Avaliação dos gangliosídios na regeneração nervosa em ratos *

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1 AVALIAÇÃO DOS GANGLIOSÍDIOS REGENERAÇÃO NERVOSA EM RATOS ARTIGO ORIGINAL Avaliação dos gangliosídios na regeneração nervosa em ratos * ANTONIO AUGUSTO NUNES DE ABREU 1, TENG H. WEI 2, ARNALDO V. ZUMIOTTI 3 RESUMO Os autores avaliaram o efeito dos gangliosídios administrados intraperitonealmente na dose de 3mg/kg, por 3 dias, após esmagamento do nervo ciático em ratos. O estudo foi do tipo duplo-cego: nove ratos receberam gangliosídio e 11, solução tamponada pelo mesmo período. Avaliou-se o índice de função do ciático no préoperatório, primeira, quarta e sexta semanas de pósoperatório, não se encontrando diferença significativa entre os grupos. Avaliou-se a regeneração nervosa histomorfometricamente através da densidade de fibras, percentagem de tecido neural e área média de uma fibra das porções proximais e distais à lesão e do lado normal. Não houve diferenças entre os grupos. A administração dos gangliosídios não interferiu na qualidade da regeneração nervosa. Unitermos Gangliosídios; nervo; uso terapêutico; regeneração; trauma ABSTRACT Effect of gangliosides on nerve regeneration in rats The authors studied the effect of the intraperitoneal administration of gangliosides (3mg/kg) for 3 days after sciatic crush injury in rats. The double-blind study evaluated nine rats which received gangliosides, and 11 rats which received tamponade solution for the same period. The sciatic function index was evaluated in the preoperative period, then in the first, fourth, and sixth week after nerve lesion. No significant difference was found between the groups. Nerve regeneration was histopathologically evaluated by the analysis of fiber density, neural tissue percentage, and average area of neural fiber, proximal and distal to the lesion, and compared to the normal limb. Furthermore, no significant difference was found between groups. The administration of gangliosides does not interfere in the quality of nerve regeneration. Key words Gangliosides; nerve; therapeutic administration; regeneration; injury INTRODUÇÃO * Trabalho realizado na Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas (IOT/HC/FM-USP). 1. Mestre em Medicina pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP). 2. Médico Assistente do Grupo de Microcirurgia Reconstrutiva (IOT/HC/ FM-USP). 3. Chefe do Grupo de Microcirurgia Reconstrutiva (IOT/HC/FM-USP). Endereço para correspondência: Rua Pedro Doll, 472, apto São Paulo, SP. Tel.: (11) , fax: (11) Recebido em 23/7/1. Aprovado para publicação em 6/11/1. Copyright RBO22 Às portas do terceiro milênio, cada vez se falava mais de substâncias que poderiam ajudar na recuperação de um nervo lesado. Termos como fatores neurotrópicos e co-fatores (1,2,3) estavam ficando cada vez mais comuns na prática clínica. Neste trabalho, procuramos estudar o efeito de uma dessas substâncias, os gangliosídios. Desde a sua descoberta, em 1935 (4), ainda não se estabeleceu o seu verdadeiro papel na regeneração nervosa. Apesar de diversos trabalhos terem demonstrado que aceleraria o processo de regeneração nervosa (5,6,7), através do aumento do brotamento axonal (sprouting) (8) e do número de fibras mielínicas (9,1,11), ainda não é um consenso sua utilização na prática clínica (12,13). Através de um estudo experimental prospectivo e duplo-cego em ratos, procuramos avaliar o efeito dos gangliosídios quando administrado via intraperitoneal por 3 dias. A avaliação dos grupos foi feita funcional e histomorfometricamente. A função foi avaliada através do teste da marcha introduzido por De Medinaceli et al (14) e modi- Rev Bras Ortop _ Vol. 37, N os 1/2 Jan/Fev, 22 39

2 A.A.N. ABREU, T.H. WEI & A.V. ZUMIOTTI Fig. 1 Esmagamento do nervo ciático Fig.1 Crush injury of the sciatic nerve ficado por Bain et al (15). Esse teste avalia o índice de função do ciático (IFC) através das pegadas das patas traseiras (16,17,18,19). Histomorfometricamente, a avaliação foi feita através do cálculo da densidade de fibra, percentagem de tecido neural e área média de uma fibra dos nervos lesados (2,21). MATERIAL E MÉTODOS No estudo foram utilizados 32 ratos da raça Wistar divididos em dois grupos com 16 ratos cada. Todos os ratos utilizados eram machos. A idade (média de 99 dias) e peso (média de 365g) dos ratos foi semelhante nos dois grupos. Tivemos o cuidado de escolher uma população de ratos a mais homogênea possível, para que a influência da idade e de fatores hormonais fosse a menor possível. Todos os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral a 1% intraperitonealmente (4mg/kg) e submetidos à exploração do nervo ciático através de via de acesso dorsal, entre as fibras do músculo glúteo. A técnica cirúrgica da lesão nervosa e da coleta dos fragmentos do nervo ciático foi rigorosamente a mesma nos dois grupos estudados. Tivemos o cuidado de escolher uma via de acesso cirúrgico em que não houvesse nenhuma desinserção ou secção muscular, para que a avaliação funcional através do teste de marcha não fosse prejudicada (22). Realizou-se o esmagamento do nervo ciático com o auxilio de um porta-agulha padrão por um minuto a 6mm da trifurcação do nervo (fig 1). Após esse procedimento efetuou-se o fechamento do plano muscular e da pele. Os animais receberam a partir do primeiro dia de pós-operatório, até o 3º dia, doses diárias intrape- Fig. 2 Rato andando em corredor para teste de marcha Fig. 2 Walking track analysis of the rat ritoneais de solução de gangliosídios (3mg/kg) ou solução tamponada, dependendo do grupo. Só ficamos sabendo o que recebeu cada grupo após terem sido realizadas todas as avaliações funcionais e histomorfométricas. GRUPO A: Gangliosídios GRUPO B: Solução tamponada Avaliação funcional A avaliação funcional foi realizada no pré-operatório, na primeira, quarta e sexta semanas de pós-operatório, através da análise do teste de marcha introduzido por De Medinaceli et al (14) e modificado posteriormente por Bain et al (15). Neste teste, procede-se à pintura das patas traseiras das cobaias com tinta preta. Coloca-se a cobaia para deambular num corredor sobre uma folha de papel sulfite (fig. 2). O teste de marcha leva em conta os seguintes parâmetros: Tamanho da pata (TP): distância medida em milímetros da ponta do calcâneo até a ponta do terceiro dedo. 4 Rev Bras Ortop _ Vol. 37, N os 1/2 Jan/Fev, 22

3 AVALIAÇÃO DOS GANGLIOSÍDIOS NA REGENERAÇÃO NERVOSA EM RATOS Separação dos dedos (SD): distância medida em milímetros entre a ponta mais medial do primeiro dedo até a ponta mais lateral do quinto dedo. Separação intermédia (SI): distância medida em milímetros entre a ponta mais medial do segundo dedo e a ponta mais lateral do quarto dedo. Acrescentamos o sufixo O para identificar o lado operado, que em todos os casos foi o esquerdo e o sufixo N para identificar o lado normal (direito) não operado. O índice de função do ciático foi calculado através da fórmula: IFC = 38,3 (TPO TPN) + 19,5 (SDO SDN) + 13,3 (SIO SIN) 8,8 TPN SDN SIN Avaliação histomorfométrica A análise histomorfométrica foi realizada com seis semanas de lesão nervosa após sacrifício dos animais. Analisamos porções proximais e distais à lesão, assim como o lado normal contralateral. Os cortes histológicos foram examinados através da microscopia óptica sob imersão e aumento de 1.x. Os índices estudados foram os seguintes: Densidade fibra (DF): corresponde ao número de fibras mielínicas presentes na área de um retículo (expresso fibras/1.µm 2 ). Percentagem de tecido normal (PTN): corresponde à parte da área do corte que está sendo estudado que é ocupada por fibras mielínicas. A PTN é calculada pelo número de pontos do retículo que incidem sobre as fibras mielínicas dividido pelo número total de pontos do retículo (expresso em percentagem). Área média de uma fibra (AMF): corresponde à divisão da PTN pela DF (expressa em x 1µm 2 ). RESULTADOS Excluímos das avaliações todos os ratos que apresentaram deiscência de sutura, contraturas das patas traseiras, amputação de qualquer um dos dedos ou morte durante o trabalho. A população final do grupo A foi reduzida a nove ratos e a do grupo B, a 11 ratos. Excluímos da avaliação funcional os ratos (quatro de cada grupo) que não conseguiram imprimir pegadas de boa qualidade na primeira semana. Apresentamos no gráfico 1 a evolução do índice de função do ciático por grupo. Apresentamos em seguida (gráficos 2, 3 e 4) os resultados dos achados histomorfométricos. Resumo dos resultados 1) Não encontramos diferenças significativas com relação ao grau de recuperação motora avaliado através do teste de marcha entre os dois grupos. IFC TEMPO (semanas) A (n=5) B (n=7) Gráfico 1 Índice de função do ciático por grupo no pré-operatório, primeira, quarta e sexta semanas de pós-operatório. A: gangliosídios, B: solução tamponada. Graph 1 Sciatic function index (IFC) before surgery and in the first, fourth and sixth week after surgery. A: ganglioside group; B: tamponade solution group. Rev Bras Ortop _ Vol. 37, N os 1/2 Jan/Fev, 22 41

4 A.A.N. ABREU, T.H. WEI & A.V. ZUMIOTTI DF PTN P D N LOCAL A (n=9) B (n=11) Gráfico 2 Densidade de fibras (DF) dos grupos em relação à origem dos fragmentos estudados: proximal (P), distal (D) e normal (N) (N o fibras/1 4 µm 2 ). A: gangliosídios, B: solução tamponada. Graph 2 Fiber density (DF) locations: (P) proximal, (D) distal, and (N) normal (No. of fibers/1 4 µm 2 ). A: ganglioside group; B: tamponade solution group. 1 P D N LOCAL A (n=9) B (n=11) Gráfico 3 Percentagem de tecido neural (PTN) dos grupos em relação à origem dos fragmentos estudados: proximal (P), distal (D) e normal (N) (x 1 2 µm 2 ). A: gangliosídios, B: solução tamponada. Graph 3 Neural tissue percentage (PTN) locations: (P) proximal, (D) distant and (N) normal (x 1 2 µm 2 ). A: ganglioside group; B: tamponade solution group. 2) Os dois grupos estudados apresentam recuperação motora completa após quatro semanas de lesão nervosa. 3) Não encontramos diferenças significativas com relação aos parâmetros densidade de fibra, percentagem de tecido neural e área média de uma fibra entre os dois grupos estudados. 4) As fibras nervosas regeneradas na porção distal da lesão são de menor calibre que as fibras proximais. AMF,7,6,5,4,3,2,1 P D N LOCAL A (n=9) B (n=11) Gráfico 4 Área média das fibras (AMF) dos grupos em relação à origem dos fragmentos. Proximal (P), distal (D) e normal (N) (x 1 2 µm 2 ). A: gangliosídios, B: solução tamponada. Graph 4 Average area of neural fiber (AMF): (P) proximal, (D) distal and (N) normal (x 1 2 µm 2 ). A: ganglioside group; B: tamponade solution group. 5) Existe aumento de tecido conjuntivo perineural ao redor dos axônios na porção distal da lesão, o que acarreta diminuição da percentagem de tecido neural. DISCUSSÃO Hoje em dia, é cada vez maior o número de substâncias que supostamente agiriam na regeneração nervosa melhorando o resultado clínico (2,3,8). Criam-se em alguns pacientes falsas expectativas quanto ao verdadeiro potencial de recuperação em lesões nervosas graves. Nossa intenção foi simular experimentalmente uma situação com que, por muitas vezes, nos defrontamos na prática clínica, que é a lesão nervosa sem secção completa do nervo (22). Os gangliosídios, apesar de descobertos há quase 65 anos (4), ainda não tiveram seu papel bem definido na prática clínica (12,13). Após a primeira referência por Ceccarelli et al (11) de que os gangliosídios acelerariam o processo de regeneração do sistema nervoso in vivo, diversos autores começaram a estudar suas implicações no sistema nervoso periférico (6,7,8,9,1,12,13). Optamos pelo esmagamento do nervo para simularmos uma lesão do tipo axoniotmese, na qual não existe secção completa do nervo (23). Podemos observar macroscopicamente na figura 1 que existe perda da continuidade axonal na região do esmagamento, porém, o invólucro epineural foi preservado. O teste de marcha presta-se muito bem para avaliar, quantitativamente (15,16,17,18), a recuperação motora dos membros inferiores após uma lesão nervosa. Nossa 42 Rev Bras Ortop _ Vol. 37, N os 1/2 Jan/Fev, 22

5 AVALIAÇÃO DOS GANGLIOSÍDIOS NA REGENERAÇÃO NERVOSA EM RATOS idéia foi avaliar funcionalmente nossos ratos através do teste de marcha para que pudéssemos comparar com os resultados histológicos e observar se existem diferenças entre os resultados. Analisando os gráficos 1, 2 e 3, notamos não haver diferenças significativas entre o grupo que recebeu a solução de gangliosídios e o da solução tamponada. Existiu diferença entre os parâmetros histomorfométricos estudados, em relação ao local onde foram colhidos os fragmentos de nervo ciático. A densidade de fibra (DF) da região proximal não apresentou diferenças significativas em relação à da região distal. Isso se deve, provavelmente, aos cortes terem sido feitos na região do brotamento axônico. Outro dado que corrobora essa observação é a de que a DF da região distal foi maior do que a da região normal. O nível de coleta dos fragmentos de nervo ciático da região distal e o da região normal foram os mesmos. A percentagem de tecido neural (PTN) e a área média da fibra (AMF) comportaram-se de maneira semelhante durante a avaliação histomorfométrica. Os dois parâmetros diminuem quando comparamos a região distal com a proximal. Distalmente, existe menos tecido neural, além de as fibras nervosas serem de calibre menor. Quando comparamos as fibras proximais e distais com as do lado normal, a diferença de tamanho é nítida. As fibras normais são bem mais calibrosas, além de apresentar bainha de mielina mais espessa. Não existe consenso na literatura quanto à utilização dos gangliosídios na prática clínica. Alguns trabalhos (6,8,9,1,11) demonstram haver melhora da regeneração nervosa, enquanto outros mostram justamente o contrário (12,13). Salientamos que a comparação desses trabalhos é muito difícil, já que as metodologias são totalmente diferentes. Não existe padronização quanto à dosagem ideal (de 5 a 5mg/kg), via de administração (local na lesão, intraperitoneal ou subcutâneo) e mecanismo de lesão nervosa (secção total ou só esmagamento do nervo). Utilizamos em nosso trabalho a dose intermediária de 3mg/kg pela via intraperitoneal numa tentativa de simularmos a administração realizada em humanos. CONCLUSÃO A solução de gangliosídios na dosagem de 3mg/kg administrado intraperitonealmente por 3 dias não apresentou nenhum efeito importante sobre a regeneração nervosa de ratos após lesão por mecanismo de esmagamento. REFERÊNCIAS 1. Terzis J.K., Sun D.D., Thanos P.K.: Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg 13: , Levi-Montalcini R., Hamburger V.: Selective growth-stimulating effects of mouse sarcoma on the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo. 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