ANEMIA DAS GALINHAS: UMA DOENÇA AINDA POUCO ESTUDADA

Transcrição

1 ANEMIA DAS GALINHAS: UMA DOENÇA AINDA POUCO ESTUDADA Cláudio Wageck Canal Doutor em Ciências Biológicas (Bioquímica), no Dep. Biotecnologia da UFRGS e Instituto de Virologia Veterinária da Universidade de Berna, Suíça. Prof. Adjunto no Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA) da Fac. Veterinária da UFRGS. Especialista no desenvolvimento de métodos de biologia molecular e imunologia para o diagnóstico de patógenos. e mail: canal@dna.cbiot.ufrgs.br. A anemia das galinhas é causada pelo vírus da anemia das galinhas (CAV = chicken anemia virus ou CIAV = chicken infectious anemia agent ) pertencente a família Circoviridae (Murphy, 1996). Os virions não são envelopados, possuem uma simetria icosaédrica e um diâmetro de 25 nm (Gelderblom et al., 1989). Seu genoma consiste em uma fita única de DNA circular, com polaridade negativa e aproximadamente 2300 bases (Noteborn et al., 1991). O genoma do CAV contem 3 fases abertas de leitura que parcialmente se sobrepõe (Kato et al., 1995), gerando as proteínas VP1, VP2 e VP3, com tamanhos estimados de 45, 30 e 16 kda (Chandratillede et al., 1991). O CAV foi isolado pela primeira vez no Japão em 1979 (Yuasa et al., 1979), e desde então sua presença tem sido descrita em criações comerciais nos Estados Unidos (Goodwin et al., 1989; Lucio et al., 1990), Brasil (Brentano et al., 1991), China (Zhou et al., 1996), África do Sul (Wicht e Maharaj, 1993), Suíça (Hoop et al., 1992), Austrália (Firth et al., 1990), Canadá, Inglaterra, Alemanha e Israel (Bülow, 1991). As galinhas são o único hospedeiro conhecido para o CAV. Ele pode ser transmitido horizontalmente, de aves infectadas para aves suscetíveis (Yuasa et al., 1980), e verticalmente, através dos ovos de aves infectadas soro-negativas (Chettle et al., 1989). O vírus também pode ser transmitido mecanicamente de granja para granja através de pessoas, equipamentos e veículos. A presença da infeção em alguns plantéis livres de patógenos específicos (SPF) usados para a produção de vacinas, explica parcialmente a incidência mundial da anemia das galinhas (CA = chicken anemia ou blue wing disease ) (Butcher, 1994). Aves de todas as idades são suscetíveis a infeção pelo vírus, mas somente pintos jovens sem proteção por anticorpos maternos desenvolvem a doença. Aves com menos de duas semanas de idade são as mais suscetíveis. Embora as galinhas diminuam a tendência à apresentação de sintomas com a idade, elas podem se tornar infectadas e excretar o CAV em qualquer idade (Bülow, 1991). As conseqüências da infeção são influenciadas por fatores do vírus, do hospedeiro e do meio ambiente. A infeção de aves jovens e suscetíveis entre 12 e 28 dias de idade resulta em um aumento da mortalidade que pode atingir 30% (Engström e Luthman, 1984; McNulty et al., 1991; Yuasa et al., 1979). A infeção pelo CAV causa anemia aplástica, imuno-supressão e atrofia linfóide em galinhas jovens. Seguidamente ocorrem infeções secundárias por vírus, bactérias ou fungos que complicam o curso da doença. As aves afetadas encontram-se deprimidas, com crescimento retardado 89

2 e pálidas. O impacto econômico da doença é expresso pela mortalidade de 10% a 30% nos surtos, e pela baixa conversão alimentar das aves infetadas devido as infeções sub-clínicas (McNulty et al., 1991; McIlroy et al., 1992). Devido a sua ação imuno-supressiva, o CAV pode estar envolvido em surtos de doenças multi-fatoriais (Engström e Luthman, 1984; McNulty et al., 1991; Cloud et al., 1992a; Cloud et al., 1992b; McNeilly et al., 1995) e pode ser a causa de falhas de vacinas, como na utilizada para a doença de Marek (De Boer et al., 1989; Otaki et al., 1988). A co-infecção do CAV com outras viroses imuno-depressivas, como a da doença de Gumboro e doença de Marek, aumentam a severidade da CA por diminuírem a proteção conferida pelos anticorpos maternos e por retardarem o desenvolvimento da resistência idade-específica (Bülow et al., 1983; Otaki et al., 1989). A resposta humoral à infeção pelo CAV é retardada, tanto no título quanto no tempo, em aves de menos de duas semanas de idade. Anticorpos maternos provêem proteção completa (Yuasa et al., 1980), desde que os pintos não estejam imuno-deprimidos por outros fatores (Bülow et al., 1986). Devido a estes fatos, a mais eficiente forma de prevenção e controle é a imunização dos pais, nunca depois de três a quatro semanas antes da coleta dos primeiros ovos para incubação (Bülow, 1991). Atualmente, existe uma vacina de vírus vivo atenuado no mercado brasileiro. Experimentalmente, foram testadas proteínas recombinantes do CAV como vacina, e os resultados foram promissores quando se utilizaram extratos de células de inseto infectadas simultaneamente com baculovírus recombinantes para a VP1 e VP2 (Koch et al., 1995). O diagnóstico das infeções pelo CAV é rotineiramente feito através do isolamento do vírus ou pela detecção de anticorpos específicos. A detecção de anticorpos pode ser feita através de testes de vírus neutralização (VN) e de imunofluorescência indireta de anticorpos (IFA) (Yuasa et al., 1983a; Yuasa et al., 1985). Contudo, a necessidade da contínua passagem do vírus em cultivo celular e a dificuldade na interpretação dos resultados, tornam estes testes muito trabalhosos para serem utilizados em estudos sorológicos amplos (Bülow, 1988; Chettle et al., 1991; Lamichhane et al., 1992). Devido à possibilidade de automação do ELISA, alguns testes foram desenvolvidos e apresentaram uma boa correlação com o teste padrão de IFA (Todd et al., 1990; Lamichhane et al., 1992; Pallister et al., 1994). O isolamento do vírus pode ser feito em embriões e pintos com um dia de idade sem anticorpos maternos e CAV, embora cultivos celulares de algumas linhagens de células linfoblastóides sejam os preferidos (Yuasa et al., 1983b). No entanto, o isolamento do vírus é trabalhoso e consome muito tempo, além de muitas linhagens de CAV não se adaptarem bem ao cultivo celular. Devido a estes fatos, testes de hibridização in situ (Novak e Ragland, 1997), de hibridização em dot-blot (Todd et al., 1991) e de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) (Tham e Stanislawek, 1992; Todd et al., 1992; Soiné et al., 1993) foram desenvolvidos. A PCR foi considerada a técnica mais sensível de detecção do CAV quando comparada com testes como o isolamento viral, e testes de imunofluorescência em seções de tecidos ou hibridização em dot-blot (Soiné et al., 1993). A PCR pode ser utilizada na detecção de infeções sub-clínicas e também para detectar contaminações pelo CAV em linhagens celulares, preparações de vírus e vacinas. Após a amplificação, a caracterização dos amplicons pode fornecer importantes informações epidemiológicas e evolutivas, além 90

3 de embasar o aconselhamento das linhagens mais adequadas para a utilização em vacinas e testes para a deteção de anticorpos (Todd et al., 1992). A expectativa das técnicas de amplificação de ácidos nucléicos in vitro é a substituição do processo de amplificação biológico, o crescimento em cultura, pela amplificação enzimática de seqüências específicas de ácidos nucléicos. A técnica da PCR possui uma significativa vantagem sobre o cultivo in vitro: as técnicas de amplificação de ácidos nucléicos não são limitadas pela capacidade do organismo crescer em cultura. Apesar das possibilidades que se abrem com as técnicas de amplificação de ácidos nucléicos, é um erro assumir que elas irão substituir as técnicas convencionais no futuro próximo. O maior impacto será na detecção de patógenos com sistemas de cultivo trabalhosos, lentos, caros ou inexistentes. O CAV, que apresenta isolados incapazes de crescer em cultivo celular, é um dos exemplos em que a PCR tem demonstrado ser uma técnica mais sensível do que o cultivo in vitro (Soiné, 1993). Apesar das perdas econômicas que podem estar ocorrendo devido à infeção por este vírus imunodepressor, sua importância não pode ser quantificada devido aos poucos dados epidemiológicos em nosso meio. Por esta razão, o CDPA iniciou um projeto de pesquisa que visa o desenvolvimento e utilização de uma PCR, que juntamente com a utilização de um ELISA comercial, está permitindo a geração de dados fundamentais para uma melhor avaliação da importância econômica e para a elaboração de estratégias de controle mais eficientes, com a conseqüente diminuição das perdas econômicas no sistema produtivo avícola. O protocolo de PCR desenvolvido, com o formato de um nested PCR, tem sido capaz de detectar o CAV no fígado, timo, baço, bursa e excreta de frangos naturalmente infectados. Desta forma, pode ser utilizado com vantagem na detecção deste vírus em surtos da doença. Já o ELISA comercial tem sido utilizado para detectar a presença e o título de anticorpos contra o CAV em matrizes de frangos de corte e postura. Desta forma, tem sido possível determinar qual a porcentagem de matrizes de um determinado lote que tem potencial de transmitir um título de anticorpos protetores para a progênie. Os resultados tem demonstrado que os lotes de matrizes tem entrado em produção com um status imune bastante variável, dependente da empresa avícola, do manejo e condições de biossegurança utilizados. Em algumas empresas, porcentagens elevadas das matrizes tem entrado em produção soronegativas ou com títulos baixos de anticorpos. Nestes casos, provavelmente se justifique a utilização da vacinação das matrizes como forma de proteger a progênie passivamente, embora o custo/benefício desta ainda deva ser melhor avaliado em nosso meio. Financiamento: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) ARD 98/ e 98/ Execução: Rosecler Alves Pereira e Danilo José Ferreira (Mestrandos), Carla Rosane Rodenbusch e Marisa Macagnan (Iniciação Científica). 91

4 Referências Bibliográficas II Simpósio de Sanidade Avícola BRENTANO, L., Mores, N., Wentz, I., Chandratilleke, D. e Schat, K.A. (1991). Isolation and identification of chicken infectious anemia virus in Brazil. Avian Diseases, 35: BÜLOW, V., Fuchs, B., Vielitz, E. e Landgraf, H. (1983). [Early mortality syndrome in chickens following double infection with Marek s disease virus and chicken anemia agent]. Zentralblatt fuer Veterinaermedizin. Reihe B, 30: BÜLOW, V. (1988). Unsatisfactory sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence tests for the presence or absence of antibodies to chicken anaemia agent (CAA) in sera of SPF and broiler breeder chickens. Zentralblatt fuer Veterinaermedizin. Reihe B, 35: BÜLOW, V. (1991). Infectious anemia In Diseases of Poultry (B.W. Calnek, H.J. Barnes, C.W. Beard, W.M. Reid e H.W. Yoder Jr., eds.), 9th Ed., pp Iowa State University Press, Ames. BÜLOW, V., Rudolph, R. e Fuchs, B. (1986). [Enhanced pathogenicity of chicken anemia agent (CAA) in dual infections with Marek s disease virus (MDV), infectious bursal disease virus (IBDV) or reticuloendotheliosis virus (REV)]. Zentralblatt fuer Veterinaermedizin. Reihe B, 33: BUTCHER, G.D. (1994). Chicken anemia agent. [on line] Disponível na Internet via Arquivo capturado em 20 de setembro de CHANDRATILLEKE, D., O Connell, P. e Schat, K.A. (1991). Characterization of proteins of chicken infectious anemia virus with monoclonal antibodies. Avian Diseases, 35: CHETTLE, N.J., Eddy, R.K., Saunders, J. e Wyeth, P.J. (1991). A comparison of serum neutralisation, immunofluorescence and immunoperoxidase tests for the detection of antibodies to chicken anaemia agent. Veterinary Record, 128: CHETTLE, N.J., Eddy, R.K., Wyeth, P.J. e Lister, S.A. (1989). An outbreak of disease due to chicken anaemia agent in broiler chickens in England. Veterinary Record, 124: CLOUD, S.S., Lillehoj, H.S. e Rosenberger, J.K. (1992). Immune dysfunction following infection with chicken anemia agent and infectious bursal disease virus. I. Kinetic alterations of avian lymphocyte subpopulations. Veterinary Immunology and Immunopathology, 34: CLOUD, S.S., Rosenberger, J.K. e Lillehoj, H.S. (1992). Immune dysfunction following infection with chicken anemia agent and infectious bursal disease virus. II. Alterations of in vitro lymphoproliferation and in vivo immune responses. Veterinary Immunology and Immunopathology, 34: ENGSTRÖM, B.E. e Luthman, M. (1984). Blue wing disease of chickens: signs, pathology and natural transmission. Avian Pathology, 17: FIRTH, G.A. e Imai, K. (1990). Isolation of chicken anaemia agent from Australian poultry. Australian Veterinary Journal, 67: GELDERBLOM, H., Kling, S., Lurz, R., Tischer, I. e Bülow,V. (1989). Morphological characterization of chicken anaemia agent (CAA). Archives of Virology, 109:

5 GOODWIN, M.A., Brown, J., Miller, S.L., Smeltzer, M.A., Steffens, W.L. e Waltman, W.D. (1989). Infectious anemia caused by a parvoviruslike virus in Georgia broilers. Avian Diseases, 33: HOOP, R.K., Guscetti, F. e Keller, B. (1992). [An outbreak of infectious chicken anemia in fattening chickens in Switzerland]. Schweiz.Arch.Tierheilkd., 134: KATO, A., Fujino, M., Nakamura, T., Ishihama, A. e Otaki, Y. (1995). Gene organization of chicken anemia virus. Virology, 209: KOCH, G., Van Roozelaar, D.J., Verschueren, C.A., Van Der Eb, A.J. e Noteborn, M.H. (1995). Immunogenic and protective properties of chicken anaemia virus proteins expressed by baculovirus. Vaccine, 13: LAMICHHANE, C.M., Snyder, D.B., Girschick, T., Goodwin, M.A. e Miller, S.L. (1992). Development and comparison of serologic methods for diagnosing chicken anemia virus infection. Avian Diseases, 36: LUCIO, B., Schat, K.A. e Shivaprasad, H.L. (1990). Identification of the chicken anemia agent, reproduction of the disease, and serological survey in the United States. Avian Diseases, 34: McILROY, S.G., McNulty, M.S., Bruce, D.W., Smyth, J.A., Goodall, E.A. e Alcorn, M.J. (1992). Economic effects of clinical chicken anemia agent infection on profitable broiler production. Avian Diseases, 36: McNEILLY, F., Smyth, J.A., Adair, B.M. e McNulty, M.S. (1995). Synergism between chicken anemia virus (CAV) and avian reovirus following dual infection of 1-day-old chicks by a natural route. Avian Diseases, 39: McNULTY, M.S., McIlroy, S.G., Bruce, D.W. e Todd, D. (1991). Economic effects of subclinical chicken anemia agent infection in broiler chickens. Avian Diseases, 35: MURPHY, F.A. (1996). Virus taxonomy In "Fields Virology" (B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, eds.), 3rd Ed., pp Philadelphia: Lippincott-Raven. NOTEBORN, M.H., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D.J., Karreman, C., Kranenburg, O., Vos, J.G., Jeurissen, S.H.M., Hoeben, R.C., Zantema, A., Koch, G., Van Ormondt, H. e Van der Eb, A.J. (1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. Jornal of Virology, 65: NOVAK, R. e Ragland, W.L. (1997). In situ hybridization for detection of chicken anaemia virus in peripheral blood smears. Molecular Cell Probes, 11: OTAKI, Y., Nunoya, T., Tajima, M., Saito, K. e Nomura, Y. (1989). Enhanced pathogenicity of chicken anemia agent by infectious bursal disease virus relative to the occurrence of Marek s disease vaccination breaks. Nippon.Juigaku.Zasshi., 51: OTAKI, Y., Tajima, M., Saito, K. e Nomura, Y. (1988). Immune response of chicks inoculated with chicken anemia agent alone or in combination with Marek s disease virus or turkey herpesvirus. Nippon.Juigaku.Zasshi., 50: PALLISTER, J., Fahey, K.J. e Sheppard, M. (1994). Cloning and sequencing of the chicken anaemia virus (CAV) ORF-3 gene, and the development of an ELISA for the detection of serum antibody to CAV. Veterinary Microbiology, 39: SOINÉ, C., Watson, S.K., Rybicki, E., Lucio, B., Nordgren, R.M., Parrish, C.R. e Schat, K.A. (1993). Determination of the detection limit of the polymerase chain reaction for chicken infectious anemia virus. Avian Diseases, 37:

6 THAM, K.M. e Stanislawek, W.L. (1992). Polymerase chain reaction amplification for direct detection of chicken anemia virus DNA in tissues and sera. Avian Diseases, 36: TODD, D., Creelan, J.L. e McNulty, M.S. (1991). Dot blot hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe. Journal of Clinical Microbiology, 29: TODD, D., Mackie, D.P., Mawhinney, K.A., Connor, T.J., McNeilly, F. e McNulty, M.S. (1990). Development of an enzyme-linked immunosorbent assay to detect serum antibody to chicken anemia agent. Avian Diseases, 34: TODD, D., Mawhinney, K.A. e McNulty, M.S. (1992). Detection and differentiation of chicken anemia virus isolates by using the polymerase chain reaction Journal of Clinical Microbiology, 30: WICHT, J.D. e Maharaj, S.B. (1993). Chicken anaemia agent in South Africa [letter]. Veterinary Record, 133: YUASA, N. (1983). Propagation and infectivity titration of the Gifu-1 strain of chicken anemia agent in a cell line (MDCC-MSB1) derived from Marek s disease lymphoma. National Institutes of Animal Health Quartely (Tokyo), 23: YUASA, N., Noguchi, K., Furata, K. e Yoshida, I. (1980). Maternal antibody and its effect on the susceptibility of chicks to chicken anemia agent. Avian Diseases, 24: YUASA, N., Taniguchi, T. e Yoshida, I. (1979). Isolation and some characteristics of an agent inducing anemia in chicks. Avian Diseases, 23: YUASA, N., Taniguchi, T., Goda, M., Shibatani, M., Imada, T. e Hihara, H. (1983). Isolation of chicken anemia agent with MDCC-MSB1 cells from chickens in the field. National Institutes of Animal Health Quartely (Tokyo): 23: ZHOU, W., Yang, B., Shen, B., Han, S. e Zhou, J. (1996). A serologic survey of antibody against chicken infectious anemia virus by indirect immunofluorescent assay in domestic poultry in China. Avian Diseases, 40: