Perspectivas bioquímicas na doença:
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- Lídia Costa Canário
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1 BIOQUÍMICA II 2010/2011 Ensino teórico - 1º ano Mestrado Integrado em Medicina 10ª Aula teórica Perspectivas bioquímicas na doença: As citopatias mitocondriais Estudo de uma doença mitocondrial 28/03/2011
2 Bibliografia Texto de apoio - WOC
3 Objectivo: encontrar as respostas Que factores são necessários para estarmos perante uma CRM funcional e ocorrer a OXPHOS? Quais as consequências de uma falha num desses factores? Como saber se estamos perante uma DCRM?
4 Doenças envolvendo o processo da OXPHOS Implicações noutras vias metabólicas Alteração do estado redox mitocondrial e citosólico Beta-OH OH-butirato/ acetoacetato Lactato/piruvato Lactato Alanina Cetonémia paradoxal Perturbação do ciclo Krebs/ beta-oxidação AG Acidúria orgânica
5 Glucose Alanina TGP Piruvato LDH Lactato Aminoácidos PDH Lípidos Acetil-CoA Ciclo de Krebs 3 NADH 1 FADH 2 Corpos cetónicos AcetoAcetato NADH B-OH-Butirato TGP Transaminase Glutâmico Pirúvica LDH lactato desidrogenase PDH piruvato desidrogenase CRM Cadeia Respiratória Mitocondrial ATP CRM
6 Doenças envolvendo o processo da OXPHOS Multissistémicas Heterogéneas (clínica, bioquímica, genética, ) DIAGNÓSTICO Estudo L/P e CRM Normal... Estudo L/P e CRM Anormal... Estudo Molecular Normal... Estudo Molecular Anormal...
7 Objectivo: encontrar as respostas Que factores são necessários para estarmos perante uma CRM funcional e ocorrer a OXPHOS? Quais as consequências de uma falha num desses factores? Como saber se estamos perante uma DCRM?
8 CITOPATIAS MITOCONDRIAIS OU DOENÇAS DA CRM/OXPHOS Todas as células necessitam de ATP Diferentes tecidos com diferentes necessidades energéticas NÍVEL ENERGÉTICO CRÍTICO PARA O APARECIMENTO DA DOENÇA Münnich et al., 2001
9 Doenças envolvendo o processo da OXPHOS HISTÓRIA CLÍNICA Caso clínico 2º Filho de casal jovem, não consanguíneo Sem história de doenças heredo-familiares Pai e irmão de 5 anos - saudáveis Mãe- deprimida (benzodiazepinas) HISTÓRIA OBSTÉTRICA 2ª Gestação; 35,5 semanas Parto eutócico Peso: 2200 g Comprimento: 42,5 cm Perímetro cefálico: 31 cm Índice Apgar* - 4,9,9 (<N) Palato ogival, dismorfismo facial Talus valgus bilateral Hipotonia Sucção pobre Alimentação com sonda nasogástrica *avaliação de 5 sinais objectivos do recém-nascido no primeiro e no quinto minutos após o nascimento, atribuindo-se a cada um dos sinais uma pontuação de 0 a 2, sendo utilizado para avaliar as condições dos recém-nascidos. Os sinais avaliados são: freqüência cardíaca, respiração, tónus muscular, irritabilidade reflexa e cor da pele. O somatório da pontuação (no mínimo zero e no máximo dez) resultará no Índice de Apgar e o recém-nascido será classificado como sem asfixia (Apgar 8 a 10), com asfixia leve (Apgar 5 a 7), com asfixia moderada (Apgar 3 a 4) e com asfixia grave: Apgar 0 a 2. Em caso de dúvida repete-se ao 10º minuto. No momento do nascimento, este índice é útil como parâmetro para avaliar as condições do recém-nascido e orientar nas medidas a serem tomadas quando necessárias.
10 Caso clínico Micrognatia Talus valgus EEG Encefalopatia epiléptica EEG normal
11 INTERNAMENTO Caso clínico 3º DIA: bilirrubina 19,5 mg/dl (N<14) Fototerapia EM CASA Bem, mas. *Dificuldades alimentares *Pobreza movimentos *Não sorri; não segue com o olhar *Choro frequente 11º DIA: Sepsis? Ventilação assistida Lactato: 2,3 mmol/l (N<2,1) Hiperamoniémia: 201 mmol/l (N<40) Ecografia cerebral: normal 37º DIA: Alta Hipertonia Dificuldades alimentares m/ s/ sonda Várias consultas Várias consultas 4 meses: Bronquiolite 6,5 meses: Espasmos infantis Atraso desenvolvimento motor Hipertonia Edemas (palpebrais, mãos, pés)
12 Caso clínico DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Encefalopatia hipóxica-isquémica Malformação cerebral Doença metabólica: - metabolismo energético - peroxissomas BIOQUÍMICA: Glicémia EXAMES COMPLEMENTARES EEG: Hemograma NORMAIS Transaminase Ácidos orgânicos Aminoácidos plasmáticos: alanina* (1329 mmol/ L) Aminoácidos LCR: aumento ligeiro ESTUDO Aminoácidos urina: aumento ligeiro *N , LBG M. Grazina Burst supression (< disparos ) RMN: Hipoplasia corpo caloso (união dos hemisférios) Atrofia opercular esquerda, focal (sulco menos profundo) Hipersinal em T2 na região periventricular esquerda Isquémia?? N Plasma Jejum Pósprandial LCR REDOX Lactato < 2,1 5,57 5,09 5,97 5,53 Lactato/ < Piruvato Corpos 0,05-0,25-0,17 0,21 - cetónicos OHB/AcA < 5,1 6,9 7,2
13 Caso clínico DIAGNÓSTICO Défice CRM? Biópsia muscular Anatomia Patológica: alterações inespecíficas; grande variabilidade do diâmetro das fibras Polarografia + Espectrofotometria: complexos III e IV mtdna: excluídas grandes deleções e mutações pontuais mais frequentes. TRATAMENTO Anticonvulsivantes múltiplos EVOLUÇÃO Hipotonia axial Hipertonia e hiperreflexia periférica Pobreza de massa muscular Edema Atraso crescimento Pneumonias de repetição Morte aos 12 meses.
14 ou N
15 INVESTIGAÇÃO DAS DCRM TECIDOS Linfócitos Fibroblastos Mitocôndrias de músculo Homogeneizado de músculo Homogeneizado de fígado Homogeneizado de coração Tecidos post-mortem Manuela Grazina, IB-FMUC
16 HISTOLOGIA DO MÚSCULO RRF s Fibras vermelhas rotas/ rasgadas Fibras vermelhas rotas Tricrómio Gomori Copyright Serviço de Neuropatologia dos Hopitais da Universidade de Coimbra, 2005 (Dra. Olinda Rebelo)
17 INVESTIGAÇÃO DAS DCRM Glicogénio LACTATO/PIRUVATO β-oh-b/ AcAc Glicose LIPÓLISE Alanina TGP Piruvato LDH Lactato Ácidos gordos citoplasma Piruvato PC Oxaloacetato Ciclo de Krebs Grazina M, Tese de Doutoramento, 2004 PDH Acetil coa NADH FADH βoxidação mitocôndria CRM ATP CETOGÉNESE βohb NAD AcAc NADH
18 Citoplasma G3P QH2 EIm Matriz MEM MIM e - Piruvato/ malato Glutamato/ malato Pir PDH NAD+ AcCoA NADH H + H + H + H + I rotenona NADH GLU TGO OAA G3PDH G3P FADH 2 II DHAP e - QH2 Q FADH 2 Malonato, 3-NP Succinato αkg ASP III C H 2 O IV CN -, azida O 2 ATP Pi ADP Grazina M, Tese de Doutoramento, 2004
19 INVESTIGAÇÃO DAS DCRM Consumo de Oxigénio NADH produzidos no citosol (glicólise) Transporte para a mitocôndria através de trocadores específicos ou shuttles (MMI é impermeável a NADH) 1) Sistema Malato-Aspartato 2) Sistema Glicerol-3-P Devlin TM ed., 1997 (Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations)
20 INVESTIGAÇÃO DAS DCRM Análise molecular do mtdna/ndna Isolamento de DNA total (linfócitos, fibroblastos, músculo, fígado, miocárdio...) PCR-Lx e F-PCR (detectar deleções/inserções) Sequenciação; PCR-RFLP (mutações pontuais e confirmação; localizar deleções) Manuela Grazina, IB-FMUC
21 INVESTIGAÇÃO DAS DCRM Mutações pontuais do mtdna Exemplos A3243G, RNAt Leu (UUR) (MELAS) T3271C, RNAt Leu (UUR) (MELAS) G3460A, ND1 (LHON) A8344G, RNAt Lys (MERRF) T8356C, RNAt Lys (MERRF, MELAS) T8993G, ATPase 6 (NARP) T11778C, ND1 (LHON) T14484C, ND6 (LHON) G15257C, Cyt b (LHON) Manuela Grazina, IB-FMUC
22 Mitocôndria Central energética da célula PDH Ciclo de Krebs Fosforilação oxidativa Síntese corpos cetónicos β-oxidação ácidos gordos
23 Mitocôndria outras funções
24 MRC DISEASES INVESTIGATION Laboratory of Biochemical Genetics Translational Approach present From the bench to the bedside TECHNIQUES MAGNETIC RESSONANCE IMAGING (MRI) MAGNETIC RESSONANCE SPECTROSCOPY (MRS) ASSESS CONTENT OF ATP, LACTATE, PYRUVATE MUSCLE HISTOLOGY (RRF s, ) PLASMA/LCR/URINE CONCENTRATION OF LACTATE/ PIRUVATO, KETONE BODIES, ALANINE CONSUMPTION OF O 2 SPECTROPHOTOMETRY (activity of MRC complexes) ANALYSIS OF mtdna (deletions/insertions, sequence variations, copy number) ANALYSIS OF ndna ANALYSIS OF RNA Coenzyme Q10 content, HPLC ATP content (plasma, cells, muscle), LUMINOMETRY TCA enzymes activity (SPECTROPHOTOMETRY ) Manuela Grazina, IB-FMUC
25 Para reflectir O exemplo a não seguir! Quais as abordagens terapêuticas possíveis nas DCRM?
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