Caracterização molecular de Bacillusthuringiensis e produção de bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays)

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI PRÓ-REITORIA DE ENSINO ENGENHARIA AGRONÔMICA André Henrique Campelo Mourão Caracterização molecular de Bacillusthuringiensis e produção de bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays) Sete Lagoas MG

2 2014 ANDRÉ HENRIQUE CAMPELO MOURÃO Caracterização molecular de Bacillus thuringiensis e produção de bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays) Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de São João Del Rei como requisito parcial para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Área de concentração: Microbiologia/Controle Biológico Orientador: Prof. Dr. Juliano de Carvalho Cury Sete Lagoas MG 2014

3 ANDRÉ HENRIQUE CAMPELO MOURÃO Caracterização molecular de Bacillusthuringiensis e produção de bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays) Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de São João Del Rei como requisito parcial para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Sete Lagoas, 11 de julho de 2014 Banca examinadora: Fernando H. Valicente Pesquisador EMBRAPA/CNPMS Leonardo Lucas Carnevalli Dias Professor UFSJ Juliano de Carvalho Cury Professor UFSJ Orientador

4 DEDICO Aos meus pais pela dedicação e carinho e ao meu irmão pelo companheirismo. AGRADECIMENTOS A Deus, fonte de luz e inspiração. A Embrapa Milho e Sorgo por possibilitar a realização do trabalho, cedendo laboratório e material às pesquisas. A Universidade Federal de São João Del Rei por fornecer conhecimento e pela oportunidade de ingressar no curso de Engenharia Agronômica. Ao Doutor Fernando HercosValicente pela oportunidade, incentivo, por proporcionar momentos descontraídos e principalmente pelos ensinamentos e lições não só profissionais, mas de vida. Ao professor Dr. Juliano de Carvalho Cury pela compreensão, disponibilidade e confiança. A Prof Leonardo Lucas Carnevalli Dias,pela participação como membro da banca de defesa. Aos colegas de laboratório Osmar (Nate), Celso, Camila, Thaís, Priscilla, Daniele, Fernando, Donald, Rosane, Arthur pelo convívio e auxílio nas tarefas desenvolvidas.

5 Aos meus pais Luiz e Jussara pelo auxílio incondicional e por me proporcionarem mais este momento feliz em minha vida. Ao meu irmão Mateus por me ajudar a esquecer as dificuldades que passamos, e por dar forçaa meus pais e a mim nos momentos difíceis. Ao meu irmão Vitor (in memorian) que sei que esta olhando por nós, uma grande perda durante esta minha caminhada. Aprender a perder nunca saberemos, mas o tempo transforma todos os sentimentos. A minha namorada Julie pela paciência, compreensão e palavras de incentivo. E a todos que de alguma forma me ajudaram e continuam me ajudando. A todos, muito obrigado.

6 A adversidade desperta em nós capacidades que, em circunstâncias favoráveis, teriam ficado adormecidas. Horácio

7 RESUMO O Bacillusthuringiensis(Bt) é uma bactéria gram positiva, aeróbica ou anaeróbica facultativa, em formato de bastonete e que forma inclusões cristalinas que são tóxicas a insetos das ordens Lepidóptera, Coleóptera, Díptera, além de nematoides e ácaros. Tais inclusões são proteínas produzidas por genes chamados Cry. O Bt pode ser utilizado para a produção de plantas transgênicas ou bioinseticidasatravés de processos fermentativos. Esse trabalho foi desenvolvido com o objetivo de analisar molecularmente a presença de alguns genes Cry na cepa 1644 e a otimização do processo de produção de bioinseticida visando o controle das lagartas Spodopterafrugiperda, Helicoverpazea e Diatreasaccharalis. Para analise molecular foi utilizada a técnica da PCR, para detecção dos genescry: Cry1Ab/1Ac; Cry 1Aa/1Ad; Cry 1Ac, Cry 1B, Cry 1D; Cry 1C; Cry 1Fa/1Fb; Cry 1G; Cry 1A5; Cry 1Ab; Cry 1Fb; Cry 1Fa1/1Fb; Cry 1I; Cry 1H; Cry 2Aa, Cry 2Ab; Cry 2Ac; Cry 2Ad; Cry 9; Cry 9A; Cry 9B e Cry 9D. O meio de cultivo utilizado para a fermentação continha 4,0% de glicose de milho e 3,0% de farinha de soja mais sais (0,002 g.l -1 de FeSO 4, 0,02 g.l -1 de ZnSO 4, 0,02 g.l - 1 de MnSO 4, 0,3 g.l -1 de MgSO 4 ).Foramdetectadosos genescry 1Ab/1Ac; Cry 1Aa/1Ad; Cry 1B, Cry 1C; Cry 1A5; Cry 1Ab; Cry 1I; Cry 1H; Cry 2Ab; Cry 2Ad; Cry 9. Foram coletadas e analisadas amostras em tempo pré determinado. O ph do meio de cultura variou entre 4,21 e 6,45. A maior quantidade de biomassa celular produzida se deu após 72h de fermentação (3,8 g.l -1 ). A concentração de esporos teve um pico máximo de 3,83E+08 após 56h de fermentação. Todos os insetos ficaram expostos á dieta com toxinas por 120 horas e as maiores eficiências de mortalidade observadas foram de 81,75% paras. frugiperdaapós 72 horas de fermentação, 58,75% para H. zeaapós 72 horas de fermentação e 50% para D. saccharalis após 56 horas de fermentação. Palavras chave: Controle de pragas, Fermentação, Bacillusthuringiensis.

8 ABSTRACT Bacillusthuringiensis (Bt) is a gram positive, aerobic or facultatively anaerobic, rod shaped bacteria and produces crystalline inclusions that are toxic to insects of the orders Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, besides mites and nematodes. Such inclusions are proteins produced by Cry genes. Bt can be used for the production of transgenic plants or biopesticides through fermentation processes. This work based on the molecular analysis of the presence of Cry genes in thebt strain 1644 and the optimization of the production process of biopesticide for the control of Spodopterafrugiperda, Helicoverpazea and Diatreasaccharalis. Molecular analyses was done using the PCR technic for detection of Cry genes: Cry1Ab/1Ac; Cry 1Aa/1Ad; Cry 1AC, Cry 1B, Cry1D; Cry 1C; Cry 1Fa/1Fb; Cry 1G; Cry 1A5; Cry1Ab; Cry 1Fb; Cry 1Fa1/1Fb; Cry 1I; Cry 1H; Cry2Aa, Cry 2Ab; Cry 2Ac; Cry 2Ad; Cry 9; Cry 9A; Cry 9B and Cry9D. The medium used for the fermentation contained 4.0% glucose and 3.0% corn soybean meal plus salts (0.002 gl-1 FeSO 4, 0.02 gl-1 ZnSO 4, 0.02 gl-1 MnSO 4, 0.3 gl-1 MgSO 4 ). There were detected the presence of Cry 1Ab/1Ac; Cry 1Aa/1Ad; Cry 1B; Cry 1C, Cry 1A5, Cry1Ab, Cry 1I, Cry 1H, Cry 2Ab, Cry 2Ad and Cry9. Samples were collected and analyzed at pre-determined time. The culture medium ph has ranged from 4.21 to A greater amount of cell biomass production occurred after 72 hours of fermentation (3.8 gl-1). The spore concentration had its peak of 3.83 E +08 spors/ml after 56h of fermentation. All insects were exposed to the toxin through artificial diet for 120 hours and the highest mortality observed was 81.75% for S. frugiperda after 72 hours of fermentation, 58.75% H. zea after 72 h and 50% for D. saccharalis after 56 hours of fermentation. Keywords: Pest control, Fermentation, Bacillus thuringiensis.

9 SUMÁRIO Introdução 08 Revisão bibliográfica 10 Material e métodos 19 Resultados e discussão 26 Conclusão 34 Referencias 35

10 INTRODUÇÃO O milho é uma gramínea pertencente à família Poaceae, tribo Maydeae, gênero Zea e espécie Zea mays L. Esse cereal é o terceiro mais cultivado no mundo, perdendo apenas para o trigo e o arroz. O Brasil é o terceiro maior produtor do grão, atrás apenas dos Estados Unidos e China. A maior parte desses grãos, cerca de 70%, é destinada à cadeia produtiva de suínos e aves, sendo o restante destinado ao consumo humano e, mais recentemente, à produção de energia (CONAB, 2011). Um dos maiores problemas da agricultura mundial é o ataque de uma ampla gama de pragas, e no milho a redução de rendimento varia em níveis de 17,7% a 55,6% (CRUZ, 2008). Dentre as principais pragas que atacam o milho podemos citar alguns Lepidópteros como Spodopterafrugiperda (lagarta do cartucho), Helicoverpazea, (lagarta da espiga) e Diatreasaccharalis (broca da cana). Sendo a lagarta do cartucho ainda a principal praga que ataca o milho, não só na fase inicial da cultura, mas também encontrada até mesmo atacando espigas(cruzetal., 2013). Mas na última safra houve no Brasil uma grande incidência do ataque de outra praga, a H. armigera, que não era uma encontrada no Brasil, recentemente vem causando grandes prejuizos não apenas no milho, mas em soja, algodão, tomate e varias outras culturas. Para o controle destas pragas, ainda é utilizado de forma indiscriminada e excessivaos inseticidas químicos, porém o controle biológicovem sendo uma arma bastante utilizada e eficaz. Nesse tipo de controle atuam inseticidas formulados com a bactéria entomopatogênicabacillus thuringiensis (Bt) (VALICENTE &ZANASI, 2005; FATORETTOetal., 2007). O uso de híbridos ou variedades transgênicas de milho, que são conhecidas por milho Bt, nas quais foram inseridos genes da bactéria B. thuringiensis, são alternativas para o manejo da lagarta do cartucho e outras larvas de lepidópteras que incidem na cultura do milho (CHIARADIA, 2010). B. thuringiensis é uma bactéria gram-positiva,aeróbica ouanaeróbica facultativa (RASKOetal., 2005), em forma de bastonete, formadora de esporos e que 8

11 tem a capacidade de produzir, durante a esporulação, diversas inclusões cristalinas altamente específicas, que são responsáveis pela atividade tóxica desta bactéria (GLARE& O CALLAGHAM, 2000; HABIB& ANDRANDE, 1998). Esporos de Bt podem ser isolados de diversos ambientes como solo, rizosfera, filoplano, água fresca, poeiras de grãos e de insetos, crustáceos, anelídeos e mamíferos insetívoros (RAYMONDetal., 2010). Bt produz inclusões cristalinas (proteínas cry), as quais são tóxicas a diferentes ordens de insetos tais como: Lepidóptera, Coleóptera, Díptera e ainda nematóides e ácaros (FEITELSONetal., 1992). Tais inclusões são formadas por polipeptídeos denominados δ-endotoxinas, que são liberadas junto ao esporo no momento da lise celular (DEAN, 1984; HANNAY&FITZ-JAMES, 1995). Portanto, o Bt é uma importantealternativa ao controle de pragas através do emprego de bioinseticidas. De acordo com Vlak (1993), o alerta aos riscos ambientais gerados pelos inseticidas químicos traz uma preocupação em buscar novas alternativas, incluindo o uso de agentes microbianos como os Baculovírus e obt. Considerando a produção de bioinseticida à base de Bt, este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de analisar molecularmente a presença de alguns genes Cry na cepa 1644, (cepa pertencente ao banco de microrganismo da Embrapa Milho e Sorgo) e a otimização do processo de produção de bioinseticida visando o controle das lagartas Spodopterafrugiperda, HelicoverpazeaeDiatreasaccharalis. 9

12 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), na safra 2013/2014 é esperada a quebra de mais um recorde na produção de grãos, com a projeção de 188,7 milhões de toneladas. Sendo a maior parte devido ao plantio de soja, seguido pelo milho, que tem expectativa de produção de 75,5 milhões de toneladas mesmo o milho sofrendo uma redução de 7,4% (6,1 milhões de toneladas), em relaçãoà safra 2012/2013. Sendo assim, a cultura do milho é uma das mais importantes do setor agrícola no Brasil. É uma das mais antigas do mundo, com origem nas Américas. Possui diversas formas de utilização, variando desde a alimentação animal até a indústria de alta tecnologia. Um dos maiores problemas da agricultura mundial é o ataque de uma ampla gama de pragas. No milho, esse ataque pode ocorrer na raiz, folha, espiga e pendões. Quando a incidência se dá na parte aérea da planta a aplicação das medidas de controle à praga é mais fácil, pois a visibilidade do ataque é maior que quando se dá na parte subterrânea. Esse ataque na raiz, por exemplo, é muitas vezes confundido com deficiência nutricional, efeito de adversidades climáticas ou da má qualidade da semente plantada (ÁVILLA& PARRA, 2004; MORÓN, 2004). A redução de rendimento na cultura do milho devido ao ataque de pragas varia em níveis de 17,7% a 55,6% (CRUZ, 2008). Os danos causados pelas pragas da fase vegetativa e reprodutiva do milho variam de acordo com o estádio fenológico da planta, condições edafoclimáticas, sistemas de cultivo e fatores bióticos localizados. Cerca de 1/3 da perda dos produtos agrícolas é causada por pragas e doenças (VLAK, 1993). A produção do milho pode ser afetada por diversas pragas que atacam as sementes, raízes e plantas jovens após a semeadura (VIANA, CRUZ, WAQUIL, 2000). 10

13 Dentre as principais pragas do milho incluem-se: a lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda), que se alimenta desta cultura em quase todos os instares, sendo encontrada no cartucho de plantas jovens até na espiga; as lagartas da espiga (Helicoverpa zeae mais recentemente a Helicoverpa armigera), que atacam principalmente a parte comercial, a espiga; a broca da cana de açúcar (Diatrea saccharalis), que ataca a cultura do milho durante quase todo o ciclo da planta, mas principalmente durante a fase de enchimento de grãos. A S. frugiperda, dependendo do estágio de crescimento, pode causar uma redução de 34% na produção do milho, e também a morte da planta (VALICENTEet al., 1988). As lagartas recém-eclodidas raspam o limbo foliar das folhas mais novas seguindo para as folhas centrais do cartucho. Depois deatingir o segundo ou terceiro instar, começam a perfurar as folhas consumidas. Valicente e Cruz (1991) descreveram possíveis formas de migração da lagarta do cartucho. Dentre elas, pode-se citar a migração para outra planta através de uma teia e o transporte das mesmas pelo vento até o cartucho. Tardiamente, podem ser encontradas se alimentando da palha e dos grãos (VALICENTEet al.,1998). Segundo Gomez, Moscardi&Sosa-Gomez (1999) há uma estimativa de que, nos EUA, a perda média anual causada pela lagarta do cartucho do milho seja de cerca de US$ 300 milhões. Nos anos de 1975 a 1977 esse prejuízo excedeu os US$ 500 milhões. No Brasil, S. frugiperda ataca amendoim, algodão e diversas gramíneas cultivadas, incluindo-se o trigo, a soja e o milho. A intensidade da perda foliar varia de acordo com a fase de desenvolvimento da planta atacada, com o local de plantio e segundo as práticas agronômicas utilizadas (HARPAZ, RACCAH, 1978). A H. zeadeposita seus ovos geralmente individualmente e em qualquer local da planta, mas tendo preferência pelo cabelo da espiga ou boneca. Após 3-4 dias dá-se a eclosão das larvas, que começam a alimentar-se imediatamente. À medida que elas se desenvolvem, penetram no interior da espiga e iniciam a destruição dos grãos em formação. O período larval varia de 13 a 25 dias, no qual estão sempre se alimentando e causando prejuízos. Os prejuízos causados pela H. zea não se limitam apenas a alimentação direta dos grãos da espiga. Podem cortar o cabelo da espiga, impedindo a 11

14 fertilização e, consequentemente, causando a má granação, provocando falhas na espiga. Além disso,podem causar perfuração da palha, permitindo a penetração de microrganismos, além de favorecer a infestação por outras pragas importantes, tais como o caruncho (Sitophiluszeamais) e a traça (Sitotrogacerealella). No Brasil os prejuízos causados pela H. zeasão da ordem de 8 a 10%. As lagartas dad. saccharalis,na fase inicial de desenvolvimento das plantas demilho, podem atacar o cartucho, cujos danos, se foremsuperficiais, resultam na formação de uma série de furostransversais na lâmina foliar.se o dano for mais profundo, o ponto de crescimento da planta pode ser atingido, provocando o sintoma característico de coração-morto. Em plantas de milho mais desenvolvidas, as lagartas, geralmente de 3º ínstar, penetram no colmo, onde fazem galerias ascendentes. À medida que se desenvolvem, a capacidade de dano das larvas aumenta, fazendo com que o colmo das plantas fique enfraquecido e sujeito ao quebramento. Cada larva pode consumir de dois a três nós. Eventualmente pode haver danos às espigas. A capacidade de dano médio da praga pode resultar em perdas de 21 a 27% no rendimento de grãos. Noentanto, prejuízos maiores podem ocorrer principalmente se o ataque ocorrer nos entrenós próximos à espiga, o que acaba afetando a relação fonte/dreno da planta. Para se evitar maiores danos e perdas, se faz necessário o controle tanto destas, como de outras pragas e doenças que atacam não só o milho como qualquer outra cultura. E, quando se pensa em controle, o que inicialmente vem àcabeça do produtor, pela praticidade, facilidade de compra e rapidez de ação, é a aplicação de inseticidas químicos. Segundo dados do BNDES (Banco Nacional de Desenvolvimento), em 2010 a indústria brasileira de inseticidas totalizou vendas de US$ 7,3 bilhões.entre 1990 e 2010 o mercado brasileiro cresceu 576%, enquanto o mercado mundial aumentou 83%. Como resultado, a participação das vendas da indústria de defensivos no Brasil, em relação às vendas globais, aumentou de 10% para 15,3% no período. 12

15 Nos sistemas agrícolas os inseticidas químicos são frequentemente e indiscriminadamente utilizados para reduzir os danos causados nas lavouras e, consequentemente, o prejuízo econômico (MOSCARDI, SOUZA, 2002). Porém, este método pode acarretar efeitos maléficos como o desequilíbrio biológico, a poluição do meio ambiente pela geração de resíduos, risco de intoxicação para o homem na aplicação e consumo acidental do inseticida, além do alto custo para o agricultor (VALICENTEet al., 1988). O uso indiscriminado de agrotóxicos acarreta também uma redução da população de organismos benéficos. As pragas podem sofrer o processo de seleção natural, sendo que as resistentes podem obter sucesso reprodutivo e conseguir, ao longo de várias gerações, passar os genes de resistência a seus descendentes. Com isso, o produtor, cada vez mais, necessita de uma dose maior de inseticida e às vezes precisa recorrer a outros produtos mais tóxicos (VALICENTE, CRUZ, 1991). Como alternativa ao controle de pragas, e atualmente devido ao surgimento de novas pragas, tem-se o controle biológico e o uso de bioinseticidas. De acordo com Vlak (1993), o alerta aos riscos ambientais gerados pelos inseticidas químicos traz uma preocupação em buscar novas alternativas, incluindo o uso de agentes microbianos como os Baculovírus e o Bacillusthuringiensis. Não só a introdução de uma nova espécie de praga no sistema agrícola brasileiro, mas os problemas causados pela utilização de apenas um método de controle de pragas têm ocasionado uma seleção de pragas resistentes. Isso nos mostra a importância de se ter rotineiramente o manejo integrado como princípio fundamental, de tal modo que o produtor possa rapidamente adequar medidas que também sejam eficientes, econômicas e ambientalmente adequadas para reduzir a população da nova praga a níveis de danos não econômicos. Contudo, as demais espécies de insetos fitófagos não devem ser negligenciadas por conta do aparecimento de novas pragas. Todo o conhecimento gerado pelas instituições de pesquisa e, por que não, pelo produtor,deve ser utilizado para que se possa reduzir a probabilidade de haver prejuízos aos produtores e à sociedade como um todo. 13

16 O controle biológico de pragas é considerado por Valicente e Cruz (1991) como o uso de organismos vivos para manter a população de determinada praga em equilíbrio no agrossistema, de modo a não ocasionar danos econômicos ao produtor. Segundo Moscardi(1984), os bioinseticidas são uma alternativa ecológica e sustentável, contribuindo para se manter o equilíbrio do ecossistema. No controle biológico pode-se utilizar parasitóides, predadores e patógenos (VALICENTE, 1989). Recomenda-se que o controle da praga deve ser feito quando a infestação representar 20% das plantas e estas estiverem menores que cm de altura. Mas é bom salientar que o monitoramento, que tem como base a precaução e visitas periódicas ao campo, é a melhor maneira para possibilitar a escolha da época mais adequada. O mercado brasileiro de biopesticidas ou dos agentes de biocontrole gira em torno de 1 a 2% do total de agrotóxicos comercializados (US$97 milhões a US$194 milhões). Mesmo as estimativas mais conservadoras de crescimento do mercado de agentes de biocontrole são bastante otimistas em nível mundial, com projeções de atingir US$6,1 bilhões em Entretanto, com a entrada consistente das grandes empresas de pesticidas na área de biocontrole, as novas projeções elevam esse valor para US$25 bilhões em Para atingir essas cifras, porém, um longo caminho deverá ser percorrido, especialmente no desenvolvimento de produtos com características que viabilizem seu uso comercial em maiores escalas. O controle biológico de alguns Lepidópteros é feito também utilizando a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), que é uma bactéria gram positiva, encontrada no solo, água, palhada e insetos mortos.possui formato de bastonete, formadora de esporos e capaz de produzir inclusões cristalinas durante a esporulação, que são responsáveis pela atividade tóxica desta espécie (GLARE&O CALLAGHAM, 2000). Como esse microrganismo não é considerado um entomopatógeno com grande agressividade e nem sempre esporula em insetos, antes ou após a sua morte, dificilmente é encontrado em epizootia natural em insetos, porém alguns trabalhos relatam este fato (POLANCZYK& ALVES, 2004). 14

17 Possíveis locais de reprodução incluem o solo, a rizosfera, o filoplano ou outros tecidos da planta, insetos vivos ou mortos e outros invertebrados (RAYMONDetal., 2010). O gênero Bacillus possui uma fase de esporulação característica no seu desenvolvimento na qual o esporo bacteriano e cristais proteicos(figura 1) são simultaneamente formados, sendo estes últimos sob forma de inclusões parasporais. Figura 1: Bacillus thuringiensisem formato de bastonetes (lado esquerdo); cristal (seta inferior); esporo vegetativo (seta superior). As inclusões cristalinas produzidas pelo Bt(proteínas Cry), as quais são tóxicas a diferentes ordens de insetos tais como Lepidóptera, Coleóptera, Díptera e ainda nematoides e ácaros (FEITELSONetal., 1992), são formadas por polipeptídeos denominados δ-endotoxinas, que são liberadas junto ao esporo no momento da lise celular (DEAN, 1984; HANNAY&FITZ-JAMES, 1995). O modo de ação das toxinas Cry tem sido caracterizado principalmente em insetos lepidópteros. Estudos mencionam que a ação primária dessa toxina é lisar as células epiteliais do intestino médio do inseto-alvo pela formação de poros na membrana microvilosa apical das células do mesêntero (ARONSON &SHAI, 2001; de MAAGD etal., 2001, BRAVOetal., 2005). As protoxinas inativas ingeridas por 15

18 larvas suscetíveis dissolvem-se no meio alcalino do intestino, são solubilizadas e clivadas por proteases do intestino médio produzindo proteínas resistentes a proteases de kda (BRAVOetal., 2005). A ativação da toxina envolve a remoção proteolítica de um peptídeo N-terminal (25-30 aminoácidos para toxinas Cry1, 58 para Cry3A e 49 para Cry2Aa) e cerca de metade das proteínas restantes da porção C-terminal, no caso de protoxinascry longas. A toxina ativada então se liga a receptores de glicoproteínas específicos na borda da membrana das células epiteliais do intestino médio (de MAAGDetal, 2001; BRAVOetal, 2005) antes de inserir na membrana. Esses receptores, na verdade, desempenham um papel fundamental na determinação de suscetibilidade/resistência a uma toxina particular de B. thuringiensis, estando sua natureza sob intensa investigação (ALCÂNTARAetal., 2004). A inserção da toxina se dá de forma rápida e irreversível, levando à formação de poros líticos nas microvilosidades da membrana apical (ARONSON &SHAI, 2001; BRAVOetal., 2005). Posteriormente ocorre a lise celular e, muito provavelmente, resulta na permeabilidade seletiva de cátions. Ocorre então a ruptura do epitélio do intestino médio, liberando o conteúdo da célula, fornecendo um meio com esporos germinando e, como consequência, uma septicemia grave (de MAAGD etal., 2001; BRAVOetal., 2005) e/ou levando à paralisia do intestino, cessando a alimentação e, como consequência, a morte por fome (inanição), o que ocorre geralmente após 1-3 dias (ALIetal., 2010). De forma resumida, a ação do Bt se da através do consumo de alimento tratado com endotoxinas que geralmente resulta na parada da alimentação de larvas de lepidópteros devidoaparalisação do intestino, que retarda a passagem de material vegetal ingerido e permite que os esporos germinem e passem a crescer vegetativamente. Quando as larvas se alimentam com altas doses da toxina sofrem uma paralisia geral seguida de morte. Com doses mais baixas ou em insetos menos susceptíveis, o dano às células intestinais é suficiente para parar a secreção normal do intestino, o qual abaixa o ph do lúmem, permitindo a germinação dos esporos. A eficiência de determinada proteína não está associada apenas ao fato dela ser ou não ativada, mas também a uma associação com os receptores do inseto alvo e o seu grau de solubilização. Por exemplo, Cry1Ac liga-se bem aos receptores de membrana da lagarta da beterraba (Spodoptera exigua), mas há muito pouca 16

19 toxicidade a este inseto (GARCZYYNSKIetal., 1991). Já a proteína Cry1Ab, que não se liga aos receptores de membrana da mariposa cigana (Lymantriadispar)é mais tóxica do que Cry1Ac, (WOLFERBERGER, 1990). As diversas linhagens de Btproduzem, em adição às endotoxinas, uma série de outras toxinas que podem ou não participar da ação entomopatogênica, tais como as proteínas Cyt (Cytolytic) e VIP (Vegetative insecticidal proteins ) (LERECLUSetal., 1993). Tais cristais em Bt, também chamados de δ-endotoxinas, são codificados pelos chamados genes cry e vêm sendo utilizados nos últimos 40 anos na formulação de bioinseticidas comerciais que forneceram níveis adequados e consistentes de controle biológico para diversas espécies de insetos-praga na agricultura (ESTRUCHet al., 1997; SCHNEPFet al., 1998). As proteínas (δendotoxinas) que formam estes cristais somam entre 20 a 30% das proteínas totais da bactéria na fase de esporulação. Proteínas Cry são δ-endotoxinas especialmente tóxicas para as ordens de insetos Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera e Diptera, e também aos nematóides. A definição de uma proteína Cry é bastante ampla: uma inclusão protéicaparasporal (cristal) de B. thuringiensis que exibe algum efeito tóxico experimentalmente verificável para um organismo alvo ou qualquer proteína que tenha similaridade de sequencia para uma proteína Cry conhecida (CRICKMOREetal., 1998). Porém, o Bt também produz outras toxinas, como por exemplo a β-exotoxina, que é solúvel em água, termoestável e dialisável.a sua estrutura química é um derivadade fosforilado de adenina. Encontramos vários tipos de beta-exotoxinas e, ao contrárioda delta, elas não são produzidas por todas as cepas de Bt. A sua produção está associada com certos sorotipos como H1, H4, H8, H9 e H10 (FERNANDÉZ & VEGA, 2002). Mas há um empecilho para a produção de bioinseticidas a base de Bt que contenham esta toxina. É que além de ser tóxica para uma quantidade grande de insetos, ela é tóxica para vertebrados, não sendo, portanto, liberadasa sua produção e comercialização. 17

20 As duas maiores aplicaçõesdas toxinas de Bt são: o controle de pragas no campo e vetores de doenças humanas através de bioinseticidas e o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas resistentes a insetos. Visando a produção de bioinseticida, obt pode ser cultivado em meio sólido, líquido e semi-sólido.o uso comercial de meios alternativos como fonte de nutriente para o crescimento desta bactériapode ser uma forma econômica para a produção de biopesticida para o controle, por exemplo, da lagarta do cartucho do milho. O meio de cultura é uma solução de nutrientes utilizada para promover o crescimento de microrganismo em laboratório e deve conter uma série de fatores químicos e físico-químicos (ambientais) para proporcionar à bactéria um crescimento próximo ao ideal. Dentre os fatores químicos podemos citar a água, macro e micro nutrientes e fatores de crescimento.com relação aos fatores ambientais temos temperatura, ph, pressão osmótica e O 2. Para o crescimento do Bt, devem ser adicionados ao meio de cultura os macronutrientes: Carbono, como fonte de energia e que é componente de aminoácidos, ácidos orgânicos, bases nitrogenadas e é necessário para todos os compostos orgânicos que constituem uma célula viva; e o Nitrogênio, que após o Carbono é o elemento mais abundante nas células,sendo fundamental na síntese de DNA, RNA e ATP. Além disso, é importante a presença de micronutrientes como Magnésio (possui importante papel na estabilização de ribossomos, membranas celulares e ácidos nucleicos), Ferro, Zinco e Manganês, sendo este último um dos principais responsáveis pela formação do cristal protéico, que é tóxicoalepidópteros. Além disso, fatores ambientais como temperatura, que deve ser ótima para que não ocorra aceleração nem retardamento do crescimento microbiano, ph ideal, evitando a desnaturação de enzimas e promovendo de maneira eficiente as reações químicas dentro da célula, pressão osmótica para evitar a absorção ou perda de água em excesso pela bactéria para o meio de cultura ou vice-versae oxigenação constante para otimizar o crescimento, são também essenciais para o bom crescimento e desenvolvimento da bactéria. 18

21 MATERIAL E MÉTODOS Cepa de Bacillus thuringiensis utilizada A cepa de Bacillusthuringiensis utilizada no trabalho foi a 1644, pertencente ao banco de microrganismos da Embrapa Milho e Sorgo. Para a utilização desta cepa foi necessário realizaranteriormente uma analise quanto à presença de β-exotoxina que, como jácitado, é uma toxina produzida naturalmente pelo Bt e que é toxica para vertebrados, não sendo, portanto, aceitapara produção de inseticidas biológicos contendo esta toxina. Para a análise molecular quanto à presença de genes tóxicos às pragas cuja eficiência deste inseticida foi testada, foi utilizada a técnica da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) para detecção de presença de tais genes. Para a utilização desta técnica há a necessidade da extração e purificação de DNA de tal cepa. Extração do DNA de Bacillus thuringiensis O DNA da cepa estudada foi extraído e purificado de acordo com Shuhaimiet al. (2001), com algumas modificações. A cepa foi plaqueada em meio LB sólido e mantida à temperatura de 30 C durante 16h. Com o auxílio de uma alça de platina, toda a massa celular foi raspada e transferida para um microtubo e ressuspendida em 700µL de solução tampão (50 mmde Glicose, 25 mmde Tris/HCl e 10 mmde EDTA ph 8,0) e lizosima na concentração de 20 mg.ml -1, sendo levado ao banhomaria a 37 C por 30 min. Em seguida adicionaram-se 25 µl de SDS 10% e 5 µl de proteinase K (20 mg.ml -1 ) seguido de incubação a 60 C por 1h. Após esse período, 500 µl de fenol/clorofórmio/octanol (25:24:1) foram adicionados seguido de centrifugação por 2 min a 12000g. Do sobrenadante transferiu-se 300 µl para um novo tubo, acrescentou-se o mesmo volume de acetato de potássio 3M e 600 µl de isopropanol, verteu- se suavemente e centrifugou-se a 12000g por 10 min. 19

22 O sobrenadante foi cuidadosamente descartado, o pellet foi lavado com 300 µl de etanol 70% gelado e novamente centrifugado a 12000g por 5 min. Novamente descartou-se o sobrenadante e secou-se o pellet de forma que não ficasse resíduo de etanol e ressuspendeu-se em 150 µl de TE (TRIS HCl 10 mm; EDTA 1mM ph 8,0). A integridade do DNA extraído foi constatada através de corrida eletroforética em gel de agarose 1% e sua quantificação se deu através do aparelho Nanodrop 16(ND-1000 V3.1.2). Em seguida a amostra foi diluída para uma concentração de 10ng.L -1. A amostra de DNA original foi armazenada a 20 C e a amostra de trabalho, diluída e armazenada a 4 C. Para a caracterização molecular foram utilizados iniciadores para os genes Cry já descritos na literatura (CERÓNet al., 1994; CERÓNet al., 1995; VALICENTEet al., 2010; ESPINASSEet al., 2003; HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZet al., 2009; IBARRAet al., 2003) (Tabela 1), além de iniciadores definidos por nossa equipe e ainda não publicados. Foi testada a presença dos genes:cry1ab/1ac,cry 1Aa/1Ad,Cry 1Ac,Cry 1B, Cry 1D,Cry 1C, Cry 1Fa/1Fb,Cry 1G,Cry 1A5,Cry1Ab,Cry 1Fb,Cry 1Fa1/1Fb,Cry 1I,Cry 1H,Cry 2Aa, Cry 2Ab,Cry 2Ac,Cry 2 Ad,Cry 9,Cry 9A,Cry 9Be Cry 9D. 20

23 Tabela 1. Sequencia e temperatura de anelamento dos iniciadores utilizados na detecção de genes Cry em cepa de Bacillus thuringiensis. Iniciador Sequencia (5'-3') N de Pares de Bases Tm ( C) Referência Cry9D Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes Cry 9B Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes Cry1Ac GTTAGATTAAATAGTAGT GG Ceronet. al., 1994 Cry2Ad Iniciador ainda não publicado - - Silva-Fagundes Cry1D Cry1 A5 CTGCAGCAAGCTATCCA A CGCCACAGGACCTCTTA TC Ceronet. al., Valicente etal., 2010 Cry9 Iniciador ainda não publicado Cry9Aa Iniciador ainda não publicado - - Silva-Fagundes - - Silva-Fagundes Cry 1H Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes Cry1Ab AATTTGCCATCCGCTGTA Valicente etal., 2010 Cry 1B Cry1Aa/Cry1Ad Cry1Ab/Cry1Ac Cry1C Cry1Fa/Cry1Fb Cry1Fa1/Cry1Fb CTTCATCACGATGGAGTA A TTG GAG TCT CAA GGT GTA A CTC TTA TTA TAC TTA CAC TAC CAA ACT CTA AAT CCT TTC AC CGG TTA CCA GCC GTA TTT CG TAA TAG GGC GGA ATT TGG AG Ceronet. al., pb 53 Ceronet. al., pb 55 Ceronetal., pb 55 Ceronetal., pb 50 Ceronetal., pb 55 Valicente etal., 2010 Cry1I Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes Cry2Aa Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes Cry2Ab Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes 21

24 Cry2Ac Iniciadoraindanãopublicado -- - Silva-Fagundes 968F CGCCCGCCGCGCGCGG CGGGCGGGCGGGGGCA CGGGGGGGAACGCCAA 600 pb - Nubeletal. (1996) e Lane (1991) GAACCTTACTGACTGACT 1494R GAGGYTACCTTGTTACG ACTT *Código universal para bases degeneradas: R=A, G; Y=C, T; M=A, C; S=G, C; H=A, T, C; D=G, A, T; N=A, C, G, T. Tm: Temperatura de anelamento. Para eliminação de falso negativo foram utilizadosiniciadorespara amplificação do gene 16S ribossomal, sendo esta subunidade encontrada no RNA ribossomal de procariontes. (968F e 1494R). Para as reações de amplificação foram utilizados microtubos de 0,2 ml contendo um volume final de 10 µl, com 30 ng de DNA, 3mM de MgCl 2, 1 µl de tampão 10 (Tris 20 mm e KCl50 mm), 250 µm de dntps (A, T, C, G), 10 µm de cada iniciador e 1 unidade de Taq DNA Polimerase. As amplificações foram realizadas em termocicladorveriti 96- Well ThermalCycler (AppliedBiosystems) utilizando o seguinte programa:95 C por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 95 C por 1 minuto, temperatura de anelamento específica para cada iniciador (Tabela 1) por 1 minuto e 72 C por 1 minuto, seguido de um ciclo de 72 C por 10 minutos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em géis de agarose (1,5% ou 2,0%, variando de acordo com o tamanho do fragmento amplificado). Foi utilizado Gel Red (BIOTIUM) para a visualização do produto de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Após a corrida o gel foi visualizado sob luz ultravioleta. As imagens foram captadas pelo fotodocumentador Kodak Gel Logic 200 Imaging System. Após a detecção destes genes foi feita uma comparação de genes tóxicos a algumas pragas descritas em Kees van Frankenhuyzen (2009), que relaciona a presença do gene com a toxicidade a algumas ordens de inseto. 22

25 Produção do bioinseticida Para a produção do pré-inóculo foi utilizado o meio de cultura LB (Luria Bertani)sólido (12g de Bacto Ágar), acrescido de sais (0,002 g.l -1 de FeSO 4, 0,02 g.l -1 de ZnSO 4, 0,02 g.l -1 de MnSO 4, 0,3 g.l -1 de MgSO 4 ), ph ajustado para 7,5. A incubação foi realizadapor 24 horas a 28 C. Posteriormente as placas foram raspadas e o material foi retirado e inoculado em meio de cultura LB + sais líquido e deixadosob agitação constante de 200 RPM por 16 horas a 28 C. Para averiguação da quantidade de esporos presentes no pré inoculo foi feita uma contagem inicial em câmera de Newbauer utilizando microscopia de contraste de fase. Após esta etapa foi realizado um teste rápido de mortalidade quanto à toxicidade desta cepa às três espécies testadas (Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea e Diatrea saccharalis). Após confirmação da quantidade de esporos presentes e da eficiência da cepa para o controle de tais pragas, o pré-inoculo foi adicionado ao meio de cultura proposto em Valicente e Mourão (2008), composto por 4,0% de glicose de milho (fonte de Carbono), 3,0% de farinha de soja (fonte de Nitrogênio), além dos micronutrientes (FeSO 4, ZnSO 4, MnSO 4 e MgSO 4 ), que são essenciais para o crescimento e desenvolvimento da bactéria, ph ajustado para 7,5 e mantido sob agitação (200 RPM) e temperatura (28 C) constantes. Amostras foram coletadas em períodos pré determinadose armazenadas para posterior realização dos testes (Tabela 2). Foi feita a inoculação de 5% do pré inoculo no meio de cultura a ser avaliado. Foram feitas 3 repetições e os erlenmeyers foram deixados em shaker com agitação constante (200rpm) por 72 horas a 28 C. Tabela 2. Horários de coleta das amostrasdo produto em processo de fermentação e testes realizados. Amostra Horas após inoculação ph Densidade ótica Massa celular Contagem de esporos Mortalidade 23

26 01 00 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Parâmetros avaliados durante o crescimento Densidade Ótica Amedição da densidade ótica (DO) a 600nm do meio de cultura foi realizada utilizando-se espectrofotômetro. Biomassa Amostras de 100 ml foram centrifugadas a rpm durante 20 min. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi liofilizado. O peso seco foi calculado e expressoem gramas por litro. Contagem de esporos 24

27 As amostras coletadas foram submetidas a diluições seriadas e a contagem de esporos realizada em câmera da Newbauer, microscopia de contraste de fase, em três repetições. ph O ph do meio foi ajustado inicialmente para 7,5 ± 0,1 com NaOHapós a esterilização, e foi medida a intervalos regularesdurante 72h do processo de fermentação utilizando-se um medidor de ph de bancada. Teste de toxicidade O complexo de cristais de esporos produzidos em diferentes horários foi testado contra lagartas de dois dias de idade(s. frugiperda, H. zea e H. armigera) e de cinco dias de idade (D. saccharalis) criadas em laboratório. A fim dedeterminar a toxicidade, a cultura foi amostrada em 8, 24, 32,48, 56 e 72horas após inicio do processo de fermentação. Foi utilizado o método de superfície para testar a toxicidade, no qual foi aplicado 165 µl da suspensão de esporos/cristais sobre um pedaço de dieta artificial com aproximadamente 3,5 cm 3 de volume. Após inoculação as lagartas foram mantidas em BOD a27 C, 70% de UR (Umidade Relativa) efoto período de 16 horas de luz e 8 horas de escurodurante 7 dias. Após este período foi avaliada a eficiência/taxa de mortalidade das lagartas. RESULTADOS E DISCUSSÃO 25

28 PCR Dos 20 iniciadorestestados para a identificação dos genes Cry presentes na cepa 1644, dez tiveram resultados positivos, como mostrado na Tabela 3. Tabela 3. Detecção de genes Cry na cepa 1644 de Bacillus thuringiensis. Genes Presença / ausência cry1ab/1ac + cry1aa/1ad + cry1ac - cry1b + cry1c + cry1d - cry1fa/1fb - cry1a5 + cry 1Ab + cry1fa1/cry1fb1 - cry 1I + cry 1 H + cry2aa - cry2ab + cry2ac - cry2ad - cry9 + cry9aa - cry9b - cry9d - Levando em consideração os relatos em Kees van Frankenhuyzen (2009), as classes de genes aqui analisadas e detectadas nesta cepa (Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1I, Cry1H, Cry2Ae Cry9) apresentam certa toxicidade àordem Lepidóptera, que são os insetos alvo deste estudo. Neste mesmo trabalho, analisando a nível de espécie, podemos citar cinco genes (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1aC, Cry1Ad e Cry2Ab) presentes nesta cepa que são tóxicos a pelo menos uma espécie de lagarta testada. Deve-se considerar que há a 26

29 possibilidade da presença de outros genes tóxicos a estas lagartas que não foram testados ou até mesmo detectados nesta cepa. Contagem de esporos e mortalidade das lagartas Foram feitas três contagens de número de esporos do pré inoculo em câmara de Newbauer, podendo-se observar uma concentração de 3,175 x 10 7 esporos.ml - 1.Já as taxas de mortalidade foram de 95% pra S. frugiperda, 70% para H. zea e 65% para D. saccharalis. Densidade ótica A leitura da densidade ótica (DO) de uma cultura bacteriana em espectrofotômetro nos da uma estimativa da concentração celular no meio. Como podemos observar na Figura 2, houve um aumento da DO entre 8 e 24 horas após a inoculação,sendo que após 24 horas essa variação é bem menor, se mantendo quase estável. Resultado similar foi relatado por Ernandesetal. (2007), no qual foi observado um crescimento exponencial de Bt entre 12 e 24 horas de inoculação. 27

30 1,2 Densidade ótica 1,0 Absorbância 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs Tempo de fermentação Figura 2. Leitura de densidade ótica das amostras de Btcoletadas em espectrofotômetro a 600nm. Biomassa A maior produção de biomassa foi observada 72 horas após a inoculação,sendo de 3,83 g.l -1. A Figura3mostra o crescimento bacteriano expresso em g.l -1. Resultados similares foram relatados por Valicente et. al(2010) após trabalho no qual também foram utilizados meios de cultura alternativos contendo Nitrogênio e Carbono como fonte de nutrientes para o Bt. 28

31 6 Biomassa 5 4 g/l h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs Tempo de fermentação Figura 3. Produção de massa celular das amostras coletadasem função do tempo de cultivo. Contagem de esporos Assim como relatado em Valicente et.al(2010) e Valicente e Mourão (2008), após um período de crescimento há uma queda na concentração de esporos a partir de 72 horas após a inoculação, apesar de terem sido feitos testes com meio de cultura diferentes. Já no presente trabalho é possível observaruma redução na concentração de esporos após 56 horas de inoculação (Figura 4). 29

32 4e+8 Concentração de esporos 3e+8 Esporos / ml 2e+8 1e+8 0 0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs Tempo de fermentação Figura 4. Variação do número de esporos de Btpor ml do meio de cultura em função do tempo de cultivo. Correlação entre concentração de esporos, biomassa e densidade ótica Assim como relatado em diversos trabalhos de fermentação e produção de bioinseticidas (ANEGELO etal, 2010; VALICENTEetal. 2010; VALICENTE e MOURÃO 2008; ERNANDES etal., 2007; VIEIRAetal., 2008), há uma tendência que com o passar do tempo, após a inoculação do Bt em meio de cultivo, a massa celular, densidade ótica e concentração de esporos também aumente, pois estas tem uma relação direta entre si. Na Figura 5 podemos observarumacorrelação entre crescimento, massa celular e a concentração de esporos, sendo que no inicio (0 horas a 24 horas) a densidade ótica também seguiu essa tendência, mas após esse período a cultura entrou no estágio estacionário. 30

33 3,50E+08 Concentração de esporos x Biomassa x D. O 4,5 3,00E+08 2,50E+08 2,00E+08 1,50E+08 1,00E+08 5,00E+07 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Contagem de esporos (esp/ml) Massa celular (gr/ml) Densdidade ótica 0,00E+00 0 h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs 0,0 Figura 5. Comparação entre concentração de esporos de Bt,biomassa e densidade ótica ao longo do tempo de cultivo. ph Vários autores relatam a queda do ph no inicio da fermentação seguida do aumento do phapós 96 horas de crescimento. Na Figura 6 é possível observar uma redução no ph um pouco mais significativa entre 8 a 24 horas de inoculação,ocorrendo um aumento após este período. Valores de ph maiores que 7 talvez não tenham sido alcançados neste experimento pelo fato da fermentação ter sido encerrada com 72 horas de crescimento. 31

34 7,0 ph 6,5 6,0 ph 5,5 5,0 4,5 4,0 0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs Tempo de fermentação Figura 6.Determinaçãodo ph em diferentes tempos de crescimento de Bt após o inicio do processo fermentativo. Toxicidade Uma eficiência na toxicidade do Bt a espécies de insetos pragas é o principal objetivo quando se inicia um processo fermentativo. Em testes já realizados no laboratório de Controle Biológico da Embrapa Milho e Sorgo com esta cepa e utilizando o meio de cultura LB + sais, foi possível encontrar até 100% de mortalidade para algumas destas pragas testadas neste estudo. Porém, como pode ser observado nafigura 7, em nenhum momento foi observada toda essa eficiência, sendo as maiores eficiências observadas para S. frugiperdaapós 72 horas da inoculação (81,75%), para H. zeaapós 72 horas da inoculação (58,75%) e para D. saccharalis após 56 horas da inoculação (50,00%). 32

35 100 Mortalidade Spodoptera frugiperda 80 Helicoverpa zea Diatrea saccharalis % mortos h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs Tempo de fermentação Figura 7. Toxicidade de Bt a diferentes insetos pragas do milho, em diferentes tempos de cultivo. 33

36 CONCLUSÕES De uma forma geral os resultados de ph, densidade ótica, biomassa e concentração de esporos corroboraram com os resultados de vários outros trabalhos. Os resultados obtidosacompanharam o que é comumente encontrado quando se trabalha com fermentação de Bacillusthuringiensis. O resultado mais importante relaciona-se com aeficiência no controle das pragas Diatreasaccharalis, Helicoverpazea e Spodopterafrugiperda. Porem não houve controle satisfatório de tais pragas, sendo recomendável novos estudos e o teste de meios de cultura alternativos com diferentes composições e proporções de fontes de Carbono e Nitrogênio como fontes de nutriente para se obter um biopesticida eficiente a partir do crescimento debt. Pois esta mesma cepa testada com o meio de cultura padrão do laboratório (LB + sais), apresentou eficiência no controle de tais pragas acima de 90%, porem o alto custo de meio, pode inviabilizar a produção do biopesticida em escala comercial. 34

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