UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA TESE DE DOUTORADO Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: Influências do Isolado, da Cinética e do Modo de Operação Andréa Farias de Almeida Natal/RN Março/2010

2 Andréa Farias de Almeida ESTRATÉGIAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE BIOINSETICIDA VIRAL: INFLUÊNCIAS DO ISOLADO, DA CINÉTICA E DO MODO DE OPERAÇÃO Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Engenharia Química, sob a orientação da Profª. Drª. Márcia Regina da Silva Pedrini e a co-orientação da Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo. Natal/RN Março/2010

3 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / PPGEQ / Biblioteca Setorial Professor Horácio Nicolas Solimo. Almeida, Andréa Farias de. Estratégias de produção in vitro de bioinseticida viral: Influências do isolado, da cinética e do modo de operação / Andréa Farias de Almeida. Natal, f. : il. Orientadora: Márcia Regina da Silva Pedrini. Co-orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo. Tese (Doutorado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. 1. Baculovírus AgMNPV Produção in vitro Tese. 2. Baculovírus recombinante Tese. 3. Bioinseticida viral - Produção Tese. 4. Pragas da soja - Controle biológico Tese. I. Pedrini, Márcia Regina da Silva. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Título. RN/UF/BSEQ CDU : (043.2)

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5 AGRADECIMENTOS Agradeço antes de tudo à minha mãe, presente em todos os momentos da minha vida, sempre. Às minhas orientadoras, Márcia Pedrini e Gorete, pela orientação e dedicação prestadas para o desenvolvimento deste trabalho. Aos amigos do Laboratório de Engenharia Bioquímica que de alguma forma ajudoume na realização do meu trabalho, em especial, agradeço a Graciana Clécia e Cinthia Meirelly pela ajuda nos experimentos. À pesquisadora Marlinda Lobo de Souza, do Laboratório de Genética Molecular de Micro-organismos e Invertebrados (LGM) - Núcleo de Controle Biológico da Embrapa/Cernagen, por ter cedido os clones selvagens do baculovírus AgMNPV: AgMNPV- MP2, AgMNPV-MP5 e AgMNPV-2D. Ao pesquisador Bergmann Ribeiro, da Universidade de Brasília (UNB), por ter cedido o baculovírus recombinante vagegt -lacz para realização deste trabalho. Aos professores Everaldo Silvino e Paulo Marinho que estiveram presentes à minha banca de qualificação contribuindo muito com seus conhecimentos. Finalmente, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da UFRN e a Capes pela bolsa concedida durante o doutorado.

6 ALMEIDA, Andréa Farias Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: Influências do Isolado, da Cinética e do Modo de Operação. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de concentração: Engenharia de Processos, Natal/RN, Brasil. Orientação: Profª. Drª. Márcia Regina da Silva Pedrini Co-orientação: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo RESUMO: A preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. Em particular, os vírus do tipo baculovírus são uma grande alternativa devido à especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propagação. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produção in vitro de baculovírus. Deste modo, poderá aumentar a oferta de vírus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estratégias de produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vagegt -LacZ, como influência do isolado, da cinética e do modo de operação, foram analisadas como alternativa para futura ampliação de escala na produção deste bioinseticida viral. A produção em batelada de três isolados selvagens do baculovírus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclusão a partir das infecções em células de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avaliação comparativa com recombinante vagegt -LacZ. A seleção identificou o isolado AgMNPV- MP5 como melhor produtor de corpos de oclusão de (5,30±0,85) x10 8 OB/mL em 8 dias de infecção. A produção in vitro do vagegt -LacZ foi foco principal deste trabalho, pois não há, na literatura, a produção deste recombinante em sistemas de cultivo em suspensão. Foi realizado estudo da multiplicidade de infecção para identificar a quantidade de inóculo viral para o cultivo. A partir daí, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9±1,42)x10 14 corpos de oclusão para um volume final de 10m³ de suspensão de células infectadas. O aumento da produção de corpos de oclusão obtidos a partir do vagegt -LacZ foi analisado utilizando a estratégia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infecção. Esta estratégia permitiu aumento de três vezes na produção de corpos de oclusão quando comparada à produção em cultivos em batelada (5,3x10 7 e 1,8x10 7 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculovírus recombinante vagegt -LacZ mostrou-se competitivo em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5. Palavras-chaves: baculovírus, baculovírus recombinante, produção in vitro, bateladaalimentada, AgMNPV

7 ABSTRACT Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vagegt -LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x10 8 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vagegt -LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x10 14 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m 3. A low MOI associated with a fed-batch process for vagegt -LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x10 7 and 5.3x10 7 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process. Key words: baculovirus, recombinant baculovirus, in vitro production, fed-batch, AgMNPV.

8 SUMÁRIO Lista de Figuras...i Lista de Tabelas...iii Lista de Variáveis...iv Nomenclatura...vii 1 Introdução Geral Revisão Bibliográfica Baculovírus Baculovírus AgMNPV Produção in vitro de baculovírus Passagem seriada Multiplicidade de infecção (MOI) Titulação viral (TCLD 50 ) Estratégias de produção in vitro de baculovírus Processo em batelada ou descontínuo Processo em batelada-alimentada ou descontínuo-alimentado Processo de produção em baixa MOI (Low MOI) Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV Introdução Metodologia experimental Células Vírus Cálculo do TCLD 50 dos isolados selvagens Produção in vitro dos isolados de baculovírus selvagem Cálculo dos parâmetros cinéticos para produção in vitro Resultados e discussão Conclusão Produção in vitro do baculovírus recombinante vagegt -LacZ Introdução Metodologia experimental Células...58

9 4.2.2 Vírus Produção do baculovírus vagegt -LacZ Cálculo TCLD 50 e MOI do vagegt -LacZ Passagem seriada do baculovírus vagegt -LacZ Obtenção dos parâmetros cinéticos na produção do baculovírus vagegt -LacZ Comparação da produção de corpos de oclusão dos baculovírus AgMNPV-MP5 e vagegt -LacZ Resultados e discussão Estudo da multiplicidade de infecção (MOI) Passagem seriada (escalonamento da produção in vitro) Comparação da produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 e o baculovírus recombinante vagegt -LacZ Conclusão Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante vagegt - LacZ Introdução Metodologia experimental Células Vírus Solução de alimentação Produção em batelada-alimentada Resultados e discussão Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes combinada com o meio de cultura SF900II Batelada-alimentada com a solução de alimentação: meio de cultura SF900II Conclusão Conclusão Geral Referências Anexos

10 Lista de Figuras i Figura 2.1. Estrutura da forma oclusa dos baculovírus...9 Figura 2.2 Ciclo da multiplicação in vitro de baculovírus (adaptado de ROHRMANN, 1999)...12 Figura 2.3. Estrutura do virion...14 Figura 2.4 Núcleo de células infectadas apresentando dois tipos de fenótipos: (A) Baculovírus muitos poliedros (MP); (B) Baculovírus com poucos poliedros (FP) (Fonte: PEDRINI, 2003) Figura 2.5 Gel de eletroforose que mostra a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa armigera SNPV durante passagem seriada em cultura de células. (Fonte: PEDRINI et al., 2005a)...18 Figura 2.6 Clivagem do anel tetrazólio do MTT...20 Figura 2.7 Curva característica de processo em batelada: X v concentração de células viáveis; [S] concentração de substrato...23 Figura 2.8 Curva característica da produção de OB em células de inseto: [OB] concentração de OB; τ i tempo inicial de pós-infecção e τ f tempo final de pós-infecção...28 Figura 2.9 Curva representativa de um processo em batelada-alimentada: X v concentração de células viáveis; [S] concentração de substrato...30 Figura 3.1 Infecções com os isolados selvagens de baculovírus AgMNPV...43 Figura 3.2 Produção volumétrica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV...47 Figura 3.3 Produção específica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV...49 Figura 3.4 Células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP5 em 4 d.p.i...50 Figura 4.1 Processo de produção em batelada (Fonte: RHODES, 1996)...57 Figura 4.2 Cinética de crescimento das células Sf21 infectadas com diferentes MOIs de BV do baculovírus recombinante vagegt -LacZ Figura 4.3 Produção de OB do baculovírus vagegt -LacZ...65 Figura 4.4 Perfis da produção volumétrica de OB do baculovírus vagegt -LacZ com diferentes MOIs...66 Figura 4.5 Passagem seriada do baculovírus vagegt -LacZ...68 Figura 4.6 Produção volumétrica de OB na passagem seriada do vagegt -LacZ...69

11 ii Figura 4.7 Esquema representativo da produção em escala do baculovírus recombinante vagegt -LacZ...70 Figura 4.8 Produção específica de OB na passagem seriada do vagegt -LacZ...73 Figura 4.9 Cinética de crescimento das células não infectadas e infectadas com os baculovírus selvagem e recombinante...74 Figura 4.10 Produção volumétrica de OB da infecção com os baculovírus selvagem e recombinante Figura 5.1 Cinética da infecção com vagegt -LacZ em batelada-alimentada (nutrientes)..87 Figura 5.2. Perfil da produção de OB da infecção com vagegt -LacZ sem alimentação...88 Figura 5.3 Perfil da produção de OB da infecção com vagegt -LacZ com alimentação (nutrientes)...89 Figura 5.4 Cinética da infecção com vagegt -LacZ em batelada-alimentada (nutrientes + meio de cultura)...91 Figura 5.5 Perfil da produção de OB com alimentação (nutrientes + meio de cultura)...92 Figura 5.6 Cinética da infecção com vagegt -LacZ em batelada-alimentada (meio de cultura)...94 Figura 5.7 Perfil de produção de OB com alimentação (meio de cultura)...95

12 Lista de Tabelas iii Tabela 2.1 Gênero da família Baculoviridae...10 Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos das infecções com os isolados selvagens...44 Tabela 3.2 Velocidade média de infecção...46 Tabela 4.1 Parâmetros cinéticos das infecções com diferentes MOIs...64 Tabela 4.2 Velocidades médias de produção de OB...66 Tabela 4.3 Quantidade de OB produzido em cada passagem do cultivo...71 Tabela 4.4 Resultado da ANOVA para produção de OB...75 Tabela 4.5 Ajustes aos pontos experimentais da curva de produção de OB...76

13 iv Lista de Variáveis a b C C CM CT CM OB C OB D Absorbância maxima (0% de resposta) Fator de inclinação Concentração celular (células/ml) Concentração máxima de células totais (células/ml) Concentração maxima de OBs (OB/mL) Concentração de OB (OB/mL) Fator de diluição D 0 Diluição na qual a resposta foi 50% dp dt ds dt dx dt dx NVNI dt dx VI dt dx VNI dt F Velocidade de variação de produto (mg/d) Velocidade de variação de substrato (mg/d) Velocidade de variação de crescimento (células/d) Velocidade de variação de crescimento das células não infectadas e não viáveis (células não infectadas não viáveis/d) Velocidade de variação de crescimento das células viáveis infectadas (células viáveis infectadas/d) Velocidade de variação de crescimento das células não infectadas (células não infectadas/d) Vazão volumétrica de alimentação (ml.d) K d Velocidade específica de morte celular (d -1 )

14 K dv Taxa de decomposição do vírus v M C Média da contagem de células M OB Média da contagem de OBs N P Número de etapas ou passagens Concentração de produto (mg/ml) PE OB Produção específica de OBs (OB/Célula) q s Velocidade específica de consumo de substrato (mg/ml.d) q p Velocidade específica de formação de produto (mg/ml.d) R 2 Coeficiente de correlação R i Velocidade de infecção (célula/ml.d) R p Velocidade de formação de produto (OB/mL.d) S Concentração final de substrato (mg/ml) S 0 Concentração inicial de substrato (mg/ml) t d Tempo de duplicação (d) V Vf Vi X Volume (ml) Volume final (ml ou m³) Volume inicial (ml ou m³) Concentração de células (células/ml) X NVNI Concentração de células não viáveis não infectadas (células/ml) X VI Concentração de células viáveis infectadas (células/ml) X VNI Concentração de células viáveis não infectadas (células/ml)

15 Y Absorbância vi Y 0 Absorbância mínima (100% de resposta) Y S Rendimento do crescimento de células por unidade de substrato α pob Taxa específica de produção de OB (OB/mL.d) α pv Taxa de produção de vírus por célula infectada Fator de diluição µ Velocidade específica de crescimento (d -1 ) µ ap Velocidade específica de crescimento aparente (d -1 ) µ x Velocidade específica de crescimento celular (d -1 ) µ(τ) Velocidade específica de crescimento no tempo de pós-infecção (d -1 ) τ τ d τ ei τ f τ i τ vrs τ vre Tempo de pós-infecção (d) Tempo final de infecção (d) Tempo inicial da replicação (d) Tempo final de intensa produção de OB (d) Tempo inicial de intensa produção de OB (d) Tempo em que o primeiro virion foi liberado (d) Tempo de quantidade máxima de virus extracelular (d)

16 Nomenclatura vii AcMNPV AgMNPV AgMNPV-2D AgMNPV-MP2 AgMNPV-MP5 ANOVA BEVS BM-5 BTI-Tn-5B1-4 BV CHO CPE DIP egt FP GmMNPV GV HaSNPV HzSNPV IPLB-LD-652Y IPLB-Sf21 MIP MNPV MOI MP MTT NPV OB ODV ORF Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone 2D Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone MP2 Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone MP5 Análise de variância Sistemas de vetores de expressão em baculovírus Linhagem de célula Bombyx mori Linhagem de célula da Trichoplusia ni Budded virus vírus extracelular Células do ovário do hamster chinês Ensaio do efeito citopático Partículas interferentes defectivas Gene ecdisteroide udp-glicosil transferase Mutantes few polyhedra Mutantes poucos poliedros Galleria mellonella multiple nucleopolyhedrovirus Granulovírus Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus Linhagem de célula Lymantria díspar Linhagem de célula Sf21 de Spodoptera frugiperda Manejo Integrado de Pragas multiple nucleopolyhedrovirus Multiplicity of infection - Multiplicidade de infecção Mutantes many polyhedra mutantes muitos poliedros 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difenil tetrazólio Nucleopoliedrovírus Occlusion body corpos de oclusão Occlusion derived virus - Vírus derivado do OB Open reading frame

17 pb Sf9 SFM SfMNPV SNPV TCLD 50 TOH TOI tpa UFP UFL-AG-286 vagegt -LacZ Pares de base Linhagem de célula de Spodoptera frugiperda Serum free medium - meio sem soro Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus Single nucleopolyhedrovirus Dose letal para infectar 50% da cultura de tecidos Time of harvest tempo de coleta após infecção Time of infection tempo de infecção Ativador plasminogênico tecidual Unidades formadoras de placas Linhagem de célula de Anticarsia gemmatalis Baculovírus recombinante de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus viii

18 Capítulo 1 Introdução Geral

19 2 Capítulo 1 Introdução Geral 1 Introdução Geral Os inseticidas químicos têm papel importante no desenvolvimento da produção agrícola, principalmente quando se trata do Manejo Integrado de Pragas (MIP). O MIP compõe-se de um conjunto de técnicas que busca o equilíbrio com a natureza, ao aperfeiçoar a atuação de inimigos naturais, com a utilização mínima de inseticidas químicos. No entanto, esses produtos, mesmo em quantidades mínimas, são tóxicos e apresentam ampla capacidade de atuação em relação a outros animais ecologicamente importantes e potencialmente úteis à agricultura. Além disso, sua utilização frequente favorece o aumento da resistência das pragas. Para países exportadores de produtos agrícolas, como o Brasil, existe ainda uma razão comercial suplementar para redução do uso de inseticidas químicos. Segundo Hamilton; Sunding; Zilberman (2003), as pesquisas mostram a utilização de inseticidas químicos como o problema mais sério em relação à qualidade dos alimentos consumidos. Os consumidores têm mostrado uma forte preferência por produtos que são cultivados em ambientes com menor exposição à inseticida químico (LISANSKI, 1994). Exemplo disto é o aumento do mercado de produtos orgânicos que estão livres de inseticidas químicos, ou, até mesmo, ausentes de defensivos agrícolas (LEVIDOW; BIJMAN, 2002). Diante disso, a preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos, em lavouras, por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. O controle de pragas por métodos naturais é um avanço na agricultura mundial. Segundo Federici (1999), agentes de biocontrole como fungos, bactérias e vírus são aplicados em mais de 1 milhão de hectares para controlar pragas em agricultura. Organismos que normalmente têm preferências específicas para determinadas pragas e podem não causar danos a outros animais benéficos e a pessoas, em particular, os vírus do tipo baculovírus são importantes agentes de controle biológico devido à especificidade oferecida aos seus organismos-alvo (hospedeiros) e a sua forma de propagação.

20 3 Capítulo 1 Introdução Geral A propagação de baculovírus é realizada através dos próprios hospedeiros (cultivo in vivo) ou utilizando as células embrionárias ou epiteliais isoladas destes hospedeiros (cultivo in vitro). No cultivo in vitro de baculovírus, destaca-se a importante contribuição das células animais, principalmente as células de inseto, na expressão de proteínas recombinantes através de sistemas de vetores de expressão em baculovírus, do inglês baculovirus expression vectors systems (BEVS) e na produção de bioinseticida viral. As células de inseto, devido às vantagens que as oferecem em relação às células de mamíferos, são facilmente cultivadas in vitro e sua manutenção é relativamente simples (KING; POSSEE, 1992). Deste modo, o conhecimento das metodologias de cultivo das células de inseto permitiu estudar o ciclo de replicação/propagação de vários baculovírus (KING; POSSEE, 1992) e com isso, a produção de baculovírus despertou interesse na agricultura como alternativa ao controle de pragas. Os baculovírus são patógenos de artrópodes, principalmente insetos da ordem Lepidóptera, caracterizam-se por possuir corpo de oclusão, do inglês occlusion body (OB), e um cristal proteico (poliedrina ou granulina) que envolve os virions (partículas virais) protegendo-os no ambiente. Eles têm sido utilizados com sucesso como agentes de controle de pragas agrícolas (GRANADOS; FEDERICI, 1986; MOSCARDI, 1999). Estes bioinseticidas são utilizados na agricultura em vários países. Por exemplo, na América do Norte dois produtos são utilizados no controle de pragas de florestas, o TM Biocontrol (Orgyia pseudotsugata nucleopolyhedrovirus) e o Gypchek (Lymantria dispar nucleopolyhedrovirus) (WOOD; GRANADOS, 1991). Nos Estados Unidos, Canadá e na Europa o baculovírus também é utilizado como agente contra pragas florestais do algodão, tomate, milho, repolho e outros vegetais. No Brasil, um bioinseticida denominado baculovírus anticarsia, cujo princípio ativo é o Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), já foi empregado para o controle da praga da soja, em uma área de tratamento biológico de 1,6 milhão de hectares, ou seja, mais de 10% da área cultivada de soja no país (MOSCARDI, 1999). Atualmente, essa área foi reduzida para 300 mil hectares devido à manifestação de outras pragas na lavoura de soja (MOSCARDI, comunicação pessoal). A produção do baculovírus anticarsia é atualmente realizada in vivo, onde sua multiplicação é na própria lavoura de soja com populações de lagartas A. gemmatalis

21 4 Capítulo 1 Introdução Geral infectadas. As lagartas infectadas coletadas no campo são conduzidas ao laboratório para purificação e formulação viral. Esse processo é ineficiente devido à necessidade da presença de lagartas na lavoura e tendo aplicação em poucos meses do ano, somente durante o cultivo de soja. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de alternativas de processos com base na produção in vitro (MOSCARDI; SOUZA, 2002; RODAS et al., 2005; CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006; REZENDE; CASTRO; SOUZA, 2008). Assim, a produção de baculovírus em larga escala, utilizando cultivo de células poderá aumentar a oferta de vírus na aplicação em lavouras, suprindo a necessidade deste bioinseticida no cultivo da soja, uma vez que as empresas produtoras ainda não atendem a demanda pelo produto (MOSCARDI; SOUZA, 2002). Apesar das vantagens ambientais conferidas ao tratamento com baculovírus, um fator importante que limita o interesse da indústria e a aceitação dos agricultores da sua utilização no controle insetos-praga, é a baixa velocidade de ação desses vírus sobre os hospedeiros naturais. A larva infectada pode levar de 5 a 8 dias para morrer e permitindo que o inseto, mesmo infectado, ainda cause danos à lavoura (MOSCARDI, 1999). Com os recursos da engenharia genética têm sido criados micro-organismos entomopatogênicos (patogênicos a insetos) geneticamente modificados, que apresentam características adicionais àquelas dos patógenos não modificados. Com baculovírus não é diferente, alguns baculovírus têm sido modificados geneticamente para ampliar a ação viral sobre seus hospedeiros (O REILLY; MILLER, 1991; PINEDO et al., 2003). Outra característica importante, sendo um parasita obrigatório, o baculovírus só se multiplica no interior do seu hospedeiro, logo, é considerado bastante seguro para ser modificado geneticamente, não apresentando riscos de invasão e multiplicação fora do ambiente de liberação (MOSCARDI; SOUZA, 2002). A produção de baculovírus em cultivo de células (in vitro) visando à ampliação de escala é desejável, pois permitiria sua multiplicação em menor espaço laboratorial e utilizando número reduzido de mão de obra, ao contrário da produção in vivo em laboratório (BLACK et al, 1997, WEISS et al., 1994, MOSCARDI, 1999, MOSCARDI; SOUZA, 2002). E ainda, resultaria em melhor planejamento e qualidade do material obtido quando comparado à produção em campo, pois o material resultante da coleta em campo é de qualidade inferior

22 5 Capítulo 1 Introdução Geral devido às impurezas presentes nas amostras. Contudo, a produção de baculovírus em cultivo de células apresenta instabilidade em relação à atividade viral (formação de mutantes). A instabilidade da virulência é evidenciada pelo efeito passagem (diminuição da produção dos corpos de oclusão durante o cultivo seriado de baculovírus), que pode ser minimizada pela redução de passagens, nos cultivos em batelada, utilizando biorreatores de volumes maiores para produzir a mesma quantidade de corpos de oclusão (CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007). Deste modo, adaptar sistemas de produção que são utilizados há muito tempo com sucesso em processos com células microbianas (bactérias, fungos ou leveduras), tais como processo descontínuo alimentado, para a produção in vitro de bioinseticidas virais é importante para o aumento da produção deste bioproduto. Vale salientar que o estudo cinético do processo descontínuo também é necessário, pois é de extremo interesse para o conhecimento dos parâmetros cinéticos do crescimento das células de inseto e do processo de infecção utilizados nesta produção. Neste contexto, objetiva-se aplicar estratégias de cultivo para produção in vitro do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) seleção de isolados, estudo da multiplicidade de infecção, modo de operação de cultivo - visando a obtenção de bioinseticida viral para o controle da praga da soja A. gemmatalis. Será avaliada a produção de corpos de oclusão utilizando como inóculo o vírus extracelular dos isolados selvagens AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 para selecionar o isolado que demonstrar melhor desempenho em relação a sua produtividade, e comparar esta produtividade com o baculovírus recombinante vagegt -LacZ. O baculovirus recombinante vagegt -LacZ não possui dados referentes ao seu cultivo em suspensão, portanto, será analisada a produção deste recombinante utilizando a linhagem Sf21, bem como, a avaliação cinética da produção deste bioinseticida viral. A análise cinética da produção do baculovírus recombinante vagegt -lacz e dos clones do baculovírus selvagem AgMNPV foi realizada em todos os resultados com base na produção de corpos de oclusão (OB). Logo, as variáveis analisadas para o conhecimento da cinética de produção do bioinseticida foram as velocidades de crescimento das células Sf21 e as de produção de OB, relevantes neste tipo de cultivo.

23 6 Capítulo 1 Introdução Geral Esta tese foi dividida em seis capítulos, onde este primeiro mostrou uma breve introdução geral sobre o tema abordado. O capítulo dois aborda a revisão bibliográfica a cerca da produção de bioinseticidas virais a partir de células de inseto considerando as estratégias de produção que são utilizadas normalmente em sistemas microbianos. O capítulo três descreve o primeiro passo deste trabalho, o qual foi selecionar os isolados virais disponíveis para a produção do bioinseticida. Os isolados genéticos do baculovírus AgMNPV representados por três diferentes clones (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) foram cultivados em shaker e observados aqueles com maior capacidade de produção dos corpos de oclusão. O capítulo quatro refere-se à produção in vitro do baculovírus recombinante vagegt -LacZ observando seu desempenho em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV e o capítulo cinco aborda o aumento da produção in vitro do baculovírus recombinante vagegt -LacZ através da estratégia de produção em batelada-alimentada associada a baixa multiplicidade de infecção. O Capítulo 6 apresenta as conclusões finais e, por fim, as referências que foram utilizadas para embasar a revisão bibliográfica e os resultados obtidos durante este estudo.

24 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica

25 8 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica 2 Revisão Bibliográfica 2.1 Baculovírus Os baculovírus são vírus isolados de invertebrados, principalmente de lepidópteros, que possuem alta especificidade e não oferecem riscos ao homem e ao ambiente, pois não se replicam em vertebrados e em plantas, características que os tornam excelentes agentes de biocontrole de pragas agrícolas. Os baculovírus são vírus da família Baculoviridae, que contêm DNA circular de fita dupla como material genético, variando de tamanho entre 80 e 180 kbases (CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006), são caracterizados pelos nucleocapsídeos em forma de bastão, envelopados, apresentando um diâmetro entre 40-50nm e comprimento entre nm (O REILLY; MILLER; LUCKOW, 1994). Os nucleocapsídeos encontram-se no interior de uma matriz proteica, formando os chamados corpos de oclusão (OB occlusion bodies). Os corpos de oclusão possuem cerca de 0,15 a 15 µm de diâmetro (BILIMORIA, 1991) que permitem a sobrevivência das partículas infectivas fora de seu hospedeiro natural (KING; POSSEE, 1992). Existem dois gêneros distintos na família dos baculovírus, os Nucleopoliedrovirus (NPVs) e os Granulovirus (GVs). Estes gêneros são diferenciados pelo tamanho das partículas virais e pela natureza da proteína do corpo de oclusão (OB) (KING; POSSEE, 1992). Os NPVs são classificados em dois subgrupos, grupo I e grupo II, baseados em dados filogenéticos das sequências dos aminoácidos da poliedrina e da DNA polimerase (ZANOTTO; KESSING; MARUNIAK, 1993; BULACH et al., 1997), apresentam forma poliédrica que é constituída pela poliedrina, proteína com cerca de 30kDa de massa molecular (SUMMERS et al., 1980), correspondendo cerca de 95% do seu conteúdo proteico (MARUNIAK, 1986). Os NPVs, ainda, podem ser do tipo múltiplo (MNPV) ou simples (SNPV), de acordo com o número de capsídeos existentes no virion. Os GVs são

26 9 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica caracterizados pela forma ovicilíndrica do corpo de oclusão, denominada grânulo, com dimensão entre 0,3 e 0,5µm (CROOK, 1991), que geralmente possui uma única partícula viral contendo somente um nucleocapsídeo, ocluso pela matriz proteica constituída pela proteína granulina, conforme observa-se na Figura 2.1. Figura 2.1. Estrutura da forma oclusa dos baculovírus A nomenclatura dos baculovírus é baseada no nome do hospedeiro do qual foi isolado. Por exemplo, o baculovírus isolado da lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda, recebe o nome de Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), isolado por Smith em 1978; o baculovírus isolado da lagarta da alfafa, Autographa californica, é chamado de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), isolado por Vail em 1971; outro exemplo clássico é o baculovírus isolado da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, denominado Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), isolado por Allen e Knell em Recentemente, foi proposta a revisão substancial da taxonomia e classificação da família Baculoviridae a partir de análises da sequência genômica de alguns baculovírus. Comparações de 29 genomas de baculovírus indicaram que a filogenia dos baculovírus seguia a classificação dos hospedeiros mais próximos do que as características morfológicas que foram anteriormente utilizadas para classificação dos vírus dessa família. De acordo com a

27 10 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica nova proposta de classificação incluem-se mais quatro gêneros (JEHLE et al., 2006), conforme mostra a Tabela 2.1. Tabela 2.1 Gênero da família Baculoviridae Gênero Alfabaculovírus Betabaculovírus Gamabaculovírus Deltabaculovírus Membros NPVs de Lepidópteros GVs de Lepidópteros NPVs de Hymenópteros NPVs de Dípteros Diversos baculovírus já foram estudados, mas o baculovírus mais explorado em se tratando da sua biologia molecular é o Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), seu modelo de replicação é caracterizado e aceito como protótipo para os demais baculovírus, o que permitiu desenvolver baculovírus recombinantes para o controle de pragas e para serem utilizados como vetor de expressão de genes heterólogos. Além disso, o AcMNPV foi o primeiro baculovírus a ser totalmente sequenciado. Tendo em vista que a eficácia e segurança na utilização de baculovírus como vetores de expressão ou como bioinseticidas dependem do profundo conhecimento da biologia desses vírus e suas interações com seus hospedeiros naturais. Com o desenvolvimento de baculovírus geneticamente modificados para serem utilizados como bioinseticidas, questões de biossegurança e análise de riscos devem ser consideradas Baculovírus AgMNPV O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é um vírus de DNA circular de fita dupla e genoma com pb, patogênico em lepidópteros e pertecente ao gênero alfabaculovírus (JOHNSON; MARUNIAK, 1989; OLIVEIRA et al., 2006; JEHLE et al., 2006). O AgMNPV foi isolado de larvas de A. gemmatalis coletadas em Campinas/SP (ALLEN; KNELL, 1977), a partir daí, vários isolados foram identificados e

28 11 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica caracterizados, dentre eles destaca-se o isolado de AgMNPV (LD-79) obtido, em 1979, a partir larvas A. gemmatalis infectadas no campo de cultivo de soja perto de Londrina/PR. Este isolado é rotineiramente produzido in vivo para uso como um bioinseticida no Brasil (MOSCARDI, 1989) e aplicado nas culturas de soja para o controle biológico do seu hospedeiro natural A. gemmatalis. A utilização do baculovírus AgMNPV no Brasil representa o maior programa mundial de aplicação de bioinseticida viral como controle biológico de pragas. Ele vinha sendo aplicado anualmente para o controle da lagarta Anticarsia gemmatalis (principal desfolheadora da lavoura de soja) em mais de um milhão de hectares de soja (MOSCARDI, 1999) o que proporcionava anualmente ao país, uma economia de 13 milhões/reais ao ano, uma vez que eliminava a aplicação de cerca de 1,5 milhão de litros de inseticidas nas lavouras brasileiras (MOSCARDI; SOUZA, 2002). Recentemente, o seu uso vem diminuindo, devido ao aparecimento de outras pragas na cultura da soja e da estratégia agressiva de vendas das empresas de inseticidas químicos (MOSCARDI, comunicação pessoal). Entretato, este ainda é o maior exemplo mundial de utilização de um inseticida viral, além disso, representa um modelo importante de substituição de agrotóxicos, que são altamente prejudiciais ao homem e ao meio ambiente, por um controle ambientalmente correto. Geralmente, uma aplicação bem sucedida de baculovírus é suficiente para manter o controle durante todo o ciclo da cultura, porque há uma reposição e redistribuição do vírus, devido aos focos deixados pelas lagartas mortas e pela grande quantidade de inóculo lançados na lavoura (SECCHI, 2002). Embora o AgMNPV seja utilizado frequentemente no controle da praga, o vírus demora em média 7 a 9 dias para matar a praga nas condições de campo. Consequentemente, a engenharia genética, com o desenvolvimento de baculovírus recombinante, deverá melhorar as propriedades inseticidas do vírus, inclusive a redução do tempo para matar o hospedeiro devido ao aumento da virulência e, assim, poderá no futuro aumentar sua utilização com menos dependência dos agrotóxicos.

29 12 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica 2.2 Produção in vitro de baculovírus Para multiplicação de baculovírus em cultura de células, o ciclo de infecção ocorre em três fases básicas: inicial (early), tardia (late), e muito tardia (very late). Essas três fases correspondem biologicamente a: (i) reprogramação da célula para replicação viral, (ii) produção de BV, e (iii) produção de OB (O REILLY, MILLER; LUCKOW, 1994). A Figura 2.2 mostra o ciclo de infecção in vitro dos baculovírus. A primeira indicação de infecção por vírus é o inchaço do núcleo celular e a formação de um material granular no centro do núcleo que podem ser observados na fase inicial do processo (LUA; REID, 2000). As alterações morfológicas (núcleo celular hipertrofiado) que podem ser visualizadas ao microscópico ótico recebem o nome de efeito citopático. A próxima fase de infecção (tardia) é caracterizada pela formação de uma estrutura densa, chamada estroma virogênico, onde ocorre uma intensa produção de vírus extracelular (BV) e replicação do DNA viral. Na terceira fase (muito tardia), há a síntese de novo da membrana que envolve os nucleocapsídeos para formação do envelope viral e a posterior oclusão dos virions na matriz proteica formando os corpos de oclusão (OB). Figura 2.2 Ciclo da multiplicação in vitro de baculovírus (adaptado de ROHRMANN, 1999)

30 13 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica A replicação de baculovírus em células de inseto é caracterizada pela produção de dois fenótipos diferentes que são produzidos em tempos distintos no ciclo de infecção. O vírus extracelular ou budded virus (BV) é produzido no início do ciclo de infecção (fase tardia late) e responsável pela infecção de células a células no hospedeiro (infecção sistêmica). O segundo fenótipo é caracterizado pelo empacotamento do virion (partícula viral) em uma matriz proteica (fase muito tardia very late), este fenótipo é denominado de corpo de oclusão ou occlusion body (OB) (BLISSARD, 1996). O OB é menos infectivo para cultura de células de inseto devido ao empacotamento proteico, mas, é responsável pela infecção de inseto para inseto (infecção horizontal) através da ingestão do OB presente na dieta alimentar do hospedeiro. A partícula viral chamada de vírus derivado do corpo de oclusão ou occlusion derived virion (ODV) são os virions contidos no interior do OB. O ODV pode conter um ou vários nucleocapsídeos. Os GVs, por exemplo, contêm, geralmente, um único nucleocapsídeo por envelope e, um único ODV por OB. Em contraste, cada OB de um NPV contém vários ODVs (BLISSARD, 1996). Portanto, quando se libera ODV de um OB de NPV tem-se mais possibilidade de infectar as células devido ao número maior de nucleocapsídeos em seu interior. Os virions envelopados normalmente entram na célula por fusão direta pela membrana da superfície celular ou por endocitose (processo natural de absorção de material pela célula). O ODV entra nas células por fusão do envelope do virion com a membrana plasmática da célula (BLISSARD, 1996). A produção in vitro de baculovírus em cultivo de células é realizada normalmente com o vírus extracelular (BV) da hemolinfa de insetos infectados ou do sobrenadante (contendo BVs) das células previamente infectadas (KING; POSSEE, 1992). Porém, é possível utilizar o ODV como fonte viral para inocular a cultura de células. Este ODV é liberado dos corpos de oclusão (OB) a partir de soluções alcalinas (LYNN, 1994). Estas formas virais podem ser observadas mais claramente na Figura 2.3.

31 14 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Figura 2.3. Estrutura do virion (Fonte: A produção de baculovírus em cultivo de células é relativamente fácil quando comparada com o processo de produção in vivo e oferece algumas vantagens: podem ser selecionadas linhagens específicas, preservadas e armazenadas em meios criogênicos para sua utilização no futuro e podem ser testadas para assegurar que estejam livres de contaminantes que certamente afetariam a qualidade do produto final (KING; POSSEE, 1992). No entanto, o processo de produção in vitro de baculovírus apresenta algumas limitações. Uma das limitações é a diminuição da eficiência de infecção (virulência) do vírus pela rápida acumulação de mutantes FP (few polyhedra) ou de partículas interferentes defectivas (DIPs) resultantes de passagens sucessivas do vírus em cultivo de células. Diversos estudos têm abordado a produção in vitro de baculovírus para produção de proteínas recombinantes e de bioinseticida viral, dentre eles destacam-se: Chan; Greenfield; Reid (1998) utilizando células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), como sistema de expressão, para produção de β-galactosidase; estudando cultivos do baculovírus SfMNPV, Pedrini; Wolff; Reid, (2004) analisaram a estabilidade do SfMNPV durante a passagem seriada também

32 15 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica utilizando células Sf9 caracterizando o efeito passagem; Almeida, (2005) utilizando duas linhagens de S. frugiperda, Sf21 e Sf9, verificou a capacidade de produção de corpos de oclusão do baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) em cultivos em shaker; Castro et al. (2006) verificaram a infectividade do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em diferentes linhagens de células: Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4, Anticarsia gemmatalis UFL-AG-286, S. frugiperda IPLB-SF- 21AE e Sf9, L. dispar IPLB-LD- 652Y e por fim, a B. mori BM-5 com a finalidade de quantificar a produção viral, observar a morfologia e a síntese de proteínas; Pedrini et al. (2006) utilizando células de Helicoverpa zea para produção e estabilidade através da passagem seriada dos baculovírus Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HaSNPV) e Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus (HzSNPV); Gioria; Jäger; Claus. (2006) utilizando as células Anticarsia gemmatalis UFL-AG-286 verificaram a produção dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) produzidos em suspensão; Rezende; Castro; Souza. (2008) também utilizando o baculovírus AgMNPV verificou a produção de corpos de oclusão e estabilidade deste virus cultivado sucessivas vezes em células Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4. Estes estudos evidenciam o grande interesse no cultivo de baculovírus para a produção de proteínas ou bioinseticidas virais Passagem seriada A passagem seriada consiste em uma série consecutiva de infecções virais em células hospedeiras. Nestas infecções virais, utiliza-se o inóculo (normalmente, vírus extracelular) obtido da infecção anterior e, assim, sucessivamente. Com isto, pode ser analisada a estabilidade do vírus durante seu cultivo em células e a produção dos corpos de oclusão durante o processo de aumento de escala. A passagem seriada de baculovírus em cultura de células de inseto pode observar uma variedade de mutações (CHAKRABORTY; REID, 1999). As mutações mais freqüentes são: mutantes FP (Few Polyhedra) e partículas interferentes defectivas (DIPs). A geração destes

33 16 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica mutantes durante as passagens do cultivo de células pode comprometer o sistema in vitro para produção de baculovírus em larga escala. Os mutantes FPs são caracterizados por um decréscimo na formação de OB e um aumento significativo na formação de BV. Os OBs produzidos praticamente não contêm partículas virais infecciosas, portanto, possuindo baixa ou nenhuma infectividade aos seus hospedeiros. A Figura 2.4 mostra o núcleo de células infectadas que apresentam os dois tipos de variantes produzidos in vitro: os baculovírus muitos poliedros (MP) e os baculovirus com poucos poliedros (FP) que podem ser observados durante a passagem seriada de baculovírus em cultivo de células hospedeiras. Figura 2.4 Núcleo de células infectadas apresentando dois tipos de fenótipos: (A) Baculovírus muitos poliedros (MP); (B) Baculovírus com poucos poliedros (FP) (Fonte: PEDRINI, 2003). Diversos mutantes FP de Autographa californica MNPV (AcMNPV) e Galleria mellonella MNPV (GmMNPV) têm sido caracterizados. A geração de mutantes FP destes vírus estão correlacionados com a ausência da proteína 25kDa e com a presença de grandes inserções e deleções (0,4 a 2,8 kpb) dentro de uma região específica dos genomas virais do

34 17 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica AcMNPV e GmMNPV. Esta região contém o gene 25K FP, que é essencial para formação da matriz proteica e do corpo de oclusão (OB) (revisado por BISCHOFF; SLAVICEK, 1997). Os mutantes de Lymantria dispar MNPV (LdMNPV) com fenótipos alterados na formação do poliedro (PF) são gerados com alta freqüência durante a passagem seriada em cultivo de células. A maioria destes mutantes exibe todas as características dos mutantes FP. As mutações encontradas nos isolados de LdMNPV foram mapeados para o gene 25 K FP e após analisados não continham grandes inserções ou deleções como são normalmente encontrados nos mutantes FP dos baculovírus AcMNPV e GmMNPV (BISCHOFF; SLAVICEK, 1997). A rápida geração de fenótipo (FP) também foi observada na produção in vitro de baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), detectada após somente duas passagens do isolado SfMNPV em cultura de células Sf9 (PEDRINI; WOLFF; REID, 2004). Em cultivos realizados por Almeida (2005) utilizando também um isolado de SfMNPV cultivado em células Sf9, observou-se uma maior estabilidade deste isolado, visto que a diminuição da sua produtividade (indicativo de formação de mutantes) foi identificada após a quarta passagem em células. Outro tipo frequente de alteração genética é a produção de DIPs, estas partículas contêm apenas parte do genoma viral, replicam mais rapidamente que o vírus padrão. A maioria das partículas defectivas está presente em altas passagens seriadas do vírus e é produzida mais rapidamente quando se utiliza uma multiplicidade de infecção (MOI) muita alta (SOUZA et al., 2003). A Figura 2.5 mostra um gel de eletroforese que apresenta a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HaSNPV), neste caso, percebe-se que os vírus provenientes de corpos de oclusão (ODV) e de baixa passagem possuem DNA com aproximadamente kb (de acordo com a literatura para o baculovírus HaSNPV). As passagens mais altas apresentam o aumento de partículas com um menor tamanho (92,3 kb) e diminuição de partículas com tamanho original, indicando a produção de partículas defectivas (DIPs) (PEDRINI et al, 2005a).

35 18 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Figura 2.5 Gel de eletroforose que mostra a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa armigera SNPV durante passagem seriada em cultura de células. (Fonte: PEDRINI et al., 2005a) Multiplicidade de infecção (MOI) A infectividade de um vírus depende de vários fatores, entre eles, da proporção de partículas virais completas, ou infecciosas; da suscetibilidade da célula hospedeira (ex. quantidade de receptor) e da chance desta partícula encontrar o receptor e penetrar na célula. Quando células suscetíveis são misturadas com uma suspensão de vírus, estas podem receber um, dois, três, dez partículas virais ou nenhuma. Isto depende da proporção entre a quantidade de vírus infecciosa presente no inóculo (título viral) e a quantidade de células utilizada no momento da infecção (TOI). Esta relação é denominada de multiplicidade de infecção ou MOI.

36 19 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Titulação viral (TCLD 50 ) O título do estoque viral é a concentração de partículas virais infecciosas. O título não é equivalente à concentração total de partículas virais porque nem todas as partículas virais são infecciosas. Existe uma ampla variabilidade de ensaios que podem ser utilizados para detectar e quantificar o título viral. Cada método tem suas vantagens e desvantagens, os dois principais métodos utilizados para quantificar as partículas virais infecciosas são: o ensaio de placas (plaque assay) e o ensaio do efeito citopático (CPE). Ambos os tipos de ensaios têm sido utilizados frequentemente para quantificar o título viral (DARLING et al., 1998). No ensaio em placas (plaque assay), o vírus entra nas células após um período de 1 hora de adsorção, o inóculo viral é removido e uma camada de agarose é adicionada na placa. A camada restringe os focos de infecção às células adjacentes, por que cada placa possui uma única partícula infecciosa, a concentração de vírus infeccioso pode ser determinada pela contagem das placas formadas pelas diferentes diluições virais. O título é expresso em unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL) e a MOI em UFP (unidades formadoras de placas) adicionada por célula (DEE; SHULLER, 1997). Outro método comumente utilizado para titulação viral é o ensaio da diluição do ponto final (endpoint dilution assay). Este método produz alta variabilidade na qual é inerente às propriedades biológicas, mas é também um método de avaliação qualitativa utilizado para identificar as células infectadas, especialmente quando possuem proteínas, tais como a β- galactosidase (MENA; RAMÍREZ; PALOMARES, 2003). No ensaio de diluição de ponto-final, as diferentes diluições virais são inoculadas em múltiplas culturas em monocamadas. O título obtido a partir deste método é conhecido como a dose letal para infectar 50% da cultura de tecidos (TCLD 50 ) que pode ser convertida em UFP pela seguinte relação estatística UFP/mL = 0,69 x TCLD 50 /ml (DEE; SHULLER, 1997). O método da viabilidade celular consiste na clivagem do anel tetrazólio do reagente MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difenil tetrazólio) através da enzima redutase mitocondrial em células viáveis. O produto resultante desta quebra é o sal de formazan que