Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após criopreservação

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1 Acta Scientiae Veterinariae, (3): REVIEW ARTICLE Pub ISSN (Online) Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após criopreservação Characterization of Cellular Damage in Female Gametes and Embryos after Cryopreservation Adeline de Andrade Carvalho, Luciana Rocha Faustino, Simone Vieira Castro, José Ricardo de Figueiredo & Ana Paula Ribeiro Rodrigues ABSTRACT Background: Cryopreservation is a biotech successfully employed in female gametes and embryos. This technique is of great importance for propagation of genetic material from animals with high-value livestock as well as to preserve the fertility of women undergoing cancer treatments. However, low temperatures can result in damage to different cellular compartments and organelles. This damage culminates in reduced viability, since they affect cell metabolism. Review: Cryopreservation consists of maintenance of biological material at low temperatures, in which chemical reactions are ceased, however, allowing the cells to preserve their viability. However, the decrease of temperature and subsequent warming may result in cellular damage. These damages occur in the cell membrane, cytoplasmic organelles and the cell nucleus. It is believed that the first cell structure undergoing cryoinjury is the plasma membrane, responsible for maintaining homeostasis within the cell, and the loss of plasma membrane during the reduction temperature reported the main damage. The membrane damage due to cryopreservation appears to correlate with the reduction of thermal energy at low temperatures, thus limiting the movement of molecules through the phospholipids of lipid bilayer. Cryopreservation also alters the morphology, structure and cellular distribution of lipid droplets, reducing the survival of oocytes and embryos. The physical state changes, besides changing physicochemical properties of intracellular lipid may also result in damage to lipids associated with the cellular cytoskeleton. The interaction between cell lipid phase and components of cytoskeleton is complex and hardening of these lipids can cause deformation and disruption of cytoskeleton with consequent negative effect on cell survival and development. The disruption of cytoskeleton can also be intrinsic to change in dehydration and cellular form that follow the cryopreservation process. Among the cellular organelles, mitochondria are sensitive to cryopreservation procedures, since the formation of intracellular ice crystals considered one of the most relevant cryoinjury, leading to damage to the mitochondrial cristae and matrix. Another important organelle undergoes damage as result of cryopreservation is the endoplasmic reticulum, which change in morphology has been described after vitrification of embryos. It is also known that cryopreservation may result in fragmentation of DNA even in the absence of deformation of the cellular morphology, and that these changes can lead to delay in the development or cell death. In addition to the direct damage to double-stranded DNA, cryopreservation may trigger chromosomal abnormalities, these the aneuploidy is the most frequent and seems to compromise the developmental competence of oocytes in addition to being indicated as the main factor for the low achieve of live births. Conclusion: Cryopreservation is an important alternative for the preservation of gametes and embryos, however, the cells are subjected to unfavorable conditions that can compromise cell recovery after thawing/warming. The main cause of reduction in survival oocytes and embryos after cryopreservation appear to be related to damage in different cellular compartments and structures, which are essential for maintaining cell metabolism. Thus, it is observed the need to achieve cryopreservation protocols capable of maintaining the integrity of different cellular components. Keywords: cryopreservation, cryoinjury cellular, oocytes, female gametes, embryos, ovarian tissue. Descritores: criopreservação, crioinjúria celular, oócitos, gametas femininos, embriões, tecido ovariano. Received: December Accepted: March 2012 Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil. CORRESPONDENCE: A.A. Carvalho [adelineandrade@gmail.com - Fax: +55 (85) ]. LAMOFOPA, Faculdade de Veterinária - UECE. Av. Paranjana n. 1700, Campus do Itaperi. CEP Fortaleza, CE, Brazil. 1

2 I. INTRODUÇÃO II. BASES GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO CELULAR III. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS CÉLULAS EUCARI- ÓTICAS IV. PRINCIPAIS DANOS CELULARES CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO 1. Danos de membrana 2. Danos em gotículas lipídicas intracitoplasmáticas e citoesqueleto 3. Danos em organelas celulares 4. Danos nucleares V. CONCLUSÃO VI. REFERÊNCIAS I. INTRODUÇÃO A criopreservação é uma técnica que tem despertado grande interesse para a reprodução assistida nos últimos 15 anos, principalmente desde os primeiros relatos de nascimentos em ovinos [39] e humanos [25] após o transplante de tecido ovariano previamente criopreservado. Portanto, é compreensível a aplicação cada vez mais frequente dessa técnica com a finalidade de preservação de gametas femininos com o objetivo final de manutenção da função reprodutiva da fêmea ou mesmo a produção de crias após impossibilidade de reprodução natural ou radicalmente, após a morte do animal. Considerando a crescente incidência de doenças cancerígenas, aliada ao sucesso atual dos tratamentos oncológicos, a criopreservação tem ganhado ênfase na medicina reprodutiva humana por representar uma alternativa para que mulheres, sobretudo as jovens, possam gerar filhos após o tratamento do câncer [78]. Além disso, a criopreservação tem sido bastante difundida no âmbito da veterinária por permitir a disseminação de material genético de animais de alto valor genético e grande produtividade [117]. Adicionalmente, a criopreservação também tem sido considerada uma vantajosa ferramenta para preservar animais em vias de extinção [114]. Vários estudos têm sido realizados visando aperfeiçoar o processo de criopreservação de gametas femininos, seja na forma matura [72,78,102] ou imatura [11,49,74], como meio de permitir um melhor aproveitamento do potencial reprodutivo mesmo após a morte ou impossibilidade da função reprodutiva da fêmea. Além da criopreservação de gametas femininos, a criopreservação de embriões também tem sido bastante estudada e amplamente difundida e estabelecida para aplicação tanto em humanos [86,87] quanto em animais [27,83]. Contudo, ainda observa-se a inexistência de um protocolo ideal [67], haja vista as baixas taxas de sobrevivência e desenvolvimento oocitário até embrião normal [60]. Além disso, também são baixas as taxas de sobrevivência e implantação embrionária após criopreservação, as quais ainda são consideradas muito inferiores àquelas obtidas quando se trata de embriões frescos [57]. A criopreservação de células germinativas pode ser realizada tanto por congelação lenta como por vitrificação. Ambos os métodos têm sido empregados em tecido ovariano [66,71], oócitos [12,29,30] e embriões [60,85]. Contudo, esse procedimento ainda é apontado por alguns autores como uma técnica prejudicial às células, que pode resultar em danos em diferentes compartimentos celulares, como por exemplo, na membrana celular [55], nas organelas [63,94] e no núcleo [45,67]. O conhecimento e a caracterização desses danos são de grande relevância para a criobiologia, visto que a intensidade com que as lesões celulares ocorrem pode incapacitar as células de superarem grandes danos, consequentemente, perdendo sua viabilidade. Desta forma, a presente revisão tem o objetivo de descrever os principais danos originados em consequência dos procedimentos de criopreservação em tecido ovariano, oócito maturo e embriões oriundos de seres humanos e animais. II. BASES GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO CELULAR A criopreservação consiste na manutenção de material biológico a temperaturas criogênicas, nas quais todas as reações químicas, processos biológicos e atividades físicas intra e extracelulares estão suspensas, contudo, as células conseguem manter-se íntegras, preservando sua viabilidade [91]. Essas temperaturas são denominadas criogênicas, sendo frequentemente utilizado o nitrogênio líquido (-196ºC) para alcançálas [7]. Em temperaturas entre 0 e 25ºC a atividade celular torna-se lenta, mas ainda está presente. Contudo, abaixo de -40ºC as trocas físico-químicas são cessadas e, para garantir a preservação celular por tempo indeterminado, as células devem ser mantidas 2

3 a temperaturas inferiores a -130ºC na presença de agentes crioprotetores [7]. Em regiões frias, algumas plantas [9] e animais [22,84] desenvolveram uma resistência natural às baixas temperaturas. Essa resistência consiste na capacidade de possibilitar que a água mantenha-se superesfriada em temperaturas próximas a -40ºC [9]. Esta adaptação é denominada de aclimatação e geralmente envolve a síntese de açúcares intra e extracelulares que aumentam a pressão osmótica das células e reduzem a injúria por plasmólise a baixas temperaturas [9,22]. Contudo, em 1949 foi realizada a descoberta de uma substância com a capacidade de atravessar a membrana celular e reduzir a formação de cristais de gelo [58,82]. Esta substância, isto é, o glicerol, bem como outras com propriedades similares, como o propanodiol, etilenoglicol e dimetilsulfóxido, passaram desde então a ser utilizadas com sucesso na criopreservação de células e tecidos [17,111]. Apesar dos avanços na criobiologia, tanto a redução de temperatura quanto o posterior aquecimento celular podem resultar em danos na estrutura da célula [9,28]. Esses danos podem ocorrer na membrana celular [17], nas organelas citoplasmáticas [47,49,50] e até mesmo no núcleo da célula [23,67]. Em virtude disso, várias pesquisas têm sido realizadas com o intuito de conhecer as crioinjúrias ocasionadas e amenizar ou reverter os danos celulares decorrente dessas injúrias [29,30,107]. Devido à complexidade da estrutura celular eucariótica e as várias organelas essenciais para a sobrevivência da mesma, cada organela será descrita em maiores detalhes a seguir. III. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS CÉLULAS EUCARIÓTICAS As células de organismos multicelulares apresentam forma e estrutura variáveis e se diferenciam de acordo com sua função. No entanto, todas as células eucarióticas apresentam uma organização básica similar (Figura 1). Esta organização consiste em uma membrana celular externa, constituída por uma bicamada lipídica com proteínas dispostas nesta bicamada [37]. Esta membrana é responsável por delimitar o citoplasma, composto por citosol, organelas celulares, proteínas e íons; e o núcleo, que alberga o material genético da célula, o qual é um compartimento altamente organizado e separado do citoplasma por uma membrana porosa denominada carioteca [41]. Figura 1. Imagem ilustrativa de uma célula eucariótica evidenciando as organelas internas no citoplasma e no núcleo. Imagem concedida por Thibodeau e Patton [103]. O citoplasma celular, além de albergar fluidos e enzimas, também contém estruturas físicas altamente organizadas, denominadas organelas intracelulares [33]. Toda esta estrutura é mantida com auxílio de uma complexa rede filamentosa chamada de citoesqueleto. O citoesqueleto é uma estrutura constituída por microtúbulos formados por tubulina α e β, microfilamentos de actina e filamentos intermediários específicos de certas células. Todos estes elementos assumem, além da função esquelética, outras funções de acordo com as proteínas as quais estão associados [49]. Nas células eucarióticas, o citoesqueleto tem como função principal coordenar a distribuição de organelas nas células e manter a forma celular. Sendo, portanto, o citoesqueleto responsável pela sustentação e resistência celular, bem como por alterações na forma e distribuição das organelas desencadeadas por interações entre a célula e seu meio e, entre células diferentes [41]. Os microtúbulos executam diversas funções, dentre elas, a manutenção da estrutura celular, o transporte de moléculas, bem como estão envolvidos na divisão celular, uma vez que participam da formação do fuso meiótico [30]. No citoplasma também estão presentes as organelas responsáveis pela respiração e energia celular, conhecidas como mitocôndrias [20]. A distribuição destas organelas parece estar associada com o nível de metabolismo celular, através da conversão de piruvato à adenosina trifosfato (ATP), substância que atua como fonte de energia para a célula [41]. As células eucarióticas também possuem organelas formadas por uma interconexão de túbulos e 3

4 vesículas. Estas estruturas, conhecidas como retículo endoplasmático, são constituídas por membrana, matriz endoplasmática e um meio aquoso que ocupa o espaço entre os túbulos e vesículas. O retículo endoplasmático pode ou não ter sua superfície recoberta por ribossomos, sendo, então, denominado de retículo endoplasmático rugoso e liso, respectivamente [70]. O retículo endoplasmático rugoso ou granular possui a capacidade de sintetizar novas moléculas proteicas, enquanto o retículo endoplasmático liso, também chamado de agranular, tem como função a síntese de substâncias lipídicas, incluindo a produção de hormônios esteróides [70]. As substâncias produzidas pelo retículo endoplasmático são liberadas no meio extracelular através de encapsulamento pelas vesículas do complexo de Golgi. Essa organela possui membranas semelhantes às membranas do retículo endoplasmático agranular e geralmente é composta por várias camadas de vesículas achatadas e empilhadas, sendo proeminente em células secretoras [96]. O núcleo celular é um compartimento organizado no qual são encontrados os cromossomos, responsáveis por armazenar as informações genéticas [54]. Durante a divisão celular os cromossomos encontram-se aderidos ao fuso meiótico, formado por microtúbulos e microfilamentos de actina [78]. O núcleo é considerado o centro de controle da célula por conter os genes que determinam as características proteicas da célula [54], incluindo proteínas estruturais e enzimas que controlam as atividades nucleares e citoplasmáticas [41]. Cada compartimento celular citado desempenha um importante papel para manutenção da homeostase celular. Entretanto, essa homeostase pode ser comprometida em virtude de alterações em diferentes estruturas celulares decorrentes da criopreservação, conforme detalhado no próximo tópico. IV. PRINCIPAIS DANOS CELULARES CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO 1. Danos de membrana De forma geral, todas as membranas celulares são sensíveis às crioinjúrias, porém, a sobrevivência da célula parece estar mais diretamente relacionada com a integridade da membrana plasmática do que com as membranas que delimitam as organelas. A membrana celular possui maior relevância por atuar no procedimento de criopreservação como uma barreira semipermeável entre o citoplasma e o meio extracelular, permitindo o movimento (efluxo/influxo) de água e agentes crioprotetores, fundamental para a preservação da célula a temperaturas ultra-baixas [105]. Acreditase que a membrana seja o primeiro compartimento a sofrer injúrias decorrentes do frio e que estas injúrias estejam correlacionadas com a redução de temperatura a qual a célula é exposta [99]. Um dos graves danos decorrentes da criopreservação é a perda de parte da membrana plasmática durante a redução de temperatura [1]. Esta perda membranária é resultado da intensa desidratação celular que precisa ocorrer com o intuito de reduzir a formação intracelular de gelo de modo a garantir o sucesso da criopreservação, desde que esta não seja excessiva. Durante a desidratação excessiva e consequente estresse hídrico, as células se retraem e ocorre uma contração da membrana celular. Esta contração resulta na aproximação de porções de membrana permitindo uma interação da bicamada lipídica com ocasional fusão da membrana [94], ocorrendo consequentemente formação de vesículas e perda de parte do material da membrana. Essa alteração pode culminar com a perda de elasticidade da membrana e lise da célula ao retornar às condições isotônicas normais [1]. Os danos de membrana decorrentes da criopreservação também parecem estar relacionados com a redução da energia térmica a baixas temperaturas e consequente limitação do movimento de moléculas na bicamada lipídica da membrana [37]. Esses danos também são influenciados pela composição lipídica da membrana, que influencia diretamente suas propriedades, inclusive a resistência ao estresse térmico [5,119,121]. Esta composição parece variar de acordo com o desenvolvimento e tipo celular. Já foi demonstrado, na espécie ovina, que a membrana plasmática de zigotos e oócitos em diferentes estágios de desenvolvimento possuem diferentes temperaturas de solidificação, sugerindo ainda que essa variação está relacionada com a composição fosfolipídica e concentração de colesterol da membrana [120]. Ao avaliar ovários humanos criopreservados utilizando a congelação lenta na presença de dimetilsulfóxido (DMSO), Martinez-Madri [62] observaram que 96,7% dos folículos ovarianos apresentavam membranas celular e nuclear intactas. A congelação lenta de tecido ovariano de cutias (Dasyprocta aguti) com propanodiol também foi eficaz em preservar as membranas do oócito e das células da granulosa [114]. 4

5 A.A. Carvalho, L.R. Faustino, S.V. Castro, J.R. Figueiredo & A.P.R. Rodrigues Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após criopreservação. Acta Scientiae Veterinariae. 40(3): sabe-se que a criopreservação de oócitos ocasiona uma redução na taxa de fecundação do oócito [98] provavelmente por mudanças estruturais da zona pelúcida. Essas alterações parecem ser ocasionadas pela liberação precoce dos grânulos corticais [16,36,52,64] devido a um aumento de cálcio após procedimentos de criopreservação [56], resultando no enrijecimento da zona pelúcida [52]. Contudo, o exato mecanismo que conduz a esse aumento de cálcio no oócito ainda não é completamente conhecido. Em embriões criopreservados foi demonstrada uma sensibilidade relativamente alta da membrana plasmática, uma vez que o processo de congelação/ descongelação de embriões reduziu em cerca de cinco vezes a fluidez da membrana de embriões de camundongos [2]. Contudo, ao avaliar a transição da fase cristalina líquida para a fase cristalina gel (Tm) de embriões e oócitos maturos (MII) e imaturos (VG) de mulheres, Ghetler et al. [37] observaram que a membrana celular de embriões possui uma Tm mais baixa que a de oócitos, tornando-os menos sensíveis às crioinjúrias. Esta variável está correlacionada com uma maior resistência ao frio, uma vez que a passagem dos lipídios da fase líquida para a fase gel ocorre a uma temperatura mais baixa, na qual os processos biológicos e a cinética de lesão são lentos. Desta forma, acredita-se que os danos na membrana possam ser reduzidos através da perfusão dos agentes crioprotetores a uma temperatura acima da Tm da membrana celular, possibilitando o transporte de crioprotetor e água através da membrana quando a bicamada lipídica ainda encontra-se em fase líquida, facilitando o transporte transmembrana [19,51,118]. Contudo, em caprinos foram relatadas alterações na membrana nuclear (Figura 2A) após congelação em meio contendo DMSO e sacarose [17]. Figura 2. Fotomicrografias demonstrativas da ultraestrutura de folículos ovarianos e oócitos submetidos a procedimentos de criopreservação. (A) Folículo primordial de mulher incluso em ovário inteiro congelado/descongelado evidenciando um oócito (O) com ruptura de membrana nuclear e condensação da cromatina (seta preta) no núcleo do oócito (N). Entre as células foliculares (Fc) percebe-se célula folicular alterada com condensação da cromatina (seta branca). Imagem concedida por Martinez-Madrid [62] e autorizada pela Elsevier. (B) Oócito bovino imaturo congelado/ descongelado com gotícula lipídica intacta (1) e com lipólise parcial (2). Observam-se áreas de lipólise (seta branca) e mitocôndrias (m). Aumento de 8000x. Figura adaptada de Isachenko [48] e autorizada por Wiley Job Network. (C) Oócitos equinos maturos vitrificados/aquecidos com enturgecimento de mitocôndrias e redução de elétron-densidade da matriz mitocondrial (setas pretas). Figura concedida por Hochi [46] e autorizada pela Elsevier. (D) Folículo suíno incluso em tecido ovariano congelado/ descongelado com mitocôndrias túrgidas (m). (l): gotículas lipídicas, (Nu): núcleo, (CG): células da granulosa e (*): espaços vazios. Figura concedida por Borges [13] e autorizada pela Elsevier. (E) Folículo ovariano humano incluso em tecido vitrificado/aquecido com presença de poros na membrana nuclear (setas pretas) e retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias (M) bem preservados, semelhante ao tecido fresco. Figura concedida por Sheikhi [95] e autorizada pela Oxford Journals. 2. Danos nas gotículas lipídicas intracitoplasmáticas e citoesqueleto O sucesso dos protocolos de criopreservação de tecido ovariano, oócitos e embriões parece ser dificultado, em grande parte, pela presença de lipídios (Figura 2B), tanto na forma de gotículas lipídicas intracitoplasmáticas [35] quanto na composição da membrana celular [37], principalmente nas espécies suína [13] e canina [50]. Além disso, o procedimento de vitrificação altera a morfologia, estrutura e distribuição celular das gotículas de lipídios [34], reduzindo a sobrevivência de oócitos e embriões [37]. Na vitrificação de oócitos e embriões suínos, algumas pesquisas têm sido realizadas com o intuito de reduzir a quantidade de lipídio intracelular [67] e Especificamente em oócitos, a camada glicoprotéica denominada zona pelúcida, exerce a importante função de impedir a polispermia e, também, se mostra sensível aos procedimentos de criopreservação [55,98,106]. A presença de vacúolos e debris na zona pelúcida, por exemplo, já foi relatada após criopreservação de ovários de camundongas, seja através da congelação lenta ou da vitrificação [55]. Em geral, 5

6 aumentar a sobrevivência oocitária [35] e embrionária [67]. Contudo, a centrifugação e a remoção química utilizadas nos tratamentos de delipação podem causar danos aos oócitos e embriões, tornando as células mais frágeis ao processo, especialmente a membrana celular, que se torna mais sensível [35]. As gotículas lipídicas parecem estar relacionadas aos filamentos intermediários do citoesqueleto [15,43]. Estes filamentos formam uma rede que se estende do núcleo à membrana plasmática envolvendo grande parte das organelas celulares [15] e já foram descritos em associação com o retículo endoplasmático [80], complexo de Golgi [65] e gotículas lipídicas intracitoplasmáticas [43]. A interação de filamentos intermediários com gotas lipídicas foi reforçada pela associação dessas estruturas com a vimentina (grupo de proteínas constituintes dos filamentos intermediários), observada por Traub [104], embora a finalidade dessa interação ainda seja desconhecida. No entanto, acredita-se que a interação lipídiocitoesqueleto possa estar relacionada à manutenção da morfologia celular [10], embora o mecanismo pelo qual este processo ocorra ainda também não esteja elucidado. As mudanças de estado físico, além de alterarem as propriedades físico-químicas dos lipídios intracelulares [49] podem resultar em danos também nos lipídios associados ao citoesqueleto celular [48] (Figura 3). A interação entre a fase lipídica das células e os elementos do citoesqueleto é complexa e o enrijecimento desses lipídios pode causar deformação e ruptura do citoesqueleto [49], com consequente influência na sobrevivência e desenvolvimento celular [47,88,112]. Figura 3. Imagens representativas do padrão de citoesqueleto de oócitos felinos imaturos submetidos à criopreservação evidenciando microfilamentos em vermelho e microtúbulos em verde. Microfilamentos difusos no ooplasma com uma concentração ligeiramente maior na zona pelúcida (A), microtúbulos uniformemente distribuídos por todo ooplasma (A ). Microfilamentos e microtúbulos distribuídos de forma irregular no citoplasma (B e B ). [Barras = 50 µm]. Figura concedida por Luciano [59] e autorizada pela Elsevier. O rompimento do citoesqueleto pode ser uma alteração intrínseca às mudanças na forma e desidratação celular que acompanham o processo de criopreservação [113]. Em oócitos, as crioinjúrias parecem afetar principalmente os microtúbulos [3] e a organização do citoesqueleto [75]. Esses criodanos podem também ser decorrentes da exposição aos agentes crioprotetores, que podem ocasionar a despolimerização de microtúbulos e microfilamentos e causar a destruição dos componentes do citoesqueleto [24]. A exposição ao crioprotetor, etapa fundamental da criopreservação, resultou em discreta redução no percentual de distribuição normal dos microfilamentos em oócitos bovinos congelados [94] e oócitos suínos vitrificados [90]. Além disso, a congelação de oócitos bovinos demonstrou um efeito negativo sobre os microfilamentos, observado pela drástica redução de oócitos com distribuição normal dos microfilamentos [94]. Contudo, alguns estudos têm mostrado a eficiência de protocolos de criopreservação com menores danos ao citoesqueleto celular. Em camundongas, a avaliação de oócitos imaturos criopreservados (congelação lenta), posteriormente submetidos à maturação in vitro, não revelou qualquer alteração significativa na organização de microtúbulos e microfilamentos [29]. Em oócitos maturos de equinos vitrificados por OPS (Open Pulled Straws), Tharasanit et al. [102] observaram um rompimento no citoesqueleto celular, porém, a frequência dessa alteração foi baixa. Alterações irreversíveis na estrutura dos microtúbulos podem ser ocasionadas em decorrência do estresse osmótico, do efeito solução e da formação de cristais de gelo intracelulares, que são efeitos intrínsecos ao processo de criopreservação [94]. A manutenção da morfologia dos microfilamentos é tão importante quanto a manutenção da morfologia dos microtúbulos. A preservação do fuso meiótico de oócitos em MII é a principal dificuldade da criopreservação destas estruturas. Nesta fase, os cromossomos encontram-se dispostos na placa equatorial e os microtúbulos ligados aos cromossomos estão estendidos [26], tornando-se mais vulneráveis às crioinjúrias. Vários estudos têm sugerido que a criopreservação causa alterações na polimerização da tubulina de microtúbulos do fuso de oócitos em MII, ocasionando uma ruptura no fuso meiótico e consequente desorganização da cromatina [81,100]. Danos no fuso meiótico já foram relatados após a vitrificação de oócitos de camundongas [38], 6

7 ovelhas [100] e mulheres [61]. Em oócitos de coelha ovulados e congelados não foi perceptível a presença de actina polimerizada (componente dos microfilamentos), sendo observada a presença de microfilamentos apenas no corpúsculo polar [111]. Contudo, algumas equipes sugerem que o citoesqueleto de oócitos em estágio de vesícula germinativa seja mais rígido que microtúbulos e microfilamentos de oócitos em estágio MII [4]. Uma hipótese é que em função da complexa interação entre a fase lipídica das células e os elementos do citoesqueleto, o enrijecimento dos lipídios pode ocasionar uma deformação e até mesmo ruptura do citoesqueleto. No citoesqueleto rígido de oócitos em vesícula germinativa o enrijecimento em decorrência dos procedimentos de criopreservação torna-se, aparentemente, permanente, enquanto oócitos em MII parecem reverter estes danos em virtude da característica flexível de seu citoesqueleto [48]. 3. Danos em organelas celulares Durante o procedimento de criopreservação, as células podem sofrer severos danos em sua estrutura. Esses danos estão relacionados com a integridade das organelas celulares e podem resultar em retardo no crescimento folicular [92] e embrionário [67] ou até mesmo culminar com a morte da célula [62]. As mitocôndrias, organelas essenciais para o metabolismo celular, são sensíveis aos procedimentos de criopreservação [12,73], apresentando criodanos ocasionados tanto pela congelação lenta [62] quanto pela vitrificação [66]. Aparentemente, a causa mais relevante desses danos é a formação de cristais de gelo intracelular, que induz a danos nas cristas e na matriz das mitocôndrias [69], acarretando em distanciamento das membranas mitocondriais e danos, principalmente, à membrana mitocondrial interna [79]. A manutenção da morfologia e atividade mitocondrial são características indispensáveis para diversos eventos que estão envolvidos com a maturação citoplasmática e retomada da meiose [108], fertilização [115] e desenvolvimento embrionário [8]. Desta forma, a preservação dessas organelas caracteriza-se como um dos grandes desafios da criopreservação, uma vez que as mitocôndrias estão relacionadas com a produção de energia celular [8,41] e, consequentemente, a integridade mitocondrial está correlacionada com a viabilidade celular [88]. A vitrificação de tecido ovariano de camundongas está relacionada com a redução na quantidade de cristas mitocondriais, alterações na morfologia mitocondrial [66] e aumento no número de mitocôndrias [55,66] tanto nas células da granulosa quanto nos oócitos. Após criopreservação rápida (redução de 1 C/ min) de ovário humano inteiro também foi observada redução nas cristas mitocondriais [62]. No entanto, em tecido ovariano humano submetido à congelação lenta observou-se um elevado número de mitocôndrias em oócitos de folículos primordiais e primários morfologicamente normais, além de matriz com baixa densidade e poucas cristas periféricas, características consideradas normais em oócitos em estado quiescente ou em desenvolvimento inicial [71]. Em oócitos humanos maturos vitrificados foi verificada a presença de mitocôndrias com matriz elétron-densa e cristas bem preservadas. Contudo, foi observada uma fragmentação da matriz mitocondrial e desintegração da membrana de algumas mitocôndrias [12]. Já após a congelação lenta de oócitos humanos maturos (MII) as mitocôndrias encontravam-se uniformemente distribuídas no citoplasma. No entanto, estas mitocôndrias possuíam aparentes danos nas cristas mitocondriais, caracterizadas por cristas que não atravessavam a matriz elétron-densa. Além disso, em um alto percentual de oócitos criopreservados (72%) foi observada uma redução na densidade da matriz mitocondrial [40]. Quando a congelação lenta foi utilizada em ovários de camundongas, foi observada presença de mitocôndrias túrgidas e com poucas cristas [66]. As mitocôndrias também têm sido bastante investigadas em embriões criopreservados em diferentes espécies, como bovinos [107] e suínos [31], uma vez que o ATP produzido pelas mitocôndrias é essencial para diversos processos celulares em embriões em desenvolvimento, incluindo a divisão celular e replicação do DNA genômico [8]. Em embriões de camundongos, após a congelação lenta, foi observado que a maioria das mitocôndrias apresentava-se agrupada, principalmente, ao longo da membrana celular. Dentre as mitocôndrias presentes no citoplasma, grande parte exibiu um baixo potencial de membrana, evidenciando que a criopreservação é capaz de induzir a despolarização da membrana mitocondrial [2]. Em bovinos, a congelação lenta de embriões de 7 dias não demonstrou alterações nas mitocôndrias. Contudo, ao se criopreservar embriões bovinos de 13 dias, observou-se danos na membrana das mitocôndrias e perda da homogeneidade de sua matriz [69]. 7

8 Apesar da presença de danos nas mitocôndrias decorrentes do procedimento de criopreservação, um estudo com blastocistos bovinos vitrificados sugere que esse tipo de dano pode ser revertido após algumas horas de incubação, cultivando-se os embriões pósaquecimento [107]. Nesse estudo, embriões analisados logo depois de aquecidos demonstraram alterações mitocondriais e redução de elétron-densidade da matriz ou mitocôndrias túrgidas e com aumento da elétron-densidade da matriz. Curiosamente, após 4 h de incubação as mitocôndrias retomaram seu tamanho normal e apenas uma minoria apresentava áreas com redução de elétron-densidade. Após 24 h de incubação, as mitocôndrias apresentavam-se com formato normal e matriz elétron-densa. De forma contrária, em blastocistos suínos vitrificados observou-se o desacoplamento da membrana mitocondrial interna e matriz mitocondrial com redução de elétron-densidade [53]. Ainda após vitrificação de blastocistos suínos, Fabian et al. [31] observaram uma degeneração extensiva das mitocôndrias com desligamento parcial das membranas interna e externa quando os embriões foram cultivados por 24 h após aquecimento. Outra importante organela que sofre danos em decorrência da criopreservação é o retículo endoplasmático, cuja modificação na morfologia foi observada após a vitrificação de embriões suínos, resultando em dilatação do retículo endoplasmático liso e presença de pequenas vesículas [31]. Alterações nessa organela também foram perceptíveis em oócitos suínos [13] e caprinos [17], com enturgecimento da mesma após a congelação do tecido ovariano (Figuras 2C e 2D). Acredita-se que essa deformação ocorre como resultado de mudanças no balanço iônico causado por alterações na permeabilidade da membrana plasmática [21]. O entumecimento de retículo endoplasmático e cristas mitocondriais [23,45] também foi observado após a vitrificação de oócitos bovinos maturos e imaturos, com estreita proximidade entre as gotículas lipídicas, mitocôndrias e retículo endoplasmático [23]. Contudo, a congelação lenta de oócitos imaturos inclusos em tecido ovariano bovino mostrou-se eficiente na preservação dos retículos endoplasmáticos (liso e rugoso), não sendo perceptíveis alterações nessas organelas [18]. Em tecido ovariano ovino, após a congelação lenta foi observado um número variável de vesículas, complexo de Golgi bem desenvolvido e retículos endoplasmáticos (liso e rugoso) agregados entre si ou formando um complexo com mitocôndrias ou vesículas [93]. Essas características evidenciam a preservação eficaz destas organelas, uma vez que também foram observadas em tecido ovariano fresco de ovinos [32], caprinos [97] e humanos [44]. A preservação de mitocôndrias e retículos endoplasmáticos (liso e rugoso) também foi observada nos oócitos e células da granulosa de ovários de camundongas submetidos ao procedimento de vitrificação [42]. As crioinjúrias resultantes da congelação lenta de tecido ovariano humano mostram-se sutis, uma vez que após aplicação da técnica observou-se numerosos complexos de Golgi e retículo endoplasmático liso e rugoso preservados no citoplasma das células foliculares [71]. A vitrificação de tecido ovariano humano também não resultou em grandes alterações nas organelas celulares, confirmado pela presença de complexos de Golgi e retículos endoplasmáticos bem definidos e abundantes (Figura 2E) [95]. Contudo, quando a vitrificação foi empregada em oócitos maturos humanos, complexos de Golgi foram encontrados apenas ocasionalmente e o citoplasma oocitário mostrou-se ocupado de forma homogênea por vesículas dilatadas de retículo endoplasmático liso, em virtude da ruptura destas organelas. Em adição, complexos retículo endoplasmático - mitocôndrias foram encontrados esporadicamente [12]. 4. Danos nucleares A sobrevivência imediata de uma célula depende da sua capacidade de evitar alterações no seu DNA. Apesar do grande esforço da célula para manter a integridade do seu material genético, diversos processos desafiam essa capacidade intrínseca. Sabe-se que a criopreservação pode resultar em fragmentação do DNA, mesmo na ausência de deformação da morfologia celular. Porém, os mecanismos subjacentes a esses danos ainda não são conhecidos [68]. Além disso, já foi demonstrado que os cromossomos são muito susceptíveis a alterações decorrentes dos procedimentos de criopreservação [14]. Estas alterações podem ser divididas em estruturais e numéricas. As alterações numéricas podem ainda ser subdividas em alterações na qual todo o genoma é multiplicado (poliploidias) e alterações no qual apenas poucos cromossomos são duplicados ou perdidos (aneuploidias) [54]. Dentre as alterações cromossômicas, a aneuploidia é a mais frequente e parece comprometer o desenvolvimento competente do oócito [116], além 8

9 de ser indicada como o principal fator para a baixa obtenção de nascidos vivos [14,67]. Essas alterações cromossômicas também podem ser decorrentes da criopreservação de oócitos. Van der Elst et al. [109] observaram que ao criopreservarem oócitos de camundongas, a formação parcial do fuso meiótico ocasiona o deslocamento cromossômico em alguns oócitos, podendo resultar em aneuploidia ou retenção do segundo corpúsculo polar no momento da fecundação originando, consequentemente, embriões poliplóides. Em oócitos, o estágio de maturação (oócito imaturo ou oócito maturo) tem sido implicado como um fator que afeta a qualidade e a competência no desenvolvimento após criopreservação [45,76]. Os principais danos da criopreservação parecem resultar principalmente da ruptura do fuso meiótico [89] (Figura 4) em decorrência da sensibilidade dos microtúbulos à redução de temperatura [23]. No entanto, esse dano pode ser minimizado pela capacidade dos microtúbulos do fuso meiótico de se reorganizar durante o resfriamento/aquecimento [110]. As espécies bovina e humana, no entanto, parecem possuir uma menor capacidade de recuperação do fuso meiótico devido à falta de material pericentriolar em alguns oócitos [110]. Essas alterações nos microtúbulos são de fundamental importância para o desenvolvimento de um oócito competente, pois os microtúbulos participam da formação do fuso meiótico e estão associados com a segregação cromossômica anormal [30]. Figura 4. Padrão de organização do fuso meiótico e de cromossomos em oócitos ovinos maturos submetidos à vitrificação. Fuso normal (A) com cromossomos alinhados na placa metafásica (A ). Fuso assimétrico (B e B ). Coluna da direita: marcação de β-tubulina, coluna da esquerda: marcação do DNA com Hoechst. Figura concedida por Asgari [6] e autorizada pela Elsevier. Em oócitos de coelhas naturalmente ovulados e congelados com DMSO foi observado um elevado número de microtúbulos em torno dos cromossomos, semelhante ao observado em oócitos não criopreservados. No entanto, quando os oócitos foram congelados na presença de propanodiol, o fuso meiótico não apresentava conformação normal, além de apresentarem microtúbulos dispersos no citoplasma celular [111]. Analisando-se oócitos suínos imaturos submetidos à vitrificação, foi observada uma redução de oócitos com organização do fuso normal (79,5% no controle ou não vitrificado vs 10,1% vitrificado) e, consequentemente, um aumento de oócitos com fuso anormal (15,6% controle vs 46,5% vitrificado) e ausente (4,8% controle vs 43,2% vitrificado). Curiosamente, os oócitos vitrificados mantiveram o alinhamento cromossômico regular, mesmo quando apresentavam fuso anormal. Quando avaliada a percentagem de F-actina (componente dos microfilamentos que formam o fuso meiótico) foi observado que a vitrificação de oócitos imaturos (VG) parece ser mais deletéria aos microfilamentos do que a vitrificação de oócitos maturos (16,9 vs 37,2% respectivamente). Contudo, o procedimento de vitrificação, independente do estágio de maturação oocitária, mostrou uma redução no percentual de normalidade do fuso quando comparado a oócitos frescos (72,3%) [117]. Após vitrificação de oócitos maturos de camundongas observou-se uma redução de cromossomos normais de oócitos desnudos vitrificados (67,2%) quando comparados a oócitos frescos (80,4%). Além disso, a taxa de fuso meiótico normal reduziu de 79,8% para 60,6%, quando os oócitos foram submetidos à vitrificação [77]. No entanto, a congelação lenta de oócitos maturos de camundongas parece ser mais danosa ao fuso meiótico, visto que o formato de barril característico do fuso meiótico foi reduzido de 97% em oócitos não criopreservados para 18% em oócitos congelados. Os demais oócitos congelados exibiram características anormais do fuso como por exemplo, fuso fusiforme ou retração nos pólos. A congelação lenta também resultou em menor percentual de cromossomos corretamente alinhados (78%) quando comparados a oócitos não congelados (97%) [30]. Em oócitos maturos ovinos vitrificados, também foi perceptível a redução do alinhamento cromossômico normal (79,14% em oócitos frescos vs 11,11% em oócitos vitrificados) [6]. 9

10 Em pesquisa realizada com embriões humanos foi observado que a sobrevivência embrionária póscongelação está relacionada com o número de células, cujo núcleo foi preservado, e a redução da sobrevivência embrionária foi relacionada com o maior número de células do embrião no momento da criopreservação [101], sugerindo que embriões em estágio mais avançado podem ser mais susceptíveis às crioinjúrias. A vitrificação de embriões suínos resultou em um acréscimo na perda de gestações [67] correlacionada principalmente com aneuplodia [14]. No entanto, ainda não é conhecido o mecanismo exato pelo qual essas alterações cromossômicas são ocasionadas nem o estágio ao qual o embrião está mais vulnerável aos danos nucleares. V. CONCLUSÃO A criopreservação é uma importante alternativa para a preservação de gametas e embriões, sendo, por isso, bastante aplicada para armazenar o material genético de animais com alto valor zootécnico, bem como restaurar a fertilidade de mulheres após tratamentos oncológicos. Contudo, este procedimento submete as células a condições desfavoráveis que podem comprometer a recuperação celular após descongelação/ aquecimento. Conforme apontado no decorrer desta revisão, diversos autores têm demonstrado que a causa na redução da sobrevivência de oócitos, folículos ovarianos (presentes ou isolados do tecido ovariano) e embriões após criopreservação está relacionada com danos em diferentes compartimentos e estruturas celulares. Essas estruturas são essenciais para o metabolismo e viabilidade da célula e, portanto, a aplicação de um protocolo de criopreservação capaz de manter essas estruturas intactas deve levar em conta o grau de desenvolvimento, tipo e número de células. Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper. REFERÊNCIAS 1 Acker J.P. & McGann L.E Protective effect of intracellular ice during freezing? Cryobiology. 46(2): Ahn H.J., Sohn I.P., Kwon H.C., Jo D.H., Park Y.D. & Min C.K Charateristics of the cell membrane fluidity, actin fibers, and mitochondrial disfunctions of frozen-thawed two-cell mouse embryos. Molecular Reproduction and Development. 61(4): Albertini D.F. & Eppig J.J Unusual cytoskeletal and chromatin configurations in mouse oocytes that are atypical in meiotic progression. Developmental Genetics. 16(1): Allworth A.E. & Albertini D.F Meiotic maturation in cultured bovine oocytes is accompanied by remodeling of the cumulus cell cytoskeleton. Developmental Biology. 158(1): Arav A., Pearl M. & Zeron Y Does membrane lipid profile explain chilling sensitivity and membrane lipid phase transition of spermatozoa and oocytes? Cryo Letters. 21(3): Asgari V., Hosseini S.M., Ostadhosseini S., Hajian M. & Nars-Esfahani M.H Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75(5): Bakhach J The cryopreservation of composite tissues - Principles and recent advancement on cryopreservation of different type of tissues. Organogenesis. 5(3): Bavister B.D Culture of pre-implantation embryo: facts and artifacts. Human Reproduction Update. 1(2): Benson E.E Cryopreservation Theory. In: Reed B.M. (Ed). Plant Cryopreservation: A Practical Guide. Corvallis: Springer, pp Bodin S., Soulet C., Tronchère H., Sié P., Gachet C., Plantavid M. & Payrastre B Integrin-dependent interaction of lipid rafts with the actin cytoskeleton in activated human platelets. Journal of Cell Science. 118(4): Bogliolo L., Ariu F., Fois S., Rosati I., Zedda M.T., Leoni G., Succu S., Pau S. & Ledda S Morphological and biochemical analysis of immature ovine oocytes vitrified with or without cumulus cells. Theriogenology. 68(8): Bonetti A., Cervi M., Tomei F., Marchini M., Ortolani F. & Manno M Ultrastructural evaluation of human metaphase II oocytes after vitrification: closed versus open devices. Fertility and Sterility. 95(3): Borges E.N., Silva R.C., Futino D.O., Rocha-Junior C.M.C., Amorim C.A., Báo S.N. & Lucci C.M Cryopreservation of swine ovarian tissue: Effect of different cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicle oocytes. Cryobiology. 59(2):

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