Núcleo Interfásico: Cromatina e Cromossomos

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1 Núcleo Interfásico: Cromatina e Cromossomos Disciplina: Biologia Celular Docentes responsáveis: Profa.. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira Profa.. Rosana Silistino de Souza Pós-graduanda: Msc.. Priscila Pasqüetto Mendonça

2 Núcleo Interfásico: Cromatina: estrutura e função

3 Cromatina: Cromatina: estrutura e função DNA + Proteínas histônicas + Proteínas não histônicas Divisão celular: nos núcleos das células em interfase + RNA Cromatina Alterações em sua morfologia, composição e função Unidades individualizadas Cromossomos

4 No núcleo n interfásico: Cromatina: compactada, granulosa, filamentosa, com distribuição variada células de um mesmo tecido / tipos celulares em diferentes estados fisiológicos Diferentes fenótipos nucleares

5 No núcleo n em divisão: Cromatina Altamente compactada Cromossomos

6 Tipos de cromatina

7 No nível n bioquímico e funcional a cromatina divide-se: Eucromatina: Difusa, descompactada Ativa na intérfase (transcrição) Eucromatina ~10% forma ativa Restante: inativa

8 No nível n bioquímico e funcional a cromatina divide-se: Heterocromatina: Condensada Constitutiva: é aquela de regiões centroméricas, teloméricas, ocorrendo em regiões correspondentes de ambos os cromossomos homólogos. É geralmente rica em DNA repetitivo ou satélite e predominantemente não codificadora. Ex.: Heterocromatina centromérica Heterocromatina Bandamento-C

9 No nível n bioquímico e funcional a cromatina divide-se: Heterocromatina: Facultativa: é considerada um estado fisiológico reprimido do DNA numa região condensada da cromatina, ocorrendo em apenas um dos cromossomos homólogos. Ex.: Heterocromatina de um dos cromossomos X de mamíferos placentários XX Não apresenta não diferenças na composição do DNA em comparação com a eucromatina Eucromatina Heterocromatinizada Facultativamente

10 Heterocromatina facultativa: No cromossomo X Heterocromatinização ao acaso Ex.: Corpúsculo de Barr

11 Heterocromatina facultativa: Em um mesmo organismo: Condensada em algumas célulasc Descondensada em outras Cromossomo X em fêmeas

12 Heterocromatina facultativa: Por quê ocorre a inativação de um dos cromossomos X nas fêmeas? Igualar a quantidade de genes Quantidade de produtos gênicos Compensação de dose A inativação dessas regiões ocorre ao acaso e ora o cromossomo proveniente da mãe pode ser inativa, ora do pai, e isso é passado às demais células Ex.: Padrão de pelagem em gatas Cromossomo X paterno Expressa pelagem laranja Cromossomo X materno Expressa pelagem preta Inativação aleatória do cromossomo X

13 Heterocromatina Visualização da heterocromatina em diferentes materiais: (a) Células de testículo de gafanhoto; (b) e (c) Cromocentros em células de Triatoma infestans; (d) Região de heterocromatina em um cromossomo politênico de Trichosia pubescen; (e) Cromocentros formados pela heterocromatina constitutiva em hepatócitos de camundongos; (f) Cromocentro em célula de Panstrongylus megistus Cromocentros são um conjunto de porções heterocromáticas constitutivas que se associam entre si, formando corpos maiores e facilmente evidenciáveis.

14 Núcleo Interfásico: Cromatina: composição

15 Cromatina: composição DNA RNA Proteínas histônicas Proteínas não histônicas Enzimas nucleares

16 DNA: Classes de DNA: a) DNA de sequência única (10 a 80%): apresenta uma única cópia do gene por genoma Ex.: Genes estruturais responsáveis pela codificação de proteínas com diversas funções - Fisiológicas: hemoglobina - Nutritivas: ovalbumina - Estruturais: miosina b) DNA de sequência medianamente repetidas (10 a 40%): constituído pelas famílias de genes codificantes Ex.: Genes para RNAr, RNAt e histonas Sequências funcionais não codificantes, como as repetições teloméricas, encontradas nos telômeros dos cromossomos c) DNA de sequências altamente repetidas (0 a 50%): geralmente são seqüências muito curtas, compostas de poucos nucleotídeos, que se localizam, preferencialmente, nas regiões próximas ao centrômero (heterocromatina centromérica). Ex.: Genes transcritos a partir do DNA satélite (região centromérica)

17 RNAs: Os RNAs estão integrados de modo transitório à estrutura da cromatina, constituindo em torno de 3% de sua composição e correspondendo às cadeias recém transcritas em várias fases do seu processo de elongação Tipos de RNAs: RNAt RNAm RNAr

18 Proteínas nucleares: a) Protaminas: proteínas básicas e simples, com baixo peso molecular. Ex.: SPTZ peixes b) Histonas: são proteínas básicas nucleares e importantes componentes da estrutura da cromatina. São encontradas em grandes quantidades. As proteínas histônicas são classificadas com base em seu teor em lisina e arginina. Classes e tipos de histonas - H1: rica em lisina - H2A e H2B: moderadamente ricas em lisina - H3 e H4: ricas em arginina c) Proteínas não histônicas ou acídicas: desempenham variados papéis na cromatina, desde o estrutural até o enzimático, participando da regulação da atividade gênica d) Enzimas nucleares: atuam nos processos de transcrição, replicação e reparo do DNA e também, nos processos de condensação e descondensação da cromatina

19 Histonas: Funções: As proteínas histônicas são importantes componentes da estrutura da cromatina que podem estar participando como repressoras ou ativadoras durante a transcrição do DNA Tipos: H1 H2A H2B H3 H4 H5 Eletroforese em gel de poliacrilamina de proteínas histônicas extraídas de eritrócitos de frango

20 Histonas: Altamente conservadas Variam pouco em sequência de aminoácidos nas diferentes espécies Participam da arquitetura molecular das fibras cromatínicas Facilitam a ligação à molécula de DNA A razão de massa DNA / histona é igual a 1,0.

21 Histonas: As moléculas de histonas possuem três regiões: - Região carboxiterminal; - Região central, globular e hidrofóbica; - Região amino-terminal Região carboxiterminal Histona H1: região carboxiterminal é rica em aminoácidos básicos, especialmente lisina. Outras histonas: maior quantidade de aminoácidos básicos na região aminoterminal e ricos em aminoácidos hidrofóbicos nas regiões carboxiterminal e globular 14 Região central globular hidrofóbica 9 Número de aminoácidos Região aminoterminal

22 Não histônicas (NHC) ou acídicas dicas: Funções: Apresentam inúmeras funções: - Enzimático - Estrutural - Transcrição-replicação Regulação da expressão gênica - Condensação-descondensação De modo geral, as proteínas não histônicas: Têm seu aumento relacionado à alta atividade metabólica da célula; Estão em maior concentração na cromatina ativa (eucromatina); Ocorrem em menor concentração na cromatina inativa (heterocromatina); Ocorrem mais em células em divisão do que em células que não estão se dividindo

23 Não histônicas (NHC) ou acídicas dicas: Principais funções: O processo de condensação cromossômica inicia-se pela formação de um esqueleto proteico metafásico, formado por proteínas não histônicas, ao redor do qual se ligam alças de cromatina Quando as histonas são removidas de um cromossomo metafásico, forma-se um halo de DNA não compactado. Este halo consiste de muitas alças de DNA ligadas à estrutura protéica Esquerda: cromossomo metafásico; Direita: cromossomo metafásico sem histonas, mostrando esqueleto de proteínas ácidas e uma nuvem formada pelas duas cadeias de DNA - uma de cada cromátide irmã (direita)

24 Cromatina: ultraestrutura

25 Histórico: Cromatina: ultraestrutura Ris (1956): DNA + proteínas Sistema de fibras de A de diâmetro com 4 fios em dupla hélice enrolados Du Praw (1965): experimentos utilizando tripsina em núcleos de células embrionárias de abelha, observou que a fibra cromatínica exibe regiões mais espessas (Fibra B) unidas por regiões mais finas (Fibra A) Du Praw / Bahr (1969): - Fibra A, menos proteínas ligadas ao DNA - Fibra B, filamento intacto (DNA + proteínas) Essas observações sugeriram a existência de diferentes ordens de compactação da estrutura nucleoprotéica

26 Histórico: Cromatina: ultraestrutura Olins e Olins (1974): núcleos de diferentes tecidos a um choque osmótico com KCl a 0,2 M Rompeu os núcleos, liberando fibras de cromatina Retirar as proteínas não histônicas Restando somente as proteínas histônicas + DNA Ao microscópio eletrônico Distribuição linear de pequenas unidades aproximadamente esféricas, com um diâmetro de 7 nm, unidas entre si por um filamento de 1,5 nm Colar de contas

27 Cromatina: ultraestrutura Olins e Olins: A) Estrutura nativa: fibra de 30 nm B) Após tratamento: cromatina em forma de contas

28 Histórico: Cromatina: ultraestrutura Kornberg et al. (1974): propuseram que a fibra cromatínica era constituída por unidades repetitivas compostas por duas moléculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 e de cerca de 200 pares de bases (pb) de DNA. E uma quinta histona, H1, se localizava superficialmente a esta unidade H2A (2) H3 (2) H1 (1) H2B (2) H4 (2)

29 Histórico: Cromatina: ultraestrutura Oudet et al. (1975): denominam a unidade estrutural repetitiva da cromatina de Nucleossomo Nucleossomo: unidade que se repete na cromatina (todas histonas + DNA) Core nucleossômico (nucleóide) + Filamento espaçador Core nucleossômico: Composto por 146 pb de DNA 1 e ¾ de volta de uma hélice ao redor de um octâmetro de histonas (sem H1)

30 Nucleossomo: - 1 molécula H1 Cromatina: ultraestrutura - 2 moléculas de cada histona: H2A, H2B, H3 e H4-200 pb (filamento espaçador spacer ou linker) Core nucleossômico: Octâmero de histonas + 1 ¾ de volta de DNA

31 Nucleossomo: Cromatina: ultraestrutura

32 Cromatina: ultraestrutura Complexo de proteínas e DNA:

33 Histórico: Cromatina: ultraestrutura Felsenfeld (1978): papel das histonas Histonas: H1 (rica em lisina): Função estabilizadora da estrutura do nucleossomo levando à formação de mini-solenóides ( super-bead ) H2A e H2B (pobres em lisina): Importante na compactação do DNA H3 e H4 (ricas em arginina): Formam dímeros quando em solução sendo essenciais ao enrolamento do DNA papel central na formação do nucleossomo

34 Histona H1: Cromatina: ultraestrutura Importante na compactação de nucleossomos adjacentes A histona H1 é necessária para que os complexos histona-dna formem a fibra de 30 nm de espessura, enrolando assim o DNA de uma forma ainda mais eficaz A H1 liga-se externamente ao centro do nucleossomo e ao DNA de ligação, constituindo o nucleossomo

35 Cromatina: ultraestrutura Modelos de Worcel para a posição de H1 (1979): A. Entrelaçamento contínuo de H1 (Solenóide contínuo) A região N-terminal de uma molécula de H1 estaria próxima à região C-terminal de outra As interações H1-H1 poderiam estabilizar a fibra Levando a formação do filamento mais grosso A cada 6-8 nucleossomos Mini-solenóide B. Entrelaçamento descontínuo de H1 (Solenóide descontínuo) A cada 10 unidades repetitivas da cromatina, a molécula de H1 apareça substituída pela proteína UH2A (ubiquitina ligada à H2A), Esse modelo dá maior flexibilidade a fibra de 200 a 300 nml

36 Cromatina: ultraestrutura A cada 6 nucleossomos 30 nm Mini-solenóide Vista lateral Vista frontal

37 Cromatina: níveis n de organização

38 Cromatina: níveis n de organização Níveis de compactação do DNA: A. Molécula de DNA 2nm (10 pb) Grau de empacotamento: 1 B. Nucleofilamento ou filamento nucleossômico Fibra cromatínica de 10 nm de espessura Arranjo linear dos nucleossomos (unidades repetitivas da cromatina) Grau de empacotamento: 6-7 C. Mini-solenóide ou solenóide Fibra mais grossa 20 a 30 nm de espessura Organização helicoidal do nucleofilamento com 5 a 6 unidades repetitivas da cromatina (nucleossomos) Grau de empacotamento 40 D. Série de domínio de alças 300 nm Grau de empacotamento: 680 E. Conjunto de domínio de alças 700 nm Super-solenóide = Cromossomo Grau de empacotamento:

39 Cromatina: níveis n de organização Níveis de compactação do DNA: Empacotamento do DNA com histonas Fibras de 10 nm de espessura Separadas por segmento de DNA de ~ 80 pb Enrolamento em fibras de 30 nm Mini-solenóide

40 Cromatina: níveis n de organização Esquema das fibras cromatínicas nicas: Fibra de 30 nm Mantida pela associação das Histonas H1 Centro do solenóide

41 Cromatina: níveis n de organização Nucleossomo:

42 Cromatina: Cromatina: níveis n de organização

43 Cromatina: níveis n de organização Organização cromatínica nica:

44 Cromatina: níveis n de organização do filamento cromatínico Região curta de DNA dupla-hélice Forma de contas de um rosário da cromatina Fibra de 30 nm de cromatina, formada por nucleossomos compactados Secção do cromossomo numa forma estendida Secção do cromossomo numa forma estendida Cromossomo metafásico completo

45 Cromatina: níveis n de organização do filamento cromatínico

46 Cromatina: níveis n de organização Compactação da hélice h do DNA:

47 Cromatina: níveis n de organização Compactação da hélice h do DNA:

48 Núcleo Interfásico: Cromossomos metafásicos

49 Cromossomos metafásicos Níveis de organização cromatínica nica: : Cromossomo mitótico tico Condensação: acompanhada pela fosforilação da H1

50 Cromossomos metafásicos Cromossomos autossômicos: Ocorrem aos pares (2n 2 lotes cromossômicos) nas células somáticas Meiose: redução em número Número de cromossomos de uma espécie: determinada na metáfase Cromossomo Metafásico

51 Cromossomos metafásicos Número, tamanho e posição do centrômero: Número: constante Tamanho: constante na mesma fase do processo de divisão no mesmo lote cromossômico, podem apresentar variabilidade Posição do centrômero: principal diferenciação morfológica Centrômero ou constrição primária: região em que se situa o cinetócoro Cinetócoro: estrutura organizada da polimerização das fibras cromossômicas do fuso mitótico

52 Classificação: Cromossomos metafásicos ão: baseada na posição do centrômero A posição do centrômero em um determinado cromossomo é constante, permitindo que este possa ser classificado como: Metacêntricos: centrômero na porção mediana do cromossomo; Submetacêntrico: centrômero deslocado para um dos braços cromossômicos; Acrocêntrico: centrômero se posiciona em uma das extremidades do cromossomo

53 Classificação: Cromossomos metafásicos ão: baseada na posição do centrômero

54 Cromossomos metafásicos Centrômeros, constrições secundárias e telômeros: Principais diferenciações morfológicas dos cromossomos Centrômero Sondas específicas e FISH (Fluorescence in situ hybridization) Identificar a região centromérica de um cromossomo em especial, inclusive em núcleos interfásicos

55 Cromossomos metafásicos Centrômeros, constrições secundárias e telômeros: Principais diferenciações morfológicas dos cromossomos Constrições secundárias Região Organizadora Nucleolar

56 Cromossomos metafásicos Centrômeros, constrições secundárias e telômeros: Principais diferenciações morfológicas dos cromossomos Constrições secundárias (RONs( RONs) Bandamento NOR Impregnação por íons prata RONs

57 Cromossomos metafásicos Centrômeros, constrições secundárias e telômeros: Principais diferenciações morfológicas dos cromossomos Telômeros Maccação específica Sondas teloméricas

58 Diferenças entre Cromatina e Cromossomo Composição química Fisiologia Estrutura Cromatina DNA + RNA + Proteínas Maior atividade de síntese Fibrilas não empacotadas (Nucleofilamentos) Cromatina: 1. Conjunto de cromossomos descondensados 2. Expressão interfásica dos cromossomos Cromossomos DNA + Proteínas Pouca ou ausência de atividade de sínteses Empacotamento das fibrilas Importante na cromatina dos eucariontes: a) Condensação dos cromossomos facilita a separação durante a divisão celular b) A maneira exata em que a região do genoma é enrolada em uma célula c particular determina a atividade dos genes naquela região

59 Dúvidas???!! Priscila Pasqüetto Mendonça Doutoranda em Genética UNESP / IBILCE [email protected]

60 Núcleo Interfásico: Nucléolo Disciplina: Biologia Celular Docentes responsáveis: Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira Profa. Rosana Silistino de Souza Pós-graduanda: Msc. Priscila Pasqüetto Mendonça

61 NUCLÉOLO - Estrutura + facilmente visível vel (sem qualquer coloração): índice de refração - Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin (1839)

62 - Organela celular, cuja função é a de produzir ribossomos - Geralmente ovalada - Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)

63 Tamanho, forma e número depende do estado funcional da célula - Tamanho - Grandes: glândulas e neurônios - Pequenos: céls da glia e endotélio - Número - Normalmente 1 (linfócitos humanos) - +1: hepatócitos citos, céls vegetais (tulipas: 6-13) - Ovócitos de anfíbios: 3000

64 Composição Química - RNA: 3-17% (pp RNAr) (RNP) - DNAr: até 17% (seqüências altamente repetidas) - Proteínas: até 85% - histonas - acídicas: Numatrina, Nucleolina, Ribogranulina - enzimas: RNA polimerase I, DNA topoisomerase I e II

65 Métodos de Estudo Microscopia de Luz - Métodos citoquímicos de basofilia (AgNOR AgNOR, Azul de Toluidina e Variante da Concentração Eletrolítica tica Crítica) * < D1, D2 - T. infestans D3 - T. infestans

66 Métodos de Estudo Microscopia de Luz -Acridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado) - Microscopia de contraste de fase

67 Métodos de Estudo Nucléolo x Citodiagnóstico

68 Nucléolo x Citodiagnóstico Parâmetros: Tamanho Número Forma Razão área N nu

69 Métodos de Estudo Microscopia Eletrônica - Método de Bernhard RNA + proteínas: elétrondensos DNA: eletronlúcidos

70 Métodos de Estudo Além de... - Análises bioquímicas e microespectrofotometria - Autorradiografia - Agentes inibidores do RNAr - Análises moleculares

71 L Rd R n Rr Tb Ti Tv L Experimento realizado na região espaçadora adora ITS-1 A L Ph Pm Tb Ti Tv Rd Rn Rr L Figura 1. 1 (A) e (B) Polimorfismo de tamanho para a região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.os valores aproximados em pares de base são: Ph 600 pb, Pm 800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e Rn 300 pb, Rr 250 pb. Letra L designa os marcadores de tamanho molecular (1Kb Ladder, Gibco). Tartarotti,E & Ceron, C. R, 2002 B

72 Morfologia do Nucléolo No microscópio de luz: simples - ovalada, no máximo alguns vacúolos No microscópio eletrônico: três grandes regiões Centro Fibrilar (CF) Componente Fibrilar Denso (CFD) Componente Granular (CG)

73 Morfologia do Nucléolo (MET) 1) Centro Fibrilar (CF) - Conjunto de finas fibrilas (4-8nm) - atividade transcricional n e tamanho dos CFs - Composição Química: DNAr, DNA topoisomerase I, RNA polimerase I, RNP, Nucleolina, Numatrina, Fibrilarina

74 Morfologia do Nucléolo (MET) 2) Componente Fibrilar Denso (CFD) - Ao redor dos CFs - Fibrilas densamente empacotadas em redes - Composição Química: DNAr, RNA polimerase I, Fibrilarina, Nucleolina, Numatrina

75 Morfologia do Nucléolo (MET) 3) Componente Granular (CG) - Periferia, ao redor do CFD - Estruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetro - Local de armazenamento das pré unidades ribossômicas - Composição Química: RNP, Fibrilarina, Nucleolina, Ribogranulina

76 Morfologia do Nucléolo

77 Morfologia do Nucléolo (MET)

78 Morfologia do Nucléolo (MET) 4) Esqueleto Nucleolar - Região amorfa relacionada com o esqueleto nuclear - Composição Química: Proteínas acídicas 5) Vacúolos Nucleolares - Áreas vazias vazias???? - Dúvidas... Artefatos??? Áreas menos densas???

79 Morfologia do Nucléolo (MET) 6) Cromatina associada ao Nucléolo - Ao redor envia ramificações intranucleolares - Cromatina perinucleolar não faz parte do nucléolo - Segmentos cromossômicos específicos - RONs

80 a) Nucléolos Reticulados (nucleolonemas) - Região granular periférica rica + Região fibrilar central Ex.: Triatoma infestans b) Compactos - Essencialmente granulosos (massa celular compacta) Ex.: Allium cepa c) Em anel Camadas concêntricas: - central filamentosa - cortical granulosa Ex.: Anfíbios Tipos de Nucléolo

81 Fisiologia do Nucléolo - Biogênese dos RIBOSSOMOS - Função bem estabelecida com observações de Brown em 1964 (Xenopus laevis aevis) - Defeito cromossômico: formação dos nucléolos (perda de DNAr) - Número de nucléolos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa) Aa X Aa ¼ AA: ½ Aa: ¼ aa

82 Experimento de Miller e Beatty (1967) - Ovócitos de Triturus viridescens - Choque osmótico separação das regiões nucleolares - CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, por RNA 45S transcrito - CG: moléculas de RNA precursor da grande subunidade 32S

83 Experimento de Miller e Beatty (1967)

84 Experimento de Miller e Beatty (1967) - DNAr em tandem - Muitas moléculas de RNAr transcritas - Regiões de DNA espaçador ador - Árvore de Natal

85 Experimento de Miller e Beatty (1967) - Cada RNA polimerase se associa ao promotor, e se move ao longo do DNAr

86 Metabolismo Nucleolar

87 Metabolismo Nucleolar

88 Subunidade maior (60S): RNAr 28S + RNAr 5,8S + RNAr 5S + proteínas nucleolares Subunidade menor (40S): RNAr 18S + proteínas nucleolares Metabolismo Nucleolar Proteínas: Importadas do citoplasma S = Unidade de Sweedberg é a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a qual se sedimentam as partículas no campo de centrifugação. Ocorre influência do tamanho, densidade e forma da partícula e também m do meio no qual as partículas estão suspensas.

89 Metabolismo Nucleolar Processamento do RNA: RNA 45 S RNA 32 S RNA 20 S RNA 28 S RNA 18 S + RNA 5,8 S + RNA 5 S Subunidade menor Subunidade maior

90 Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs RONs) - Moldes de DNA relacionados com a síntese de estruturas nucleolares Visualizadas como zonas de constricções secundárias nos cromossomos que apresentam regiões satélites - RONs: local do cromossomo responsável pela codificação do RNA 45S

91 Cromossomos Humanos -RONs RONs: zonas de constricções secundárias - regiões satélites Representação esquemática da metade do cariótipo

92 Biogênese do Nucléolo - Divisão celular: intérfase e início da prófase - Desaparece Desaparece : final da prófase (mitose) e no diplóteno (meiose) - Reaparece Reaparece na telófase -Como o nucléolo de reorganiza?!

93 Biogênese do Nucléolo Três hipóteses: 1) Reconstrução a partir dos corpúsculos pré-nucleolares agrupados nas RONs 2) Reconstrução a partir de Matriz pré-existente 3) Formação de estrutura totalmente nova a partir da RON

94 Fim! Priscila Pasqüetto Mendonça Doutoranda em Genética UNESP / IBILCE [email protected]