989) foi significativo, apresentando D=-2,06842 e p=0, 00200, assim como o teste de Fs de Fu (FU, 1997) que resultou em -6,592 e p=0, Tabela 11 Análise hierárquica de variância molecular (AMOVA) baseada nas sequencias nucleotídicas de COI em Eulaema nigrita. Fonte de variação Variância %do total P ϕst Interpopulacional Va 3.70 Intrapopulacional Vb ,

197 Morfometria geométrica Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Euglossa cordata x Eulaema nigrita Foram categorizados por bioma de coleta, machos de duas espécies de gêneros distintos de Euglossini, Eg. cordata e El. nigrita, a partir dos quinze marcos anatômicos feito na junção das nervuras das asa. De acordo com esses dados a análise da porcentagem da variância obtida mostrou que o primeiro componente representa 86,75% da variação. A Análise Canônica, por sua vez, representou a separação desses indivíduos de acordo com a espécie a qual pertencem (Figura13), o que vem a ser confirmado pelas distâncias de Mahalanobis e de Procruster (Tabela 12). A partir das distâncias quadradas de Mahalanobis foi construído um dendrograma de proximidade morfológica entre os grupos estudados separados por bioma e por espécie no qual podemos perceber que as populações de Eg. cordata e El. nigrita são distintas entre si e onde também é possível verificar o ordenamento das espécies por bioma, sendo que para a primeira os biomas Caatinga e Mata Atlântica foram agrupadas em um ramo separado do Cerrado, já para a segunda espécie é possível ver um distanciamento da população coletada na Caatinga dos outros biomas (Figura 14). 180

198 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 13 Disposição relativa das populações de Eg. cordata e El. nigrita, separadas por biomas nos quais foram coletadas, obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos Caatinga Eg.cordata 1.18 Mata Atlantica Eg.cordata 1.74 Cerrado Eg.cordata 1.31 Caatinga El.nigrita 0.96 Cerrado El.nigrita Mata Atlantica El.nigrita 2 Figura 14 Dendrograma de proximidade morfológica entre as populações de Eg. cordata e El. nigrita. A história evolutiva foi inferida usando o método Neighbor- Joining. 181

199 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Tabela 12 Distâncias quadradas de Mahalanobis e distâncias de Procrustes com suas respectivas probabilidades, entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas. Mata Atlântica Eg. cordata Mata Atlântica El. nigrita Caatinga Eg. cordata Caatinga El. nigrita Cerrado Eg. cordata Cerrado El. nigrita Mata Atlântica 0,1217 P 0,0136 P 0,1235 P 0,0220 P 0,1204 P Eg. cordata P< 0,0001 0,0004 P< 0,0001 0,0025 P< 0,0001 Mata Atlântica 23,45 m 0,1238 P 0,0117 P 0,1267 P 0,0067 P El. Nigrita P< 0,0001 P< 0,0001 0,1398 P< 0,0001 0,0700 Caatinga 2,69 m 23,83 m 0,1253 P 0,0212 P 0,1295 P Eg. cordata P< 0,0001 P< 0,0001 P< 0,0001 0,0162 P< 0,0001 Caatinga 23,44 m 2,76 m 23,80 m 0,1225 P 0,0111 P El. Nigrita P< 0,0001 0,0342* P< 0,0001 0,0006 0,3576 Cerrado 3,66 m 23,37 m 3,83 m 23,37 m 0,1257 P Eg. cordata P< 0,0001 P< 0,0001 P< 0,0001 0,0002* P< 0,0001 Cerrado 23,73 m 1,68 m 24,11 m 2,87 m 23,63 m El. Nigrita P< 0,0001 0,0007* P< 0,0001 0,0310* P< 0,0001 m distância quadrada de Mahalanobis d significância estatística Valores de p para testes de permutação para distância de Procrustes entre grupos *Pares de populações nas quais a distância entre os centroides não foi estatisticamente significante (α = 0,05). 182

200 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Euglossa cordata As amostras das asas dos machos de Eg. cordata foram categorizadas de acordo com o seu bioma de coleta; a partir da configuração consensus dos 15 marcos anatômicos das nervuras das asas foram obtidos os resíduos de Procrustes (Figura 15), no qual foi observado que a maioria dos pontos estão distribuídos em torno da média. Figura 15 Resíduos de Procrustes dos 11 marcos anatômicos marcados nas junções das nervuras das asas dos machos de Eg. cordata. Pontos pretos representam os resíduos de Procrustes e pontos azuis apresentam a média obtida. A Análise de Componente Principal realizada com base nos resíduos de Procrustes das coordenadas cartesianas alinhadas sob os 15 marcos anatômicos anteriormente definidos produziram 26 medidas de deformações relativas (k = 2n-4, sendo k o número total de deformações relativas e n igual ao número de marcos anatômicos). A análise mostra os dois componentes principais de maior variação entre as amostras PC1 e PC2 com 25,15% e 17,18% respectivamente (Figura 16). O gráfico de dispersão, com os dois componentes de maior contribuição para variação dos grupos, não demonstrou, tanto para o eixo correspondente à PC1 como à PC2, diferença entre os grupos analisados (Figura 17). 183

201 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 16 Representação gráfica da porcentagem da variância obtida para as vinte e seis deformações relativas dos Componentes Principais. Figura 17 Análise dos Componentes de Principais das populações de Eg. cordata provenientes de três áreas distintas do Brasil: Caatinga (noroeste de Sergipe), Cerrado (norte de São Paulo) e Mata Atlântica (leste de Sergipe). 184

202 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. De acordo com a Análise de Variáveis Canônicas, obtida a partir da matriz de covariância entre os grupos foram encontrados dois eixos que maximizam a separação significativa das populações, sendo que o primeiro eixo explicou 62,91% de toda a variabilidade do conjunto de dados (Tabela 13). Apesar das populações estarem muito próximas, a distribuição dos pontos no gráfico de dispersão gerado a partir da análise de covariância (Figura 18) mostra no eixo CV1 uma tendência à separação das populações de Caatinga e Mata Atlântica, já segundo o eixo CV2 foi verificado uma separação dos indivíduos destes biomas com os provenientes do Cerrado, o que está de acordo com a distância quadrada de Mahalanobis (Tabela 14). Tabela 13 Variação dos dois eixos de Variáveis Canônicas. Autovalores % Variância % Cumulativa 1. 1, ,91 62, , ,09 100,000 Tabela 14 Distâncias quadradas de Mahalanobis e distâncias de Procrustes com suas respectivas probabilidades, entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas. Caatinga Cerrado Mata Atlântica Caatinga 0,0213 0,0190* P 0,0137 0,0001* P Cerrado 3,4853 P<0,001 m 0,0221 0,0012* P Mata Atlântica 3,0075 P<0,001 m 3,3593 P<0,001 m m distância quadrada de Mahalanobis d significância estatística Valores de p para testes de permutação para distância de Procrustes entre grupos *Pares de populações nas quais a distância entre os centroides não foi estatisticamente significante (α = 0,05). 185

203 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 18 Disposição relativa das populações de Eg. cordata em estudo obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos. Observando ainda a tabela das distâncias quadradas de Mahalanobis e de distâncias de Procrustes entre as populações (Tabela 23), apesar da pequena diferença morfológica apresentada pelos grupos, podemos identificar que a maior proximidade morfológica ocorre entre as populações de Mata Atlântica e Caatinga. De acordo com as distâncias de Mahalanobis obtidas e as distâncias em linha reta entre as localidades (Tabela 15), foi realizado o teste de Mantel, o qual confirmou que as distâncias morfológicas estão correlacionadas com as distâncias geográficas entre as populações (r=0,97; p=0,05), indicando haver uma distribuição gradual dessa característica no espaço geográfico. Tabela 15 Distância em linha reta entre as localidades (km). Caatinga Cerrado Mata Atlântica Caatinga Cerrado 1.568,29 Mata Atlântica 120, ,54 186

204 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. A análise de superposição ortogonal pelos quadrados mínimos (ANOVA Procrustes) demonstrou por comparação que é significativa a diferença entre os grupos de Eg. cordata quanto ao tamanho do centroide (<0, Tabela 16) e quanto à forma (<0,0001- Tabela 17). Tabela 16 ANOVA de Procrustes para o tamanho das asas entre os grupos analisados. Efeito SS MS df F P Individual , , ,27 <0,0001 Residual , ,58 59 Tabela 17 ANOVA de Procrustes para a forma das asas entre os grupos analisados. Efeito SS MS df F P Individual 0, , ,25 <0,0001 Residual 0, , As análises das funções discriminantes classificaram corretamente grande porcentagem dos indivíduos dentro de seus respectivos grupos (Figura 19). A população do cerrado foi mais distinta entre os grupos, possuindo 100% de classificação correta quando confrontada com as outras populações. Dentre as análises, o teste de validação cruzada apresentou os maiores valores foi entre Cerrado e Caatinga com 76,47% e 50%, respectivamente. 187

205 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 19 Discriminação par a par dos grupos estudados pela Análise de Função discriminante e pela validação cruzada entre as populações de Eg. cordata em cada bioma. 188

206 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Eulaema nigrita Os machos de de El. nigrita foram separados de acordo com a área em que foram coletados e apartir da configuração dos 15 marcos anatômicos na junção das nervuras, como previamente determinados, foram obtidos os resíduos de Procrustes (Figura 20), a partir deste foi possível observar que a maioria dos pontos demarcados encontram-se próximos à média. Já as Análises de Componente Principal com base nesses resíduos produziram 26 medidas de deformações relativas (onde k = 2n-4, sendo k equivalente ao número total de deformações relativas e n igual ao número de marcos anatômicos). A análise apresentou os cois componentes principais para variação entre as amostras, PC1 e PC2, com, respectivamente, 15,94% e 15,14% (Figura 21). O gráfico de dispersão com os componentes PC1 e PC2 não demosntrou em nenhum desses eixos diferenças entre os grupos analisados (Figura 22). Figura 20 Resíduos de Procrustes dos onze marcos anatômicos marcados nas junções das nervuras das asas dos machos de El. nigrita. Pontos pretos representam os resíduos de Procrustes e pontos azuis apresentam a média obtida. 189

207 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 21 Variância obtida para as vinte e seis deformações relativas dos Componentes Principais de El. nigrita com suas respectivas porcentagens. Figura 22 Disposição relativa das populações de El. nigrita em estudo obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos marcado nas junções das nervuras das asas. 190

208 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. A Análise de Variáveis Canônicas obtidas por meio da matriz de covariância entre os grupos apresentou dois eixos que maximizaram a separação significativa das populações sendo que estes explicaram, respectivamente, com 55,09% e 44,91 de toda a variabilidade conjunto de dados (Tabela 18). As populações demonstram estarem próximas entre si, embora isso ocorra, a distribuição dos pontos no gráfico de dispersão resultante da Análise de Covariância (Figura 23) exibiu para o eixo CV2 uma tendência à separação das populações de Caatinga em relação às demais, esses dados estão de acordo com as Distâncias Quadradas de Mahalanobis e de Procrustes (Tabela 19); essas distâncias demonstraram ainda que o grupo de maior proximidade morfológica entre Mata Atlântica e Cerrado. Tabela 18 Variação dos eixos de Variáveis Canônicas para machos de El. nigrita. Autovalores % Variância % Cumulativa 1. 0, ,09 52, , ,91 100,00 Tabela 19 Distâncias quadradas de Mahalanobis e distâncias de Procrustes com suas respectivas probabilidades, entre as populações estudadas obtidas através das Análises de Variáveis Canônicas dos machos de El. nigrita. Caatinga Cerrado Mata Atlântica Caatinga 0,0111 0,3579* P 0,0117 0,1415* P Cerrado 3,6204 0,0003* m 0,0067 0,0719 P Mata Atlântica 3,6754 P< 0,0001 m 1,9930 P< 0,0001 m m distância quadrada de Mahalanobis; d significância estatística; Valores de p para testes de permutação para distância de Procrustes entre grupos; *Pares de populações nas quais a distância entre os centroides não foi estatisticamente significante (α = 0,05). 191

209 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 23 Disposição relativa das populações de El. nigrita dos biomas Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica em estudo obtidas a partir das análises das variáveis canônicas dos 15 pontos anatômicos. De acordo com as distâncias de Mahalanobis obtidas e as distâncias em linha reta entre as localidades (Tabela 20), foi realizado o teste de Mantel, o qual confirmou que as distâncias morfológicas estão correlacionadas com as distâncias geográficas entre as populações (r= -0,51; p=0,05), indicando haver uma distribuição gradual dessa característica no espaço geográfico. Tabela 20 Distância em linha reta entre as localidades (km). Caatinga Cerrado Mata Atlântica Caatinga Cerrado 1.568,29 Mata Atlântica 120, ,54 192

210 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. A análise de superposição ortogonal pelos quadrados mínimos (ANOVA Procrustes) demonstrou por comparação que é significativa a diferença entre os grupos de El. nigrita, quanto ao tamanho do centroide (<0, Tabela 21), mas não quanto à forma (0,10- Tabela 22). Tabela 21 ANOVA de Procrustes para o tamanho das asas entre os grupos analisados. Efeito SS MS df F P Individual , , ,48 <0,0001 Residual , ,66 70 Tabela 22 ANOVA de Procrustes para a forma das asas entre os grupos analisados. Efeito SS MS df F P Individual 0, , ,21 0,10 Residual 0, , As análises das funções discriminantes classificaram corretamente grande porcentagem dos indivíduos dentro de seus respectivos grupos (Figura 24). Ao contrário de Eg. cordata a população que se manteve mais distinta foi a do bioma Caatinga apresentando 100% de classificação correta quando confrontada com as outras populações. Para o teste de validação cruzada os maiores valores foram entre Caatinga e Mata Atlântica com 60% e 87,18%, respectivamente. 193

211 Capítulo 5 Análise populacional de duas espécies de Euglossini por meio do DNA mitocondrial e morfometria geométrica de asas. Figura 24 Discriminação par a par dos grupos estudados pela Análise de Função discriminante e pela validação cruzada entre as populações de El. nigrita em cada bioma. 194