Universidade do Sagrado Coração de Jesus Gisele Blassioli Dalpino

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1 Universidade do Sagrado Coração de Jesus Gisele Blassioli Dalpino O EMPREGO DA RESSONÂNCIA DO SPIN ELETRÔNICO COMO TÉCNICA AUXILIAR NA DETERMINAÇÃO DO GRAU DE MINERALIZAÇÃO DO OSSO NEOFORMADO EM MODELOS DE CICATRIZAÇÃO ÓSSEA GUIADA. Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação, da Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, no Programa de Pós-graduação em Biologia Oral. Orientadora: Prof. Dra. Angela Kinoshita Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio A. Catanzaro Guimarães Bauru 2006

2 Dalpino, Gisele Blassioli D149e O emprego da ressonância do spin eletrônico como técnica auxiliar na determinação do grau de mineralização do osso neoformado em modelos de cicatrização óssea guiada / Gisele Blassioli Dalpino f. Orientadora: Prof. Dra. Ângela Kinoshita Dissertação de Mestrado (Biologia Oral) - Universidade do Sagrado Coração, Bauru, São Paulo. 1.Ressonância do Spin eletrônico 2. Regeneração óssea 3. Membrana de Poliuretana 4. Membrana de politetrafluoretileno I.Kinoshita, Ângela II.Título.

3 DALPINO, Gisele Blassioli. O emprego da Ressonância do Spin Eletrônico como técnica auxiliar na determinação do grau de mineralização do osso neoformado em modelos de cicatrização óssea guiada. Dissertação de Mestrado em Biologia Oral apresentada à Universidade do Sagrado Coração de Jesus e aprovada pela seguinte banca examinadora: Orientadora: Prof(a). Dra. Angela Mitie O. Kinoshita Programa de Pós Graduação em Biologia Oral da Universidade do Sagrado Coração, Bauru, São Paulo. Departamento de Física e Matemática da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo. Prof. Dr. Sérgio Augusto Catanzaro Guimarães Programa de Pós Graduação em Biologia Oral da Universidade do Sagrado Coração, Bauru, São Paulo. Prof. Dr. Orivaldo Tavano Curso de Pós Graduação em Odontologia, sub área: radiologia - Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic Campinas, São Paulo. Bauru, 06 de outubro de 2006.

4 Dedico este trabalho à...deus meus pais Renato e Sueli, pela dedicação, amor eterno, compreensão, exemplos de comportamento, de força e coragem em que sempre me espelho. Obrigada por tudo. meu marido Fabio, pelo incentivo, apoio nas horas difíceis, pelo amor, confiança e cumplicidade em todos os momentos. Eu te amo. meu irmão João Gabriel pelo amor, carinho, apoio e compreensão durante toda a minha vida. E principalmente aos meus filhos, Gabriela e Leonardo, donos do meu mais puro e verdadeiro amor. Vocês são a alegria de toda a minha vida.

5 AGRADECIMENTOS À minha orientadora Professora Doutora Angela Mitie O. Kinoshita, pela imensa sabedoria, capacidade e dedicação em pesquisa científica, pelo apoio, compreensão e confiança em mim depositada desde o início do curso. Com toda admiração e respeito.

6 Ao Coordenador do Curso de Pós Graduação em Biologia Oral da USC Professor Doutor Sérgio Augusto Catanzaro Guimarães pela experiência e capacidade de administrar muito bem um curso de suma importância, pelo carinho, apoio, colaboração na realização deste trabalho e pela segurança sempre transmitida em todas as decisões. Você sempre será um exemplo a ser seguido. Ao Professor Doutor Orivaldo Tavano, pela importante colaboração neste trabalho, por toda paciência e disponibilidade de nos ajudar na análise dos resultados. A todos os professores, colegas e funcionários do curso de Pós-graduação em Biologia Oral da USC, pela convivência e amizade durante todo o curso. Ao Departamento de Física e Matemática da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto USP, pelos registros dos espectros da Ressonância do Spin Eletrônico. Ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares de São Paulo, pela irradiação das amostras. As amigas Aline e Rita, pela amizade e principalmente pelo auxílio nos procedimentos cirúrgicos deste trabalho.

7 Ao funcionário do biotério Sérgio, pela imensa ajuda nos procedimentos cirúrgicos e cuidados diários com os animais estudados. Obrigada por toda sua atenção. A técnica e histologia Mayra pela preparação das lâminas. Ao técnico de laboratório Wilson, pela grande ajuda na fase final da análise histológica das peças. A FAPESP pelo apoio financeiro através do processo 03/ trabalho. Agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste

8 "Estar presente no próprio corpo, por meio do exercício constante da atenção, conduz a atitudes justas e harmoniosas em todas as nossas relações. Gabriela Bal - terapeuta corporal

9 RESUMO O mecanismo e o curso da formação óssea em resposta ao implante de materiais apresentam questões de importância fundamental na instituição da terapia de reconstrução óssea. Com o objetivo de estudar o processo de regeneração óssea foi utilizada a técnica de Ressonância do Spin Eletrônico, que proporciona informações sobre a mineralização óssea. Para tanto, foram realizados defeitos ósseos no crânio de 27 coelhos divididos em 3 grupos, sendo eles: grupos experimentais (A e B) e grupo controle (C). No grupo A foram utilizadas membranas oclusivas de resina de poliuretano, no grupo B, membranas de politetrafluoretileno e no grupo controle C, não foi utilizada barreira mecânica. Após os períodos de 30, 60 e 120 dias, os animais foram sacrificados e as peças foram coletadas e submetidas à análise radiográfica, histológica, histométrica e por ressonância do spin eletrônico. Na análise estatística dos resultados da histometria óssea (ANOVA), observou-se para o período de 30 dias, que as médias dos grupos A e B não tem diferença estatisticamente significativa tanto na região de neoformação da margem do defeito quanto na região de neoformação do centro do defeito. Quando comparou-se estes grupos com o controle, houve diferença estatisticamente significativa nas duas regiões. Nos períodos de 60 e 120 dias, as médias dos grupos não têm diferença estatisticamente significativa. Com relação aos resultados da ressonância, para o período de 30 dias, as médias dos 3 grupos na região de neoformação na margem do defeito não têm diferença significante, porém foram diferentes estatisticamente na região de neoformação do centro do defeito. No período de 60 dias, as médias dos grupos não têm diferença estatisticamente significativa nas regiões de neoformação. Para o período de 120 dias a média do grupo

10 A não tem diferença estatisticamente significativa em relação à média do grupo B, porém, quando as médias destes dois grupos são comparadas com o controle, houve diferença estatisticamente significante. Concluímos com este estudo que a RSE pode ser utilizada para avaliar a dinâmica da regeneração óssea, fornecendo informações adicionais às análises radiológica e histológica, oferecendo dados sobre o grau de mineralização do osso neoformado. A análise histométrica, no período de 30 dias, e por RSE, nos períodos de 30 e 120 dias, mostraram a eficiência das barreiras mecânicas, no que se refere à evolução do reparo ósseo. Nestes mesmos períodos, a membrana de Poliuretano apresentou o mesmo desempenho da membrana de Politetrafluoretileno. Palavras chave: Ressonância do Spin Eletrônico, Regeneração Óssea, Membrana de Poliuretana, Membrana de Politetrafluoretileno.

11 ABSTRACT The mechanism of the bone formation as consequence of implant of materials are very important questions in the therapy of bone reconstruction. The subject of this work is the study of the bone regeneration by Electron Spin Resonance (ESR), that provides complementary information on the bone mineralization. Bone defects were made surgically in the calvarial of 27 rabbits divided in 3 groups: experimental groups (A and B) and control group (C). In the group A Polyurethane oclusive membranes were implanted; group B received polytetrafluorethylene membrane implant; and in the group C none membrane was used. After the periods of 30, 60 and 120 days, the animals were sacrificed and the calvarial bones were submitted to the radiographic, histological, histometric and ESR analysis. The statistical analysis (ANOVA) of the histometric results shows that the averages of the groups A and B did not present significant differences in the neoformation region in the border and center of the defect for the period of 30 days. In this period there is statistical difference in experimental gorups in comparison with control gorup in both regions os neoformation. In the periods of 60 and 120 days, the averages of the groups did not present significant differences. For the ESR results the averages of the neoformation region in the border of the defect did not show significant difference for the 3 gorups. However the averages presented statistical difference in the center of the defect. In the period of 60 days, the averages of the groups did not present statistical differences in the neoformation regions. For the period of 120 days, the average of the group A did not show significant difference when compared with the group B, however when both groups were compared with the control statistical difference was noted. In conclusion the ESR is able to evaluate the dynamic of the bone

12 regeneration, supplying additional information of the bone remodeling process in relation of radiological and histological analysis. The histometric analysis, in the period of 30 days, and the ESR in the periods of 30 and 120 days, showed the efficiency of the mechanical barriers in the bone repair with the same performance for the Polyurethane and Polytetrafluorethylene membranes. Key words: Electron Spin Resonance, Bone Regeneration, Polyurethane Membranes, Polytetrafluorethylene Membrane.

13 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 - Espectro de Ressonância do Spin Eletrônico de um Osso da calvária de coelho irradiado com 3kGy da radiação γ de uma fonte de Cobalto FIGURA 2 - Procedimento cirúrgico: (A) Incisão; (B) Divulsão muscular e periostal; (C) Confecção do defeito; (D) Defeito no tamanho de 5x15mm; (E) Membrana recobrindo a meninge e a superfície do defeito, grupos A e B; (F) Coágulo sanguíneo preenchendo o defeito, grupo Controle; (G) Sutura do Periósteo; (H) Sutura da pele FIGURA 3 - Sistema Digora FIGURA 4 - Imagem colorida da fotografia da lâmina através do software e as 3 regiões consideradas na análise: Osso Maduro Pré-existente, Neoformação na Margem do Defeito e Neoformação no Centro do Defeito FIGURA 5 - Análise Histométrica da região de Neoformação no Centro do Defeito. Osso Maduro Neoformado em verde e Osso Imaturo em amarelo FIGURA 6 - Análise Histométrica da região de Neoformação na Margem do Defeito. Em verde a região de Osso Maduro Neoformado, em amarelo a região de Osso Imaturo e em magenta, a Medula Óssea... 50

14 FIGURA 7 - Análise Histométrica da região de Osso Maduro Pré-existente. Em verde a região de Osso Maduro Neoformado e em magenta, a Medula Óssea FIGURA 8 - Espectrômetro Varian-E4 pertencente ao Departamento de Física e Matemática USP Ribeirão Preto FIGURA 09 - Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema C Digora do crânio de coelho no período de 30 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C FIGURA 10 - Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema Digora do crânio de coelho no período de 60 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C FIGURA 11 - Imagem radiográfica obtida digitalmente pelo sensor do Sistema Digora do crânio de coelho no período de 120 dias após a cirurgia, Grupos A, B e C FIGURA 12 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração: Tricrômico de Masson. Aumento original 2,6X. Grupo A, período de 30 dias FIGURA 13 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo B, período de 30 dias... 61

15 FIGURA 14 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 30 dias FIGURA 15 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo A, período de 60 dias FIGURA 16 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo B, período de 60 dias FIGURA 17 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 60 dias FIGURA 18 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo A, período de 120 dias FIGURA 19 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo B, período de 120 dias FIGURA 20 - Corte Histológico do defeito ósseo. Coloração Tricrômico de Masson, aumento original de 2,6x. Grupo C, período de 120 dias FIGURA 21 - Média e desvio padrão da análise histométrica de neoformação na margem do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias... 75

16 FIGURA 22 - Media e desvio padrão da análise histométrica de neoformação no centro do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias FIGURA 23 - Espectros de osso da calvária de coelho. (A) irradiado com diferentes doses e (B) espectro do osso irradiado com dose de 1500 Gy, em função do fator g, mostrando as posições de g e g // FIGURA 24 - Curva dose-resposta das amostras de osso temporal de coelho FIGURA 25 - Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo A, razão I NMD /I OMP = 48,6% FIGURA 26 - Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo B, razão razão I NMD /I OMP = 43,7% FIGURA 27- Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo Controle razão I NMD /I OMP = 52,7% FIGURA 28 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 30 dias FIGURA 29 - Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo A razão I NMD /I OMP = 70,9% e I NCD /I OMP = 52,0%... 81

17 FIGURA 30 - Espectros de RSE referente ao período de 30 dias após a cirurgia; Grupo B razão I NMD /I OMP = 89,6% FIGURA 31 - Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo Controle razão I NMD /I OMP = 60,2% e I NCD /I OMP = 46,8% FIGURA 32 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 60 dias FIGURA 33 - Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo A, razão I NMD /I OMP = 100% e I NCD /I OMP = 73% FIGURA 34 - Espectros de RSE referente ao período de 60 dias após a cirurgia. Grupo B, razão I NCD /I OMP = 98,2% FIGURA 35 - Espectros de RSE referente ao período de 120 dias após a cirurgia. Grupo Controle razão I NMD /I OMP = 65,2% FIGURA 36 - Média e desvio padrão do grau de mineralização óssea obtida pela RSE no centro e na margem do defeito dos grupos A, B e C, no período de 120 dias... 85

18 FIGURA 37 - Média e desvio padrão de neoformação na margem do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias FIGURA 38 - Média e desvio padrão de neoformação no centro do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias... 87

19 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo A, período de 30 dias TABELA 2 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo B, período de 30 dias TABELA 3 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo C, período de 30 dias TABELA 4 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo A, período de 60 dias TABELA 5 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo B, período de 60 dias TABELA 6 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo C, período de 60 dias TABELA 7 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo A, período de 120 dias TABELA 8 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo B, período de 120 dias TABELA 9 - Resultado da Análise Histométrica do corte histológico do defeito ósseo. Grupo C, período de 120 dias TABELA 10 - Resultado da análise histométrica das porcentagens de osso maduro neoformado, existentes no defeito ósseo dos coelhos do período de 30 dias... 72

20 TABELA 11 - Resultado da análise histométrica das porcentagens de osso maduro neoformado, existentes no defeito ósseo dos coelhos do período de 60 dias TABELA 12 - Resultado da análise histométrica das porcentagens de osso maduro neoformado, existentes no defeito ósseo dos coelhos do período de 120 dias TABELA 13 - Resultado da media e desvio padrão da análise histométrica de Neoformação na Margem do Defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias TABELA 14 - Resultado da media e desvio padrão da análise histométrica de neoformação no centro do defeito dos grupos A, B e C, nos períodos de 30, 60 e 120 dias TABELA 15 - Resultado do grau de mineralização óssea obtida pela RSE em todos os grupos no período de 30 dias TABELA 16 - Resultado do grau de mineralização óssea obtida pela RSE em todos os grupos no período de 60 dias TABELA 17 - Resultado do grau de mineralização óssea obtida pela RSE em todos os grupos no período de 120 dias TABELA 18 - Média e desvio padrão de neoformação na margem do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias TABELA 19 - Média e desvio padrão de neoformação no centro do defeito obtida pela RSE nos grupos A, B e C nos períodos de 30, 60 e 120 dias... 87

21 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 135 Sm-EDTMP Samarium Etilenodiaminotetrametileno difosfonico 89 SrCI 2 Cloreto de Estrôncio ANOVA Análise de variância BMP Proteína Morfogenética Óssea Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) Hidroxiapatita - - CO 2 - Radical Livre CO 2 FAPESP Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo Gy - Gray IPEN Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares Kg Kilograma kgy kilo Gray kvp kilo Volt ma - miliampere mas miliampere por segundo ml Mililitro mm - Milímetro MO Medula Óssea m-ptfe Membrana de Politetrafluoretileno NCD Neoformação no Centro do Defeito NMD Neoformação na Margem do Defeito OI Osso Imaturo OMN Osso Maduro Neoformado

22 OMP Osso Maduro Pré-existente PVPI Polivinilpirrolidona-iodo Radiação UV Radiação Ultra-Violeta Radiação y Radiação Gama ROG Regeneração Óssea Guiada RPE Ressonância Paramagnética Eletrônica RSE Ressonância do Spin Eletrônico TC Tecido Conjuntivo USC Universidade do Sagrado Coração USP Universidade de São Paulo

23 Sumário Página 1) Introdução ) Revisão da Literatura ) Tecido Ósseo: Estrutura e Formação ) Regeneração Óssea ) Regeneração Óssea Guiada ) Polímeros ) Ressonância do Spin Eletrônico ) Objetivos ) Materiais e Métodos ) Local e Grupo de Estudo ) Delineamento Experimental ) Técnicas e Procedimentos ) Obtenção das Membranas ) Técnica Cirúrgica ) Análise das Amostras ) Resultados ) Análise das Imagens Digitalizadas pelo Sistema Digora ) Período de 30 dias ) Período de 60 dias... 57

24 5.1.3) Período de 120 dias ) Análise Histológica e Histométrica ) Período de 30 dias ) Período de 60 dias ) Período de 120 dias ) Análise Histométrica Comparativa ) Período de 30 dias ) Período de 60 dias ) Período de 120 dias ) Análise por Ressonância do Spin Eletrônico ) Propriedades Dosimétricas de RSE do Osso da Calvária de Coelho ) Estudo da Dinâmica de Regeneração Óssea por RSE ) Discussão ) Conclusão ) Referência Bibliográfica Anexos Anexo 1 Termo de Aprovação do comitê de Ética em Pesquisa Anexo 2 Certificado de Apresentação do Trabalho na 18º JOB Anexo 3 ATA da Defesa de Mestrado

25 INTRODUÇÃO 25

26 26 1) INTRODUÇÃO O osso desempenha uma excelente função mecânica para o corpo humano, exibindo um forte potencial de regeneração, sendo capaz de reparar fraturas ou defeitos locais com uma organização estrutural altamente semelhante à original. Quando ocorrem defeitos com muita perda óssea devido a traumas, tumores, infecções ou anomalias do desenvolvimento, o osso ainda enfrenta um grande desafio durante a sua reconstrução, pois o crescimento de tecido conjuntivo frouxo no local da lesão apresenta-se como um obstáculo para a sua reparação, podendo perturbar ou impedir totalmente a osteogênese. Para tentar impedir a ocupação do tecido conjuntivo, vários procedimentos foram utilizados, como o uso de enxertos, implantes e também a técnica da Regeneração Óssea Guiada (ROG), que tem sido preconizada como um método efetivo para estimular a regeneração em defeitos ósseos cirúrgicos por mais de uma década (DUPOIRIEX et al, 1994). O uso de membranas oclusivas é eficaz na regeneração óssea guiada quando utilizadas como barreiras, formando um obstáculo mecânico que impede a invasão de células e tecidos não-osteogênicos competitivos na área do defeito, como o tecido conjuntivo frouxo, permitindo assim a ocupação local por células osteogênicas que irão orientar a regeneração óssea (SCHENK, 1994). Atualmente, diversos tipos de cirurgias ósseas guiadas têm utilizado membranas reabsorvíveis. Isto exclui os inconvenientes das membranas não reabsorvíveis, como uma segunda cirurgia para a sua remoção e prejuízos de um novo trauma cirúrgico na área do osso neoformado.

27 27 Estudos histológicos e radiológicos são normalmente empregados para a avaliação do processo de reparo ósseo. Além destes métodos pode-se usar a Ressonância do Spin Eletrônico (RSE), que consiste em uma técnica espectroscópica capaz de detectar qualquer material com spin eletrônico resultante diferente de zero. Dentre os diversos materiais que possuem essa característica, destacam-se os radicais livres. Radicais livres não estão presentes naturalmente em tecidos calcificados, mas podem ser criados através da interação com a radiação ionizante (raios X, raios γ ou UV). Os radicais livres gerados na parte orgânica destes tecidos são instáveis, ou seja, desaparecem com o tempo. Já os radicais gerados na parte mineral, cuja componente principal é a Hidroxiapatita, são estáveis e podem ser detectados e quantificados por RSE. Para uma amostra homogênea (de osso, dentina ou esmalte), quanto maior a dose de radiação, maior será a concentração de radicais presentes na amostra e maior será a intensidade do sinal de RSE. Da mesma forma, para uma amostra não homogênea, como a do presente estudo, para uma mesma dose de radiação, quanto maior a mineralização do tecido, maior é a concentração de radicais livres e, conseqüentemente, maior a intensidade do sinal de RSE. Desta forma, neste trabalho, utilizamos a RSE para avaliar a dinâmica da regeneração óssea e como a intensidade do sinal está associada ao grau de mineralização obtida nas diferentes fases, este dado pode ser utilizada como indicador da qualidade do osso regenerado.

28 REVISÃO DA LITERATURA 28

29 29 2) REVISÃO DA LITERATURA 2.1) Tecido Ósseo: Estrutura e Formação. Alem de desempenhar o papel de estrutura de sustentação do corpo, o osso tem outras funções como servir de apoio para as contrações dos músculos esqueléticos transformando-as em movimento, proporcionar proteção para as partes moles do organismo e também como reservatório de cálcio, fosfato e outros íons. É formado em cerca de 65% de componente mineral, conhecido como hidroxiapatita, 25% de matriz orgânica e 10% de água (BUSER D, 1994). A porção mineralizada do osso é composta por envoltórios de periósteo e endósteo, que possuem dois fatores importantes: potencial osteogênico e vascularização abundante, permitindo sua participação nas atividades modeladoras e reparadoras do tecido ósseo. As células presentes no tecido ósseo são os osteócitos, os osteoblastos e os osteoclastos, que são responsáveis pela constante remodelagem óssea, durante toda a vida do organismo (KATCHBURIAN & ARANA-CHAVEZ, 1999). Os osteoblastos são as células que formarão o tecido ósseo e estão presentes em todos os locais ativos de formação óssea. Sua função é secretar matriz osteóide que subseqüentemente mineraliza-se (SODEK, 2000) Quando um osteoblasto interrompe a secreção de matriz osteóide e fica encoberto pela matriz calcificada das células adjacentes, ele se torna um osteócito. Localizados em lacunas no interior da matriz óssea, os osteócitos são células achatadas em forma de amêndoas com inúmeros prolongamentos citoplasmáticos, que

30 30 se estendem e se comunicam através dos canalículos, por onde ocorre a difusão dos nutrientes, desempenhando um papel fundamental na manutenção da integridade da matriz óssea (STEVENS, 2001). Os osteoclastos são células especializadas em decompor matrizes calcificadas e pertencem a uma família de células gigantes, estando localizados em focos de reabsorção óssea (HID, 2003). A formação do tecido ósseo resulta de uma complexa cascata de ocorrências. Inicialmente ocorre a atração quimiotática dos precursores dos osteoblastos, mediada por fatores locais. Em seguida temos a proliferação dessas, cuja indução mitótica é mediada por fatores de crescimento liberados a partir do tecido ósseo degradado durante o processo de reabsorção. Numa fase mais avançada tem-se a diferenciação dos osteoblastos em células maduras que promovem a síntese de matriz óssea com posterior mineralização (ERIKSEN, 1986). 2.2) Regeneração Óssea. A regeneração fisiológica pode ser observada em muitos tecidos e sistemas orgânicos que sofrem uma reposição contínua de células, como por exemplo, as células sanguíneas, as células epiteliais, as glândulas e também o endométrio durante o ciclo reprodutivo. Durante a regeneração óssea, o osso cortical (denso) e trabecular (esponjoso) apresentam remodelagem, o que não é observado na cartilagem articular dos adultos, onde raramente ocorre divisão mitótica e a renovação dos componentes da matriz é extremamente lenta.

31 31 Quando temos uma lesão ou doença onde há perda de tecidos, o organismo desencadeia uma regeneração reparadora, dando inicio a um processo de cicatrização do local acometido. Os tecidos apresentam diferentes capacidades de se regenerar após uma lesão. A cartilagem articular é quase sempre substituída por tecido fibroso ou por fibrocartilagem menos diferenciada. Os tecidos conjuntivos altamente diferenciados, como ligamentos e tendões, nunca apresentam um nível original de organização e sempre se restabelecem com uma cicatriz de força mecânica reduzida. Diferente dos demais tecidos não só na sua estrutura fisioquímica, mas também na sua extraordinária capacidade de reparação e remodelação, o osso retorna completamente a sua estrutura e função originais depois de lesado, sem deixar cicatriz (SCHENK, 1994; SZACHOWICZ, 1995; HOLLINGER, 1996). O processo de reparação ocorre da mesma forma que o crescimento e desenvolvimento ósseo, onde uma lesão inicial desencadeia uma seqüência contínua de eventos celulares, terminando com a completa remodelação sem deixar cicatriz, sendo esse processo semelhante à ossificação intramembranosa ou endocondral (BOSTROM, 1998; JUNQUEIRA, 2002). 2.3) Regeneração Óssea Guiada A regeneração óssea guiada (ROG) consiste no uso de uma barreira mecânica para promover a formação óssea e impedir a invasão de tecidos competidores não osteogênicos (MUZALFER, 2004).

32 32 Vários estudos apresentam o uso da ROG no tratamento do reparo ósseo causado por eventuais patologias ou traumas (MACEDO, 2003). Como a ROG pode ser aplicada em defeitos ósseos cirúrgicos, ela também constitui um bom modelo para o estudo da reparação óssea. Esses desfeitos cirúrgicos são menos sujeitos aos fatores mecânicos e obstruções do suprimento sanguíneo em relação às fraturas e por isso têm sido amplamente utilizados em estudos com animais experimentais, buscando uma melhor regeneração óssea através da aplicação de diferentes materiais de enxerto (SCHENK, 1984; JUNQUEIRA, 2002). Inicialmente, o uso de membranas como barreiras foi estudado por Hurley e Boyne e posteriormente as membranas foram aplicadas para promover a regeneração periodontal, sendo um método testado em diferentes tipos de defeitos ósseos e ao redor de implantes dentais (BUSER, 1993). A neoformação em defeitos cirúrgicos se baseia em dois princípios básicos: osteoindução e osteocondução. O termo osteoindução tem sido usado para descrever o processo de diferenciação de células osteoprogenitoras em condroblastos e osteoblastos. Na osteocondução, um material condutivo serve como um substrato para novas formações ósseas, auxiliando as células durante a ocupação do local a ser regenerado (OSTRUM, 1994). A indução óssea pode ser obtida por dois processos: um mediado por células e outro mediado por fatores de crescimento. No primeiro, células mesenquimais indiferenciadas osteogênicas, colhidas da medula óssea, são colocadas na parede do defeito ósseo, pois estas células induzem a neoformação óssea, inclusive quando depositadas em ambiente não ósseo (SANDEBERG, 1993; LIND, 1998). No segundo,

33 33 fatores de crescimento específicos, denominados proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), são capazes de estimular a proliferação das células mesenquimais indiferenciadas osteoprogenitoras e a sua migração, reagregação e diferenciação em osteoblastos, com conseqüente deposição de matriz óssea (URIST, 1965; REDDI, 1986). As BMPs podem ser aplicadas isoladamente ou em associação com matriz óssea ou matriz dentinária, e estimular uma extensa osteoindução em defeitos ósseos (WOZNEY, 1992; CATANZARO GUIMARÃES, 1993; GONÇALVES, 1997). Durante a osteocondução, a neoformação óssea pode ser auxiliada por materiais com estrutura especializada, que atuam como um arcabouço de sustentação para a penetração de células ósseas. O material implantado serve de ancoragem para o crescimento de capilares, tecido perivascular e células indiferenciadas osteoprogenitoras originadas no leito ósseo cirúrgico, mas também deve impedir que tecidos não osteogênicos invadam o local a ser reparado. A utilização de membranas como barreiras à proliferação de fibroblastos para o interior do defeito ósseo permite um tempo adicional para as células osteogênicas repovoarem a área do defeito, desencadeando com eficiência a neoformação óssea (BUSER, 1994; GOMES, 1998; SCHLEGEL, 2000). MURRAY (1957), relatou o uso de barreiras mecânicas para isolar um sítio anatômico e direcionar a regeneração da área. O autor removeu um fragmento do osso ilíaco de cães e recobriram o defeito com material plástico, rígido o suficiente para manter um espaço entre o tecido ósseo e a face interna do material. Após dez semanas verificaram crescimento de tecido ósseo com as características histológicas próprias deste tecido.

34 34 2.4) Polímeros Dentre os biomateriais de interesse atual, destacam-se os polímeros como as resinas de poliuretano que são produtos sintetizados a partir de moléculas de ácidos graxos vegetais. Algumas propriedades devem ser consideradas quando se deseja explorar os polímeros para o reparo ósseo, tais como a composição e estrutura do polímero, que devem ser adequadas às finalidades específicas, como também a biodegradação dada por ligações químicas susceptíveis à hidrólise, quando expostas aos fluidos corporais (WILLIANS, 1983). Em 1994, o Grupo de Química Analítica e Tecnologia de Polímeros da Universidade de São Paulo no campus de São Carlos, por intermédio do Professor Gilberto Chierice, iniciou uma pesquisa para o desenvolvimento de um novo poliol derivado da poliuretana da mamona. A mamona, além de ser encontrada em grande quantidade no território brasileiro, apresenta um grande potencial óleo químico, podendo garantir o fornecimento de polióis e pré-polímeros a partir de ácidos graxos. Esta equipe constatou que a poliuretana da mamona pode ser utilizada na forma pura ou em associação com o carbonato de cálcio, que facilitaria as trocas iônicas na interface osso-resina, aumentado os níveis de dissolução celular e facilitando sua degradação (SOARES, 1994). A poliuretana, derivada do óleo da mamona, apresenta uma forma molecular que tem mostrado certa compatibilidade com os tecidos vivos, apresentando aspectos favoráveis de processabilidade, flexibilidade de formulação, versatibilidade da curva de temperatura e controle de pico exotérmico na transição líquido/gel, excelentes

35 35 propriedades estruturais, ausência de emissão de vapores tóxicos, bom poder de adesão, não liberação de radicais tóxicos quando implantada e baixo custo (IGNÁCIO, 1997). Para analisar o grau de irritabilidade aos tecidos causado pela poliuretana derivada da mamona, PASCON (1991) estudou sua citotoxidade in vitro e observou que de início foi baixa, mas aumentou após 24 e 60 horas. IGNÁCIO (1995) em sua dissertação de mestrado estudou a neoformação óssea e a incorporação do cimento derivado do polímero da mamona através da análise radiológica, histológica e morfológica. O autor concluiu que o polímero da mamona é um material osteocondutor, atuando como um espaçador biológico, permitindo que o osso neoformado desenvolva-se por toda a superfície externa do material, formando uma cortical óssea e um periósteo envolvendo este tecido neoformado. O material testado em sua pesquisa também ofereceu uma resistência mecânica satisfatória e ausência de qualquer reação tóxica. O polímero da mamona é considerado uma substância promissora para a utilização na Biomedicina. Sua biocompatibilidade foi testada por vários autores, os quais observaram uma grande aceitação orgânica à resina, obtendo em seus estudos a neoformação óssea. Não demonstraram encapsulamento do material, ausência de migração local de células inflamatórias e sem crescimento bacteriano nas culturas obtidas ou qualquer alteração patológica nos rins, fígado e baço (VILARINO, 1996; SOARES, 1994; TEIXEIRA, 1996; TEÓFILO, 1996). Outro polímero bastante utilizado como barreira é o politetrafluoretileno (m- PTFE), que consiste em um polímero quimicamente estável e biologicamente inerte, capaz de resistir ao ataque enzimático e microbiológico.

36 36 SCHMITZ (1990) analisou o reparo de alvéolos dentários de humanos, com e sem o uso de m-ptfe em um estudo imuno-histoquímico. Os alvéolos foram recobertos por m-ptfe no grupo teste e observados microscopicamente quatro semanas depois. Observou-se que nos dois grupos analisados havia presença de infiltrado de células inflamatórias mononucleares, porém no grupo teste a quantidade foi escassa. MACEDO (2003) comparou duas membranas usadas como barreiras físicas na regeneração óssea guiada em defeitos ósseos cirúrgicos na tíbia de ratos. Quinze animais foram divididos em 3 grupos, sendo no grupo I inserida a membrana de politetrafluoretileno, no grupo II inserido pequenos blocos de hidroxiapatita e o grupo III como controle. Durante o procedimento cirúrgico foi feito um defeito ósseo na tíbia de 2x3mm e após os períodos de 7,14,21 e 30 dias os animais foram sacrificados para a remoção da peça neoformada. A análise histológica demonstrou quantidades variadas de osso neoformado em ambos os tipos de polímeros, confirmando as suas biocompatibilidade como barreira física, porém a barreira de politetrafluoretileno mostrou melhores resultados. 2.5) Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) A Espectroscopia por Ressonância do Spin Eletrônico (RSE) ou Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) é uma técnica capaz de detectar qualquer material com elétrons desemparelhados por apresentarem spin eletrônico diferente de zero. Os radicais livres são moléculas que contém um elétron desemparelhado e, portanto podem ser detectados através da RSE. Outros exemplos de moléculas com

37 37 esta característica são os Birradicais, com dois elétrons desemparelhados, e os metais de transição. Todas estas substâncias podem ser detectadas por RSE. Como toda técnica espectroscópica, a espectroscopia por RSE monitora a absorção líquida de energia vinda de uma fonte de microondas, enquanto as moléculas mudam seu estado de energia. Para observar o fenômeno da RSE, a amostra interage com um campo magnético externo e, ao mesmo tempo, com um campo de microondas. O campo magnético externo tem como função orientar os spins presentes na amostra, os quais adquirem 2 orientações: paralela e antiparalela ao campo. O estado paralelo é o de menor energia, enquanto que o estado antiparalelo é instável e de maior energia. Quando a separação entre esses dois níveis corresponde à energia do campo de microondas, ocorre o fenômeno da ressonância. Nesta situação, ocorre uma absorção líquida do campo de microondas, conseqüência da transição entre os dois níveis de energia, o qual é registrado pelo equipamento. Quanto maior o número de spins (ou concentração de radicais livres), maior será a absorção de energia do campo de microondas (SWARTZ, 1972). Quando a radiação ionizante interage com os tecidos calcificados, radicais livres estáveis são gerados em sua matriz mineral. A hidroxiapatita (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) está presente em ossos (60-70%) e dentes (95-98% no esmalte e 70-80% na dentina). O principal radical livre gerado pela radiação ionizante é o CO 2 - e deve-se à presença de impurezas de Carbonato (CO 3 2- ) em sua matriz (CALLENS, 1989; SCHRAMM, 2000).

38 38 A figura 1 mostra o espectro típico de RSE do osso irradiado. O radical CO 2 -, gerado na Hidroxiapatita, é caracterizado pelo fator espectroscópico g, ilustrado na figura. g = 2,0025 g // = 1, Campo Magnético (mt) FIGURA 1: Espectro de Ressonância do Spin Eletrônico de um Osso da calvária de coelho irradiado com 3kGy da radiação γ de uma fonte de Cobalto-60. A dosimetria por RSE é uma técnica especialmente utilizada em casos de acidente com radiações ionizantes, pois permite a utilização de partes do corpo como dosímetros. A idéia de se utilizar ossos e dentes como indicador da dose em acidentes foi apresentada por MASCARENHAS (1973), no American Physical Society Meeting. O autor observou um sinal de RSE intenso em ossos de vítimas da Bomba-A. Nesta ocasião, propôs-se a avaliação de doses recebida pelas vitimas de Hiroshima através do esmalte dental, a fim de proporcionar um tratamento médico adequado e estudar os efeitos biológicos produzidos pela radiação. Utilizando-se uma amostra de esmalte ou osso da vítima, constroe-se uma curva Dose-Resposta. A determinação da curva Dose- Resposta é feita pela técnica chamada Doses Aditivas, onde a amostra é irradiada com doses conhecidas e a intensidade do sinal é obtida a cada dose adicional.

39 39 CARACELLI (1986) determinou as propriedades dosimétricas dos ossos e recentemente estas propriedades foram aplicadas para avaliar a dose liberada por 135 Sm-EDTMP e 89 SrCl2, que são compostos utilizados em Radioterapia Sistêmica para tratamento paliativo da dor provocada por metástases ósseas (KINOSHITA, 2001). Através da curva Dose-Resposta, pode-se determinar uma dose desconhecida inicialmente depositada na amostra, como é o caso de uma exposição acidental. Essa técnica foi utilizada para avaliar a dose de radiação recebida por vítimas das bombas de Hiroshima e Nagasaki por NAKAMURA (1998), do acidente em Chernobyl por SKVORTSOV (2000) e também de trabalhadores do complexo nuclear de Mayak e habitantes da região do Rio Techa nos Montes Urais por ROMANYUKHA (1996), ROMANYUKHA (2000), de Goiânia por ROSSI (2000) e de um acidente ocorrido com um trabalhador em Arequipa Peru por KINOSHITA (2003).

40 OBJETIVOS 40

41 41 3) OBJETIVOS O propósito deste trabalho foi analisar o uso da Ressonância do Spin Eletrônico para avaliar o grau de remodelação óssea como método adicional às análises radiográfica e histológica. Avaliar comparativamente a regeneração óssea guiada em defeitos cirúrgicos experimentais, em crânio de coelhos, com o uso de membrana vegetal de poliuretano e de politetrafluoretileno.

42 MATERIAIS E MÉTODOS 42

43 43 4) MATERIAIS E MÉTODOS 4.1) Local e Grupo de Estudo As cirurgias foram realizadas no Biotério da Universidade do Sagrado Coração, na cidade de Bauru-SP. No estudo foram utilizados 29 coelhos adultos brancos da raça New Zeland, divididos em três grupos com 9 coelhos cada. A análise da reparação óssea foi realizada nos períodos de 30, 60, e 120 dias. Durante todo o procedimento experimental, os coelhos permaneceram em gaiolas individuais e receberam água e dieta de ração balanceada. Este trabalho foi previamente analisado e aprovado pela Comissão de Ética da Universidade do Sagrado Coração, Bauru SP (ANEXO). 4.2) Delineamento Experimental Inicialmente, dos 29 coelhos, dois foram utilizados para a realização do teste da dose da Ressonância do Spin Eletrônico. Os 27 coelhos restantes foram divididos aleatoriamente em três grupos (A, B, C). Em todos foi provocado um defeito ósseo de 5 x 15mm no crânio. No Grupo A foi implantada a membrana oclusiva de poliuretano; no Grupo B, a membrana oclusiva de politetrafluoretileno; e no Grupo C, nenhuma membrana foi utilizada.

44 44 Levando-se em consideração a fragilidade destes animais, após os procedimentos cirúrgicos os coelhos ficaram sob observação diária durante todo o processo do estudo. Nos períodos de 30, 60, e 120 dias após a cirurgia, 3 coelhos de cada grupo foram sacrificados para posterior análise dos defeitos ósseos. 4.3) Técnicas e Procedimentos 4.3.1) Obtenção das membranas: As membranas de poliuretano foram fornecidas pelo Prof. Gilberto Chierice, do Instituto de Química de São Carlos, USP, responsável pelo aperfeiçoamento da resina. A membrana de politetrafluoretileno foi adquirida pela empresa Consulmat da cidade de São Paulo ) Técnica Cirúrgica: Anestesia e Assepsia: Inicialmente foi feita a aplicação intramuscular de Diazepan numa dose de 0,1 ml/kg de peso corpóreo, seguida pela administração intramuscular de Ketamina numa dose de 0,25mL/kg, para produzir uma anestesia dissociativa. Posteriormente, para fins de isquemia e anestesia local, associou-se na região da incisão cirúrgica cloridrato de prilocaína a 3% e felipressina 0,03U.I.

45 45 Após a administração anestésica, o animal ficou posicionado sobre a mesa cirúrgica para a realização da tricotomia na região e posterior assepsia local com iodopolivinilpirrolidona / PVPI (Polvedine Parke-Davis). Procedimento Cirúrgico: O isolamento da área foi realizado através de campos fenestrados estéreis. Com uma lâmina de bisturi número 15, realizou-se na pele do animal uma incisão linear de aproximadamente 4,5cm ao nível da linha média do osso frontal, seguida de divulsão muscular e periostal. Posteriormente foi realizado o defeito ósseo no crânio de tamanho de 5mm x 15mm com o uso de uma trefina de 5mm de diâmetro, juntamente com abundante irrigação de soro fisiológico para prevenir o aquecimento local, removendo todo o osso cortical e esponjoso, expondo a membrana meníngea. O grupo A recebeu uma membrana vegetal no assoalho ósseo recobrindo a meninge do crânio e outra membrana na superfície da loja cirúrgica, com posterior sutura do periósteo e pele com fio absorvível. No grupo B o mesmo procedimento do grupo A foi realizado, porém, a membrana de politetrafluoretileno foi empregada. No grupo C, controle, o defeito ósseo foi preenchido apenas por coágulo sanguíneo e, em seguida, procedida a sutura por planos, primeiramente do periósteo, seguida da sutura da pele. No pós-operatório imediato, os animais receberam uma aplicação única de ampicilina sódica, via intramuscular, na dose de 1mL/kg como profilaxia a infecções. A figura abaixo demonstra o procedimento cirúrgico (FIGURA 2)

46 46 A B C D E F G H FIGURA 2 Procedimento cirúrgico: (A) Incisão; (B) Divulsão muscular e periostal; (C) Confecção do defeito; (D) Defeito no tamanho de 5x15mm; (E) Membrana recobrindo a meninge e a superfície do defeito, grupos A e B; (F) Coágulo sanguíneo preenchendo o defeito, grupo Controle; (G) Sutura do Periósteo; (H) Sutura da pele; 4.3.3) Análise das Amostras: Nos períodos de 30, 60 e 120 dias após a cirurgia os coelhos foram sacrificados com uma superdosagem de anestésico geral (Ketamina). A área do crânio foi exposta e

47 47 o local contendo o defeito ósseo foi removido através da osteotomia com o uso de brocas de aço em baixa rotação. Após a remoção das peças, as mesmas foram colocadas em solução de Formol a 10%. Primeiramente foi realizada a tomada da radiografia. Posteriormente as peças contendo osso neoformado foram divididas ao meio para as análises histológica e por ressonância do spin eletrônico. Tomada da radiografia digital Inicialmente as peças foram absorvidas por um lenço de papel, para a retirada da umidade. Para as radiografias, utilizou-se um aparelho de raios-x odontológico, regulado para 70kVp e 8mA, com filtragem total equivalente a 2mm de alumínio. Posicionou-se o cilindro localizador de modo que o feixe central incidisse perpendicularmente ao plano do sensor, com distância foco/sensor de 40cm e a exposição de 2mAs previamente selecionado. A placa de imagem sensibilizada foi posicionada no leitor óptico do Sistema Digora para a captura da imagem latente contida na porção ativa da placa, por meio de varredura a laser. Depois da conversão dos sinais analógicos em digital, a imagem foi transferida para uma mídia de armazenagem para posterior edição e análise interpretativa (FIGURA 3).

48 48 FIGURA 3 Sistema Digora Pertencente ao Professor Doutor Orivaldo Tavano Bauru SP. Análise Histológica Inicialmente as peças foram fixadas em formol a 10% por 92 horas, seguida de descalcificação pelo método Morse (solução aquosa de ácido fórmico/citrato de sódio) e incluídas em parafina. Os cortes microscópicos foram obtidos no sentido longitudinal com seis micrômetros de espessura e corados pelo método de Tricômico Masson. Os cortes histológicos foram analisados e descritos em todas as suas peculiaridades, procurando observar características histológicas como: tecido mesenquimal osteogênico, trabéculas ósseas imaturas, presença de cartilagem, presença de tecido conjuntivo frouxo, presença de coágulo sanguíneo. As lâminas também foram fotografadas no fotomicroscópio Nikon H550L, adquirido através do projeto FAPESP 03/ sob responsabilidade do Prof. Dr.

49 49 Sérgio A. Catanzaro-Guimarães. A imagem digital adquirida foi analisada pelo Software Image-Pro-Plus, onde foi selecionado 3 regiões do corte histológico, sendo elas denominadas como: - Osso Maduro Pré-existente na região adjacente ao defeito (OMP); - Neoformação na Margem do Defeito (NMD); - Neoformação no Centro do Defeito (NCD). Por meio deste software, foi determinada a proporção entre as áreas correspondentes a Osso Maduro Neoformado (OMN), Osso Imaturo (OI), Medula Óssea (MO) e Tecido Conjuntivo (TC). A razão entre Osso Maduro Neoformado existente em cada região da neoformação e Osso Maduro Pré-existente foi determinada para fins de comparação com os resultados da RSE. As figuras abaixo são exemplos da aplicação do software (FIGURAS. 4-7). NMD NCD OMP FIGURA 4 - Imagem colorida da fotografia da lâmina através do software e as 3 regiões consideradas na análise: Osso Maduro Pré-existente, Neoformação na Margem do Defeito e Neoformação no Centro do Defeito.

50 50 FIGURA 5 - Análise Histométrica da região de Neoformação no Centro do Defeito. Osso Maduro Neoformado em verde e Osso Imaturo em amarelo. FIGURA 6 - Análise Histométrica da região de Neoformação na Margem do Defeito. Em verde a região de Osso Maduro Neoformado, em amarelo a região de Osso Imaturo e em magenta, a Medula Óssea.

51 51 FIGURA 7 - Análise Histométrica da região de Osso Maduro Pré-existente. Em verde a região de Osso Maduro Neoformado e em magenta, a Medula Óssea. Análise por Ressonância do Spin Eletrônico: - Estudo das propriedades dosimétricas de RSE do osso temporal de coelho Previamente, para a obtenção das melhores condições experimentais, dois coelhos adultos foram sacrificados e o osso temporal coletado. As amostras dos ossos foram limpas, lavadas em água destilada e álcool etílico, e secas em dessecador por um período de 15 dias. Posteriormente foram moídas manualmente, com um gral de ágata, a fim de se produzir um pó com diâmetro de cerca de 1 mm. Do material obtido, foram selecionadas 5 frações, de aproximadamente 100mg cada. Estas frações forma

52 52 colocadas em cápsulas de gelatina (comprimido) e receberam diferentes doses (500, 1000, 1500, 2000 e 3000 Gy) de radiação γ de uma fonte de Cobalto-60. As irradiações foram realizadas no IPEN Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares SP. A seguir, registramos o espectro de RSE de cada fração, a fim de se determinar qual dose de radiação é necessária para se produzir um espectro com boa relação sinal/ruído. Caso a maior dose citada (3000 Gy) fosse insuficiente para esse objetivo, novos valores de dose seriam testados. Os espectros de RSE foram registrados no espectrômetro Varian-E4, pertencente ao Departamento de Física e Matemática, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP. - Estudo da dinâmica de regeneração óssea por Ressonância do Spin Eletrônico As amostras de ossos neoformados de cada grupo (A, B e C) e referentes a cada fase (30, 60, 120 dias) foram lavadas em água destilada e álcool etílico, secas em dessecador por um período de 15 dias e moídas manualmente, como citado anteriormente. Após esse processo, todas as amostras foram irradiadas com uma dose de 3 kgy, determinada no teste anterior. Após o registro dos espectros de RSE, a amplitude do sinal referente ao radical CO - 2 (gerado na hidroxiapatita) foi determinada e comparada em relação ao osso normal e também entre os grupos A, B e C. O sinal de RSE do osso irradiado é dependente da concentração de radicais livres e, com isso, essa técnica pode ser utilizada para avaliar a dinâmica da

53 53 regeneração óssea, comparando-se o sinal de RSE do osso regenerado com o de um osso normal. Uma amostra de cada região do defeito foi retirada e moída manualmente com gral de ágata, sendo elas: neoformação na margem do defeito, neoformação no centro do defeito e osso maduro preexistente. Após este processo foram transferidas aos tubos de quartzo para o registro do espectro de RSE, realizados no Espectrômetro Varian-E4 pertencente ao Departamento de Física e Matemática da Universidade de São Paulo de Ribeirão Preto (FIGURA 8). Cerca de 60mg de osso moído foram utilizados para o registro dos espectros. A razão entre as amplitudes dos sinais de cada região e a região pré-existente foi adotada como o grau de mineralização da região. FIGURA 8 - Espectrômetro Varian-E4 pertencente ao Departamento de Física e Matemática USP Ribeirão Preto.