OBTENÇÃO DE ANTICORPO POLICLONAL ANTI-GP43 DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS EM COELHO

Transcrição

1 OBTENÇÃO DE ANTICORPO POLICLONAL ANTI-GP43 DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS EM COELHO Atilio Sersun Calefi (PIBIC/UEL), Melina Bertola Galvão (Mestranda), Isabele Kazahaya (Mestranda), Donizeti Rodrigues Belitardo (Doutorando), Aline Myuki Omori, Marilda Carlos Vidotto, Mario Augusto Ono (Orientador), Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Patologia Geral/Londrina, PR. Ciências Biológicas; Microbiologia. Palavras-chave: Paracoccidioidomicose, Paracoccidioides brasiliensis, blastomicose sul-americana. Resumo: A Paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, é uma micose sistêmica de natureza granulomatosa crônica que acomete principalmente trabalhadores rurais. A doença é limitada aos países da América Latina, e o Brasil apresenta o maior número de casos. Ensaios sorológicos são os principais métodos auxiliares no diagnóstico da PCM. A gp43 é o principal antígeno utilizado no imunodiagnóstico da PCM, porém podem ocorrer reações cruzadas devido à porção carboidrato. Uma das alternativas seria a utilização de gp43 recombinante produzida em Escherichia coli, sem a porção carboidrato. Este estudo teve como objetivo produzir anticorpo policlonal de coelho para a gp43 recombinante. Introdução O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, uma micose humana sistêmica descrita pela primeira vez no Brasil há um século. É uma doença limitada aos países da América Latina, e no Brasil é a oitava causa de óbito entre as doenças infecciosas e parasitárias, sendo que a maioria dos casos tem sido reportada nas regiões Sudeste, Sul e Centro-Oeste (BRUMMER et al., 1993). Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico, que à 25ºC, apresentam-se na forma de micélio com colônias brancas, aderentes ao meio, com hifas finas, septadas, com esporos terminais ou intercalares. À temperatura de 37ºC apresenta-se na forma de levedura, com células globosas com múltiplos brotamentos (BRUMMER et al., 1993). Acredita-se que a infecção ocorra por inalação de propágulos de fungo provenientes do solo, seu provável hábitat. Ao atingirem o pulmão, os

2 propágulos convertem-se para a forma de levedura, provocando lesões granulomatosas. A partir do pulmão pode ocorrer disseminação para qualquer outro órgão e tecido como fígado, baço, linfonodos, pele, sistema nervoso central, mucosas, testículos, sistema esqueléticos e adrenais (LACAZ, 1982;SCULLY & ALMEIDA, 1992; BRUMMER et al., 1993). A PCM pode ser classificada como PCM Infecção e PCM Doença. A PCM-Infecção acomete indivíduos de ambos os sexos, aparentemente sadios, que residem ou residiram em áreas endêmicas. É caracterizada pela ausência de sinais clínicos e reação intradérmica positiva a paracoccidioidina. (FRANCO, 1987). A PCM-doença afeta principalmente trabalhadores rurais do sexo masculino, com idade média de 40 anos. A forma crônica ocorre em mais de 90% dos pacientes, e é freqüente em indivíduos adultos do sexo masculino. A doença progride lentamente e o período de incubação pode durar meses ou anos. A forma aguda ou juvenil é caracterizada por um período curto de incubação e por envolvimento do sistema reiculoendotelial (LONDERO; MELO, 1983). Devido a composição estrutural antigênica complexa do P. brasiliensis, tem sido empregado para o imunodiagnóstico da PCM a detecção de uma glicoproteína de 43 kda (gp43). A gp43 é o principal antígeno utilizado no imunodiagnóstico e em estudos soroepidemiológicos de PCM (MENDES-GIANNINI et al.,1997, ONO et al., 2001). Embora a gp43 seja o antígeno específico para o PCM, em testes imunológicos que preservam sua conformação nativa, unidades galactofuranose terminais na cadeia oligossacarídica podem ser responsáveis pela reatividade cruzada em testes que utilizam antígeno imobilizado, tal como o ELISA (PUCCIA E TRAVASSOS, 1991). Este estudo teve como objetivo produzir anticorpo policlonal em coelho para a gp43 recombinante produzida em E. coli. Materiais e métodos Isolado de P. brasiliensis Manutenção do isolado B-339 em ágar Sabouraud a 25º C. Obtenção do exoantígeno de P. brasiliensis O isolado de P. brasiliensis B-339 foi cultivado em ágar Sabouraud à 35ºC, e então transferido para Erlenmeyer com meio de Negroni, e mantido sob agitação a 50 rpm, a 35ºC. Após 3 dias, o crescimento foi transferido para frasco de Fernbach, contendo o mesmo meio e mantido em agitador orbital, a 35ºC, por 7 dias. A cultura foi interrompida com timerosal (0,05%), filtrada, e o filtrado foi concentrado e liofilizado. Obtenção de gp43

3 A gp43 foi purificada a partir da aplicação de exoantígeno em coluna de afinidade acoplada com anticorpos monoclonais anti-gp43. Obtenção de gp43 recombinante Com a utilização de E. coli BL21 transformada com plasmídio pet30.gp43 foi feita indução para a expressão da proteína de interesse. A purificação da proteína foi realizada em coluna de afinidade com posterior determinação de pureza e concentração de proteína. Obtenção de anticorpo policlonal anti-gp43 recombinante O anticorpo policlonal foi produzido em coelho mantido em biotério com fornecimento de água e ração comercial ad libitum. Foram inoculadas quatro doses de 100 µg gp43 recombinante, por vias subcutânea, com espaço de 7 dias entre as doses (1 a. dose com adjuvante completo de Freud e adjuvante incompleto de Freud nas demais doses). Foram coletadas amostras de sangue semanalmente para obtenção do soro, que foi armazenado a 20ºC até a utilização no ELISA indireto. ELISA indireto com antígeno gp43 recombinante e nativa Microplacas de poliestireno, de fundo chato com 96 cavidades, foram sensibilizadas com antígeno gp43 recombinante ou nativa. Cada cavidade foi incubada com soro de coelho (concentração 1:100) imunizado com gp43 recombinante. Após foi incubado com conjugado IgG Anti-IgG de coelhoperoxidase, seguido de revelação com solução de substrato/cromógeno. A reação foi bloqueada com H2SO4 4N e a absorbância a 450 foi determinada em leitora de ELISA. ELISA indireto com antígeno gp43 recombinante e nativa desnaturadas As amostras de gp43 recombinante e nativa foram aquecidas à 100ºC por 5 minutos para desnaturação das proteínas. Microplacas de poliestireno, de fundo chato contendo 96 cavidades, foram sensibilizadas com antígeno gp43 recombinante ou nativa desnaturadas. O ensaio de ELISA foi realizado conforme descrito anteriormente. Resultados e Discussão A resposta humoral do coelho imunizado com a gp43 recombinante foi avaliada por meio de ensaio de ELISA indireto com a gp43 nas formas

4 nativa e recombinante. O pico da reposta ocorreu após a quarta dose sendo observado maior reatividade com a gp43 recombinante (Figura 1). A diferença na reatividade possivelmente se deve ao fato de que a gp43 recombinante, pelo fato de estar desnaturada, apresenta apenas os epítopos lineares. Desta forma o anticorpo policlonal anti-gp43 recombinante reconheceria apenas esse tipo de epítopo, reduzindo portanto a reatividade com a gp43 nativa, que apresenta predominantemente os epítopos conformacionais. Para avaliar essa hipótese, foi realizado um ELISA com gp43 nas formas nativa e desnaturada. A maior reatividade do anticorpo anti-gp43 recombinante com a gp43 desnaturada sugere que a diferença na reatividade se deve aos epítopos lineares. Figura 1. Avaliação da resposta imune humoral de coelho imunizado com gp43 recombinante por meio de ensaio de ELISA indireto com a gp43 nas formas nativa e recombinante. Conclusões O anticorpo policlonal de coelho anti-gp43 recombinante apresentou maior reatividade com a gp43 recombinante quando comparada com a gp43 nativa. A diferença observada possivelmente se deve ao fato da gp43 recombinante estar na forma desnaturada. Mais estudo são necessários para melhor caracterizar o anticorpo anti-gp43 recombinante e seu possível uso no imunodiagnóstico da PCM. Referências Brummer, E.; Castaneda, E.; Restrepo, A. Paracoccidioidomycosis: An update. Clinical Microbiology, v.6, n.2, p , 1993.

5 Franco, M. Paracoccidioidomycosis: a recently proposed classification on its clinical forms. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.20, p , Lacaz, C.S.; Del Negro, C.S.; Fialho. Aspectos clínicos gerais. Formas polares de paracoccidioidomicose. In: A.M. Paracoccidioidomycosis. Ed.: Sarvier EDUSP, São Paulo, Londero, A.T.; Mello, I.S. Paracoccidioidomycosis in childhood. A critical review. Mycopathology, v.82, p.49-55, Mendes-GianinniI, M.J.S.; Bueno, J.P.; Shikanai-Yasuda, M.A.; Stolf, A.M.; Masuda, A.; Neto, V.A.; Ferreira, A.W. Antibody response to 43KDa glycoprotein of Paracoccidioides brasiliensis as a marker for the evaluation of patients under treatment. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, Mclean, v.43, n.2, p , Scully, C.; Almeida, O.P. Orofacial manifestations of the systemic mycoses. J. Oral Pathol. Med., 21: , Travassos, L.R.; Puccia, R.; Cisalpino, P.; Taborda, C.; Rodrigues, E.G.; Rodrigues, M.; Silveira, J.F.; Almeida, I.C. Biochemistry and molecular biology of the mais diagnostic antigen of Paracoccidioides brasiliensis. Arch. Med. Res., 26: , 1995.